本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于預(yù)測肺腺癌患者預(yù)后及判斷輔助化療獲益的系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

肺癌是當(dāng)今世界上癌癥相關(guān)死亡中最常見的原因，而其中80％為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。TNM分期是目前為人們所普遍接受的臨床分期系統(tǒng)，被用于預(yù)測預(yù)后并指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌患者的治療。然而，目前的TNM分期系統(tǒng)遠(yuǎn)不足以準(zhǔn)確預(yù)測非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后情況。比如，對于肺癌患者來說，即使處于臨床Ⅰ期，肺癌的復(fù)發(fā)率也高達(dá)35-50％。另外，相當(dāng)一部分患者僅靠手術(shù)方式即能治愈，這些病人應(yīng)該可以避免基于當(dāng)前TNM系統(tǒng)而進(jìn)行輔助性化療所帶來的極強(qiáng)副反應(yīng)。

為了提高對非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的預(yù)測效果，人們已經(jīng)投入了極大努力去鑒定和識別其相關(guān)的分子標(biāo)志物譜。很多研究肺癌的團(tuán)隊(duì)都曾報道過具有不同預(yù)后能力的基因表達(dá)譜。然而，到目前為止還沒有一個基因表達(dá)譜應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌臨床預(yù)后的預(yù)測。

另外，由于術(shù)后輔助化療只有約5.4％的五年生存獲益，因此目前臨床上十分關(guān)注輔助化療中的過度治療問題，亟待發(fā)展可識別化療受益群體的新方法。

肺腺癌是肺癌的一種，屬于非小細(xì)胞癌。不同于鱗狀細(xì)胞肺癌，肺腺癌較容易發(fā)生于女性及不抽煙者。起源于支氣管粘膜上皮，少數(shù)起源于大支氣管的粘液腺。發(fā)病率比鱗癌和未分化癌低，發(fā)病年齡較小，女性相對多見。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何對肺腺癌患者進(jìn)行預(yù)后預(yù)測和/或如何預(yù)測肺腺癌患者是否受益于輔助化療。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了A和/或B的系統(tǒng)，包括檢測c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1這六種蛋白質(zhì)表達(dá)量的系統(tǒng)：

A、預(yù)測肺腺癌患者預(yù)后的系統(tǒng)；

B、預(yù)測肺腺癌患者是否受益于輔助化療的系統(tǒng)。

上述A和/或B的系統(tǒng)中，所述檢測c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1這六種蛋白質(zhì)表達(dá)量的系統(tǒng)可包括通過免疫組織化學(xué)染色方法測定所述六種蛋白質(zhì)的表達(dá)量所需的試劑和/或儀器。

上述A和/或B的系統(tǒng)中，所述A包括蛋白質(zhì)表達(dá)量數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)1，所述蛋白質(zhì)表達(dá)量數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)1用于將來自待預(yù)測肺腺癌患者的分離的肺腺癌組織(手術(shù)切除的肺腺癌組織)中所述六種蛋白質(zhì)表達(dá)量轉(zhuǎn)換為所述待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后分值，根據(jù)所述待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后分值預(yù)測所述待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后；所述B包括蛋白質(zhì)表達(dá)量數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)2，所述蛋白質(zhì)表達(dá)量數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)2將來自待預(yù)測肺腺癌患者的分離的肺腺癌組織(手術(shù)切除的肺腺癌組織)中所述六種蛋白質(zhì)表達(dá)量轉(zhuǎn)換為所述待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后分值，根據(jù)所述待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后分值預(yù)測所述待預(yù)測肺腺癌患者是否受益于輔助化療。

上述A和/或B的系統(tǒng)中，所述蛋白質(zhì)表達(dá)量數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)1內(nèi)設(shè)模塊1-a和模塊1-b，所述模塊1-a用于將來自待預(yù)測肺腺癌患者的分離的肺腺癌組織中所述六種蛋白質(zhì)表達(dá)量轉(zhuǎn)換為所述待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后分值，所述模塊1-b用于根據(jù)所述待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后分值預(yù)測所述待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后；所述蛋白質(zhì)表達(dá)量數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)2內(nèi)設(shè)所述模塊1-a和模塊2-b，所述模塊2-b用于根據(jù)所述待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后分值預(yù)測所述待預(yù)測肺腺癌患者是否受益于輔助化療的系統(tǒng)。

所述檢測c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1這六種蛋白質(zhì)表達(dá)量的系統(tǒng)在制備A和/或B中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：

A、預(yù)測肺腺癌患者預(yù)后的系統(tǒng)；

B、預(yù)測肺腺癌患者是否受益于輔助化療的系統(tǒng)。

所述檢測c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1這六種蛋白質(zhì)表達(dá)量的系統(tǒng)和蛋白質(zhì)表達(dá)量數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)在制備A和/或B中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：

A、預(yù)測肺腺癌患者預(yù)后的系統(tǒng)；

B、預(yù)測肺腺癌患者是否受益于輔助化療的系統(tǒng)；

所述蛋白質(zhì)表達(dá)量數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為所述蛋白質(zhì)表達(dá)量數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)1和/或所述蛋白質(zhì)表達(dá)量數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)2。

上述A和/或B的系統(tǒng)中，所述檢測c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1這六種蛋白質(zhì)表達(dá)量的系統(tǒng)可包括通過免疫組織化學(xué)染色方法測定所述六種蛋白質(zhì)的表達(dá)量所需的試劑和/或儀器。

上述預(yù)測肺腺癌患者預(yù)后的系統(tǒng)和/或預(yù)測肺腺癌患者是否受益于輔助化療的系統(tǒng)中，所述六種蛋白質(zhì)均來自于人(Homo sapiens)。

上述預(yù)測肺腺癌患者預(yù)后的系統(tǒng)和/或預(yù)測肺腺癌患者是否受益于輔助化療的系統(tǒng)中，所述肺腺癌患者為經(jīng)手術(shù)切除肺腺癌組織的肺腺癌患者。

上述A和/或B的系統(tǒng)中，檢測上述六種蛋白質(zhì)的表達(dá)量的系統(tǒng)具體可為免疫組織化學(xué)染色方法測定上述六種蛋白質(zhì)的表達(dá)量所需的試劑和/或儀器，如c-Src的單克隆抗體或多克隆抗體、Cyclin E1的單克隆抗體或多克隆抗體、TTF1的單克隆抗體或多克隆抗體、p65的單克隆抗體或多克隆抗體、CHK1的單克隆抗體或多克隆抗體和JNK1的單克隆抗體或多克隆抗體。

上述預(yù)測肺腺癌患者是否受益于輔助化療的系統(tǒng)中的肺腺癌患者可處于TNM分期的I-III期中的任一時期。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了Z1和/或Z2的方法：

Z1、預(yù)測肺腺癌患者預(yù)后的方法，包括：C、檢測來自待預(yù)測肺腺癌患者的分離的肺腺癌組織樣本的c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1這六種蛋白質(zhì)表達(dá)量；D、將所述六種蛋白質(zhì)表達(dá)量轉(zhuǎn)換為所述待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后分值，根據(jù)所述待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后分值預(yù)測所述待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后；

Z2、預(yù)測肺腺癌患者是否受益于輔助化療的方法，包括：C、檢測來自待預(yù)測肺腺癌患者的分離的肺腺癌組織樣本的c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1這六種蛋白質(zhì)表達(dá)量；D、將所述六種蛋白質(zhì)表達(dá)量轉(zhuǎn)換為所述待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后分值，根據(jù)所述待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后分值預(yù)測所述待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后；E、將D中預(yù)后不良的所述待預(yù)測肺腺癌患者預(yù)測為受益于輔助化療的患者，將D中預(yù)后良好的所述待預(yù)測肺腺癌患者預(yù)測為非受益于輔助化療的患者。

上述方法中，預(yù)后分值也可以通過“組合分子標(biāo)志物篩選及模型構(gòu)建軟件”(軟件著作權(quán)登記號為2014SR142190)獲得。

上述方法中，所述六種蛋白質(zhì)表達(dá)量可根據(jù)免疫組織化學(xué)染色方法獲得。

上述方法中，所述分離的肺腺癌組織樣本可來自所述待預(yù)測肺腺癌患者的分離的肺腺癌組織經(jīng)過福爾馬林固定石蠟包埋制備的樣本或來自所述待預(yù)測肺腺癌患者的分離的肺腺癌組織的冰凍切片。

上述方法中，所述六種蛋白質(zhì)表達(dá)量轉(zhuǎn)換為所述待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后分值的方法可包括將所述六種蛋白質(zhì)表達(dá)量轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)表達(dá)量向量，將所述蛋白質(zhì)表達(dá)量向量代入公式1得到f(v)，將f(v)代入公式2，得到所述待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后分值；

所述公式1為：

所述公式1中，v是蛋白質(zhì)表達(dá)量向量，簡稱向量，sv_coef(i)是支持向量的系數(shù)，SV(i)是支持向量；

所述公式2為：

所述公式2中，prob(v)為待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后分值。

所述蛋白質(zhì)表達(dá)量向量以v表示，v＝(x_CHK1,x_{Cyclin E1},x_JNK1,x_p65,x_c-SRC,x_TTF1)。

上述方法中，根據(jù)所述待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后分值預(yù)測所述待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后可為通過受試者工作特征曲線(ROC曲線)確定診斷閾值，比較所述待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后分值和所述診斷閾值的大小，如果所述待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后分值小于或等于所述診斷閾值，所述待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后不良，如果所述待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后分值大于所述診斷閾值，所述待預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后良好。

預(yù)后判斷也可通過“非小細(xì)胞肺癌預(yù)后判斷軟件”(軟件著作權(quán)登記號為2014SR157070)獲得。

所述通過受試者工作特征曲線確定診斷閾值是以具有統(tǒng)計學(xué)意義數(shù)量的正常肺組織中所述六種蛋白質(zhì)表達(dá)量為對照，根據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)意義數(shù)量的肺腺癌組織中所述六種蛋白質(zhì)表達(dá)量和相應(yīng)的肺腺癌患者分組信息制作受試者工作特征曲線，ROC曲線上的最優(yōu)值為閾值；所述分組信息是肺腺癌患者從手術(shù)切除肺腺癌組織開始存活的時間，3年以上(大于等于3年)為一組，不足3年(小于3年)為一組；所述最優(yōu)值是在特異性最大的基礎(chǔ)上敏感性盡可能地大。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了D1-D4中至少一種中的應(yīng)用：

D1)c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1六種蛋白質(zhì)作為標(biāo)志物在預(yù)測肺腺癌患者預(yù)后中的應(yīng)用；

D2)c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1六種蛋白質(zhì)作為標(biāo)志物在制備預(yù)測肺腺癌患者預(yù)后的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

D3)c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1六種蛋白質(zhì)作為標(biāo)志物在預(yù)測肺腺癌患者是否受益于輔助化療中的應(yīng)用；

D4)c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1六種蛋白質(zhì)作為標(biāo)志物在制備預(yù)測肺腺癌患者是否受益于輔助化療的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生肺腺癌相關(guān)蛋白質(zhì)特征譜的方法，包括檢測來自TNM I-III期肺腺癌患者的分離的肺腺癌組織樣本中c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1六種蛋白質(zhì)表達(dá)量的步驟。

本申請中所述肺腺癌患者可為TNM I-III期肺腺癌患者。進(jìn)一步，本申請中所述肺腺癌患者具體可為TNM IB-IIIA期肺腺癌患者。

本申請中所述預(yù)后不良是從手術(shù)切除肺腺癌組織時間開始存活時間不足3年，所述預(yù)后良好是從手術(shù)切除肺腺癌組織時間開始存活時間為3年及3年以上。

本申請中所述待預(yù)測肺腺癌患者的分離的肺腺癌組織可為手術(shù)切除的肺腺癌組織。

本申請中所述c-Src在NCBI的記錄名(RecName)為SRC原癌基因非受體酪氨酸蛋白激酶(SRC Proto-Oncogene,Non-Receptor Tyrosine Kinase)；所述TTF1在NCBI的記錄名(RecName)為甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1(Thyroid Transcription Factor 1)；所述Cyclin E1在NCBI的記錄名(RecName)為G1/S-特異細(xì)胞周期蛋白E1(G1/S-specific cyclin-E1)；所述p65在NCBI的記錄名(RecName)為禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒癌基因同源物A(V-Rel Avian Reticuloendotheliosis Viral Oncogene Homolog A)；所述CHK1在NCBI的記錄名(RecName)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)蛋白激酶1(Checkpoint Kinase1)；所述JNK1在NCBI的記錄名(RecName)為絲裂原活化蛋白激酶8(Mitogen-activated protein kinase 8)。

本發(fā)明中，肺腫瘤組織樣本中北京大學(xué)人民醫(yī)院有121腺癌患者病例滿足樣本入選標(biāo)準(zhǔn)，將其作為北京腺癌樣本群，將北京腺癌樣本群命名為BJ腺癌群。在BJ腺癌群中隨機(jī)選擇三分之二的樣本(80例)作為腺癌訓(xùn)練組，另三分之一的樣本(41例)作為腺癌測試組。肺腫瘤組織樣本中重慶西南醫(yī)院有72名腺癌患者病例符合樣本入選標(biāo)準(zhǔn)，將其作為重慶獨(dú)立驗(yàn)證腺癌樣本群，將重慶獨(dú)立驗(yàn)證腺癌樣本群命名為CQ腺癌群。通過對腺癌訓(xùn)練組樣本的組織微陣列(TMA)進(jìn)行免疫組化(IHC)染色，我們分析了75個在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用的信號蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。通過隨機(jī)森林算法和支持向量機(jī)算法的結(jié)合，得到了肺腺癌(ADC)相關(guān)蛋白質(zhì)的特征譜并開發(fā)出分類模型，即6-蛋白質(zhì)模型。然后用腺癌測試組樣本和CQ腺癌群對P6-ADC預(yù)后腺癌方法進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

結(jié)果表明，由六個蛋白質(zhì)c-SRC,Cyclin E1,TTF1,p65,CHK1和JNK1組成的P6-ADC成套蛋白質(zhì)為準(zhǔn)確預(yù)測肺腺癌的蛋白質(zhì)特征譜。在腺癌測試組中，預(yù)后良好組患者的3年生存率為96.0％(置信區(qū)間為74.8％-99.4％)，而預(yù)后不良組患者的3年生存率為37.5％(置信區(qū)間為15.4％-59.8％)，預(yù)后良好組和預(yù)后不良組間風(fēng)險比為7.67(置信區(qū)間為3.96-39.34)；在CQ腺癌群，預(yù)后良好組患者的3年生存率為97.3％(置信區(qū)間為82.3％-99.6％)，而預(yù)后不良組患者的3年生存率為42.9％(置信區(qū)間為26.4％-53.3％)，兩組間風(fēng)險比為2.81(置信區(qū)間為1.65-6.05)。Cox回歸分析表明，腺癌相關(guān)蛋白質(zhì)的特征譜的效能優(yōu)于TNM分級系統(tǒng)并可作為獨(dú)立的預(yù)后因子。

結(jié)果還表明，P6-ADC預(yù)后腺癌方法可準(zhǔn)確預(yù)測肺腺癌的臨床預(yù)后情況，顯著提高了肺腺癌患者的預(yù)后預(yù)測水平；P6-ADC預(yù)后腺癌方法還對TMN分級的腺癌患者進(jìn)一步預(yù)后；同時P6-ADC預(yù)后腺癌方法還能區(qū)分受益于輔助化療的腺癌患者，只有TMN IB期/Ⅱ期患者/ⅢA期患者中的預(yù)后不良組能從輔助化療中受益，因此P6-ADC預(yù)后腺癌方法可用于指導(dǎo)可進(jìn)行化療的患者，使不受益者免于化療，避免過度治療。

附圖說明

圖1為P6-ADC預(yù)后腺癌方法的確立和效能驗(yàn)證。

其中A為腺癌訓(xùn)練組的ROC曲線；B為腺癌訓(xùn)練組的預(yù)后；C為腺癌測試組的預(yù)后；D為BJ腺癌群的預(yù)后分值分布、預(yù)后預(yù)測結(jié)果、腺癌特征譜及患者試劑生存狀態(tài)總圖；E為CQ腺癌群的預(yù)后；F為CQ腺癌群的預(yù)后分值分布、預(yù)后預(yù)測結(jié)果、腺癌特征譜及患者試劑生存狀態(tài)總圖。

圖2為P6-ADC預(yù)后腺癌方法對臨床TMN分級的腺癌患者的預(yù)后。

其中A為TMN ⅠB期腺癌患者的預(yù)后；B為TMN Ⅱ期腺癌患者的預(yù)后；C為TMN ⅢA期腺癌患者的預(yù)后。

圖3為P6-ADC預(yù)后腺癌方法的化療獲益分類。

其中A為TMN IB期&Ⅱ期&ⅢA期腺癌患者預(yù)后不良組輔助化療與否的生存分析；B為TMN IB期&Ⅱ期&ⅢA腺癌患者預(yù)后良好組輔助化療與否的生存分析。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中所涉及的名詞解釋：

預(yù)后良好：從手術(shù)切除腫瘤時開始，患者生存時間超過3年。

預(yù)后不良：從手術(shù)切除腫瘤時開始，患者在3年內(nèi)死亡。

總生存期(OS)：從接受肺癌根治性外科手術(shù)到任何原因造成的死亡或最近一次隨訪之間的時間段。

總體生存率：一個群體特定時間點(diǎn)時的存活率。

受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，簡稱ROC曲線)：是根據(jù)一系列不同的二分類方式(分界值或決定閾)，以靈敏度(真陽性率)為縱坐標(biāo)，1-特異性(真陰性率)為橫坐標(biāo)繪制的曲線。ROC曲線下面積是重要的試驗(yàn)準(zhǔn)確度指標(biāo)，ROC曲線下面積越大，試驗(yàn)的診斷價值越大。

靈敏度(真陽性率)：實(shí)際有病而按試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)被正確判斷為有病的百分率，靈敏度越大越好，理想靈敏度為100％。

1-特異性(真陰性率)：實(shí)際無病而按試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)被正確判斷為無病的百分率，特異性越大越好，理想特異度為100％。

實(shí)施例1、腺癌相關(guān)蛋白質(zhì)特征譜的發(fā)現(xiàn)、組合分子標(biāo)志物模型、非小細(xì)胞肺癌預(yù)后判斷、P6-ADC預(yù)后腺癌方法及有效性的驗(yàn)證

1、腺癌相關(guān)蛋白質(zhì)特征譜的發(fā)現(xiàn)

1.1、病例及樣品

所述福爾馬林固定和石蠟包埋的人正常肺組織樣本，由北京大學(xué)人民醫(yī)院和西南醫(yī)院組織庫提供。所述福爾馬林固定和石蠟包埋的肺腫瘤組織樣本，由北京大學(xué)人民醫(yī)院病理科和重慶西南醫(yī)院病理科的組織庫提供。肺腫瘤組織的提供者(即患者)在2004年到2010年期間在上述醫(yī)院接受了肺癌根治性外科手術(shù)并有系統(tǒng)的。本發(fā)明不包括以下情況的病例：既往有惡性腫瘤的病例、在手術(shù)前接受過其他手段治療的病例、手術(shù)不完全切除的病例、接受過表皮生長因子(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑治療的病例、小細(xì)胞肺癌的病例、存在被國際肺癌研究協(xié)會(IASIC)標(biāo)準(zhǔn)定義的浸潤性癌前病變的病例以及那些術(shù)后30天內(nèi)死亡的病例。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WTO)采用的組織病理學(xué)分類系統(tǒng)，所有病例經(jīng)蘇木精-伊紅(H&E)染色的病理切片，都再次進(jìn)行集中審查，并確認(rèn)腫瘤類型、組織學(xué)分級以及腫瘤轉(zhuǎn)移程度。臨床及隨訪信息來自于醫(yī)院的前瞻性病例數(shù)據(jù)庫。

肺腫瘤組織樣本中北京大學(xué)人民醫(yī)院有121名腺癌患者病例滿足樣本入選標(biāo)準(zhǔn)，將其作為北京腺癌樣本群，將北京腺癌樣本群命名為BJ腺癌群。在BJ腺癌群中隨機(jī)選擇三分之二的樣本(80例)作為腺癌訓(xùn)練組，另三分之一的樣本(41例)作為腺癌測試組。肺腫瘤組織樣本中重慶西南醫(yī)院有72名腺癌患者病例符合樣本入選標(biāo)準(zhǔn)，將其作為重慶獨(dú)立驗(yàn)證腺癌樣本群，將重慶獨(dú)立驗(yàn)證腺癌樣本群命名為CQ腺癌群。

1.2、制備組織芯片

將腺癌訓(xùn)練組的石蠟包埋肺腫瘤組織樣本逐一做切片，H&E染色做形態(tài)學(xué)觀察，將病變的典型位置標(biāo)記出來作為穿刺點(diǎn)，然后用環(huán)鉆裝置穿刺肺腫瘤組織蠟塊(直徑2毫米)得到肺腫瘤組織蠟芯。

將石蠟包埋的人正常肺組織樣本做切片，H&E染色標(biāo)記出作為穿刺點(diǎn)，然后用環(huán)鉆裝置穿刺正常肺組織蠟塊(直徑2毫米)得到正常肺組織蠟芯。

將上述肺腫瘤組織蠟芯和正常肺組織蠟芯一一配對，轉(zhuǎn)移至受體蠟塊的陣列中排列，得到組織芯片。

每個受體蠟塊包含一張組織芯片，每張組織芯片包含30個腺癌病例。

1.3、免疫組化染色及化學(xué)評分

將上述1.2制備的組織芯片進(jìn)行免疫組化染色，具體步驟為：A：烘片、脫蠟與洗片：將組織陣列蠟塊連續(xù)切成4微米厚切片并固定在載玻片上，載玻片經(jīng)過2小時60℃烘烤后，通過二甲苯、梯度乙醇和水依次進(jìn)行有序浸泡、脫蠟，PBS(pH7.4)洗片3次，每次3min；B：抗原恢復(fù)：將切片95℃進(jìn)行抗原修復(fù)15min；C：加入3％過氧化氫室溫處理30min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；D：加入10％正常山羊血清封閉非特異蛋白質(zhì)，切片在4℃與75種抗體孵育過夜；E：按照ABC試劑盒(Vector Laboratories公司產(chǎn)品)步驟進(jìn)行增強(qiáng)處理、加入二抗以及DAB顯色；F：蘇木精染色，切片沖洗干凈并封片。

免疫組化分析時使用的部分抗體為：抗c-Src的抗體(兔源單抗、出售公司CST、產(chǎn)品號#2109)、抗Cyclin E1的抗體(兔源多抗、出售公司Abnova、產(chǎn)品號PAB4852)、抗TTF1的抗體(兔源單抗、出售公司Epitomics、產(chǎn)品號#5883-1)、抗p65的抗體(兔源單抗、出售公司Epitomics、產(chǎn)品號#1546-1)、抗CHK1的抗體(鼠源單抗、出售公司CST、產(chǎn)品號#2360)和抗JNK1的抗體(鼠源單抗、出售公司BD、產(chǎn)品號51-1570GR)。

免疫組化染色評價采用改良型免疫組織化學(xué)評分(組織病理染色評分)系統(tǒng)進(jìn)行。該系統(tǒng)通過對病理切片的染色強(qiáng)度以及陽性細(xì)胞的百分比定量賦分后進(jìn)行評估，其中依據(jù)染色強(qiáng)度可定義為0分、1分、2分、3分，分別對應(yīng)于染色陰性、染色弱陽、染色中陽及染色強(qiáng)陽；同時，統(tǒng)計每個強(qiáng)度陽性細(xì)胞的百分比。所有的免疫組化染色切片均經(jīng)3位專業(yè)的病理學(xué)家平行評估，且事先不了解患者的臨床信息。若3位病理學(xué)家對切片的解讀有分歧，3位病理學(xué)家將一起對該切片重新評估，直到達(dá)成共識?；瘜W(xué)評分計算公式為：每種蛋白質(zhì)的表達(dá)分值＝1×弱陽性百分率+2×中陽性百分率+3×強(qiáng)陽性百分率。

1.4、蛋白質(zhì)表達(dá)譜的數(shù)據(jù)處理

蛋白質(zhì)特征譜的數(shù)據(jù)處理：根據(jù)上述1.3的方法逐一評估每個蛋白質(zhì)的表達(dá)分值，將表達(dá)分值首先歸一化處理，缺失值被所有腫瘤中該蛋白質(zhì)表達(dá)的中間值替代，然后計算出每個蛋白質(zhì)的分值和腺癌訓(xùn)練組的該蛋白質(zhì)平均值的表達(dá)比，之后表達(dá)水平以表達(dá)比的log₁₀(表達(dá)比)量化。為了避免對數(shù)中0的出現(xiàn)，所有分?jǐn)?shù)都加上0.01。

1.5、腺癌相關(guān)蛋白質(zhì)的特征譜

將腺癌訓(xùn)練組應(yīng)用隨機(jī)森林算法得到各個蛋白質(zhì)的重要性指標(biāo)。使用袋外數(shù)據(jù)[out-of-bag(OOB)]誤差最小化準(zhǔn)則，依次消減最不重要的蛋白質(zhì)，較小OOB誤差的若干蛋白質(zhì)即作為肺腺癌相關(guān)蛋白質(zhì)的特征譜。上述過程是通過在隨機(jī)森林軟件包上使用R varSelRF包程序?qū)崿F(xiàn)的。

支持向量機(jī)(SVM)是用來開發(fā)帶特征譜的訓(xùn)練組的分類模型。選擇徑向基函數(shù)(RBF)內(nèi)核進(jìn)行SVM訓(xùn)練，因?yàn)楫?dāng)類特征譜與屬性之間非線性時，通過非線性映射樣品到高維空間，內(nèi)核可以處理這些情況。RBF內(nèi)核的兩個參數(shù)C和γ都可以使用網(wǎng)格搜索策略進(jìn)行調(diào)諧。分類模型經(jīng)SVM的最優(yōu)C和γ訓(xùn)練而成。在訓(xùn)練階段，SVM的性能通過5倍交叉驗(yàn)證精度進(jìn)行評估。

1.6、統(tǒng)計分析

由于患者的死因難以完全準(zhǔn)確定義，使用特定的生存點(diǎn)作為生存終點(diǎn)可能帶來潛在偏離，因此我們以從手術(shù)切除腫瘤時間開始的總生存作為我們主要的分析事件。用Kaplan-Meier分析患者總體生存率。用雙側(cè)對數(shù)秩(two-sided log-rank)檢驗(yàn)分析預(yù)后良好患者的生存時間、預(yù)后不良患者的生存時間以及輔助化療的效能。相關(guān)的變量，包括腺癌相關(guān)蛋白質(zhì)的特征譜確定、患者年齡、吸煙指數(shù)、組織學(xué)類型、腫瘤大小和疾病階段等，都通過單變量和多變量Cox比例風(fēng)險分析的結(jié)果進(jìn)行比較。Wald似然比(Wald likelihood ratio)檢驗(yàn)應(yīng)用于檢驗(yàn)單變量和多變量分析，以評估是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。Cox比例風(fēng)險分析和雙側(cè)對數(shù)秩檢驗(yàn)同時也用于比較是否接受輔助性化療的患者之間的總體生存率。所有的統(tǒng)計測試，以預(yù)設(shè)的雙側(cè)α小于0.05視為有統(tǒng)計學(xué)意義。上述分析都是在R編程語言(3.0.2版本)下完成。

根據(jù)上述1.1—1.6的方法，本發(fā)明以腺癌訓(xùn)練組為樣本，通過檢測與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的75個信號蛋白質(zhì)的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)肺腺癌相關(guān)蛋白質(zhì)的特征譜。肺腺癌相關(guān)蛋白質(zhì)的特征譜包括六種蛋白質(zhì)，六種蛋白質(zhì)的名稱分別為c-Src，Cyclin E1，TTF1，p65，CHK1和JNK1。肺腺癌相關(guān)蛋白質(zhì)的特征譜以下簡稱腺癌特征譜。將這六種蛋白質(zhì)c-Src，Cyclin E1，TTF1，p65，CHK1和JNK1組成的成套蛋白質(zhì)命名為P6-ADC。

2、組合分子標(biāo)志物模型和非小細(xì)胞肺癌預(yù)后判斷

2.1、組合分子標(biāo)志物模型

將發(fā)現(xiàn)的肺腺癌特征譜采用支持向量機(jī)算法開發(fā)分類模型，該模型全稱為組合分子標(biāo)志物模型，簡稱為6-蛋白質(zhì)模型。再對每個患者的預(yù)后評分進(jìn)行計算，預(yù)后分值代表了6-蛋白質(zhì)模型中每個蛋白質(zhì)的綜合信息。

上述6-蛋白質(zhì)模型可以十分簡單明確的應(yīng)用于臨床。6-蛋白質(zhì)模型的使用方法為：⑴對于每個肺腺癌患者使用免疫組化的方法檢測6個標(biāo)志物蛋白質(zhì)的表達(dá)分值；⑵6個蛋白質(zhì)分子的表達(dá)水平采用下列公式進(jìn)行歸一化：

f_s(x)＝-1+2·(x-lower)/(upper-lower)；

公式中x是質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)化后蛋白質(zhì)分子的表達(dá)水平，每個蛋白質(zhì)對應(yīng)的Upper(上限)和Lower(下限)在表1中列出；

表1.腺癌標(biāo)志物蛋白質(zhì)分子歸一化系數(shù)

⑶得到6個蛋白質(zhì)分子歸一化的表達(dá)量后，每個患者可以表示為由該6個蛋白質(zhì)分子組成的蛋白質(zhì)分子向量v：

v＝(x_CHK1,x_{Cyclin E1},x_JNK1,x_p65,x_c-SRC,x_TTF1)

⑷將患者蛋白質(zhì)分子向量v代入下列公式計算f(v)：

其中，sv_coef(i)是支持向量的系數(shù)，SV(i)是支持向量(表2)；

表2.組合分子標(biāo)志物模型中的支持向量和系數(shù)

⑸將f(v)代入下列公式計算該患者的預(yù)后分值：

2.2、非小細(xì)胞肺癌預(yù)后判斷

閾值的獲得：腺癌特征譜的性能由receiver-operating characteristic(ROC)分析進(jìn)行評估。以正常肺組織中P6-ADC的表達(dá)分值為對照，根據(jù)腺癌訓(xùn)練組每個患者的P6-ADC的表達(dá)分值和患者的分組信息(分組信息是指患者從手術(shù)切除時間開始存活的時間，3年以上為一組，3年以下為一組；見表3)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行ROC曲線分析。腺癌訓(xùn)練組腺癌特征譜ROC曲線下的面積(AUC)是0.967，表明在腺癌訓(xùn)練組中該腺癌特征譜可以準(zhǔn)確的對預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(圖1中A)。ROC曲線上的最優(yōu)值即為閾值，綜合考慮敏感性和特異性，是指在特異性最大的基礎(chǔ)上靈敏度盡可能地大?；谶@個方法，腺癌訓(xùn)練組ROC曲線的最優(yōu)值為0.71，即閾值為0.71。在腺癌訓(xùn)練組的這一節(jié)點(diǎn)上，肺腺癌特征譜顯示出96.6％的靈敏度和76.2％的1-特異性，91.9％的陽性預(yù)測值和患者3年內(nèi)死亡的總體精度為91.3％。

表3.腺癌訓(xùn)練組肺腺癌相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)分值和分組信息

注：“NA”表示無法得到數(shù)值。

將步驟2.1得到的預(yù)后分值和閾值經(jīng)比較分析后，得到預(yù)后良好或預(yù)后不良。比較分析結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下：如果所述待測腺癌患者的預(yù)后分值小于或等于閾值(即預(yù)后分值小于等于0.71)，則判定該腺癌患者預(yù)后不良；若預(yù)后分值大于閾值(即預(yù)后分值大于0.71)，則判定該腺癌患者預(yù)后良好。

3、P6-ADC預(yù)后腺癌方法

a、以待測腺癌患者的肺腫瘤組織為檢測樣本，按照上述步驟1中所述方法進(jìn)行免疫組化染色和化學(xué)評分，得到P6-ADC的表達(dá)分值；

b、按照步驟2.1的方法，得到預(yù)后分值；

c、將上述步驟b得到的預(yù)后分值按照步驟2.2的方法，得到預(yù)后良好或預(yù)后不良。

Kaplan-Meier生存分析顯示在腺癌訓(xùn)練組中預(yù)后良好組3年總體生存率為91.9％(置信區(qū)間為81.7％-96.6％)，而預(yù)后不良組總體生存率為11.1％(置信區(qū)間為1.9％-29.8％)(P<0.0001，圖1中B)。

4、P6-ADC預(yù)后腺癌方法有效性的驗(yàn)證

4.1、以腺癌測試組為樣本，對步驟3中P6-ADC預(yù)后腺癌方法的有效性進(jìn)行驗(yàn)證。

4.2、以CQ腺癌群為樣本，對步驟3中P6-ADC預(yù)后腺癌方法的有效性進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證。與上述4.1不同的是，進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)譜的數(shù)據(jù)處理時，只保留不超過2個缺失蛋白質(zhì)讀值的患者，對逐一評估CQ腺癌群中腺癌相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)分值，將表達(dá)分值用腺癌訓(xùn)練組和腺癌測試組程序進(jìn)行歸一化處理，缺失值由BJ腺癌群中該蛋白質(zhì)表達(dá)的中值替代，然后計算出每個蛋白質(zhì)的分值和CQ腺癌群的該蛋白質(zhì)平均值的表達(dá)比，之后表達(dá)水平以表達(dá)比的log₁₀(表達(dá)比)量化。為了避免對數(shù)中0的出現(xiàn)，所有分?jǐn)?shù)都加上0.01。

Kaplan-Meier生存分析結(jié)果表明，腺癌測試組中預(yù)后良好組3年存活率達(dá)96％(置信區(qū)間為74.8％-99.4％)，而預(yù)后不良組為37.5％(置信區(qū)間為15.4％-59.8％)，預(yù)后良好組和預(yù)后不良組間風(fēng)險比為7.67(置信區(qū)間為3.96-39.34)(P<0.0001,圖1中C)；CQ腺癌群中在預(yù)后良好組3年存活率達(dá)97.3％(置信區(qū)間為82.3％-99.6％)，預(yù)后不良組3年存活率達(dá)42.9％(置信區(qū)間為26.4％-53.3％)，兩者間風(fēng)險比為2.81，置信區(qū)間為1.65-6.05(P<0.0001，圖1中E)。

將BJ腺癌群的預(yù)后分值分布、預(yù)后預(yù)測結(jié)果、腺癌特征譜以及患者的實(shí)際生存狀態(tài)進(jìn)行總結(jié)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1中D。預(yù)后分值與患者3年生存率的比較結(jié)果顯示，腺癌特征譜可以預(yù)測患者的預(yù)后情況。預(yù)后方法對其中高預(yù)后分值的32％患者和低預(yù)后分值的15％患者的預(yù)測準(zhǔn)確程度為100％。

CQ腺癌群的預(yù)后評分分布、預(yù)后預(yù)測結(jié)果、腺癌特征譜以及患者的實(shí)際生存狀態(tài)都與BJ腺癌群的相似(圖1中F)。進(jìn)一步證實(shí)步驟3的預(yù)后方法對腺癌患者預(yù)后預(yù)測的有效性。

為了進(jìn)一步分析腺癌特征譜能否作為一個獨(dú)立的預(yù)后因子，我們用單變量和多變量Cox回歸分析對模型和現(xiàn)有臨床風(fēng)險因子(包括病例分級、年齡、吸煙和組織學(xué)等)的預(yù)后價值進(jìn)行比較。單變量分析結(jié)果顯示，雖然該腺癌特征譜和臨床分級區(qū)分患者的預(yù)后均具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，但對3年總體生存率預(yù)測來說，腺癌特征譜是一個相對更好的預(yù)后因子；多變量回歸分析顯示，在消除了病例分級、年齡、腫瘤大小和吸煙因素后，腺癌特征譜仍可作為一個獨(dú)立的的預(yù)后因子(表5)。

表5.肺腺癌模型在重慶樣本群中的Cox比例風(fēng)險分析

注：^*預(yù)后不良組與預(yù)后良好組比較；⁺作為連續(xù)變量

實(shí)施例2、P6-ADC預(yù)后腺癌方法對TNM分級的腺癌患者的進(jìn)一步預(yù)后

對TNM分級的腺癌患者的進(jìn)一步預(yù)后的方法為：對經(jīng)TNM分級的任何級別的腺癌患者(如IB期腺癌的患者)，按照實(shí)施例1的方法獲得P6-ADC的表達(dá)分值，然后將該表達(dá)分值按照實(shí)施例1步驟2.1的方法，得到預(yù)后分值；將各預(yù)后分值按照實(shí)施例1步驟2.2的方法，判定該腺癌患者預(yù)后良好或預(yù)后不良。

將BJ群和CQ群的樣本整合得到總腺癌樣本，P6-ADC預(yù)后腺癌方法能將總腺癌樣本中的每個患者在TNM分級基礎(chǔ)上進(jìn)一步分成預(yù)后不良組或預(yù)后良好組(IB期P<0.0001；II期P＝0.0001；IIIA期P＝0.0008)(圖2)。結(jié)果表明，P6-ADC預(yù)后腺癌方法可在TNM分級基礎(chǔ)上，對腺癌患者進(jìn)一步進(jìn)行預(yù)后。

實(shí)施例3、P6-ADC預(yù)后腺癌方法預(yù)測肺腺癌患者是否受益于輔助化療

根據(jù)美國臨床腫瘤學(xué)會(ASCO)發(fā)布的指南，非小細(xì)胞肺癌IB期或II期或IIIA期患者推薦術(shù)后輔助化療，然而數(shù)據(jù)顯示只有極少比例的患者可從化療中獲益。

實(shí)驗(yàn)表明，P6-ADC預(yù)后腺癌方法有助于識別出那些能真正受益于輔助化療的TNM IB期和TNM II期和IIIA期患者。在預(yù)后不良組中，輔助化療能明顯提高總體生存率(風(fēng)險比為0.51，置信區(qū)間為0.24-0.86；P＝0.018；圖3中A)。P6-ADC預(yù)后腺癌方法預(yù)后良好組中，輔助化療并未對延長預(yù)后有任何顯著的作用(風(fēng)險比為0.99，置信區(qū)間為0.40-2.46；P＝0.987；圖3中B)；。

預(yù)測TNM IB期或TNM II期或IIIA期肺腺癌患者是否受益于輔助化療的方法為：按照實(shí)施例1中的方法獲得TNM IB期或TNM II期或TNM IIIA期腺癌患者P6-ADC的表達(dá)分值，然后將該表達(dá)分值按照實(shí)施例1步驟2.1的方法，得到預(yù)后分值；將各預(yù)后分值按照實(shí)施例1步驟2.2的方法，判定該腺癌患者預(yù)后良好或預(yù)后不良。預(yù)后不良組受益于輔助化療，預(yù)后良好組則不能從輔助化療中受益。