本申請涉及用于診斷肺部疾病，并且特別是慢性阻塞性肺疾病(COPD)的方法。本發(fā)明具體涉及用于檢測個體中COPD的進展以及病況發(fā)作(flair ups)的風(fēng)險的方法。

發(fā)明背景

COPD是常見的漸進性致殘疾病，并且是世界范圍的主要健康負(fù)擔(dān)。該疾病是一種致殘的且復(fù)雜的疾病，并且是世界范圍的主要公共衛(wèi)生問題，因為其影響了估計600百萬人且被列入死亡的主要原因的前5名。該疾病以由原位炎癥性變化和氣道壁重塑驅(qū)使的部分可逆性氣流阻塞為特點。因此，COPD患者的生活質(zhì)量差，由急性痛苦發(fā)作(flare-ups)而加重。這些傳染性/炎癥性的急性加重隨疾病的嚴(yán)重程度而增加，其發(fā)生在患者的肺功能可變但漸進地自然衰退的背景下。

當(dāng)前，在特定的時間點下測量COPD，并且其給出在該時刻下的疾病狀態(tài)的指示。當(dāng)前，不存在監(jiān)測COPD，以及更具體而言如何預(yù)測哪一些COPD患者更易發(fā)生肺功能的迅速惡化以及急性加重增加的常規(guī)病人身邊(near-patient)敏感性工具。通常，基于臨床依據(jù)診斷COPD的‘發(fā)作’；所述臨床依據(jù)包括具體癥狀(如，呼吸短促)的惡化。當(dāng)前，利用支氣管擴張后的一秒用力呼氣量(FEV)的測量對患者的病況進行評估，但是這些測量不能預(yù)測疾病的進展或后果。通過支氣管/肺的活組織檢查以及支氣管肺泡灌洗進行COPD的評估，但同時將對COPD狀態(tài)的認(rèn)識大大提前，此類度量不適合于每天使用。還利用生物技術(shù)的混合進行了自然痰和誘導(dǎo)痰的分析，并且呼出氣分析的最新進展看起來是有前景的，但是其受限于高量級的患者間呼出的揮發(fā)性有機化合物和一氧化氮標(biāo)志物的的差異，極低水平的有機化合物和標(biāo)志物不容易被檢測到，因此潛在地降低了該生物標(biāo)志物的常規(guī)臨床價 值。因此，當(dāng)前方法處于早期階段的研究或臨床前的試驗階段或者只是不適合于臨床，從而留下了這樣的臨床需求和挑戰(zhàn)：以有效、實用且非侵入性的方式鑒定患有COPD的患者以能夠足夠敏感地確定和監(jiān)測疾病狀態(tài)，從而給出疾病急性加重的早期預(yù)警。

傅里葉變換紅外光譜(FTIR)是能夠檢測來自組織或細(xì)胞的分子的結(jié)構(gòu)變化的非侵入性技術(shù)。利用通常取自中間紅外線范圍(4000至400cm^-1)的波數(shù)的光譜可以使此類變化可視化。FTIR已經(jīng)顯示出作為將癌癥(如結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、胃癌、口腔癌和食道癌)中的瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞區(qū)分開的敏感的診斷工具的前景。在這些以及其它研究中，在被稱為“指紋區(qū)”的波數(shù)范圍(包含1800至950cm^-1)內(nèi)，經(jīng)常觀察到腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞之間的生化變化。雖然FTIR已證明了在其它項目中的適用性，但是FTIR分析還未被應(yīng)用于處理COPD的臨床需求中，其中獲得人痰的光譜特性以鑒定COPD個體和健康個體之間的差異。

本發(fā)明旨在通過提供容易使用的分析方法來克服當(dāng)前存在的監(jiān)測COPD的問題，所述分析方法可被用于分析COPD的階段和COPD的進展，從而可以根據(jù)患者的具體病況為他們提供合適的治療?？梢允褂弥T如FTIR和可變?yōu)V波器紅外光譜(VFIR)的光譜學(xué)方法。

發(fā)明概述

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供用于診斷對象的COPD或者用于鑒定對象中COPD的進展的方法，所述方法包括：

(a)對獲自對象的痰樣本進行FTIR或VFIR光譜分析；

(b)將產(chǎn)生自樣本的光譜與來自正常對照的FTIR或VFIR光譜或者之前取得的對象的光譜進行比較，

其中，在選自約940cm^-1至約970cm^-1、約1080cm^-1至約1130cm^-1、約1230cm^-1至約1250cm^-1、約1570cm^-1至約1590cm^-1、約1620cm^-1至約1650cm^-1以及約1720cm^-1至約1750cm^-1的一個或多個范圍內(nèi)的一個或多個波數(shù)下，產(chǎn)生自樣本的光譜與正常對照的光譜或之前取得的光譜之間的差異指示對象患有COPD或者對象中COPD的進 程。

顯著地，已發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的方法在鑒定COPD的進展以及特別是在早期階段發(fā)作的風(fēng)險中特別有效。

優(yōu)選地，患有COPD的個體與正常對照的痰光譜之間在相同波數(shù)下吸光度的增加或減少或者吸收位置在波數(shù)之間的移動指示對象罹患COPD或?qū)ο笾蠧OPD的進展，所述波數(shù)在選自約940cm^-1至約970cm^-1、約1080cm^-1至約1130cm^-1、約1230cm^-1至約1250cm^-1、約1570cm^-1至約1590cm^-1、約1635cm^-1至約1650cm^-1，以及約1735cm^-1至約1750cm^-1的一個或多個范圍內(nèi)選擇。

優(yōu)選的是，在選自約965cm^-1、約970cm^-1、約1125cm^-1、約1130cm^-1、約1235cm^-1至約1248cm^-1、約1570cm^-1至約1590cm^-1、約1640cm^-1至約1648cm^-1以及約1740cm^-1至約1748cm^-1中的一個或多個波數(shù)下，當(dāng)與正常對照相比時，樣本中吸光度的增加指示對象中的COPD。

設(shè)想的是，COPD或高風(fēng)險對象與正常對照之間的波數(shù)吸光度的差異在統(tǒng)計學(xué)上是顯著的，例如如通過利用諸如“t-檢驗”的統(tǒng)計學(xué)檢驗所測定的。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供用于監(jiān)測對象中COPD的進展的方法，所述方法包括：

(a)對獲自對象的痰樣本進行FTIR或VFIR光譜分析；

(b)將產(chǎn)生自樣本的光譜與來自正常對照的FTIR或VFIR光譜或者之前取得的對象的光譜進行比較，

其中，在選自約940cm^-1至約970cm^-1、約1080cm^-1至約1130cm^-1、約1230cm^-1至約1250cm^-1、約1570cm^-1至約1590cm^-1、約1620cm^-1至約1650cm^-1以及約1720cm^-1至約1750cm^-1的一個或多個范圍內(nèi)的一個或多個波數(shù)下，產(chǎn)生自樣本的光譜與正常對照的光譜或之前取得的光譜之間的差異指示對象罹患COPD或?qū)ο笾蠧OPD的進展。

優(yōu)選地，患有COPD的個體與正常對照的痰光譜之間在相同波數(shù)下吸光度的增加或減少或者吸收位置在波數(shù)之間的移動指示患有COPD的對象中COPD的進展或?qū)ο笾蠧OPD的進展，所述波數(shù)在選 自約940cm^-1至約970cm^-1、約1080cm^-1至約1130cm^-1、約1230cm^-1至約1250cm^-1、約1570cm^-1至約1590cm^-1、約1635cm^-1至約1650cm^-1，以及約1735cm^-1至約1750cm^-1的一個或多個范圍內(nèi)選擇。

優(yōu)選地是，在選自約965cm^-1、約970cm^-1、約1080cm^-1、約1130cm^-1、約1235cm^-1至約1248cm^-1、約1570cm^-1至約1590cm^-1、約1640cm^-1至約1648cm^-1，以及約1740cm^-1至約1748cm^-1的一個或多個波數(shù)下，當(dāng)與正常對照相比時，樣本中吸光度的增加指示對象中COPD的進展。

因此，本發(fā)明的方法可被用于檢測COPD的發(fā)作以及進展。

優(yōu)選地，對照可以來自同一對象的之前樣本，從而監(jiān)測發(fā)作或進展。然而，還優(yōu)選的是，可對群體特別是未患COPD的健康或正常群體進行標(biāo)準(zhǔn)化。

優(yōu)選地是，提供短暫相隔的至少兩個定量步驟。設(shè)想的是，所述步驟相隔數(shù)天、數(shù)周、數(shù)年或數(shù)月，以確定光譜之間的差異是否改變，從而指示COPD的進展是否存在變化，使得能夠?qū)⒃趦蓚€或更多場合下進行的光譜之間進行比較，因為差異隨時間的增加指示癌癥的發(fā)作或進展，而減少可以指示降低的風(fēng)險或癌癥進展的減緩。

優(yōu)選地，光譜之間差異的改變在統(tǒng)計學(xué)上是顯著的，例如如通過利用“t-檢驗”所測定的。

通過分析對象的痰，本發(fā)明的方法特別適用于檢測COPD的進展。作為檢驗的結(jié)果，預(yù)后和治療選擇取決于特定時間點下鑒定的病況。

例如通過在治療方案的過程中監(jiān)測來自正常對照與樣本的光譜之間的差異的改變，本發(fā)明的方法還可被用于監(jiān)測COPD的治療功效。

可以通過本領(lǐng)域已知的任何數(shù)量的方式獲得痰樣本，如對技術(shù)人員而言顯而易見的方式。將會理解，可以在不使用侵入性技術(shù)的情況下獲得痰樣本。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供用于如本文所描述的方法的試劑盒，其中所述試劑盒包括FTIR或VFIR機器，以及用于本文所描述的方法的說明書。

優(yōu)選地，試劑盒還包括用于收集痰樣本的收集工具。合適的收集 工具對技術(shù)人員而言將是顯而易見的，并且可以包括例如合適的容器，如優(yōu)選提供有蓋子(如螺紋式或推進式的蓋)的塑料瓶或杯子。

設(shè)想的是，收集工具包括芯片單元上的實驗室。

優(yōu)選地，試劑盒包含存儲單元，其被安排以使在其中儲存的患者信息與涉及時間的定時數(shù)據(jù)相關(guān)，在所述時間下：接收患者信息；或儲存患者信息。

設(shè)想的是，存儲單元被安排為儲存多個測定的疾病狀態(tài)，以及與做出各測定的時間相關(guān)的定時數(shù)據(jù)。

優(yōu)選的是，存儲單元被安排為儲存多個隨時間從患者接收的患者信息片段。

優(yōu)選地，輸出單元被安排為根據(jù)處理單元做出的測定提供肺部疾病狀態(tài)的輸出指示，所述輸出指示狀態(tài)為穩(wěn)定的或變化的。

優(yōu)選的是，輸出單元被安排為提供指示COPD相關(guān)疾病應(yīng)答的起始的輸出。

設(shè)想的是，輸出單元被安排為向本機用戶提供本機輸出和/或被安排為將信息從裝置傳輸至遠(yuǎn)程監(jiān)測站。

現(xiàn)在，將參考附圖來描述本發(fā)明的示例性實施方案。

附圖簡述

圖1顯示：COPD測量的峰圖。

發(fā)明詳述

在本說明書中，以使待書寫的說明書能夠清楚且簡潔的方式來描述實施方案，但是旨在且將會理解，在不脫離本發(fā)明的情況下，可將實施方案進行不同地組合或分離。在本說明書中，術(shù)語“包括(comprises)”和“包括(comprising)”被解釋為意為“除了別的以外包括”。這些術(shù)語不意圖被解釋為“僅由…組成”。此外，在本說明書中，術(shù)語“約”意為加或減20％，更優(yōu)選地加或減10％，甚至更優(yōu)選地加或減5％，最優(yōu)選地加或減2％。例如，將會理解，部分由于不同的分辨率，在FTIR或VFIR技術(shù)間特定波數(shù)吸光度的位置可以存在輕微的變化，例 如±5cm^-1。

本文使用的術(shù)語“對象”指動物，優(yōu)選哺乳動物，以及特別是人。在具體的實施方案中，對象是哺乳動物，特別是患有肺癌、疑患肺癌或處于患肺癌風(fēng)險的人。術(shù)語“診斷”包括鑒定、確認(rèn)和/或表征肺癌或者良性或轉(zhuǎn)移性癌癥的存在或不存在，以及其發(fā)展階段，如早期階段或晚期階段。此外，術(shù)語“正常對照”意為無COPD的存在且未懷疑處于COPD的高風(fēng)險的代表性樣本。例如，正常對照可以是獲自未患COPD的對象的樣本。

材料和方法

傅里葉變換紅外光譜/可變?yōu)V波器紅外光譜

用配備有白金ATR單反射金剛石采樣模塊(Bruker Optics)的Bruker Alpha傅里葉變換IR(FTIR)儀獲得IR光譜。在光譜采集之前，將樣本直接點于采樣模塊上并在室溫下晾干。由光學(xué)用戶軟件(Optics User Software)(OPUS)第6.5版(Bruker Optics)控制，以4cm^-1的分辨率，在450-4000cm^-1的波數(shù)范圍之間，以每個樣品平均24次掃描收集數(shù)據(jù)點。重復(fù)所述過程，直至每個樣本產(chǎn)生六個重復(fù)。利用九點Savitzky-Golay算法對得到的光譜進行背景校正和平滑處理。利用OPUS第6.5版(Bruker Optics)確定峰位置。利用可變?yōu)V波器紅外光譜儀進行相同的過程。

FTIR/VFIR分析

針對巖藻糖、半乳糖、甘露糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸、Lex、Ley、Lea和Leb、唾液酸化Lex以及硫代Lex產(chǎn)生IR光譜。通過制備1mg ml^-1濃度的糖在Milli-Q水中的溶液獲得糖膜，用于分析。將3μl糖溶液置于FTIR采樣模塊或VFIR采樣模塊上，用于光譜采集。在5mg ml^-1的濃度下產(chǎn)生Lewis抗原譜，隨后進行相同的方法。

痰FTIR/VFIR分析

從患有COPD的患者收集自發(fā)痰，所述患者為戒煙者，無任何其它呼吸疾病的癥狀且在痰收集時未經(jīng)歷惡化。因此，所述患者被認(rèn)為代表具有基本特征且無細(xì)菌或病毒感染的穩(wěn)定COPD。獲得提供痰樣本的知情同意書。將3μl未處理的痰置于FTIR或VFIR采樣模塊上，用于光譜采集。將COPD光譜內(nèi)的IR吸收峰的位置與已公開的代表性COPD光譜內(nèi)的IR吸收峰位置和正常痰的結(jié)果進行比較。

存在于粘蛋白聚糖中的單糖的IR光譜

針對存在于粘蛋白聚糖核心中的單糖構(gòu)塊(building blocks)產(chǎn)生紅外吸收光譜。利用重復(fù)樣本，通過重復(fù)程序，所有光譜均被認(rèn)為是高度可再現(xiàn)的。首先，針對甘露糖、巖藻糖和半乳糖單糖產(chǎn)生IR光譜，以確立各碳水化合物結(jié)構(gòu)的吸收峰的位置和強度。在900–1280cm^-1的范圍內(nèi)記錄光譜，因為注意到由于碳水化合物的存在導(dǎo)致最大的IR吸收發(fā)生在該區(qū)域內(nèi)。在該區(qū)域內(nèi)，觀察到與各單糖相關(guān)的下述獨特峰(unique peaks)：在956cm^-1、971cm^-1、1020cm^-1、1047cm^-1、1167cm^-1、1251cm^-1下的甘露糖；在963cm^-1、996cm^-1、1027cm^-1、1057cm^-1、1095cm^-1、1131cm^-1、1164cm^-1、1216cm^-1下的巖藻糖的峰，以及在1037cm^-1、1068cm^-1、1143cm^-1、1249cm^-1下的半乳糖的峰。針對糖衍生物，包括N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺和唾液酸產(chǎn)生IR光譜。在光譜的碳水化合物區(qū)域中，這些單糖還呈現(xiàn)具有可區(qū)別的主峰的獨特IR吸收模式(圖3)：唾液酸的吸收峰出現(xiàn)在1024cm^-1、1068cm^-1、1125cm^-1、1142cm^-1、1210cm^-1、1238cm^-1；GalNAc的峰出現(xiàn)在976cm^-1、1038cm^-1、1076cm^-1、1095cm^-1、1115cm^-1,1153cm^-1、1219cm^-1，以及GlcNAc的峰出現(xiàn)在961cm^-1、1025cm^-1、1079cm^-1、1103cm^-1。

Lewis抗原和修飾的衍生物的IR光譜

在光譜的碳水化合物相關(guān)區(qū)域內(nèi)的Lewis抗原的吸收光譜的比較中，可以看出，峰的位置和相關(guān)的吸收水平極其類似，基于它們的單糖組成這是可以預(yù)期的。主要的共有峰出現(xiàn)在968cm^-1、1033cm^-1和 1074cm^-1。然而，歸因于糖苷連接的低頻振動還作用于光譜。Lewis b和y抗原在與半乳糖的α-2糖苷連接中均含有第二個巖藻糖殘基，其可能導(dǎo)致在1164cm^-1周圍的峰的波數(shù)移動。此外，經(jīng)由α-3連接連接至GlcNAc的巖藻糖殘基可能導(dǎo)致在1020cm^-1周圍的未分辨出的峰，在Lewis x(Lex)光譜中顯著，存在于Lewis y光譜中，但在Lewis a和b中均不存在。

FTIR或VFIR光譜提供關(guān)于化學(xué)基團振動的信息，該研究顯示，基于碳水化合物的紅外吸收峰來區(qū)分它們是可能的。我們已鑒定了痰的IR譜中觀察到的多個獨立的糖和硫酸鹽相關(guān)的紅外吸收峰，其可被用來預(yù)測主要的粘蛋白連接的碳水化合物和粘蛋白修飾的存在。分析顯示，紅外光譜是糖特異性的，并且能夠基于分子鍵的振動在糖部分之間進行區(qū)分。多糖光譜也是分子特異的，并且其不僅含有與單糖組分相關(guān)的峰也含有推斷關(guān)于糖苷連接的信息的峰，這提供了碳水化合物構(gòu)象的細(xì)節(jié)。

在該區(qū)域中還發(fā)生由于糖環(huán)的復(fù)合振動(CH的搖擺振動和OH的彎曲振動)導(dǎo)致的獨特吸收模式，導(dǎo)致光譜中糖特異性峰的形成。本發(fā)明表明，在患有COPD的患者中，主要含有粘蛋白的病痰在FTIR/VFIR光譜的碳水化合物相關(guān)區(qū)域中顯示出改變，這是由痰組成的改變引起的。FTIR/VFIR能夠在未修飾的、硫酸化的以及唾液酸化的Lewis抗原之間進行區(qū)分，并能夠顯示病痰中可變的抗原特異性IR峰的事實潛在地使其成為糖蛋白分析的強有力工具，并且可被用于利用非侵入性技術(shù)的用于疾病的檢測和監(jiān)測的新技術(shù)和方法的發(fā)展中。

應(yīng)當(dāng)理解，對本文所描述的當(dāng)前優(yōu)選實施方案進行的各種改變和修飾對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。在不脫離本發(fā)明的精神和范圍以及不減少其伴有的優(yōu)勢的情況下，可以做出此類改變和修飾。因此，意圖由所附的權(quán)利要求涵蓋此類改變和修飾。將本文提及的所有參考文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用整體并入本文。