本實用新型涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種腫瘤活體檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
活體腫瘤成像技術(shù)是一種在活生物體，特別是在活動物體的腫瘤部位產(chǎn)生熒光信號，從而被相關(guān)熒光檢測儀器檢測到的一種技術(shù)?；铙w腫瘤成像在在體實驗和/或臨床研究中是非常重要的評價指標(biāo)。活體熒光成像是近年來發(fā)展起來的一種無損生物醫(yī)學(xué)成像方法。常規(guī)的動物活體熒光成像技術(shù)是在動物成瘤前，在移植瘤細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入能穩(wěn)定表達的熒光基因，該基因中細(xì)胞內(nèi)經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯表達出熒光蛋白，這種熒光蛋白在外界一定波長的熒光激發(fā)下產(chǎn)生特定的熒光。因此這種熒光成像技術(shù)只能用于活體動物研究。在動物體內(nèi)成瘤實驗前需對腫瘤細(xì)胞進行處理，轉(zhuǎn)染外源基因蛋白，并進行較長時間的篩選，獲得穩(wěn)定表達的細(xì)胞株亞群，隨后再種入動物體內(nèi)，進行活體觀察。這一預(yù)處理過程由于對腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)入外源基因，因此在一定程度上改變了該腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，不能反映該細(xì)胞的本來生物學(xué)功能特征，因此研究結(jié)果往往會有一定系統(tǒng)誤差。另外即使獲得穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)染表達熒光蛋白的腫瘤細(xì)胞，一旦接種到動物體內(nèi)后，由于失去了抗性篩選壓力，熒光蛋白表達也會出現(xiàn)丟失。而且丟失熒光蛋白的腫瘤細(xì)胞更加可能獲得生長優(yōu)勢，因此在一些需要較長時間觀察以及一些腫瘤轉(zhuǎn)移實驗中可能無法得到可靠的結(jié)果。另外通過熒光蛋白在細(xì)胞中表達的方法，需要激發(fā)光作用，而且所得到的信號強度較弱。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本實用新型要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有的動物腫瘤熒光成像需要在處理腫瘤細(xì)胞時進行轉(zhuǎn)染入熒光蛋白表達基因的復(fù)雜操作步驟，而對腫 瘤細(xì)胞生物學(xué)功能產(chǎn)生的干擾和影響，提供了一種腫瘤活體檢測試劑盒。本實用新型試劑盒在檢測活體腫瘤時不干預(yù)腫瘤細(xì)胞株，減少了復(fù)雜的對腫瘤細(xì)胞進行熒光基因轉(zhuǎn)染的操作步驟，避免了對腫瘤細(xì)胞本身生物學(xué)功能的影響，而且本實用新型檢測試劑盒所包括的與熒光化合物CY5.5偶聯(lián)的CXCR3抗體所產(chǎn)生的熒光信號較強，只在需要評價的時候進行給藥觀察，大大減少對結(jié)果的影響。
本實用新型是通過下述技術(shù)方案來解決上述技術(shù)問題：
一種腫瘤活體檢測試劑盒，其包括：盒蓋、盒體、襯墊、裝有與熒光化合物CY5.5偶聯(lián)的CXCR3抗體的容器、注射器和裝有抗體稀釋緩沖液的容器，所述襯墊設(shè)置于所述盒體內(nèi)，所述襯墊上設(shè)有容器孔和槽，所述裝有與熒光化合物CY5.5偶聯(lián)的CXCR3抗體的容器和所述裝有抗體稀釋緩沖液的容器置于所述容器孔內(nèi)，所述注射器置于所述槽內(nèi)。
所述熒光化合物CY5.5可以通過常規(guī)的方法與所述CXCR3抗體進行偶聯(lián)，如按照以下步驟進行偶聯(lián)：1)將CY5.5和NHS在DMF中，以1∶1.5的摩爾比混合，攪拌反應(yīng)3小時，溫度35℃，用薄層層析和LC-MS檢測反應(yīng)完全；2)加水稀釋10倍，HPLC分離純化，得到純度95％以上的NHS-CY5.5；3)將所得NHS-CY5.5凍干成粉末，溶于HEPES緩沖液；4)將CXCR3抗體和NHS-CY5.5在HEPES緩沖體系下，以1∶10的摩爾比，反應(yīng)6小時；5)在緩沖液中反復(fù)透析去除游離NHS-CY5.5，得與熒光化合物CY5.5偶聯(lián)的CXCR3抗體。
所述容器為本領(lǐng)域常規(guī)的容器，較佳地為塑料試劑瓶或離心管，更佳地為1.5mL離心管。所述容器孔的數(shù)量較佳地為一個到多個，更佳地為兩個。
所述抗體稀釋緩沖液可以為本領(lǐng)域常規(guī)的緩沖液，較佳地為生理鹽水或PBS緩沖液，更佳地為生理鹽水。
所述腫瘤活體檢測試劑盒較佳地還可以包括裝有細(xì)胞培養(yǎng)基的容器和裝有血清的容器。所述培養(yǎng)基較佳地為DMEM培養(yǎng)基。所述血清較佳地為胎牛血清。
所述腫瘤活體檢測試劑盒較佳地還可以包括一份使用說明書，所述使用說明書記載利用與熒光化合物CY5.5偶聯(lián)的CXCR3抗體對活體的腫瘤進行檢測的操作步驟。更佳地，所述操作步驟包括將所述與熒光化合物CY5.5偶聯(lián)的CXCR3抗體靜脈注射到荷瘤動物體內(nèi)，注射后1-48小時在小動物熒光成像儀中觀察熒光。
本實用新型的積極進步效果在于：本實用新型的檢測試劑盒可以用于靶向識別膽囊癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞或組織，使用方法簡單，在檢測活體腫瘤時不干預(yù)腫瘤細(xì)胞株，減少了復(fù)雜的對腫瘤細(xì)胞進行熒光基因轉(zhuǎn)染的操作步驟，避免了對腫瘤細(xì)胞本身生物學(xué)功能的影響，而且本實用新型檢測試劑盒所包括的與熒光化合物CY5.5偶聯(lián)的CXCR3抗體所產(chǎn)生的熒光信號較強，只在需要評價的時候進行給藥觀察，大大減少對結(jié)果的影響。
附圖說明
圖1為本實用新型實施例1中的腫瘤活體檢測試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為盒蓋，2為盒體，3為裝有與熒光化合物CY5.5偶聯(lián)的CXCR3抗體的容器，4為裝有生理鹽水的容器，5為襯墊，6為注射器。
具體實施方式
下面舉各較佳實施例，并結(jié)合附圖來更清楚完整地說明本實用新型。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。其中所述室溫為常規(guī)，若無特別說明為15～35℃。
CXCR3和CY5.5抗體購買自sigma公司；
5-6周齡裸鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司；肺癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、膽囊癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞購買自中科院上海生命科學(xué)研究院；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購買自Gibco公司；
小動物熒光成像儀購買自中科愷盛在體自發(fā)熒光分子影像系統(tǒng)。
以下實施例中，熒光化合物CY5.5與CXCR3抗體通過以下方法進行偶 聯(lián)：
1)將CY5.5和NHS在DMF中，以1∶1.5的摩爾比混合，攪拌反應(yīng)3小時，溫度35℃，用薄層層析和LC-MS檢測反應(yīng)完全；
2)加水稀釋10倍，HPLC分離純化，得到純度95％以上的NHS-CY5.5；
3)將所得NHS-CY5.5凍干成粉末，溶于HEPES緩沖液；
4)將CXCR3抗體和NHS-CY5.5在HEPES緩沖體系下，以1∶10的摩爾比，反應(yīng)6小時；
5)在緩沖液中反復(fù)透析去除游離NHS-CY5.5，得與熒光化合物CY5.5偶聯(lián)的CXCR3抗體。
實施例1
一種腫瘤活體檢測試劑盒，其形狀和結(jié)構(gòu)如圖1所示，其包括：盒蓋1、盒體2、襯墊5、裝有與熒光化合物CY5.5偶聯(lián)的CXCR3抗體的容器3、裝有生理鹽水的容器4和注射器6，襯墊5設(shè)置于盒體內(nèi)，所述襯墊5上設(shè)有2個容器孔，裝有與熒光化合物CY5.5偶聯(lián)的CXCR3抗體的容器3和裝有生理鹽水的容器4嵌入2個容器孔內(nèi)，所述注射器6置于槽內(nèi)。
實施例2用腫瘤活體檢測試劑盒檢測活的腫瘤細(xì)胞
1)將狀態(tài)良好的處于指數(shù)期生長的肺癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、膽囊癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞消化收集，根據(jù)實驗需要和細(xì)胞生長特性接種到24孔板或6孔板。例如肺癌A549細(xì)胞，用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整濃度為2×105/mL，接種到24孔板，24小時后細(xì)胞重新貼壁；
2)繼續(xù)培養(yǎng)到約50％密度，吸去培養(yǎng)液，PBS輕輕洗三次后，每孔加入無血清培養(yǎng)基500μL及與熒光化合物CY5.5偶聯(lián)的CXCR3抗體10μL，繼續(xù)在37度培養(yǎng)2小時。取出后在采用633nm激發(fā)光，熒光顯微鏡下用690nm濾光觀察細(xì)胞產(chǎn)生的熒光情況。
結(jié)果顯示，上述肺癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、膽囊癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞均能被本試劑盒檢測到，用偽彩顯示該熒光強度和分布。
實施例3用腫瘤活體檢測試劑盒檢測活體小鼠膽囊癌皮下移植瘤
將指數(shù)生長期膽囊癌細(xì)胞消化，計數(shù)，重懸5×106/mL，取1mL注射到6周齡裸鼠前腋皮下，繼續(xù)飼養(yǎng)2-3周，出現(xiàn)約0.5cm-2cm直徑皮下腫瘤。在小鼠尾靜脈注射100μL用緩沖液稀釋后的與熒光化合物CY5.5偶聯(lián)的CXCR3抗體。可在注射后1-48小時在小動物熒光成像儀中，采用633nm激發(fā)光，用690nm濾光觀察裸鼠皮下瘤產(chǎn)生的熒光情況。觀察裸鼠熒光情況并拍照記錄。
結(jié)果顯示該裸鼠移植瘤可被與熒光化合物CY5.5偶聯(lián)的CXCR3抗體識別，在腫瘤部位產(chǎn)生較強的熒光信號，而周圍或其他部位則無明顯熒光信號。其中注射后1小時-6小時可在心臟部位觀察到熒光信號；24-48小時在膀胱部位觀察到熒光信號，可以根據(jù)熒光范圍和強度，相對定量地判斷移植瘤中腫瘤細(xì)胞的量。
實施例4用腫瘤活體檢測試劑盒檢測結(jié)腸癌肺轉(zhuǎn)移模型腫瘤的活體小鼠
1)將指數(shù)生長期結(jié)腸癌細(xì)胞消化，計數(shù)，重懸1×107/mL，取1mL注射到4-5周齡裸鼠前腋皮下，繼續(xù)飼養(yǎng)3周，推測可能產(chǎn)生肺轉(zhuǎn)移腫瘤；也可解剖一只觀察是否存在肺轉(zhuǎn)移，如果前期已經(jīng)對細(xì)胞進行檢測確定可被與熒光化合物CY5.5偶聯(lián)的CXCR3抗體識別，則可用該與熒光化合物CY5.5偶聯(lián)的CXCR3抗體判斷是否出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移而不需要處死實驗裸鼠；
2)在小鼠尾靜脈注射100μL用緩沖液稀釋后的與熒光化合物CY5.5偶聯(lián)的CXCR3抗體。可在注射后1-48小時在小動物熒光成像儀中，采用633nm激發(fā)光，用690nm濾光觀察裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤產(chǎn)生的熒光情況。觀察裸鼠熒光情況并拍照記錄。
結(jié)果顯示，該裸鼠移植瘤可被試劑盒中與熒光化合物CY5.5偶聯(lián)的CXCR3抗體識別，可以根據(jù)熒光范圍和強度，相對定量地判斷移植瘤中腫瘤細(xì)胞的量。
雖然以上描述了本實用新型的具體實施方式，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些僅是舉例說明，本實用新型的保護范圍是由所附權(quán)利要求書限 定的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本實用新型的原理和實質(zhì)的前提下，可以對這些實施方式做出多種變更或修改，但這些變更和修改均落入本實用新型的保護范圍。