含乳飲料中γ-氨基丁酸和16種蛋白水解氨基酸同時(shí)檢測的專用高精度高效液相色譜方法技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬于氨基酸檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體為含乳飲料中γ-氨基丁酸和16種蛋白水解氨基酸同時(shí)檢測的高效液相色譜方法。

背景技術(shù)：
γ-氨基丁酸（GABA）是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸,是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性傳遞物質(zhì)，是腦組織中最重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一。它能夠結(jié)合抗焦慮的腦受體并使之激活，然后與另外一些物質(zhì)協(xié)同作用，阻止與焦慮相關(guān)的信息抵達(dá)腦中樞，能夠降低神經(jīng)元活性，舒緩人們的不安、壓力、疲倦、憂慮等狀況。2009年衛(wèi)生部批準(zhǔn)GABA為新資源食品，以L-谷氨酸為原料經(jīng)希氏乳桿菌發(fā)酵制成，可應(yīng)用于飲料及糖果、膨化食品等中。乳品作為人們普遍食用的消費(fèi)品之一，GABA與牛奶的結(jié)合，能夠使人們很好地在補(bǔ)充日常營養(yǎng)所需的同時(shí)緩解壓力、減少不安。針對γ-氨基丁酸，現(xiàn)行輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T4587-2013《γ-氨基丁酸》的規(guī)范性附錄中提供了γ-氨基丁酸含量檢測方法；張暉等（2003）采用OPA柱前自動(dòng)衍生測定了米胚芽中的γ-氨基丁酸；涂云飛等（2012）采用柱前衍生高效液相色譜法測定茶葉中的γ-氨基丁酸；胡雪蓮等（2015）采用高效液相色譜法測定了黑莓果汁及黑莓啤酒中的γ-氨基丁酸。針對氨基酸檢測，現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》，用于測定食品中16種氨基酸，但是采用全自動(dòng)氨基酸分析儀。這些方法或是對米胚芽、茶葉、黑莓果汁和啤酒中的γ-氨基丁酸進(jìn)行檢測，或是對食品中16種氨基酸的檢測，對含乳飲料中γ-氨基丁酸和16種蛋白水解氨基酸同時(shí)檢測的快速準(zhǔn)確的分析檢測方法還鮮見報(bào)道。因此，開展含乳飲料中γ-氨基丁酸和16種蛋白水解氨基酸同時(shí)檢測方法的研究工作，對提高產(chǎn)品品質(zhì)、加強(qiáng)監(jiān)督具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種含乳飲料中γ-氨基丁酸和16種蛋白水解氨基酸同時(shí)檢測的專用高精度高效液相色譜方法，具有極高的靈敏度和優(yōu)越的穩(wěn)定性。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。含乳飲料中γ-氨基丁酸和16種蛋白水解氨基酸同時(shí)檢測的專用高精度高效液相色譜方法，設(shè)定樣品水解、衍生處理、上柱檢測三個(gè)操作步驟，然后針對含乳飲料的特性設(shè)定上述三操作步驟所使用的處理試劑及試劑用量及處理參數(shù)，使得上述三操作步驟的工藝參數(shù)相互嚴(yán)密配合，實(shí)現(xiàn)對含乳飲料中γ-氨基丁酸和16種蛋白水解氨基酸的一步式高精度檢測。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，該檢測方法包括如下步驟：A、制備含乳飲料水解樣品：取含乳飲料置于水解管中，加入鹽酸和苯酚后隨即冷凍處理，然后充入惰性氣體并擰緊水解管螺蓋，再將水解管放入恒溫干燥箱進(jìn)行充分水解，然后將水解液取出過濾，取濾液干燥蒸干，再次用鹽酸溶解并精濾到高效液相色譜的進(jìn)樣瓶中；B、水解樣品的自動(dòng)柱前衍生處理：在室溫條件下，吸收步驟A所得樣品并與和硼酸緩沖液、鄰苯二甲醛混勻，再吸取9-芴基甲基氯甲酸酯混勻，準(zhǔn)備上樣；C、高效液相色譜檢測γ-氨基丁酸和16種氨基酸的含量：高效液相色譜的分離條件為，色譜柱：通用的C18液相色譜柱；柱溫：40℃；流動(dòng)相A：純水中加入結(jié)晶乙酸鈉混勻，調(diào)pH調(diào)后加入四氫呋喃；流動(dòng)相B：純水中加入結(jié)晶乙酸鈉混勻，調(diào)pH后加入乙腈和甲醇混勻；梯度洗脫條件設(shè)定如下：序號時(shí)間(min)流動(dòng)相A%流動(dòng)相B%流速（mL/min）10.00100-900-100.8-1.1227.535-4555-650.8-1.1331.501001.3-1.643201001.3-1.653401000.8-1.1635.5100-900-100.8-1.1檢測條件設(shè)定如下：檢測器采用二極管陣列或紫外檢測器；0-25min，設(shè)定檢測波長338nm；25-32min，設(shè)定檢測波長262nm；32-35.5min，設(shè)定檢測波長338nm。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，該檢測方法包括如下步驟，下述步驟中涉及的重量份均以克為單位計(jì)算，涉及的體積份均以毫升為單位計(jì)算：A、制備含乳飲料水解樣品：取含乳飲料1重量份置于水解管中，加入濃鹽酸1-3體積份或加入6mol/L鹽酸10-15體積份，再加入新蒸餾的苯酚3-4滴，將水解管放入冷凍劑中，冷凍3min-5imn，充入高純氮?dú)獠⒃诔涞獨(dú)鉅顟B(tài)下擰緊螺蓋，將水解管放入109-111℃的恒溫干燥箱中，水解20-30小時(shí)后取出冷卻，打開水解管，將水解液全部過濾轉(zhuǎn)移到容量瓶中，取濾液1-2體積份用真空干燥器在40℃-50℃干燥，蒸干，用0.5-2體積份0.1mol/L的鹽酸溶解，然后采用0.2μm-0.8μm的濾膜過濾到高效液相色譜進(jìn)樣瓶中；B、水解樣品的自動(dòng)柱前衍生處理：在室溫條件下，吸收步驟A所得樣品0.5-2體積份，吸取硼酸緩沖液3-7體積份，吸取鄰苯二甲醛0.5-2體積份，混勻，再吸取9-芴基甲基氯甲酸酯0.5-2體積份，混勻，準(zhǔn)備上樣；C、高效液相色譜檢測γ-氨基丁酸和16種氨基酸的含量：高效液相色譜的分離條件為，色譜柱：通用的C18液相色譜柱；柱溫：40℃；流動(dòng)相A：1000體積份純水中加入4-8重量份結(jié)晶乙酸鈉，混勻，pH調(diào)為7.15-7.25，再加入3-5體積份四氫呋喃；流動(dòng)相B：400體積份純水中加入6-12重量份結(jié)晶乙酸鈉，混勻，pH調(diào)為7.15-7.25，再加入600-1000體積份乙腈和600-1000體積份甲醇，混勻；梯度洗脫條件設(shè)定如下：序號時(shí)間(min)流動(dòng)相A%流動(dòng)相B%流速（mL/min）10.00100-900-100.8-1.1227.535-4555-650.8-1.1331.501001.3-1.643201001.3-1.653401000.8-1.1635.5100-900-100.8-1.1檢測條件設(shè)定如下：檢測器采用二極管陣列或紫外檢測器；0-25min，設(shè)定檢測波長338nm；25-32min，設(shè)定檢測波長262nm；32-35.5min，設(shè)定檢測波長338nm。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，該檢測方法包括如下步驟，下述步驟中涉及的重量份均以克為單位計(jì)算，涉及的體積份均以毫升為單位計(jì)算：A、制備含乳飲料水解樣品：取含乳飲料1重量份置于水解管中，加入濃鹽酸2體積份或加入6mol/L鹽酸12體積份，再加入新蒸餾的苯酚3滴，將水解管放入冷凍劑中，冷凍4imn，充入高純氮?dú)獠⒃诔涞獨(dú)鉅顟B(tài)下擰緊螺蓋，將水解管放入110℃的恒溫干燥箱中，水解24小時(shí)后取出冷卻，打開水解管，將水解液全部過濾轉(zhuǎn)移到25mL容量瓶中，取濾液1.5體積份用真空干燥器在45℃干燥，蒸干，用1體積份0.1mol/L的鹽酸溶解，然后采用0.45μm的濾膜過濾到高效液相色譜進(jìn)樣瓶中；B、水解樣品的自動(dòng)柱前衍生處理：在室溫條件下，吸收步驟A所得樣品1體積份，吸取硼酸緩沖液5體積份，吸取鄰苯二甲醛1體積份，混勻，再吸取9-芴基甲基氯甲酸酯1體積份，混勻，準(zhǔn)備上樣；C、高效液相色譜檢測γ-氨基丁酸和16種氨基酸的含量：高效液相色譜的分離條件為，色譜柱：通用的C18液相色譜柱；柱溫：40℃；流動(dòng)相A：1000體積份純水中加入6重量份結(jié)晶乙酸鈉，混勻，pH調(diào)為7.15-7.25，再加入4體積份四氫呋喃；流動(dòng)相B：400體積份純水中加入9重量份結(jié)晶乙酸鈉，混勻，pH調(diào)為7.15-7.25，再加入800體積份乙腈和800體積份甲醇，混勻；梯度洗脫條件設(shè)定如下：序號時(shí)間(min)流動(dòng)相A%流動(dòng)相B%流速（mL/min）10.00100-900-100.8-1.1227.535-4555-650.8-1.1331.501001.3-1.643201001.3-1.653401000.8-1.1635.5100-900-100.8-1.1檢測條件設(shè)定如下：檢測器采用二極管陣列或紫外檢測器；0-25min，設(shè)定檢測波長338nm；25-32min，設(shè)定檢測波長262nm；32-35.5min，設(shè)定檢測波長338nm。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟C中所述的C18液相色譜柱選用XBridgeC18色譜柱、HypersilODSC18色譜柱。本發(fā)明檢測得到的γ-氨基丁酸和16種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸衍生物色譜圖，出峰順序依次為：（1）Asp，天門冬氨酸；（2）Glu，谷氨酸；（3）Ser，絲氨酸；（4）His，組氨酸；（5）Gly，甘氨酸；（6）Thr，蘇氨酸；（7）Arg，精氨酸；（8）Ala，丙氨酸；（9）GABA，γ-氨基丁酸；（10）Tyr，酪氨酸；（11）Val，纈氨酸；（12）Met，蛋氨酸；（13）Phe，苯丙氨酸；（14）Ile，異亮氨酸；（15）Leu，亮氨酸；（16）Lys，賴氨酸；（17）Pro，脯氨酸。采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于：本發(fā)明針對含乳飲料的特性研制了專用的處理試劑及試劑用量及處理參數(shù)，使得檢測步驟的工藝參數(shù)相互嚴(yán)密配合，實(shí)現(xiàn)了對含乳飲料中γ-氨基丁酸和16種蛋白水解氨基酸的一步式高靈敏度、高穩(wěn)定性的檢測，對提高乳制品產(chǎn)品品質(zhì)和加強(qiáng)監(jiān)督具有重要的實(shí)際意義。申請人針對本發(fā)明的檢測方法進(jìn)行了系列試驗(yàn)。參看附圖1、2（圖1是γ-氨基丁酸和16種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的分離譜圖；圖2是實(shí)施例1中含乳飲料中γ-氨基丁酸和16種蛋白水解氨基酸的分離譜圖），可見本發(fā)明的檢測方法能夠?qū)崿F(xiàn)對含乳飲料中γ-氨基丁酸和16種蛋白水解氨基酸的一步式同時(shí)檢測，分離圖譜十分清晰和可靠。同時(shí)，申請人的系列試驗(yàn)顯示本檢測方法穩(wěn)定性極高。利用其檢測含乳飲料中γ-氨基丁酸和16種蛋白水解氨基酸含量，檢測限為1.10pmol/μL-3.86pmol/μL，RSD分別為3.62%-8.51%和2.56%...