鑒別和分子水平理解整個(gè)生命過程期間的相互作用化學(xué)反應(yīng)在基本生物研究和醫(yī)藥科學(xué)中具有很大價(jià)值。熒光成像已長(zhǎng)期用于這個(gè)目的，原因是其允許我們實(shí)時(shí)且以高空間分辨率探查活細(xì)胞和生物體包括人類中的事件。使用小熒光探針的位點(diǎn)特異性化學(xué)標(biāo)記是研究細(xì)胞和組織中的生物事件的有力和吸引人的技術(shù)，且因此用于探查疾病的機(jī)理。具體而言，基于金屬螯合的熒光標(biāo)記具有高選擇性、小尺寸和共價(jià)標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)。

在現(xiàn)代生物化學(xué)中，將多組氨酸標(biāo)簽基因編碼到POI為蛋白質(zhì)化學(xué)中穩(wěn)健的技術(shù)。His標(biāo)簽基本上是指具有寡組氨酸的短肽基序，且六個(gè)組氨酸的序列為最常見的His標(biāo)簽。His標(biāo)簽的組氨酸的咪唑環(huán)可以與各種過渡金屬例如Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺等相互作用。因此，通常發(fā)現(xiàn)His標(biāo)簽與過渡金屬?gòu)?fù)合物例如Ni²⁺-次氮基三乙酸(NTA)復(fù)合物相互作用，由此有助于使用固定化金屬親和層析法(IMAC)純化過表達(dá)的蛋白質(zhì)。該相互作用組合亦已廣泛應(yīng)用于位點(diǎn)特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記，這說明了對(duì)所報(bào)道的廣泛的現(xiàn)有帶寡組氨酸-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)庫的相容性，且His標(biāo)簽的基因編碼是靈活的，其中其可經(jīng)基因工程改造到用于標(biāo)記的蛋白質(zhì)靶標(biāo)的末端或內(nèi)部位點(diǎn)(Soh, N. Sensors 8, 1004-1024 (2008)；Kapanidis, A. N., Ebright, Y. W. & Ebright, R. H. J. Am. Chem.Soc. 123, 12123-12125(2001))。

最成熟和廣泛使用的基于金屬(或基于類金屬)的小分子熒光探針為F1AsH或其類似物，例如ReAsH和SplAsH (Griffin, B. A., Adams, S. R. & Tsien，R. Y. Science281，269-272 (1998)； Hoffmann，C.等. Nat. Protocols 5，1666-1677 (2010))。Vogel在2004公開了用于帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的另外兩種典型的小熒光傳感物，其具有選擇性、快速和可逆的金屬螯合NTA探針，而Auer在2008合成了不可逆的金屬螯合NTA探針(Guignet，E. G.，Hovius，R.& Vogel，H. Nat. Biotechno1. 22，440-444 (2004)； Hintersteiner，M.等. ChemBioChem 9, 1391-1395 (2008))。大多數(shù)其它組氨酸標(biāo)記探針以相同方式發(fā)現(xiàn)，但僅報(bào)道標(biāo)記細(xì)胞表面上的蛋白質(zhì)。業(yè)已進(jìn)行廣泛研究，以僅在穿透肽的存在下且歷時(shí)30分鐘以上的孵育時(shí)間使用小分子熒光探針使活細(xì)胞內(nèi)的帶CysHis₆-標(biāo)簽(CH₆-標(biāo)簽)的蛋白質(zhì)成像(Uchinomiya，S.，Nonaka，H.，Wakayama，S.，Ojida，A.& Hamachi，I.Chem.Commun.49，5022-5024 (2013))，遺憾的是，沒有這樣的探針可以直接進(jìn)入細(xì)胞且標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。

如上所述，用于蛋白質(zhì)標(biāo)記的基于小分子的熒光探針已長(zhǎng)期用于生物醫(yī)藥和臨床科學(xué)，然而這些探針的差的膜滲透性阻止其應(yīng)用。幾種特別基于螯合的這樣的探針業(yè)已上市(例如Invitrogen?的FlAsH、ReAsH和Sp1AsH)。所有這些為雙砷熒光探針，其可以跨過細(xì)胞膜以遺傳標(biāo)記四半胱氨酸融合的目的蛋白質(zhì)。然而小的有機(jī)化合物，1，2-乙二硫醇(EDT)必須與探針協(xié)同使用以提高標(biāo)記率且降低背景。已知砷對(duì)人類有毒，而且還是環(huán)境污染物。所述的雙砷探針的合成包括大量采用高毒性的汞和砷，導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境問題。而且，在氧化環(huán)境中，特異性標(biāo)記是困難的，由于還原形式的四半胱氨酸基序可易于轉(zhuǎn)化成氧化形式。相比之下，組氨酸選擇大量聚集在特別且重要的蛋白質(zhì)中，且多組氨酸標(biāo)簽用于蛋白質(zhì)純化。在細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)藥研究中，四半胱氨酸基序并不像多組氨酸標(biāo)簽一樣普遍而經(jīng)基因融合到蛋白質(zhì)(Rowinska-Zyrek，M.，Witkowska，D.，Potocki，S.，Remelli，M.& Kozlowski，H.New J.Chem.37, 58-70 (2013))。

概述

當(dāng)前，不存在金屬可調(diào)節(jié)探針，其對(duì)于標(biāo)記蛋白質(zhì)的顯現(xiàn)和后續(xù)鑒別實(shí)現(xiàn)高通量。文中所述為基于金屬螯合的熒光探針，其用于使活細(xì)胞和組織中的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或其它生物分子成像由此監(jiān)控其生物事件并研究疾病機(jī)理。通過綴合各種熒光團(tuán)到金屬-螯合劑和光反應(yīng)性交聯(lián)劑提供具有藍(lán)光、紅光和綠光的至少三種不同發(fā)射的一系列探針。通過與不同金屬離子配位，金屬-螯合探針充當(dāng)潛在的探針以標(biāo)記帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)/生物分子。而且，探針還能夠共價(jià)結(jié)合到標(biāo)記的蛋白質(zhì)，使得能夠進(jìn)一步鑒別蛋白質(zhì)。

與使用有毒砷且需要引入四半胱氨酸的最廣泛使用的當(dāng)前的探針(F1AsH)相比，我們的探針使用通過含氮配體螯合的無毒金屬例如鎳(Il)以使帶多組氨酸-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)成像，其更快速跨過細(xì)胞膜且毒性較小。更重要地，考慮到多組氨酸標(biāo)簽在生物化學(xué)和生物醫(yī)藥研究中的廣泛用途，鑒于大的現(xiàn)有帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)庫，可更方便地使用所述探針。本發(fā)明涉及檢測(cè)和顯現(xiàn)細(xì)胞中的生物分子。其適用于容易且快速追蹤或追隨生物化學(xué)事件，包括細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。該制備是簡(jiǎn)單的且因此低成本，且該探針可以避免使用砷和四半胱氨酸(其可以影響細(xì)胞中的氧化還原環(huán)境)。取而代之地，其它無毒金屬離子例如鎳(Il)摻入到當(dāng)前的探針中，所述探針靶向經(jīng)基因編碼到蛋白質(zhì)或其它生物分子的多組氨酸標(biāo)簽。這種探針因此具有替換或至少補(bǔ)充當(dāng)前使用最多的種類的探針例如F1AsH (ReAsH)的潛在性。

本說明書涉及開發(fā)新的基于金屬螯合的熒光探針，其用于使活細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或其它生物分子成像以監(jiān)控其生物事件。文中進(jìn)一步描述了探針的設(shè)計(jì)和合成。

在一方面，提供了用于靶向生物樣品特別是活的樣品中的生物分子的熒光探針。所述熒光探針包含產(chǎn)生熒光信號(hào)的熒光團(tuán)報(bào)道部分、螯合用于與編碼到靶蛋白質(zhì)的多組氨酸標(biāo)簽配位的金屬離子的金屬-螯合部分、連接所述熒光團(tuán)報(bào)道部分和金屬-螯合部分的接頭和充當(dāng)?shù)桨械鞍踪|(zhì)上的錨點(diǎn)以激增標(biāo)記親和力和穩(wěn)定性的光反應(yīng)性交聯(lián)劑。

在一些實(shí)施方案中，在吸收光能之后所述報(bào)道部分的熒光信號(hào)具有約400-約800nm的波長(zhǎng)。所述報(bào)道部分包含香豆素-衍生物、熒光素-衍生物和若丹明-衍生物。

在一些實(shí)施方案中，所述金屬-螯合部分包含多齒配體。所述多齒配體包含次氮基三乙酸(NTA)和亞氮基二乙酸(IDA)。所述金屬-螯合部分還包含含有鎳(II)、鈷(II)和銅(II)金屬離子的螯合金屬離子。

在一些實(shí)施方案中，所述熒光團(tuán)和所述金屬-螯合部分之間的接頭設(shè)計(jì)為烴鏈或肽序列。

在一些實(shí)施方案中，所述光反應(yīng)性交聯(lián)劑包含芳基疊氮化物、雙吖丙啶或二苯甲酮。所述光反應(yīng)性交聯(lián)劑包含或者不包含作為熒光團(tuán)的共軛體系的一部分。所述光反應(yīng)性交聯(lián)劑可以呈現(xiàn)光激活，所述光激活通過在熒光探針與生物樣品中的帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)配位之后紫外輻射約5-約15分鐘實(shí)現(xiàn)。通常所述紫外輻射的范圍為約340nm-約380nm。

在一些實(shí)施方案中，包括鎳(II)、鈷(II)和銅(II)離子的金屬離子的螯合產(chǎn)生金屬-螯合探針的熒光猝滅。

在一些實(shí)施方案中，所述探針以1:1摩爾比與金屬離子配位。

在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記靶生物分子通過經(jīng)由探針的金屬-螯合與編碼到生物分子的多組氨酸標(biāo)簽配位實(shí)現(xiàn)。當(dāng)所述金屬-螯合熒光探針在pH 6-8的緩沖液(可以在約4℃-約40℃的溫度下)中標(biāo)記帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)時(shí)，所述金屬-螯合熒光探針呈現(xiàn)熒光信號(hào)的提高(“接通”響應(yīng))并實(shí)現(xiàn)所述提高。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述標(biāo)記過程花費(fèi)約5-30分鐘。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述標(biāo)記對(duì)于過夜孵育穩(wěn)定。

在一個(gè)實(shí)施方案中，帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的標(biāo)記在所述蛋白質(zhì)用約90℃-約110℃的溫度變性之后保持。

在其它實(shí)施方案中，帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)記能夠在非變性或變性凝膠電泳之后在凝膠上顯現(xiàn)。

在另一方面，提供了標(biāo)記帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的方法。所述方法包括：通過熒光探針的金屬-螯合將多組氨酸標(biāo)簽編碼的蛋白質(zhì)與靶生物分子配位，所述熒光探針包含在吸收光能之后產(chǎn)生熒光信號(hào)的熒光團(tuán)報(bào)道部分、螯合用于與編碼到所述靶蛋白質(zhì)的多組氨酸標(biāo)簽配位的金屬離子的金屬-螯合部分、連接所述熒光團(tuán)和金屬-螯合部分的接頭和充當(dāng)?shù)桨械鞍踪|(zhì)上的錨點(diǎn)以激增標(biāo)記親和力和穩(wěn)定性的光反應(yīng)性交聯(lián)劑。

在一些實(shí)施方案中，所述熒光探針產(chǎn)生在吸收光能之后具有約400-約800nm的波長(zhǎng)的熒光信號(hào)。

在一些實(shí)施方案中，帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的標(biāo)記在包含細(xì)菌細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物組織、植物細(xì)胞和植物組織的生物樣品中實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，引入熒光探針不損害生物樣品。

在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記方法在約4℃-約40℃的溫度下進(jìn)行。標(biāo)記可以花費(fèi)約5-約60分鐘。

在其它實(shí)施方案中，所述方法包括通過緩沖液洗滌和/或進(jìn)行共焦成像。

在一些實(shí)施方案中，具有圖1中表示的化學(xué)結(jié)構(gòu)的熒光劑包含：

(a) 具有確定的共軛體系作為熒光團(tuán)的環(huán)狀部分，且發(fā)射范圍為400-800nm；

(b) 包含多齒配體的金屬-螯合部分，包括但不限于螯合金屬離子的含羧酸配體，例如次氮基三乙酸(NTA)和亞氮基二乙酸(IDA)；

(c) 金屬離子，其與金屬-螯合部分部分配位，包括但不限于，鎳(II)、鈷(II)和銅(II)離子中的一種或多種；

(d) 所述熒光團(tuán)和所述金屬-螯合部分之間的接頭，其可以包括短烴鏈或短肽序列；和/或

(e) 光反應(yīng)性交聯(lián)劑，包括但不限于，芳基疊氮化物、雙吖丙啶和二苯甲酮，其可以是或可以不是熒光團(tuán)的共軛體系的一部分。

本發(fā)明提供有效標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)(和細(xì)胞外)帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)/生物分子，同時(shí)探針還能夠共價(jià)結(jié)合到標(biāo)記的蛋白質(zhì)以進(jìn)一步鑒別蛋白質(zhì)。在加入生物樣品之后，部分-配位的金屬離子可以引導(dǎo)熒光劑以標(biāo)記帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)，而接近地所述光反應(yīng)性交聯(lián)劑可以通過340-380nm的UV輻射光激活以產(chǎn)生到靶蛋白質(zhì)的共價(jià)鍵。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括與常規(guī)方法中超過30分鐘相比，帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)在10分鐘或更少時(shí)間(例如9分鐘)快速標(biāo)記。優(yōu)點(diǎn)還可以包括標(biāo)記帶多組氨酸標(biāo)簽的靶蛋白質(zhì)會(huì)產(chǎn)生“接通”響應(yīng)，這增強(qiáng)熒光劑的熒光強(qiáng)度超過5倍、超過10倍且甚至高達(dá)13倍。還有，在一些實(shí)施方案中，所公開的標(biāo)記方法不損害生物樣品或其組分。

附圖簡(jiǎn)述

圖1說明熒光劑設(shè)計(jì)的示意圖。

圖2說明金屬-螯合的NTA-AC和NTA-AF的結(jié)構(gòu)。

圖3A顯示展示使用Ni-NTA-AC細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記帶His₆-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)(頂部)和NTA-AC的合成方案(底部)的示意圖。探針快速進(jìn)入細(xì)胞并靶向具有顯著熒光“接通”的帶His₆-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。圖3B顯示在加入Ni²⁺(作為NiSO₄)之后NTA-AC (5μM)的標(biāo)準(zhǔn)化熒光變化。注意到在Ni²⁺與NTA-AC螯合之后熒光降低約70%。圖3C顯示在NTA-AC與Ni²⁺在20mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.2)中絡(luò)合之后熒光變化(λ_ex=342nm，λ_em=448nm)的Job's圖。NTA-AC和Ni²⁺的總濃度保持恒定(10μM)。在0.5的Ni²⁺: NTA-AC摩爾比下觀察到最大熒光變化，指示Ni-NTA-AC復(fù)合物以1:1的NTA-AC: Ni²⁺比率形成。

圖4A說明NTA-AC的¹H (4-A)且圖4B說明¹³C (4-B)NMR光譜。

圖5說明NTA-AC的ESI-MS光譜。

圖6說明NTA-AC的激發(fā)(實(shí)線)和發(fā)射(虛線)光譜，且λ_ex=342nm和λ_em=448nm。

圖7A顯示在加入His-XPA122 (10μM)之后在不同時(shí)間間隔下Ni-NTA-AC (1μM)的熒光光譜。插圖：在結(jié)合到His-XPA122之后Ni-NTA-AC的時(shí)間依賴性熒光變化(λ_em=448nm)。對(duì)于Ni-NTA-AC，觀察到熒光提高13倍且信號(hào)在9分鐘達(dá)到平穩(wěn)。圖7B顯示在各種條件下用His-XPA122孵育的Ni-NTA-AC的標(biāo)準(zhǔn)化熒光。在沒有芳基疊氮化物光激活(在黑暗下)的情況下，將過量的EDTA (40倍)加到Ni-NTA-AC和His-XPA122的混合物中導(dǎo)致熒光降低了約60%(由于來自Ni-NTA-AC的Ni²⁺被EDTA螯合)，這導(dǎo)致探針從His-XPA122解離。相反，在Ni-NTA-AC結(jié)合到His-XPA122之后且在芳基疊氮化物光激活之后，加入過量的EDTA將不干擾探針和蛋白質(zhì)之間的共價(jià)鍵，且熒光稍微提高(30%)歸因于從被Ni猝滅恢復(fù)的熒光。圖7C顯示在不同條件下通過等摩爾量Ni-NTA-AC (或Ni-NTA-C)的蛋白質(zhì)標(biāo)記(12μΜ)的SDS-PAGE分析。該探針通過Ni結(jié)合蛋白質(zhì)的His-標(biāo)簽，然而芳基疊氮化物部分在光激活之后經(jīng)由共價(jià)鍵進(jìn)一步增強(qiáng)結(jié)合，因此標(biāo)記甚至在變性電泳下保持。第1道：His-XPA122；第2道：在過量EDTA (50μΜ)存在下的His-XPA122；第3道：His-XPA122和Ni-NTA-AC (不具有芳基疊氮化物)；第4道：XPA122 (不具有His-標(biāo)簽)。所有樣品在4℃下孵育過夜且在凝膠電泳之前通過UV輻射(λ=365nm )10分鐘進(jìn)行芳基疊氮化物的光激活。

圖8A顯示通過考馬斯藍(lán)和熒光染色監(jiān)控的在用不同量(0-10摩爾當(dāng)量)的Ni-NTA-AC孵育之后通過SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)標(biāo)記(10μM)，Ni-NTA-AC到His-XPA122的標(biāo)記效率。圖8B顯示通過圖8A中的SDS-PAGE測(cè)定的Ni-NTA-AC到His-XPA122的標(biāo)記產(chǎn)率。圖8C顯示在不存在和存在1和2摩爾當(dāng)量的Ni-NTA-AC的情況下，His-XPA122 (10μΜ)的MALDI-TOF MS光譜。在14981Da的m/z的峰可指定為完整蛋白質(zhì)(計(jì)算值14979Da)且在15549和16100Da的m/z的峰在用Ni-NTA-AC孵育His-XPA122之后出現(xiàn)，對(duì)應(yīng)于分別結(jié)合到1和2個(gè)探針的蛋白質(zhì)。由于蛋白質(zhì)的尺寸比探針的尺寸大得多，假定Ni-NTA-AC摻入His-XPA122呈現(xiàn)對(duì)天然蛋白質(zhì)His-XPA122的離子化效率的可忽略不計(jì)的作用，通過比較完整His-XPA122和探針結(jié)合的His-XPA122的峰面積而評(píng)估標(biāo)記效率。使用1和2摩爾當(dāng)量的標(biāo)記效率分別計(jì)算為38%和62%。

圖9顯示原核和真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)的Ni-NTA-AC標(biāo)記。圖9A顯示不同時(shí)間下的Ni-NTA-AC標(biāo)記的His-RFP-轉(zhuǎn)染細(xì)胞。Ni-NTA-AC快速進(jìn)入細(xì)胞且在2分鐘內(nèi)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)His-RFP蛋白質(zhì)。圖9B顯示相對(duì)于孵育時(shí)間繪制的相對(duì)熒光強(qiáng)度的圖表。圖9C顯示在用Ni-NTA-AC(10μΜ)處理30分鐘(n=5)之后具有或不具有His-XPA122過表達(dá)的大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞的圖像。只有表達(dá)帶His-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的細(xì)胞顯示藍(lán)色熒光。比例尺：5μm。圖9D顯示在用Ni-NTA-AC (25μΜ)孵育30分鐘之后His-XPA122-轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞的圖像。該信號(hào)在核中富集，其中定位XPA蛋白質(zhì)(Kuraoka I, 等. (1996) Mutat Res 362(1)：87-95)。沒有轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞充當(dāng)對(duì)照，顯示在相同處理(n=5)下沒有熒光。比例尺：10μΜ。圖9E顯示用于圖9D中的共焦成像的細(xì)胞的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析。第1道：純化的His-XPA122和Ni-NTA-AC；第2道：沒有His-XPAl22轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞裂解物；第3道：His-XPAl22轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞的核提取物。His-XPA122轉(zhuǎn)染細(xì)胞的核提取物的藍(lán)帶匹配純化的His-XPA122的帶，確定出現(xiàn)帶His-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)被細(xì)胞中Ni-NTA-AC標(biāo)記，但不在未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中標(biāo)記。圖9F顯示在用Ni-NTA-AC(25μM) (n=5)處理之后His-RFP-His-XPA122-轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞的熒光標(biāo)記的圖像。該蛋白質(zhì)在所有細(xì)胞上表達(dá)，與使用Ni-NTA-AC的熒光標(biāo)記相反。藍(lán)色和紅色熒光共定位且在重疊圖像中顯示為紫色。比例尺：10μM。

圖10顯示與野生型(頂部)葉(n=5)相比，來自表達(dá)His-BjCHIl的葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草葉(底部)的遠(yuǎn)軸表面的保衛(wèi)細(xì)胞的共焦成像。幼苗(左)在含Ni-NTA-AC的緩沖液(10μΜ)中孵育過夜。野生型煙草充當(dāng)負(fù)對(duì)照。比例尺：10μM。

圖11顯示用于原生質(zhì)體提取的野生型(WT)和His-BjCHI1-表達(dá)的4周齡煙草植物和在用Ni-NTA-AC(10μΜ)孵育30-分鐘之后來自WT和His-BjCHI1-表達(dá)的4周齡煙草植物(n=5)的原生質(zhì)體的共焦圖像。比例尺：10μM。

圖12說明NTA-AF的合成。

圖13說明NTA-AF的熒光光譜，展示在496nm的激發(fā)最大值同時(shí)在518nm的發(fā)射最大值。

圖14說明與考馬斯藍(lán)染色相比，帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)His-XPA122與Ni²⁺-NTA-AF在SDS-PAGE變性凝膠中的熒光標(biāo)記。

圖15顯示Ni-NTA-AC (1μΜ)對(duì)范圍為0-10μΜ的XPA122濃度的熒光響應(yīng)的圖表。在相同條件下加入XPA之后在不存在His₆標(biāo)簽的情況下，Ni-NTA-AC不顯示明顯的熒光響應(yīng)。

圖16顯示NTA-AC (1μΜ)對(duì)范圍為0-10μΜ的His-XPA122濃度的熒光響應(yīng)的圖表。在相同條件下加入His-XPA122之后在不存在Ni²⁺的情況下，NTA-AC不呈現(xiàn)任何熒光響應(yīng)。

圖17顯示通過等溫滴定量熱法的(A) Ni-NTA-AC和(B) Ni-NTA-C對(duì)His-XPA122 (在20mM HEPES，100mM NaCl，pH 7.4)的結(jié)合親和力。將Ni-NTA-AC和Ni-NTA-C (各自500μΜ)逐滴注射到包含apo-His-XPA122 (35μΜ)的細(xì)胞中，且記錄每一次注射的結(jié)合熱。

圖18顯示NTA-C的合成方案的示意圖。

圖19顯示NTA-C的¹³C NMR (125MHz)光譜。

圖20顯示NTA-C的ESI-MS光譜。在m/z 514.5的離子對(duì)應(yīng)于[M-2H⁺+K⁺] (計(jì)算值514.5)。

圖21顯示通過與其衍生物NTA-C比較，NTA-AC的芳基疊氮化物的作用的圖表評(píng)估。(A) 在加入Ni²⁺之后NTA-C (5μΜ)的標(biāo)準(zhǔn)化熒光變化。注意到與Ni²⁺結(jié)合到NTA-AC (70%)相比，Ni²⁺摻入NTA-C導(dǎo)致熒光在較少程度(50%)上猝滅。(B) 在用His-XPA122孵育之后在λ_em=448nm下NTA-AC的時(shí)間-依賴性熒光變化。盡管Ni-NTA-C結(jié)合到His-XPA122，但沒有觀察到明顯的熒光接通響應(yīng)。

圖22顯示在補(bǔ)充Ni-NTA-AC (25μΜ) 2分鐘(n=5)之后具有His-RFP-表達(dá)的HeLa細(xì)胞的共焦圖像。注意到藍(lán)色熒光與來自RFP的紅色熒光共定位，確定探針進(jìn)入細(xì)胞且標(biāo)記帶His-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。比例尺：10μM。

圖23顯示在用NTA-AC (25μΜ)或Ni-NTA-AC (25μΜ)處理30分鐘(n=5)之后His-RFP-His-XPA122-轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞的熒光標(biāo)記的顯微鏡圖像。在細(xì)胞內(nèi)沒有觀察到藍(lán)色熒光，由于NTA-AC在不存在Ni²⁺的情況下無法進(jìn)入細(xì)胞。比例尺：10μM。

圖24為顯示通過顯微鏡成像測(cè)定的用不同濃度的Ni-NTA-AC (0，10，25，50，100μΜ)孵育的His-XPA122-表達(dá)的大腸桿菌的存活力的圖表(n=5)。甚至當(dāng)100μΜ的Ni-NTA-AC用細(xì)胞孵育時(shí)，大腸桿菌的存活力達(dá)到99% +/－1%。

圖25顯示HeLa細(xì)胞中的Ni-NTA-AC的毒性測(cè)定的圖表。Ni-NTA-AC (25和50μΜ)用HeLa細(xì)胞孵育且細(xì)胞毒性通過MTT化驗(yàn)測(cè)定(n=5)。該探針呈現(xiàn)對(duì)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞存活力的可忽略不計(jì)作用。

圖26顯示具有考馬斯藍(lán)染色和熒光的SDS-PAGE凝膠。具有(第1道)或不具有(第2道) His-XPA122過表達(dá)的大腸桿菌細(xì)胞在37℃下用Ni-NTA-AC(10μΜ)孵育30分鐘，用HEPES緩沖液洗滌，裂解并進(jìn)行電泳。注意到只有具有His-XPA122過表達(dá)的細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)烈熒光帶(對(duì)應(yīng)于~15kDa的分子量，即His-XPA122)，與不具有過表達(dá)的大腸桿菌細(xì)胞相反。M：蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(marker)。

圖27說明Ni-NTA-AF的ESI-MS光譜。

圖28顯示COS-7細(xì)胞中蛋白質(zhì)的Ni-NTA-AF標(biāo)記的共焦成像。His-FP在COS-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染并表達(dá)，且樣品用Ni-NTA-AC(25μΜ)處理(n=3)。藍(lán)色和紅色熒光共定位且在重疊圖像中顯示為紫色。比例尺：10μM。

序列概述

SEQ ID NO: 1為含有BamHI限制位點(diǎn)的用于質(zhì)粒構(gòu)建的引物。

SEQ ID NO: 2為含有XhoI限制位點(diǎn)的用于質(zhì)粒構(gòu)建的引物。

SEQ ID NO: 3為含有BamHI限制位點(diǎn)的用于質(zhì)粒構(gòu)建的引物。

SEQ ID NO: 4為含有Xhol限制位點(diǎn)的用于質(zhì)粒構(gòu)建的引物。

SEQ ID NO: 5為含有Nhel限制位點(diǎn)的用于質(zhì)粒構(gòu)建的引物。

SEQ ID NO: 6為含有BamHI限制位點(diǎn)的用于質(zhì)粒構(gòu)建的引物。

發(fā)明詳述

定義

術(shù)語“生物分子”是指通過活的生物體產(chǎn)生的分子。文中所用的實(shí)例包括但不限于多肽、蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)。如文中所用的術(shù)語“靶生物分子”是指一種生物分子，即是: (1) 能夠?qū)⑵渌浇拥膶?shí)體(例如熒光部分)主動(dòng)引導(dǎo)到靶區(qū)域，例如細(xì)胞；或(2) 優(yōu)先被靶區(qū)域被動(dòng)吸收或夾帶在其內(nèi)。所述靶生物分子可以為小分子，其旨在包括非肽和肽兩者。靶基團(tuán)還可以為大分子，其包括但不限于糖、凝集素、受體、受體的配體、蛋白質(zhì)例如BSA、抗體、聚(醚)、樹狀聚合物、聚(氨基酸)等。

術(shù)語“光反應(yīng)性交聯(lián)劑”是指用于在被紫外光或可見光激活之后以不可逆方式標(biāo)記蛋白質(zhì)、核酸和其它生物分子的可光激活的反應(yīng)基團(tuán)。光反應(yīng)性交聯(lián)劑的實(shí)例包括，但不限于，芳基疊氮化物、疊氮基-甲基-香豆素、二苯甲酮、蒽醌、某些重氮基化合物、雙吖丙啶和補(bǔ)骨脂素衍生物。在某些實(shí)施方案中，所述探針在其骨架中具有芳基疊氮化物作為交聯(lián)劑。術(shù)語“芳基疊氮化物”還稱為苯基疊氮化物，是指含有與疊氮基直接連接的芳基的化合物。

術(shù)語“熒光團(tuán)”是指吸收特定波長(zhǎng)的光且重新發(fā)射不同且通常更長(zhǎng)波長(zhǎng)的光的熒光化合物。大多數(shù)熒光團(tuán)為小分子熒光團(tuán)，表示具有含有結(jié)合芳基的確定的共軛體系或π體系的典型的大環(huán)狀化合物。典型的小熒光團(tuán)包括氧雜蒽衍生物、香豆素衍生物、熒光素衍生物和BODIPY衍生物等。該標(biāo)簽-標(biāo)記對(duì)策略當(dāng)然能夠受益于化學(xué)熒光團(tuán)的不同選擇，且與熒光蛋白質(zhì)相比，這些熒光化合物的響應(yīng)時(shí)間相對(duì)短和穩(wěn)定。現(xiàn)在選擇香豆素和熒光素用于該目的，但各種熒光團(tuán)可以容易地從商業(yè)上獲得或通過簡(jiǎn)單合成獲得以用于未來計(jì)劃。

術(shù)語“接頭”是指用于不同目的的碳鏈(C)_n，文中的“C”是指碳原子。其可以為烴鏈以提高試劑的親油性或?yàn)殡男蛄幸蕴岣哂H水性。接頭的合適長(zhǎng)度對(duì)該目的是重要的。在一些實(shí)施方案中使用的例示性連接基團(tuán)-(C4H8)-使當(dāng)滲透細(xì)胞膜且接近生物分子靶標(biāo)時(shí)由大環(huán)狀熒光團(tuán)和螯合劑引起的干擾最小化。連接基團(tuán)并不限于烷基?！翱闪呀饨宇^”為具有一個(gè)或多個(gè)可以由于反應(yīng)或條件而斷裂的可裂解基團(tuán)的接頭。

術(shù)語“金屬螯合”是指金屬-螯合部分以提高的穩(wěn)定性結(jié)合金屬離子的方式。在一些實(shí)施方案中，金屬螯合在金屬離子和金屬螯合部分之間發(fā)生，且在金屬離子和帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)之間發(fā)生，且具有相對(duì)較強(qiáng)的親和力。

術(shù)語“金屬-螯合部分”是指金屬離子附接到的部分，其常常為環(huán)狀或環(huán)結(jié)構(gòu)中的多齒配體，其根據(jù)尺寸、電荷、配位幾何和路易斯酸特征與金屬離子配位。金屬-螯合部分的實(shí)例包括但不限于，次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺、乙二胺四乙酸(EDTA)和亞氮基二乙酸(IDA)。它們往往用于結(jié)合金屬以啟動(dòng)金屬與蛋白質(zhì)配位的可利用性。在一些實(shí)施方案中，NTA部分螯合鎳(II)離子以形成用于位點(diǎn)特異性標(biāo)記帶his-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的Ni²⁺-NTA螯合室(compartment)。在一些實(shí)施方案中為了更好結(jié)果考慮其它螯合配體。

術(shù)語“輻射”是指這樣的過程，通過所述過程使對(duì)象暴露到輻射例如紫外、可見光、微波和紅外。術(shù)語“紫外輻射”是指在特定波長(zhǎng)紫外光下的輻射過程。其在消毒、農(nóng)業(yè)，醫(yī)學(xué)和工業(yè)領(lǐng)域中具有不同應(yīng)用。光反應(yīng)性交聯(lián)劑在通過紫外光激活之后以不可逆方式標(biāo)記蛋白質(zhì)、核酸和其它生物分子。在一些實(shí)施方案中，熒光探針用光能或UV光(一般為200-400nm波長(zhǎng))或通常具有340-380nm的波長(zhǎng)的UV光激發(fā)。

術(shù)語“多組氨酸標(biāo)簽”是指氨基酸基序常常在蛋白質(zhì)的N-或C-末端包含至少六個(gè)組氨酸((His)_n，n≥6)殘基。多組氨酸蛋白質(zhì)的實(shí)例包括但不限于，六組氨酸((His)₆)和十組氨酸(His)₁₀，其亦是公知的且廣泛用于生物化學(xué)。

術(shù)語“共價(jià)”是指當(dāng)它們共享電子對(duì)以形成鍵時(shí)原子之間力的穩(wěn)定平衡。所采用的交聯(lián)劑可以通過光激活產(chǎn)生以提供靶標(biāo)的共價(jià)連接。自修飾蛋白質(zhì)融合標(biāo)簽用于通過生物正交反應(yīng)產(chǎn)生與相應(yīng)的配體的不可逆結(jié)合，由此提供最小背景的顯著特異性且確保在變性條件中進(jìn)一步分析。在一些實(shí)施方案中，與靶蛋白質(zhì)的金屬配位提供探針非共價(jià)結(jié)合到靶標(biāo)和光反應(yīng)性交聯(lián)劑自組裝到相應(yīng)的蛋白質(zhì)，且隨后共價(jià)連接將通過樣品的光激活實(shí)現(xiàn)以進(jìn)行進(jìn)一步分離和蛋白質(zhì)鑒別過程。這樣至蛋白質(zhì)靶標(biāo)的共價(jià)鍵合用于鑒別蛋白質(zhì)，在整個(gè)變性分離過程中保留熒光標(biāo)記并允許切除相應(yīng)的蛋白質(zhì)以在全蛋白質(zhì)組中檢測(cè)。

文中的術(shù)語“接通”是指非破壞性和即時(shí)檢測(cè)到的熒光增強(qiáng)。在一些實(shí)施方案中，金屬-螯合探針的熒光在螯合金屬離子例如鎳(Il)離子之后猝滅。文中的術(shù)語“猝滅”時(shí)指熒光快速消失，這還稱為熒光斷開。然而當(dāng)Ni²⁺-螯合探針與Ni²⁺-螯合的帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)混合時(shí)，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度顯著提高。所記錄的熒光提高確保接通體系。

文中的術(shù)語“生理學(xué)條件”是指監(jiān)控可以在具有合適的緩沖溶液的活生物體中出現(xiàn)的外部或內(nèi)部環(huán)境的實(shí)驗(yàn)室條件，例如pH 7.2-7.4，溫度20-40℃和大氣氧濃度。在文中使用一些常見緩沖體系，包括20mM HEPES (4-(2-羥基乙基)-哌嗪乙磺酸)與100mM氯化鈉(pH 7.2)、PBS(磷酸鹽緩沖鹽水，pH 7.4)或20mM Tris-HCl (三(羥基甲基)氨基甲烷，pH 7.2)，其在一些實(shí)施方案中應(yīng)用。

術(shù)語“生物樣品”是指在實(shí)驗(yàn)室中作為研究的實(shí)驗(yàn)體系使用的生物樣本。文中所用的實(shí)例包括，但不限于，檢測(cè)、定位和分析細(xì)胞中帶his-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的細(xì)菌細(xì)胞、植物細(xì)胞和組織、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和組織。

術(shù)語“共焦成像”是指用共焦培養(yǎng)皿進(jìn)行的熒光成像。例如，可以利用具有Plan-Apochromat 63x 1.40NA油浸目鏡的Car1 Zeiss LSM700反向共焦顯微鏡。

術(shù)語“SDS-PAGE”是指用變性凝膠電泳的蛋白質(zhì)分離過程。在一些實(shí)施方案中，SDS-PAGE使用15%分離膠進(jìn)行。熒光凝膠成像可以通過來自GE Healthcare的ImageQuant 350和Typhoon 9410系統(tǒng)捕獲。變性凝膠可以通過考馬斯藍(lán)(和/或蛋白質(zhì)印跡)染色進(jìn)行比較。

如文中所用的術(shù)語“載體分子”是指共價(jià)鍵合到生物或非生物組分的熒光(fluorogenic)或熒光(fluorescent)化合物。這種組分包括但不限于，氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、多糖、核苷、核苷酸、寡聚核苷酸、核酸、半抗原、補(bǔ)骨脂素、藥物、激素、脂質(zhì)、脂質(zhì)組裝體、合成聚合物、聚合微粒、生物細(xì)胞、病毒及其組合。

如文中所用的術(shù)語“可檢測(cè)的響應(yīng)”是指通過觀察或通過儀器可直接或間接檢測(cè)的信號(hào)的變化或出現(xiàn)。通常，可檢測(cè)的響應(yīng)為導(dǎo)致波長(zhǎng)分布模式或吸光度或熒光強(qiáng)度改變或光散射、熒光壽命、熒光極化或上述參數(shù)的組合改變的光學(xué)響應(yīng)。

六組氨酸-Ni-NTA體系業(yè)已廣泛用于蛋白質(zhì)純化且全世界存在大量的帶His-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)庫。研究用于蛋白質(zhì)在活細(xì)胞中成像的這樣一種體系提供用于追蹤各種細(xì)胞事件的許多機(jī)會(huì)，且對(duì)目的蛋白具有最小空間和功能干擾。然而，先前報(bào)道的基于Ni-NTA的探針遭受差的膜滲透性且只限于標(biāo)記膜蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供第一個(gè)小熒光探針Ni-NTA-AC，其可以快速跨過細(xì)胞膜以在各種類型的活細(xì)胞中甚至在植物組織中特異性靶向帶His₆-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。所述探針提供用于原位分析各種細(xì)胞事件的新機(jī)會(huì)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，熒光探針由報(bào)道部分(熒光團(tuán))、通過接頭連接到熒光團(tuán)的金屬-螯合部分和光反應(yīng)性交聯(lián)劑構(gòu)成(圖1)。螯合到熒光探針的金屬離子引導(dǎo)試劑以標(biāo)記帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)，而接近地所述光反應(yīng)性交聯(lián)劑通過UV輻射光激活以充當(dāng)靶蛋白質(zhì)上的第二錨點(diǎn)且因此給熒光標(biāo)記提供額外的穩(wěn)定性。這樣的錨接的優(yōu)點(diǎn)在于結(jié)合實(shí)際上是共價(jià)的，因此激增探針的結(jié)合親和力，且標(biāo)記可以甚至在靶蛋白質(zhì)變性(其可以破壞金屬-螯合部分到多組氨酸標(biāo)簽的金屬-配位)之后保持。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述探針包括藍(lán)色香豆素衍生物(7-氨基-4-

甲基香豆素-3-乙酸，AMCA)作為熒光團(tuán)，這說明了其優(yōu)異的靈敏度和小尺寸。金屬-螯合部分次氮基三乙酸(NTA)用于與金屬離子部分配位，允許基于到標(biāo)簽的金屬配位追蹤帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)，其可以分為通用的金屬-螯合試劑，且可能與各種硬金屬至邊界金屬離子(路易斯酸)例如Ni²⁺、Cu²⁺和Co²⁺配位(Haas，K. L. & Franz，K. J. Chem. Rev.109，4921-4960 (2009))，使其相對(duì)適用于追蹤結(jié)合到過渡金屬的帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。熒光劑還具有光反應(yīng)性交聯(lián)劑芳基疊氮化物，以不可逆方式錨接到目的靶標(biāo)上，前提是交聯(lián)的引發(fā)只需要通過365nm的紫外輻射簡(jiǎn)單光激活 (Hintersteiner，M.等，ChemBioChem 9，1391-1395 (2008))。這樣至蛋白質(zhì)靶標(biāo)的共價(jià)鍵合有助于在整個(gè)變性蛋白質(zhì)分離過程(例如凝膠電泳)中保留熒光標(biāo)記并允許切除相應(yīng)的蛋白質(zhì)以在全蛋白質(zhì)組中檢測(cè)(圖2)。

熒光標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)在于金屬離子通過探針螯合引起熒光猝滅，而帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的標(biāo)記增強(qiáng)熒光信號(hào)以產(chǎn)生“接通”響應(yīng)。然而，帶多組氨酸-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的存在引起熒光顯著提高，這說明對(duì)目的蛋白進(jìn)行小-分子-熒光標(biāo)記。在另一個(gè)實(shí)施方案中，引入帶多組氨酸-標(biāo)簽的XPA122蛋白質(zhì)(His-XPA122)可以引起Ni²⁺-NTA-AC的熒光增強(qiáng)13倍，而根據(jù)時(shí)間進(jìn)程圖(圖7A)完全標(biāo)記可以在9分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)。

在一些實(shí)施方案中，所述探針以共價(jià)鍵標(biāo)記帶多組氨酸-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)，且因此在蛋白質(zhì)經(jīng)受變性蛋白質(zhì)分離過程(例如SDS-PAGE)之后保持染色。在一些實(shí)施方案中，熒光劑因此可以應(yīng)用到活的生物樣品以靶向細(xì)胞內(nèi)(和膜結(jié)合的)帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。例如，除了植物細(xì)胞和組織之外，生物樣品包括但不限于，細(xì)菌樣品、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和組織。

在文中提供具有圖1中相同結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的另一種探針NTA-AF(圖2)，其包含熒光素-衍生的熒光團(tuán)、連接到熒光團(tuán)的金屬-螯合次氮基三乙酸(NTA)部分接頭和芳基疊氮化物光反應(yīng)性交聯(lián)劑(圖12)。

因此，提供以下非限制性實(shí)施方案：

1. 用于靶向生物樣品中的生物分子的熒光探針，其包含產(chǎn)生熒光信號(hào)的熒光團(tuán)報(bào)道部分、螯合用于與編碼到靶蛋白質(zhì)的多組氨酸標(biāo)簽配位的金屬離子的金屬-螯合部分、連接所述熒光團(tuán)報(bào)道部分和金屬-螯合部分的接頭和充當(dāng)?shù)桨械鞍踪|(zhì)上的錨點(diǎn)以激增標(biāo)記親和力和穩(wěn)定性的光反應(yīng)性交聯(lián)劑。

2. 根據(jù)實(shí)施方案1的熒光探針，其中在吸收光能之后所述報(bào)道部分的熒光信號(hào)具有約400-約800nm的波長(zhǎng)。

3. 根據(jù)實(shí)施方案1-2中任一項(xiàng)的熒光探針，其中所述報(bào)道部分包含香豆素-衍生物、熒光素-衍生物和若丹明-衍生物。

4. 根據(jù)實(shí)施方案1-3中任一項(xiàng)的熒光探針，其中所述金屬螯合部分包含多齒配體。

5. 根據(jù)實(shí)施方案4的熒光探針，其中所述多齒配體包含次氮基三乙酸(NTA)和亞氮基二乙酸(IDA)。

6. 根據(jù)實(shí)施方案1-5中任一項(xiàng)的熒光探針，其中所述金屬-螯合部分包含含有鎳(II)、鈷(II)和銅(II)金屬離子中至少一種的螯合金屬離子。

7. 根據(jù)實(shí)施方案1-6中任一項(xiàng)的熒光探針，其中所述熒光團(tuán)和所述金屬-螯合部分之間的接頭為烴鏈或肽序列。

8. 根據(jù)實(shí)施方案1-7中任一項(xiàng)的熒光探針，其中所述光反應(yīng)性交聯(lián)劑包含芳基疊氮化物、雙吖丙啶和二苯甲酮,

9. 根據(jù)實(shí)施方案8的熒光探針，其中所述光反應(yīng)性交聯(lián)劑包含或不包含作為熒光團(tuán)的共軛體系的一部分。

10. 根據(jù)實(shí)施方案8-9中任一項(xiàng)的熒光探針，其中所述光反應(yīng)性交聯(lián)劑呈現(xiàn)光激活，其通過在所述熒光探針與生物樣品中帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)配位之后紫外輻射約5-約15分鐘實(shí)現(xiàn)。

11. 根據(jù)實(shí)施方案10的熒光探針，其中所述紫外輻射的范圍為約340nm-約380nm。

12. 根據(jù)實(shí)施方案1-11中任一項(xiàng)的熒光探針，其中包括鎳(II)、鈷(II)和銅(II)離子的金屬離子的螯合產(chǎn)生金屬-螯合探針的熒光猝滅。

13. 根據(jù)實(shí)施方案1-12中任一項(xiàng)的熒光探針，其中所述探針與金屬離子以1: 1摩爾比配位。

14. 根據(jù)實(shí)施方案1-13中任一項(xiàng)的熒光探針，其中標(biāo)記靶生物分子通過經(jīng)由所述探針的金屬-螯合與編碼到所述生物分子的多組氨酸標(biāo)簽配位而實(shí)現(xiàn)。

15. 根據(jù)實(shí)施方案14的熒光探針，其中當(dāng)所述金屬-螯合熒光探針在pH 6-8的緩沖液中標(biāo)記帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)時(shí)，所述金屬-螯合熒光探針呈現(xiàn)熒光信號(hào)的提高(“接通”響應(yīng))并實(shí)現(xiàn)所述提高。

16. 根據(jù)實(shí)施方案15的熒光探針，其中當(dāng)所述金屬-螯合熒光探針在約4℃-約40℃的溫度下標(biāo)記帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)時(shí)，所述金屬-螯合熒光探針呈現(xiàn)熒光信號(hào)的增強(qiáng)。

17. 根據(jù)實(shí)施方案16的熒光探針，其中帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的標(biāo)記對(duì)過夜孵育穩(wěn)定。

18. 根據(jù)實(shí)施方案1-17中任一項(xiàng)的熒光探針，其中帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的標(biāo)記在所述蛋白質(zhì)用約90℃-約110℃的溫度變性之后保持。

19. 根據(jù)實(shí)施方案17的熒光探針，其中帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)記能夠在非變性或變性凝膠電泳之后在凝膠上顯現(xiàn)。

20. 標(biāo)記帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的方法，其包括：

通過熒光探針的金屬螯合將多組氨酸標(biāo)簽編碼的蛋白質(zhì)與靶生物分子配位，所述熒光探針包含在吸收光能之后產(chǎn)生熒光信號(hào)的熒光團(tuán)報(bào)道部分、螯合用于與編碼到靶蛋白質(zhì)的多組氨酸標(biāo)簽配位的金屬離子的金屬-螯合部分、連接所述熒光團(tuán)和金屬-螯合部分的接頭和充當(dāng)?shù)桨械鞍踪|(zhì)上的錨點(diǎn)以激增標(biāo)記親和力和穩(wěn)定性的光反應(yīng)性交聯(lián)劑。

21. 根據(jù)實(shí)施方案20的方法，其中所述熒光探針產(chǎn)生在吸收光能之后具有約400-約800nm的波長(zhǎng)的熒光信號(hào)。

22. 根據(jù)實(shí)施方案20-21中任一項(xiàng)的方法，其中帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的標(biāo)記在包含細(xì)菌細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物組織、植物細(xì)胞或植物組織的生物樣品中實(shí)現(xiàn)。

23. 根據(jù)實(shí)施方案22的方法，其中所述標(biāo)記在約4℃-約40℃的溫度下進(jìn)行。

24. 根據(jù)實(shí)施方案22的方法，其還包括通過緩沖液進(jìn)行洗滌。

25. 根據(jù)實(shí)施方案20-24中任一項(xiàng)的方法，其還包括進(jìn)行共焦成像。

26. 根據(jù)實(shí)施方案22的方法，其中引入所述熒光探針不損害所述生物樣品。

材料和方法

NTA-AC的合成。合成NTA-AC包括三個(gè)步驟且整體產(chǎn)率為64% (圖3)。分析型薄層層析法(TLC)使用Macherey-Nage1預(yù)先包被的0.25mm厚TLC-板(具有熒光指示劑UV254的硅膠60)進(jìn)行。來自Merck的硅膠60用于快速柱層析法(230-400目ASTM)。用于電噴霧離子化質(zhì)譜法(ESI-MS)的HPLC級(jí)的水得自Labscan。用于NMR的氘化溶劑購(gòu)自Cambridge Isotope Laboratories (對(duì)于丙酮-d6)和Sigma-Aldrich (對(duì)于D₂O)。質(zhì)子和碳磁共振光譜(¹H和¹³C NMR)實(shí)驗(yàn)在298 K下在Bruker Avance-300和Avance-500光譜儀上進(jìn)行。ESI-MS光譜使用Finnigan LCQ光譜儀收集。

探針NTA-AC通過圖3A中所示的三步合成法合成。所有反應(yīng)避免曝光進(jìn)行。

在一個(gè)實(shí)施方案中，NTA-A的熒光光譜在25℃的水中在Hitachi F-7000熒光分光光度計(jì)上使用1000W氙燈源測(cè)定，且激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度設(shè)定在5.0nm，同時(shí)光電倍增管電壓設(shè)定在700V。具有1.5mL樣品體積的1cm x 1cm石英比色皿應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)。具有5μM溶解在25℃的水中的NTA-AC的樣品用近紫外波長(zhǎng)激發(fā)并在藍(lán)光區(qū)域中發(fā)射，呈現(xiàn)在λ_ex=342nm的激發(fā)最大值和中心在λ_em=448nm的發(fā)射(圖6)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，NTA-AC與Ni²⁺離子的結(jié)合化學(xué)計(jì)量通過NTA-AC和Ni²⁺離子在Tris-HCl緩沖液中的熒光變化的Job's圖測(cè)定。NTA-AC和Ni²⁺離子的濃度恒定地保持在總共10μM，且11種溶液具有變化濃度的NTA-AC和Ni²⁺離子且在檢測(cè)之前孵育30分鐘。Ni²⁺-NTA-AC絡(luò)合的化學(xué)計(jì)量通過監(jiān)控?zé)晒庾兓?λ_ex=342nm和λ_em=448nm)測(cè)量且在[Ni²⁺]/{[Ni²⁺]+[NTA-AC]相交的點(diǎn)的標(biāo)繪等于0.5，指示Ni²⁺-NTA-AC的絡(luò)合源自1:1的Ni²⁺:NTA-AC比率(圖3C)。Ni²⁺離子與NTA-AC配位通過質(zhì)譜法監(jiān)控，其在560.0m/z(計(jì)算值560.0m/z)呈現(xiàn)峰值，證實(shí)Ni²⁺-NTA-AC以等于1:1的Ni²⁺:NTA-AC比率形成。

2-(7-疊氮基-4-甲基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)乙酸(1)

(1)根據(jù)文獻(xiàn)合成。(Thevenin BJ等. (1992) Eur J Biochem 206 (2):471-477)。簡(jiǎn)而言之，7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(0.143g，0.61mmol)與亞硝酸鈉(0.045g，0.65mmol)在含有濃硫酸(1mL)的水(6mL)中在冰浴中混合。隨后，將疊氮鈉(0.051g，0.79mmol)加到冰浴中的混合物中，且連續(xù)攪拌45分鐘，且形成沉淀物。將沉淀物過濾，用冰冷的水洗滌，隨后通過凍干干燥并作為淺褐色粉末(0.135g，0.52mmol，85%產(chǎn)率)獲得。

2,5-二氧代吡咯烷-l-基 2-(7-疊氮基-4-甲基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)乙酸酯(2)

(2). 將化合物(1) (0.129g，0.50mmol)溶解在25mL乙腈中并在室溫下攪拌。隨后將N-羥基琥珀酰亞胺(0.058g，0.51mmol)和N，N'-

二環(huán)己基碳亞胺(0.105g，0.51mmol)加到反應(yīng)燒瓶中且反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜。將溶液過濾，且將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以產(chǎn)生粗制黃色產(chǎn)物，其隨后溶解在氯仿中以進(jìn)行簡(jiǎn)單的溶劑提取。粗制黃色固體(2)在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)之后獲得。

(S)-2,2'-(5-(2-(7-疊氮基-4-甲基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)乙酰氨基)-l-羧基戊基氮烷二基)二乙酸 (NTA-AC)

將化合物(2)溶解在乙腈(50mL)中并在室溫下攪拌。將N_α,N_α-雙(羧基甲基)-L-賴氨酸水合物(0.180g，0.69mmol)溶解在補(bǔ)充三乙胺(0.5mL)的水(10mL)中。隨后將該溶液逐滴加到(2)的溶液中,且反應(yīng)混合物在室溫下連續(xù)攪拌過夜。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和凍干之后，粗制產(chǎn)物通過柱層析純化以得到淺黃色粉末NTA-AC (0.198g，0.39mmol，與第二反應(yīng)中的反應(yīng)物1相比79%產(chǎn)率) (整體產(chǎn)率為64%)。IR(Nujol, cm^-1)：3413.8 (br), 2725.2 (m), 2119.6 (m), 1645.2 (s), 1461.9 (s), 1307.6 (m), 1159.1 (w), 1097.4 (w), 1035.7 (w), 964.3 (w), 866.0 (w), 721.3 (m)。¹H NMR (500MHz, D₂O) (圖4A)：δ 7.70 (d, J=8.69 Hz, 1H), δ 7.03 (d, J=8.62 Hz, 1H), δ 6.94 (s, 1H), δ 3.80 (br s, 5H), δ 3.63 (s, 2H), δ 3.24 (s, 2H), δ 2.39 (s, 3H), δ 1.98 (s, 2H), δ 1.59 (br s, 4H). ¹³C NMR (500 MHz, D₂O) (圖4B)：δ 180.794, δ 172.698, δ 171.057, δ 163.884, δ 152.817, δ 152.765, δ 144.057, δ 127.385, δ 117.926, δ 117.378, δ 116.407, δ 106.835, δ 68.977, δ 55.999, δ 55.696, δ 39.606, δ 34.383, δ 28.616, δ 27.119, δ 24.320, δ 23.042, δ 15.298。ESI-MS (m/z) (圖5)：[M+Na]⁺ 計(jì)算值526.1，觀測(cè)值526.1。Ni-NTA-AC ESI-MS (m/z)：[M-3H]^-計(jì)算值558.9，觀測(cè)值558.6。

NTA-C的合成

(S)-二甲基-2,2'-((6-氨基-l-甲氧基-l-氧代己-2-基)氮烷二基)二乙酸酯(3)。

將(S)-2，2'-((5-氨基-l-羧基戊基)氮烷二基)二乙酸(100mg，0.43mmol)溶解在30mL甲醇中且將該溶液冷卻到0℃，隨后將SOCl₂(623μl，8.58mmol)以逐滴方式加入?；旌衔镌?5℃的回流下攪拌48小時(shí)，隨后將溶劑旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以提供無色油狀產(chǎn)物。假定保護(hù)步驟為100%產(chǎn)率且(3)在不進(jìn)一步純化的情況下用于下一個(gè)步驟。¹H NMR (300MHz, CD₃OD)：δ 4.53-4.35 (m, 5H), 3.90 (s, 3H), 3.88 (s, 6H), 3.08-2.96 (m, 2H), 2.15-2.02 (m, 2H), 1.87-1.73 (m, 2H), 1.72-1.60 (m, 2H). ESI-MS (m/z) (圖5)：[M+Na]⁺ 計(jì)算值305.2，觀測(cè)值305.2。

(S)-二甲基-2，2'-((6-(2-(7-氨基-4-甲基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)乙酰氨基)-1-甲氧基-1-氧代己-2-基)氮烷二基)二乙酸酯(4)

將2-(7-氨基-4-甲基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)乙酸(30mg，0.13mmol)溶解在1mL DMF中，隨后加入HATU(GL Biochem) (98mg，0.26mmol)。在5分鐘之后，加入DIEA (90PL，0.516mmol)和(3) (51mg，0.167mmol)的0.5mL DMF和2mL DCM的溶液，且在稀釋到50mL DCM中之前，攪拌反應(yīng)混合物2小時(shí)。有機(jī)相用5%乙酸、水和鹽水洗滌，經(jīng)無水硫酸鎂干燥。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)之后，殘留物通過快速層析純化以提供(4) (12mg，18%產(chǎn)率)。ESI-MS (m/z)：[M+Na]⁺ 計(jì)算值542.2，觀測(cè)值542.3。

(S)-6-(2-(7-氨基-4-甲基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)乙酰氨基)-2-((羧基甲基)(過氧氫基甲基)氨基)己酸 (NTA-C)

將LiOH·H₂O(8mg，0.19mmol)溶解在4.5mL溶液混合物(H₂O:THF:MeOH為1:4:1)中，且隨后加入(4) (10mg，0.019mmol)且溶液進(jìn)一步攪拌48小時(shí)。使用樹脂(Dowex? 50Wx8氫形式)以通過調(diào)節(jié)pH到6除去Li⁺離子，且隨后將溶劑旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)且通過凍干除去水以產(chǎn)生NTA-C。(3.5mg，39%產(chǎn)率)¹H NMR (300 MHz, D₂O)：δ 7.49 (d, J=8.3Hz, 1H), 6.76 (d, J=9.3Hz, 1H), 6.64 (s, 1H), 3.78-3.65 (m, 5H), 3.45 (s, 2H), 3.17-3.04 (m, 2H), 2.24 (s, 3H), 1.88-1.63 (m, 2H), 1.53-1.27 (m, 4H)。¹³C NMR (400Hz, D₂O)：ι 172.94, 172.63, 170.36, 164.38, 153.38, 148.02, 126.90, 114.40. 114.36, 113.29, 102.77, 68.23, 55.39, 39.03. 33.90, 28.12, 26.59, 23.63, 14.77。ESI-MS (m/z)：[M-2H+K]^-計(jì)算值514.5，觀測(cè)值514.5。

NTA-AF的合成

疊氮基熒光素的合成-將熒光素-胺(0.1340g，0.38mmol)溶解在10mL甲醇中，且將0.1506g NaNO₂溶解在4mL水中并加到該溶液中，隨后加入4mL 5M鹽酸。將疊氮鈉(0.1827 g)溶解在4mL水中且逐滴加到反應(yīng)混合物中。在室溫下攪拌140分鐘且用TLC檢查之后，該溶液在真空下濃縮，隨后過濾并用冷水洗滌。所有步驟在黑暗或箔包裝中進(jìn)行。產(chǎn)率：92.06%。¹H NMR (400 MHz，CO(CD₃)₂)：δ=7.57 (s，1H，ArH)，7.47 (d，1H，ArH)，7.29 (d，1H，ArH)，6.71-6.58 (m，6H，ArH)。ESI-MS (m/z)：[M+H]⁺ 計(jì)算值374.1，觀測(cè)值374.1。

NTA-胺的保護(hù)-在冰浴中，將NTA-胺(0.1006g，0.38mmol)溶解在30mL甲醇中，且SOCl₂ (332μL，4.57mmol)逐滴加到溶液中。使該混合物回流并在油浴中攪拌48小時(shí)，且在蒸發(fā)之后獲得油狀產(chǎn)物。¹H NMR (400 MHz，MeOD)：δ=4.52-4.38 (m，5H)，3.81 (d，3H+6H)，2.95 (t，2H)，2.10-1.59 (m，6H，2H+2H+2H)。ESI-MS (m/z)：[M+H]⁺計(jì)算值304.2，觀測(cè)值305.3。

探針前體(pro-probe)的合成-在0℃下，將疊氮基熒光素(0.1141 g，0.3mmol)、l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDCI，0.0544 g，0.35mmol)、1-羥基苯并三唑水合物(HOBT，0.1210 g，0.79mmol)和N-甲基嗎啉(NMM，0.15mL，1.2mmol)溶解在無水DMF(5mL)中并在氮?dú)庵袛嚢?小時(shí)。隨后，將之前合成的NTA前體(pro-NTA)溶解在2mL無水DMF中且逐滴加入。將該溶液在室溫下在氮?dú)庀聰嚢柽^夜。在用TLC檢查之后，在壓力下除去溶劑，將殘留物溶解在乙酸乙酯中并用飽和氯化鈉洗滌，隨后有機(jī)相經(jīng)MgSO₄干燥。在除去乙酸乙酯之后，粗制產(chǎn)物通過硅膠柱層析法(溶劑：EA/己烷=2.5：l)純化，獲得干凈產(chǎn)物且產(chǎn)率為25.07%。¹H NMR (400 MHz，CDCl₃)：δ=7.58 (s，1H，ArH)，7.10 (d，1H，ArH)，7.04 (d，1H，ArH)，6.68-6.42 (m，6H，ArH)，3.66-3.51 (d，6H+3H)，3.46 (m，4H)，3.17 (t，1H)，2.98 (t，2H)，1.98-0.91 (m，6H，2H+2H+2H)。 ¹³C NMR (400MHz，CDC1₃)：δ 23.341，27.696，30.000，40.422，51.606，51.932，52.521，64.812，64.983，77.287，98.916，103.289，110.007，110.115，112.622，113.051，123.951，125.233，129.136，132.738，141.208，149.376，152.720，152.761，154.138，157.955，158.023，167.526，172.411，173.300. dept NMR：δ 23.263，27.617，29.914，40.349，52.432； 51.527，51.853，64.723，103.201，103.245，112.543，112.970，123.877，125.177，129.058。ESI-MS (m/z)：[M+Na]⁺ 計(jì)算值682.2，觀測(cè)值682.2。

脫保護(hù)-將30.6mg探針前體(0.046mmol)、氫氧化鋰(LiOH·H₂O，0.0201 g，0.48mmol)在0℃下溶解在6mL 4:1:1的THF:甲醇:水中。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物60小時(shí)，隨后在真空中蒸發(fā)。加入5mL甲醇以溶解且蒸發(fā)兩次以除去溶劑。¹H NMR (400 MHz，CD₃OD)：δ=7.55 (s，1H，ArH)，7.24 (d，1H，ArH)，7.06 (d，1H，ArH)，6.64-6.39 (m，6H，ArH)，3.68-3.58 (m，4H+1H)，3.09 (t，2H)，1.60-0.99 (m，6H，2H+2H+2H)。¹³C NMR (400MHz，CDC₁₃)：δ 23.387，27.417，28.757，39.504，53.898，65.008，65.442，102.284，109.253，109.326，112.324，123.721，125.120，128.699，128.777，132.636，141.275，149.645，152.839，152.925，158.979，167.599，173.924。 dept NMR：δ：23.290，27.328，28.661，39.404，53.809； 65.346，102.192，112.026，112.236，123.635，125.032，128.611，128.689。ESI-MS (m/z)：[M+H]⁺ 計(jì)算值618.2，觀測(cè)值618.5。

在一些實(shí)施方案中，基于熒光素的熒光探針NTA-AF在λ_em=518nm呈現(xiàn)其綠色熒光，且激發(fā)最大值位于λ_ex=496nm(圖13)。帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)His-XPA122 (12μΜ)還在4℃下用等摩爾濃度的Ni²⁺-NTA-AF預(yù)先孵育1小時(shí)且隨后光反應(yīng)性交聯(lián)劑芳基疊氮化物在室溫下通過365nm的紫外輻射光激活10分鐘。SDS-PAGE分析使用15%分離膠進(jìn)行，且熒光凝膠圖像通過來自GE Healthcare的Typhoon 9410系統(tǒng)(λ_ex=488nm，λ_em=~520nm)捕獲且用考馬斯藍(lán)染色以進(jìn)行比較。該探針利于帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)His-XPA122(第1道)在凝膠上的綠色熒光標(biāo)記，且因此證明其適用性類似于NTA-AC，但以不同的顏色以提供光譜多樣性(圖14)。

哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。包含mrfp基因的pRSETB-mRFP1購(gòu)自Clontech Laboratories，Inc。在mrfp和xpa122的N-端之前加入連續(xù)組氨酸殘基。接頭(Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser)在多組氨酸標(biāo)簽和mrfp或xpa122基因之間插入以增強(qiáng)多組氨酸標(biāo)簽和靶蛋白質(zhì)之間的柔韌性。

全長(zhǎng)mrfp基因通過用引物對(duì)His-mRFP-For/His-mRFP-Rev (表1)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增。xpa122基因通過用引物對(duì)His-XPA122-For/His₆-XPA122-Rev (表1)的PCR擴(kuò)增。限制位點(diǎn)BamHI和XhoI分別在PCR產(chǎn)物的5'-和3'-端引入。PCR產(chǎn)物和載體pcDNA3.1-(+) (Life Technologies Corporation)通過限制性核酸內(nèi)切酶(New England Biolabs，Inc.)消化。在消化之后，PCR產(chǎn)物通過T4連接酶(Life Technologies Corporation)連接到pcDNA3.1-(+)載體中以獲得pcDNA3.1-His-mRFP和pcDNA3.1-His-XPA122。

表1. 用于質(zhì)粒構(gòu)建的引物

或者，為了構(gòu)建pcDNA3.1-His-mRFP-His-XPA122，全長(zhǎng)mrfp基因用引物對(duì)His-mRFPtag-For/His-mRFPtag-Rev擴(kuò)增，分別在5'和3'-端引入NheI和BamHI位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物和載體pcDNA3.1-His-XPA122通過限制性核酸內(nèi)切酶(New England Biolabs，Inc.)消化。在消化之后，PCR產(chǎn)物通過T4連接酶(Life Technologies Corporation)連接到載體pcDNA3.1-His-XPA122中以獲得pcDNA3.1-His-mRFP-His-XPA122。構(gòu)建的質(zhì)粒的序列通過DNA測(cè)序確定。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。HeLa細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。所有關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的化學(xué)品購(gòu)自Life Technologies的Gibco?，否則另有說明。HeLa細(xì)胞在補(bǔ)充10%胎牛血清(FBS)和1%抗生素(Pen Strep)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中生長(zhǎng)，且在37℃的5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HeLa細(xì)胞用制備的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染用Lipofectamine 2000(Invitrogen)進(jìn)行。HeLa細(xì)胞在不具有抗生素的10% FBS和DMEM的存在下在6-孔板(用于裂解物收集)或共焦培養(yǎng)皿(用于共焦成像)上接種。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%匯合時(shí)，將Lipofectamine和制備的質(zhì)粒以2PL/Pg的比率補(bǔ)充到細(xì)胞樣品。在轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后，培養(yǎng)基用Hank平衡鹽溶液(HBSS)替換以進(jìn)行隨后的實(shí)驗(yàn)。

His-XPA122和XPA122的過表達(dá)和純化。將質(zhì)粒pET-His₆-XPA122轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中。接種到補(bǔ)充34μg/mL卡那霉素的新鮮Luria-Bertani(LB)肉湯中的過夜培養(yǎng)物在37℃下生長(zhǎng)直到600nm(OD₆₀₀)的光密度為約0.6。蛋白質(zhì)表達(dá)在16℃下用0.2mM異丙基β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)過夜誘導(dǎo)。細(xì)菌隨后通過在4000rpm下在4℃下離心15分鐘收獲且懸浮在Tris緩沖液A (20mM Tris-HCl，pH 7.6，500mM NaCl和20mM 咪唑)中。

細(xì)胞在1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)的存在下通過超聲裂解。該細(xì)胞裂解物在10000g下在4℃下離心30分鐘以分離包涵體。上清液通過0.45μm過濾器單元過濾并施加到HisTrap Ni-NTA柱(GE Healthcare)，用相同緩沖液平衡。蛋白質(zhì)用包含300mM咪唑的Tris緩沖液洗脫。各級(jí)分通過12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。具有His-XPA122的級(jí)分通過Amicon Ultra-15離心過濾器單元(Millipore)濃縮。

為了獲得不具有His-標(biāo)簽的XPA122，將His-XPA122在Tris緩沖液B (20mM Tris-HCl，pH 7.2，130mM NaCl)中通過Amicon Ultra-15離心過濾器單元(Millipore)濃縮。His-標(biāo)簽的除去通過在20℃下在溫和振蕩下的凝血酶裂解過夜進(jìn)行，且裂解產(chǎn)物通過HisTrap Ni-ΝΤA柱(GE Healthcare)純化。

His-XPA122和XPA122在Tris緩沖液C (20mM Tris-HCl，pH 7.4，300mM NaCl)中通過Superdex 75尺寸排阻柱(GE Healthcare)經(jīng)受進(jìn)一步純化。將峰值級(jí)分收集并用Amicon Ultra-15離心過濾器單元(Millipore)濃縮。蛋白質(zhì)的純度通過15% SDS-PAGE確定且蛋白質(zhì)濃度通過BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Novagen)測(cè)定。

熒光光譜測(cè)量。熒光探針在不同條件下結(jié)合到蛋白質(zhì)使用1cm x 1cm石英比色皿(1.5mL樣品體積)在具有1000W氙燈的Hitachi F-7000熒光分光光度計(jì)上進(jìn)行。NTA-AC與Ni²⁺離子的結(jié)合化學(xué)計(jì)量通過NTA-AC和Ni²⁺離子的熒光變化的Job's圖測(cè)定。NTA-AC和Ni²⁺離子的濃度在總共10μΜ中保持恒定，其具有各種濃度的NTA-AC和Ni²⁺離子并在每一測(cè)量之前孵育30分鐘。在加入His-XPA122(10摩爾當(dāng)量)之后Ni-NTA-AC或Ni-NTA-C (1μM)的熒光變化在25℃下以每分鐘間隔測(cè)量。

為了證明His₆-標(biāo)簽和Ni²⁺存在對(duì)于特異性相互作用的意義，測(cè)定在用蛋白質(zhì)孵育之后Ni-NTA-AC的熒光變化。載脂蛋白XPA122在20mM HEPES、100mM NaCl (pH 7.4)中制備并以1μΜ增量滴定到Ni-NTA-AC (1μΜ)中。還在20mM HEPES、100mM NaCl (pH 7.4)中制備載脂蛋白His-XPA122并以1μΜ增量滴定到NTA-AC (1μΜ)中。

等溫滴定量熱法(ITC)。載脂蛋白(Apo-protein)His-XPA122在20mM HEPES、100mM NaCl(pH 7.4)中新鮮地制備，同時(shí)Ni-NTA-AC或Ni-NTA-C在使用之前在相同緩沖液中在4℃下預(yù)先孵育過夜。對(duì)于探針-蛋白質(zhì)相互作用，將Ni-NTA-AC或Ni-NTA-C(500μΜ)滴定到His-XPA122 (35μΜ)中。所有ITC實(shí)驗(yàn)在25℃下在ITC200等溫滴定量熱儀(Microcal)上進(jìn)行。

蛋白質(zhì)在SDS-PAGE上體外成像。包含Ni-NTA-AC的溶液首先用10摩爾當(dāng)量的乙二胺四乙酸(EDTA)在4℃下孵育過夜以制備NTA-AC溶液。隨后，蛋白質(zhì)(各自12μΜ)用等摩爾濃度的探針或NTA-C在4℃下預(yù)先孵育2小時(shí)，共價(jià)連接隨后使用UVP UVGL-25 Mineralight UV燈通過365nm的紫外輻射在室溫下光激活10分鐘。SDS-PAGE分析使用15%分離膠進(jìn)行。熒光凝膠圖像通過ImageQuant 350 (GE Healthcare) (λ_ex=365nm，λ_em=460-500nm)捕獲。變性凝膠通過考馬斯藍(lán)染色，之后用于比較且His-標(biāo)簽存在蛋白質(zhì)中通過蛋白質(zhì)印跡證實(shí)。

在SDS-PAGE和MALDI-MS上通過Ni-NTA-AC的His-XPA122標(biāo)記產(chǎn)率。His-XPA122蛋白質(zhì)(各自10μM)用0、0.2、0.5、1、2、5、10摩爾當(dāng)量的Ni-NTA-AC在4℃下預(yù)先孵育過夜。共價(jià)連接在室溫下在365nm的紫外輻射下經(jīng)由光激活使用UVP UVGL-25 Mineralight UV燈10分鐘實(shí)現(xiàn)。SDS-PAGE分析使用15%分離膠進(jìn)行。熒光凝膠圖像通過ImageQuant 50 (GE Healthcare) (λ_ex=365nm，λ_em=460-500nm)捕獲。變性凝膠通過考馬斯藍(lán)染色，之后用于比較。標(biāo)記產(chǎn)率通過在熒光和考馬斯藍(lán)染色之后使用Image J定量蛋白質(zhì)帶的面積獲得且相對(duì)于最大強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化。

His-XPA122蛋白質(zhì)(各自10μΜ)在20mM HEPES、100mM NaCl(pH 7.4)中用或不用各種比率的Ni-NTA-AC孵育。隨后通過Ultraflex II TOF/TOF MALDI-TOF MS(Bruker)分析。標(biāo)記效率經(jīng)由圖像J使用峰面積評(píng)估。

大腸桿菌的共焦成像和體內(nèi)研究。pET-His-XPA122或pET32a (作為對(duì)照)轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)細(xì)胞在包含34μg/mL卡那霉素(對(duì)于pET-His-XPA122)或100μg/mL氨芐西林(對(duì)于pET32a)的Luria-Bertani (LB)中在37℃下培養(yǎng)過夜，且隨后通過1:100稀釋繼代培養(yǎng)。當(dāng)OD₆₀₀達(dá)到0.6時(shí)，加入異丙基β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG) (0.2mM)以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)在16℃下表達(dá)過夜。加入Ni-NTA-AC (10μM)且進(jìn)一步在黑暗中孵育。具有或不具有His-XPA 122過表達(dá)的大腸桿菌細(xì)胞隨后在4℃下用50mM HEPES、100mM NaCl(pH 7.3)洗滌。用HEPES緩沖液將OD₆₀₀調(diào)節(jié)到0.3且在成像之前將碘化丙啶(PI) (1μg/mL)加到樣品中以檢查細(xì)胞的存活力。圖像在Carl Zeiss LSM700反向共焦顯微鏡上使用405nm激光(用于激發(fā))和555nm激光(用于激發(fā)碘化丙啶(PI))捕獲。使用分別用于熒光和相差成像的Plan-Apochromat 63x 1.40NA油浸物鏡來顯現(xiàn)細(xì)胞。細(xì)胞存活力通過測(cè)量His-XPA122-表達(dá)的大腸桿菌中非PI-染色的死細(xì)胞的百分比而測(cè)定，其在用不同濃度的Ni-NTA-AC (0-100μΜ)孵育之后通過共焦成像(n=5)捕獲。

轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞的共焦成像。HeLa細(xì)胞在共焦培養(yǎng)皿上瞬時(shí)轉(zhuǎn)染之后，細(xì)胞用HBSS洗滌一次，且該溶液被預(yù)先負(fù)載有25μM Ni-NTA-AC的HBSS替換以進(jìn)一步孵育30分鐘。隨后棄去緩沖溶液且細(xì)胞用HBSS洗滌三次并進(jìn)行共焦成像。熒光和相差圖像在Carl Zeiss LSM700反向共焦顯微鏡上使用405nm和555激光在Plan-Apochromat 63 x 1.40NA油浸物鏡下捕獲，同時(shí)發(fā)射的測(cè)量范圍(430-500nm)是固定的(對(duì)于探針的發(fā)射)且為575-700nm(對(duì)于mRFP發(fā)射)。為了定量通過探針標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)所需要的時(shí)間，His-mRFP轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞用HBSS洗滌一次，經(jīng)受共焦顯微鏡且在25μΜ Ni-NTA-AC補(bǔ)充到細(xì)胞之后每30秒引發(fā)成像。來自各個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的探針熒光強(qiáng)度通過Zen軟件(Carl Zeiss)定量并繪制。

細(xì)胞存活力的測(cè)量。將HeLa細(xì)胞接種到96-孔板(10000個(gè)細(xì)胞/孔)中并在37℃下以5% CO₂用相應(yīng)的培養(yǎng)基孵育過夜。將培養(yǎng)基替換且細(xì)胞用在培養(yǎng)基中的不同濃度(0、25和50μM)的Ni-NTA-AC在37℃下孵育30分鐘并避光。隨后除去培養(yǎng)基并用新鮮培養(yǎng)基替換，隨后加入10μL溴化(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-四唑鎓(MTT，5mg/mL，在無菌PBS中)并進(jìn)一步孵育4小時(shí)。在除去除25μL培養(yǎng)基外的其它所有之后，將50μL DMSO施加以在37℃下孵育10分鐘。各個(gè)孔的吸光率在λ=540nm下使用微板閱讀器(BIO-RAD，iMark^TM)記錄，且相對(duì)于未處理的細(xì)胞的存活力，報(bào)道細(xì)胞存活力。

煙草植物細(xì)胞的共焦成像。使用表達(dá)帶His-標(biāo)簽的芥菜(Brassica juncea)殼多糖酶的葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草(Nicotiana tabacum)Xanthi品種His-BjCHIl植物(Guan Y，Ramalingam S，Nagegowda D，Taylor PWJ，Chye M-L (2008) J Exp Bot 59(12)：3475-3484)。將煙草種子表面消毒，播種在補(bǔ)充2%蔗糖的Murashige and Skoog (MS)培養(yǎng)基且如先前報(bào)道生長(zhǎng)(Guan Y，Ramalingam S，Nagegowda D，Taylor PWJ，Chye M-L (2008) J Exp Bot 59(12)：3475-3484)。根據(jù)先前方案，原生質(zhì)體從4周齡野生型和His-BjCHIl 煙草植物的葉提取(Papadakis AK，Siminis CI，Roubelakis-Angelakis KA (2001) Plant Physiol126(l)：434-444)。剝出葉的下表皮并用提取溶液孵育3小時(shí)。分離的細(xì)胞用Ni-NTA-AC (10μΜ)孵育30分鐘且施加到顯微鏡載片上以成像。對(duì)于活的全植物中的應(yīng)用，將在MS 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的七天齡幼苗轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充Ni-NTA-AC (10μΜ)的PBS緩沖液 (pH 7.4)以浸沒根24小時(shí)。隨后用PBS緩沖液洗滌幼苗并在成像之前吸干。在具有Spectra Physics MaiTai HP可調(diào)節(jié)2-光子激光 (λ_ex=780nm和λ_em=435-470nm，572-674nm)的Carl Zeiss LSM7 10 NLO 反向共焦顯微鏡上捕獲煙草植物圖像。原生質(zhì)體使用40x1.30油浸物鏡鏡片成像，而葉上的圖像使用63x1.40油浸物鏡鏡片捕獲。

免疫印跡。細(xì)胞在超聲緩沖液 (50μM HEPES，pH 7.3，100mM NaCl)中通過超聲裂解。細(xì)胞裂解物通過12% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Hybond-P，GE Healthcare)上。該膜在TBST緩沖液(10mM Tris-HCi，pH 7.6，130mM NaCl，0.1% (v/v) Tween-20)中用5% BSA封閉1小時(shí)且用Anti-6X His tag?抗體(Abcam)在室溫下孵育1小時(shí)。隨后將膜用辣根過氧化酶-綴合的山羊抗小鼠IgG第二抗體(Abcam)孵育以用LumiGLO?試劑(Cell Signaling Technology)通過化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

實(shí)施例

熒光標(biāo)記的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于金屬離子通過探針螯合引發(fā)熒光的猝滅，而帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的標(biāo)記增強(qiáng)熒光信號(hào)以產(chǎn)生“接通”響應(yīng)。在加入Ni²⁺離子之后對(duì)NTA-AC的熒光變化的測(cè)量(λ_ex=342nm和λ_em=448nm)通過在25℃下滴定濃度為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15和20μM的Ni²⁺離子到5μM NTA-AC進(jìn)行，且在加入Ni²⁺之后，NTA-AC的熒光強(qiáng)度逐漸降低了72%(圖3B)。然而，帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的存在引發(fā)熒光顯著提高，這說明了對(duì)目的蛋白進(jìn)行小-分子-熒光標(biāo)記。在另一個(gè)實(shí)施方案中,引入帶多組氨酸標(biāo)簽的XPA122蛋白質(zhì)(His-XPAI22)可以引起Ni²⁺-NTA-AC的熒光增強(qiáng)13倍，而根據(jù)時(shí)間進(jìn)程圖(圖7A)，完全標(biāo)記可以在9分鐘內(nèi)獲得。

帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)His-XPAI22和不帶組氨酸-標(biāo)簽的XPA122 (12μM)在4℃下用等摩爾濃度的Ni²⁺-NTA-AC預(yù)先孵育1小時(shí)，且隨后光反應(yīng)性交聯(lián)劑在室溫下通過365nm的紫外輻射光激活10分鐘。SDS-PAGE分析使用15%分離膠進(jìn)行，且熒光凝膠圖像通過來自GE Healthcare的ImageQuant 350捕獲(λ_ex=365nm和λ_em=460-500nm)。變性凝膠通過考馬斯藍(lán)染色，之后用于比較，而蛋白質(zhì)中多組氨酸標(biāo)簽的存在通過蛋白質(zhì)印跡確保。與除去多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)(第4道)相比，只有帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)(第1道)可以被熒光標(biāo)記，因此證明對(duì)多組氨酸標(biāo)簽編碼的蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)記的特異性(圖7C)。

為了針對(duì)活的生物樣品試驗(yàn)熒光劑靶向細(xì)胞內(nèi)(和膜結(jié)合的)帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的應(yīng)用，將鎳(II)預(yù)先負(fù)載的探針Ni²⁺-NTA-AC (10μM)直接加到大腸桿菌培養(yǎng)物中且在黑暗中在37℃中進(jìn)一步孵育1小時(shí)，且隨后在4℃下用20mM Tris-HCl、100mM NaCl(pH 7.2)洗滌。用緩沖液將細(xì)胞的密度調(diào)節(jié)到0.3 (OD₆₀₀)且在成像之前將碘化丙啶(PI) (1μg/mL)加到樣品中以檢查細(xì)胞的存活力。在共焦成像下，與不具有帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)過表達(dá)的pET 32a樣品相比，只有過表達(dá)帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)His-XPA122的大腸桿菌細(xì)胞可以被照亮，且該細(xì)胞在整個(gè)標(biāo)記過程保持存活(圖9C)。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，表達(dá)帶多組氨酸標(biāo)簽的芥菜殼多糖酶BjCHIl(稱為His-BjCHIl)的葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草(Nicotiana tabacum)品種Xanthi植物的原生質(zhì)體從4周齡野生型和His-BjCHIl煙草植物的葉提取(圖11)，隨后分離的原生質(zhì)體在黑暗中在室溫下在共焦成像分析之前用10μΜ Ni²⁺-NTA-AC處理30分鐘。與野生型(WT)樣品相比，對(duì)于表達(dá)His-BjCHIl的細(xì)胞，強(qiáng)烈藍(lán)色熒光只在共焦顯微鏡上獲得，同時(shí)另外解釋以下事實(shí)：His-BjCHIl被表達(dá)且隨后積聚在煙草葉綠體(Guan，Y.，Ramalingam，S.，Nagegowda，D.，Taylor，P. W. J. & Chye，M.-L. J. Exp. Bot. 59，3475-3484 (2008))，藍(lán)色熒光在煙草原生質(zhì)體中共定位可以用葉綠素的自動(dòng)熒光觀察，指示出現(xiàn)通過探針熒光標(biāo)記His-BjCHIl(只在葉綠體中表達(dá))(圖11)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在共焦顯微鏡下直接研究標(biāo)記的植物組織，且將7天齡的葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草植物幼苗轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充10μΜ Ni²⁺-NTA-AC的PBS緩沖液(pH 7.4)以將根浸沒24小時(shí)，隨后洗滌并在成像之前吸干。葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草葉的遠(yuǎn)軸表面在共焦顯微鏡下直接分析，且只在His-BjCHIl葉綠體轉(zhuǎn)基因的煙草葉上的保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體上再次觀察到藍(lán)色熒光，指示該探針通過根吸收且可以檢測(cè)到活的植物內(nèi)的Ni²⁺-結(jié)合的帶多組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì) (圖10)。

熒光探針Ni-NTA-AC的設(shè)計(jì)和合成。利用Ni²⁺-次氮基三乙酸體系(包括與熒光團(tuán)綴合的二、三或四-NTA衍生物)的先前許多熒光探針只可以用于標(biāo)記細(xì)胞中的膜蛋白質(zhì)，由于這些探針遭受差的膜滲透性且?guī)缀醪荒軌蜻M(jìn)入細(xì)胞(Soh N (2008) Sensors 8(2)：1004-1024； Jing C & Cornish VW (2011) Acc Chem Res 44(9)：784-792)。據(jù)推理，高度負(fù)電荷會(huì)抑制這些探針跨過細(xì)胞膜，盡管將多-NTA引入到探針可以克服Ni-NTA與His₆-標(biāo)簽的弱結(jié)合特點(diǎn)。因此，設(shè)計(jì)一種探針(圖3A)，其由單-Ni-ΝTΑ部分、小的膜可滲透的熒光團(tuán)(香豆素衍生物) (Uttamapinant C，等. (2010) Proc Natl Acad Sci USA 107(24)：10914-10919)和芳基疊氮化物部分組成。Ni-次氮基三乙酸(NTA)將靶向His₆-標(biāo)簽以獲得目的蛋白的特異性標(biāo)記，且將芳基疊氮化物基團(tuán)摻入探針中以在光激活之后在探針及其靶蛋白質(zhì)之間提供另外的共價(jià)鍵(Melcher K (2004) Curr Protein Pept Sci 5(4)：287-296)，因此決定Ni-NTA與His₆-標(biāo)簽的固有弱結(jié)合性質(zhì)。單-Ni-NTA和熒光團(tuán)之間的接頭設(shè)計(jì)成允許Ni-NTA的柔韌性以促進(jìn)有效的蛋白質(zhì)標(biāo)記。另外，這樣的接頭還可以在活細(xì)胞標(biāo)記期間增強(qiáng)Ni-NTA-AC的膜滲透性，其將進(jìn)一步詳細(xì)說明(參見下文)。

基于香豆素的配體NTA-AC通過將次氮基三乙酸部分與香豆素?zé)晒鈭F(tuán)和芳基疊氮化物綴合經(jīng)由三步反應(yīng)首先合成，且總產(chǎn)率為64%(圖3A、圖4B和5)。該化合物的純度通過¹H NMR和ESI-MS兩者確定。該配體呈現(xiàn)在約342nm(ε=11100M^-1cm^-1)的最大吸收且在448nm (Φ=0.056)發(fā)射(圖6)。該探針Ni-NTA-AC隨后通過隨后NTA-AC與Ni²⁺ (作為NiSO₄)在緩沖水溶液中的反應(yīng)產(chǎn)生。如圖3B中所示，在加入等摩爾量的Ni²⁺到20mM Tris緩沖液(pH 7.2)中的NTA-AC之后，熒光明顯猝滅了約70%；與先前報(bào)道的NTA-DCF綴合物中所觀察到的5%降低形成鮮明對(duì)比(Goldsmith CR，Jaworski J，Sheng M，& Lippard SJ (2006) J Am. Chem Soc128(2)：418-419)，因此Ni-NTA-AC只具有在448nm的非常弱的發(fā)射。滴定數(shù)據(jù)使用Ryan-Weber方程非線性匹配(Bai YC，等. (2008) Anal Chim Acta 616(1)：115-121)，其產(chǎn)生38±13nM的離解常數(shù)(Kd)。為了評(píng)估結(jié)合化學(xué)計(jì)量，Job's圖通過監(jiān)控在NTA-AC與Ni²⁺在448nm下絡(luò)合在342nm下在20mM Tris緩沖液(pH 7.2)中激發(fā)之后熒光的變化而構(gòu)建。在0.5的Ni²⁺與NTA-AC摩爾比觀察到最大熒光變化，指示Ni-NTA-AC絡(luò)合物以1:1的NTA-AC:Ni²⁺比率形成(圖3C)。這通過觀察在來自ESI-MS的558.6的m/z的峰進(jìn)一步驗(yàn)證，與558.9的計(jì)算值(m/z)一致。

Ni-NTA-AC探針體外標(biāo)記帶His₆-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的評(píng)估

為了檢查Ni-NTA-AC在體外標(biāo)記帶His₆-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)中的可行性，DNA修復(fù)蛋白(著色性干皮癥A組)的功能域(XPA122)用作展示研究。著色性干皮癥A組充當(dāng)XP蛋白的典型形式，其對(duì)修復(fù)由紫外輻射引起的DNA損害重要；功能域XPA122充當(dāng)損害的DNA結(jié)合位點(diǎn)且因此引起修復(fù)(Cleaver JE (2005) Nat Rev Cancer 5(7)：564-573)。具有(作為His-XPA122表示)或不具有(XPA122)基因融合His₆-標(biāo)簽到其N端的蛋白質(zhì)過表達(dá)且如先前所述純化(支持信息) (Kuraoka I，等. (1996) Mutat Res 362(1)：87-95)。Ni-NTA-AC探針與蛋白質(zhì)的相互作用首先通過熒光光譜研究。用1μΜ Ni-NTA-AC孵育10摩爾當(dāng)量的His-XPA122導(dǎo)致熒光強(qiáng)度隨時(shí)間快速提高，在約9分鐘達(dá)到穩(wěn)定，在此觀察到熒光提高約13倍(圖7A)。相反，在相同條件下混合Ni-NTA-AC與XPA122之后沒有注意到明顯熒光變化(小于50%提高) (圖15)。類似地，配體NTA-AC(不具有Ni²⁺配位) 與His-XPA122在相同條件下預(yù)先混合完全不導(dǎo)致熒光增強(qiáng)(圖16)。這些組合結(jié)果指示Ni-NTA-AC通過Ni²⁺選擇性靶向蛋白質(zhì)的His₆-標(biāo)簽，導(dǎo)致熒光“接通”響應(yīng)。非特異性結(jié)合在所用的條件下可忽略不計(jì)。盡管并不完全理解探針對(duì)帶His₆-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的熒光接通響應(yīng)的基本機(jī)理，但可能是Ni²⁺-NTA和熒光團(tuán)之間的弱相互作用導(dǎo)致“夾層狀”結(jié)構(gòu)，由于存在如先前報(bào)道的柔韌接頭(Kamoto Μ，Umezawa N，Kato N，& Higuchi T (2008) Chem Eur J 14(26)：8004-8012)，其使熒光團(tuán)的熒光猝滅。這種弱相互作用可能在Ni-NTA-AC結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)帶His₆-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)之后消失，熒光團(tuán)與蛋白質(zhì)靶標(biāo)的隨后的相互作用導(dǎo)致熒光顯著提高。

Ni-NTA-AC對(duì)His-XPA122的結(jié)合性質(zhì)還通過等溫滴定量熱法(ITC)研究，其產(chǎn)生7.1±0.6μΜ的離解常數(shù)和1.4±0.1的結(jié)合能力(圖17A)，與Ni-NTA與組氨酸殘基的弱結(jié)合性質(zhì)一致。結(jié)合到His₆-標(biāo)簽的Ni-NTA-AC的非整數(shù)化學(xué)計(jì)量歸因于以下事實(shí)：一個(gè)His₆-標(biāo)簽可能可以結(jié)合一個(gè)至兩個(gè)Ni²⁺離子(Valenti LE，De Pauli CP，& Giacomelli CE (2006) J Inorg Biochem 100(2)：192-200；Knecht S，Rickiin D，Eberle AN，& Ernst B (2009) J Mol Recognit 22(4)：270-279)。該弱結(jié)合可能導(dǎo)致探針在活細(xì)胞的復(fù)雜環(huán)境中從標(biāo)記的蛋白質(zhì)離解。為了解決這個(gè)問題，將芳基疊氮化物摻入探針，以便提供在光激活之后探針及其靶蛋白質(zhì)之間的另外的結(jié)合。隨后檢查芳基疊氮化物的作用。首先，使1μΜ Ni-NTA-AC和10摩爾當(dāng)量的His-XPA122的混合物在UV光(365nm)下經(jīng)受輻射15min以確保芳基疊氮化物光激活。與Ni-NTA-AC的熒光相比，可觀察到顯著的熒光增強(qiáng)(高于10倍)，由于探針結(jié)合到His-XPA122 (圖7B)。在將40摩爾當(dāng)量的乙二胺四乙酸(EDTA)加到混合物以從探針-蛋白質(zhì)復(fù)合物剝離Ni²⁺之后，所觀察到的熒光強(qiáng)度稍微提高(約30%)，而不是降低，歸因于被Ni²⁺猝滅的熒光恢復(fù)(圖7B)。隨后，在黑暗中進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)以避免芳基疊氮化物光激活，且結(jié)果顯示熒光顯著降低(60%) (圖7B)，指示在沒有芳基疊氮化物光激活的情況下，從探針-His-XPA122復(fù)合物除去Ni²⁺廢除了探針使帶His₆-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)成像的能力?；谶@些數(shù)據(jù)，我們得出結(jié)論，芳基疊氮化物摻入探針可以克服Ni-NTA對(duì)組氨酸殘基的弱結(jié)合性質(zhì)。

用于在光激活之后增強(qiáng)探針和His-標(biāo)簽蛋白質(zhì)之間的結(jié)合的芳基疊氮化物的能力還通過在變性條件下觀察探針-蛋白質(zhì)復(fù)合物證明。Ni-NTA-AC標(biāo)記的His-XPA122通過4W Longwave Compact UV燈(720PW/cm²)用UV光(365nm)輻射10分鐘，隨后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。在SDS-PAGE凝膠中可觀察到對(duì)應(yīng)于His-XPA122的強(qiáng)烈藍(lán)色熒光帶，證實(shí)甚至在變性條件下探針與His-XPA122的強(qiáng)結(jié)合。相反，當(dāng)Ni-NTA-AC (12μΜ)在存在50μΜ EDTA的情況下與等摩爾量的XPA122或His-XPA122混合時(shí)，沒有檢測(cè)到相應(yīng)的藍(lán)色熒光帶，所述EDTA從探針除去Ni²⁺ (圖7C)，與以上觀察一致：探針通過Ni²⁺靶向到XPA122的His₆-標(biāo)簽且芳基疊氮化物基團(tuán)的隨后的光激活增強(qiáng)探針和蛋白質(zhì)之間的結(jié)合。

為了進(jìn)一步評(píng)估探針的芳基疊氮化物的作用，經(jīng)由三步反應(yīng)合成不具有附接的芳基疊氮化物的基于香豆素的配體，即NTA-C，以便比較(圖18-20)。對(duì)于NTA-C，加入等摩爾量的Ni²⁺導(dǎo)致約50%熒光降低(圖21A)。意料不到地，在與探針類似的條件下用His-XPA122孵育1μΜ Ni-NTA-C導(dǎo)致熒光不提高(圖21AB)，盡管Ni-NTA-C仍以如由ITC滴定數(shù)據(jù)證明的類似于探針Ni-NTA-AC的親和力結(jié)合到His-XPA122 (圖17B)。類似地，當(dāng)Ni-NTA-C (12μΜ)與等摩爾量的His-XPA122混合時(shí)，在SDS-PAGE上沒有檢測(cè)到明顯的藍(lán)色熒光(圖7C)。這些結(jié)果證明芳基疊氮化物不僅對(duì)增強(qiáng)探針及其靶標(biāo)之間的結(jié)合有利，而且對(duì)針對(duì)帶His₆-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的顯著熒光“接通”響應(yīng)有利。

通過監(jiān)控其對(duì)His-XPA122的反應(yīng)性進(jìn)一步評(píng)估Ni-NTA-AC對(duì)帶His₆-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的標(biāo)記效率。His-XPA122 (10μΜ)用不同摩爾當(dāng)量的Ni-NTA-AC孵育、光激活且進(jìn)行SDS-PAGE電泳(圖8A)。通過將蛋白質(zhì)帶的熒光強(qiáng)度與考馬斯染色的熒光強(qiáng)度比較，確定一摩爾當(dāng)量的Ni-NTA-AC可以標(biāo)記~50%的His-XPA122 (圖8B)。還檢查使用MALDI-TOF質(zhì)譜的標(biāo)記功效。孵育等摩爾的Ni-NTA-AC和His-XPA122且隨后在進(jìn)行MALDI-MS之前光激活。在光譜(圖8C)中，在m/z 14981和15549觀察到兩個(gè)離子峰，對(duì)應(yīng)于完整蛋白質(zhì)和與探針結(jié)合的蛋白質(zhì)(計(jì)算值14979和15541)。在將2摩爾當(dāng)量的探針加到蛋白質(zhì)溶液中之后，在m/z 15549Da的峰強(qiáng)度相對(duì)于在m/z 14981的峰強(qiáng)度進(jìn)一步提高。在m/z 16100的弱峰可指定為與兩個(gè)探針結(jié)合的蛋白質(zhì)。通過比較峰面積，發(fā)現(xiàn)在分別加入1和2摩爾當(dāng)量的Ni-NTA-AC之后，38%和62%的His-XPA122被標(biāo)記(圖8C)，與從SDS-PAGE測(cè)定的結(jié)果(圖8A-8B)一致。

Ni-NTA-AC探針膜滲透性和毒性的評(píng)估。研究活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的Ni-NTA-C的細(xì)胞滲透性。His₆-標(biāo)簽經(jīng)基因融合到紅色熒光蛋白質(zhì)(RFP) (His-RFP)的N端且在HeLa細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)該融合蛋白質(zhì)。在施用Ni-NTA-AC (25μΜ)之后，在共焦顯微鏡下使用紅色熒光作為參考監(jiān)控對(duì)His-RFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的熒光響應(yīng)?？紤]到芳基疊氮化物在通過用于捕獲圖像的共焦顯微鏡法利用的405nm激光下可以容易光激活，在所有細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中沒有使用另外的UV輻射。在不存在Ni-NTA-AC的情況下通過優(yōu)化細(xì)胞的成像參數(shù)使細(xì)胞自動(dòng)熒光最小化。如圖9A, B和圖22中所示，在用Ni-NTA-AC處理之后快速出現(xiàn)藍(lán)色熒光且在2分鐘內(nèi)達(dá)到飽和，指示探針可以快速跨過細(xì)胞膜且在結(jié)合到His-RFP之后呈現(xiàn)接通熒光。相反，在NTA-AC處理(即沒有Ni²⁺配位)之后沒有觀察到藍(lán)色熒光，指示NTA-AC本身無法進(jìn)入細(xì)胞(圖23)。這與我們的探針設(shè)計(jì)原理一致：電荷可能是決定探針的膜滲透性的重要因素。在不存在Ni²⁺的情況下，帶電荷的親水NTA部分保持暴露，且因此抑制NTA-AC跨過細(xì)胞膜。在Ni²⁺與NTA部分配位之后，總電荷顯著降低，而且，“夾層狀”結(jié)構(gòu)可能形成，由于Ni-NTA和熒光團(tuán)之間的弱相互作用以及柔韌接頭(Kamoto M，Umezawa N，Kato N，& Higuchi T (2008) Chem Eur J. 14(26)：8004-8012)，導(dǎo)致Ni-NTA部分被“埋藏”，這使得Ni-NTA-AC跨過疏水細(xì)胞膜。

還檢查細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的探針的毒性。甚至當(dāng)100μΜ Ni-NTA-AC用細(xì)胞孵育時(shí)，大腸桿菌的存活力達(dá)到約99%+/-1% (圖24)。通過MTT測(cè)定法研究的HeLa細(xì)胞的存活力顯示在用25和50μΜ Ni-NTA-AC孵育之后，超過90%細(xì)胞是活的，再次證實(shí)探針對(duì)細(xì)胞呈現(xiàn)無毒性(圖25)。

用于標(biāo)記大腸桿菌中的帶His-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的Ni-NTA-AC探針的評(píng)估。

為了檢查探針在使活細(xì)胞中的帶His-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)成像的可行性，研究用于標(biāo)記大腸桿菌細(xì)胞中His-XPA122的Ni-NTA-AC的適用性。探針(10μΜ)在37℃下用過表達(dá)His-XPA122的大腸桿菌細(xì)胞孵育30分鐘，隨后在用HEPES緩沖液(pH 7.4)洗滌之后進(jìn)行共焦成像(n=5)。如圖9C中所示，過表達(dá)His-XPA122的大腸桿菌細(xì)胞用藍(lán)色熒光染色，且隨后SDS-PAGE分析細(xì)胞裂解物顯示只有具有約15kDa分子量的一個(gè)蛋白質(zhì)帶呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，證實(shí)確實(shí)His-XPA122為唯一被標(biāo)記的蛋白質(zhì)(圖26)。相反，不具有His-XPA122表達(dá)的細(xì)胞沒有呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，顯示探針在標(biāo)記活細(xì)菌細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)帶His-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的可行性。還通過碘化丙啶(PI)染色檢查這些細(xì)胞的存活力和膜完整性。如圖9C中所示，沒有細(xì)胞被PI染成紅色，說明它們?yōu)榛罴?xì)胞。

使用Ni-NTA-AC探針使活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中帶His-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)成像。研究探針標(biāo)記哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的帶His-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的能力。具有或不具有His-XPA122轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞在37℃下補(bǔ)充25μΜ在HBSS緩沖液中的Ni-NTA-AC歷時(shí)30分鐘，洗滌且進(jìn)行共焦成像。如圖9D中所示，只有在用His-XPA122轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中觀察到主要位于核的強(qiáng)烈藍(lán)色熒光，但在沒有轉(zhuǎn)染的那些細(xì)胞中沒有觀察到。為了進(jìn)一步證實(shí)標(biāo)記蛋白質(zhì)的特性，具有或不具有His-XPA122轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用探針(25μΜ)處理且在365nm下輻射10分鐘，使得能夠光激活芳基疊氮化物，提取并濃縮轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞的核，且隨后進(jìn)行熒光成像和蛋白質(zhì)印跡(圖9E)。為了進(jìn)行比較，還研究用Ni-NTA-AC (5μΜ)標(biāo)記的純化的His-XPA122。來自His-XPA122轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的核的藍(lán)色熒光和蛋白質(zhì)印跡帶與純化的His-XPA122的那些類似，證實(shí)標(biāo)記蛋白質(zhì)實(shí)際上為在HeLa細(xì)胞中表達(dá)的His-XPA122。相反，對(duì)于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的核，沒有觀察到相應(yīng)的帶(圖9E)。

熒光蛋白業(yè)已廣泛用于研究在基因融合到目的蛋白時(shí)在活細(xì)胞的生理學(xué)情況下蛋白質(zhì)功能、定位以及其它生物事件(Lam AJ，等. (2012) Nat Meth 9：1005-1012)。然而，由于其大尺寸，使用熒光蛋白可能潛在地干擾目的蛋白的恰當(dāng)定位或功能，(Giepmans BNG，Adams SR，Ellisman MH，& Tsien RY (2006) Science 312(5771)：217-224)，特別對(duì)于相對(duì)小的蛋白質(zhì)。相反，在該問題上，基于小分子的熒光探針可能具有優(yōu)點(diǎn)。為了證明這一點(diǎn)，將帶His₆標(biāo)簽的RFP摻入帶His₆標(biāo)簽的XPA122的N端以產(chǎn)生His₆-RFP-His6-XPA122質(zhì)粒，隨后轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中以在相同條件下研究蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位。觀察到藍(lán)色熒光 (由于Ni-NTA-AC標(biāo)記) 和紅色熒光 (由于RFP的表達(dá))兩者共定位 (圖9F)。有趣的是，熒光信號(hào)均勻地分布在整個(gè)細(xì)胞中，而不是在核中富集(如對(duì)于His-XPA122所發(fā)現(xiàn))(圖9D)。蛋白質(zhì)定位的干擾可以歸因于與XPA122 (15 kDa)相比相對(duì)大尺寸的RFP (27.5kDa) (Shaner NC，Steinbach PA，& Tsien RY (2005) Nat Meth 2(12)：905-909)。相比之下，使用Ni-NTA-AC探針，發(fā)現(xiàn)His-XPA122在核中富集，這與先前報(bào)道的XPA(一種在核苷酸切除修復(fù)過程期間識(shí)別DNA損害中涉及的蛋白質(zhì))的細(xì)胞內(nèi)定位 (Uchinomiya S，Nonaka H，Wakayama S，Ojida A，& Hamachi I (2013) Chem Commun 49(44)：5022-5024；Kuraoka I，等. (1996) Mutat Res 362(l)：87-95)一致。綜合來看，證明新的熒光探針Ni-NTA-AC可以優(yōu)先應(yīng)用于追蹤活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的帶His-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)且特別是小蛋白質(zhì)的豐度和定位。

用于使植物組織中帶His-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)成像的Ni-NTA-AC探針的應(yīng)用。顯示Ni-NTA-AC可以標(biāo)記其它真核體系中的蛋白質(zhì)。如先前所述產(chǎn)生表達(dá)帶His-標(biāo)簽的芥菜(Brassica juncea)殼多糖酶BjCHIl (His-BjCHIl)的葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草(Nicotiana tabacum)Xanthi品種(Guan Y，Ramalingam S，Nagegowda D，Taylor PWJ，& Chye M-L (2008) J Exp Bot59(12)：3475-3484)。根據(jù)先前程序，原生質(zhì)體從4周齡野生型和His-BjCHIl葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草的葉(圖11)提取(Papadakis AK，Siminis CI，& Roubelakis-Angelakis KA (2001) Plant Physiol. 126(l)：434-444)。在用Ni-NTA-AC (10μΜ)孵育原生質(zhì)體30分鐘之后，在葉綠體中檢測(cè)到藍(lán)色熒光(圖11)，其中His-BjCHIl被表達(dá)且隨后積聚(Guan Y，Ramalingam S，Nagegowda D，Taylor PWJ，& Chye M-L (2008) J Exp Bot 59(12)：3475-3484)。在共焦顯微鏡下只在表達(dá)His-BjCHIl的細(xì)胞中看到葉綠體的藍(lán)色熒光與紅色自動(dòng)熒光的共定位，而不是在野生型(WT)中，指示葉綠體中的His-BjCHIl被Ni-NTA-AC標(biāo)記 (圖11)。而且，將Ni-NTA-AC (10μΜ)加到PBS緩沖液 (pH 7.4)中以浸漬7天齡葉綠體轉(zhuǎn)基因幼苗的根過夜，在成像之前洗滌并吸干。葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草葉的遠(yuǎn)軸表面經(jīng)受共焦顯微鏡法且在表達(dá)His-BjCHIl的煙草葉中再次觀察到藍(lán)色熒光(圖10)，說明探針通過幼苗的根吸收且隨后檢測(cè)到活的葉內(nèi)的帶His-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。這些結(jié)果明確證明探針、Ni-NTA-AC可以容易地延伸以標(biāo)記各種真核細(xì)胞(包括植物組織)的帶His-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。

先前的實(shí)施例說明本發(fā)明的實(shí)施方案。除非在實(shí)施例以及說明書和權(quán)利要求書中的別處另有指定，否則所有份數(shù)和百分比以重量計(jì)，所有溫度為攝氏度，且壓力為大氣壓或接近大氣壓。

針對(duì)任何圖或給定特征的數(shù)值范圍，圖或來自一個(gè)范圍的參數(shù)可以與對(duì)于相同特征的另一個(gè)圖或來自對(duì)于相同特征的不同范圍的參數(shù)合并以產(chǎn)生數(shù)值范圍。

除了操作實(shí)施例中或另有指定之外，說明書和權(quán)利要求書中使用的提及成分的量、反應(yīng)條件等的所有數(shù)字、數(shù)值和/或表達(dá)應(yīng)當(dāng)理解為在所有情況下由術(shù)語“約”修飾。

討論

蛋白質(zhì)的化學(xué)和生物化學(xué)標(biāo)記充當(dāng)用于闡明活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)功能、定位、動(dòng)力學(xué)以及其它生物事件的有力工具 (Giepmans BNG，Adams SR，Ellisman MH，& Tsien RY (2006) Science 312(5771)：21 7-224；Sletten EM & Bertozzi CR (2009) Angew Chem Int Ed48(38)：6974-6998；Uttamapinant C，Sanchez MI，Liu DS，Yao JZ，& Ting AY (2013) Nat Protoc 8(8)：1620-1634)。重組蛋白的基于小分子的熒光標(biāo)記特別有希望成為熒光蛋白(FP)-融合技術(shù)的備選(Tsien RY (1998) Ann Rev Biochem 67：509-544；Shaner NC，Steinbach PA，& Tsien RY (2005) Nat Meth 2(12)：905-909)，而不有害地?cái)_亂蛋白質(zhì)功能。將短肽引入到能夠與所設(shè)計(jì)的合成熒光探針位點(diǎn)特異性結(jié)合的目的蛋白是代表性技術(shù)，允許分析體內(nèi)功能蛋白質(zhì)。最近幾十年來，在使用基于小分子的探針來監(jiān)控細(xì)胞事件方面存在巨大進(jìn)步 (Ueno T & Nagano T (2011 ) Nat Meth 8(8)：642-645； Marks KM & Nolan G (2006) Nat Meth 3(8)：591-596)，特別是，蛋白質(zhì)的金屬螯合標(biāo)記似乎為有吸引力方法之一，由于其簡(jiǎn)單和高特異性。在大量的基于小分子的探針中，F(xiàn)lAsH及其衍生物(包括RcAsH和SplAsH)似乎為最成功的基于小分子的含金屬探針之一，其往往用于點(diǎn)亮(light-up)與四半胱氨酸基序融合的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì) (Giepmans BNG，Adams SR，Ellisman MH，& Tsien RY (2006) Science 312(5771)：217-224； Hoffmann C，等. (2010) Nat Protoc 5(10)：1666-1677； Adams SR & Tsien RY (2008) Nat Protoc 3(9)：1 527-1 534)。盡管業(yè)已指出該體系具有若干限制，例如需要充分洗滌以降低背景(Stroffekova K，Proenza C，& Beam K (2001 ) Pflugers Archiv 442(6)：859-866)或其不能應(yīng)用到細(xì)胞氧化環(huán)境(Soh N (2008) Sensors 8(2)：1004-1024)，但開發(fā)基于雙砷的熒光探針充當(dāng)了重要工作，其已鼓舞研究員設(shè)計(jì)靶向其它標(biāo)簽體系的各種探針。

考慮到(組氨酸)₆-Ni²⁺-次氮基三乙酸體系(Ni²⁺-NTA)在用于基于親和層析法的蛋白質(zhì)純化的分子生物學(xué)和生物技術(shù)中的廣泛實(shí)用性，先前亦已廣泛利用該體系以經(jīng)由與熒光團(tuán)綴合而位點(diǎn)選擇性標(biāo)記大的現(xiàn)有帶六組氨酸標(biāo)簽(His-標(biāo)簽)的蛋白質(zhì)庫(Guignet EG，Hovius R，& Vogel H (2004) Nat Biotcchnol 22(4)：440-444； Meredith GD，Wu HY，& Allbritton NL (2004) Bioconjugate Chem 15(5)：969-982； Hauser CT & Tsien RY (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104(10)：3693-3697； Hintersteiner M，等. (2008) ChemBioChem 9(9)：1391-1395； Uchinomiya S，Nonaka H，Wakayama S，Ojida A，& Hamachi I (2013 ) Chem Commun. 49(44)：5022-5024)。各種基于NTA的熒光探針經(jīng)由熒光團(tuán)與單-NTA綴合合成 (Guignet EG，Hovius R，& Vogel H (2004) Nat Biotechnol 22(4)：440-444； Goldsmith CR，Jaworski J，Sheng M，& Lippard SJ (2006) J Am Chem Soc 128(2 )：418-419)或與二、三和四NTA衍生物綴合合成以模擬FlAsH概念或克服His-標(biāo)簽與Ni²⁺-NTA的弱結(jié)合性質(zhì) (Kd=13μΜ) (Soh N (2008) Sensors 8(2)：1004-1024； Jing C & Cornish VW (2011) Acc Chem Res 44(9)：784-792；Uchinomiya S，Ojida A，& Hamachi I (2013) Inorg Chem 53(4)：1816-1823；Lata S，Gavutis M，Tampe R，& Piehler J (2006) J Am. Chem Soc 128(7)：2365-2372；Kapamdis AN，Ebright YW，& Ebright RH (2001) J Am Chem Soc 123(48)：12123-12125)。盡管與單-NTA相比多個(gè)螯合劑頭-His-標(biāo)簽復(fù)合物的穩(wěn)定性顯著提高，這些部分的高度負(fù)電荷可防止它們進(jìn)入細(xì)胞。實(shí)際上，靶向帶His₆-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的目前已報(bào)道的所有基于Ni-NTA的熒光探針排他性限制于標(biāo)記膜蛋白質(zhì)，由于它們中沒有一個(gè)可以跨過細(xì)胞膜以標(biāo)記活細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)(Hintersteiner M，等. (2008) ChemBioChem 9(9)：1391-1395； Goldsmith CR，Jaworski J，Sheng M，& Lippard SJ (2006) J Am. Chem Soc 128(2)：418-419)。二NTA雙溴二胺(dibromobimane)綴合物進(jìn)入細(xì)胞以靶向含多組氨酸的蛋白質(zhì)的先前主張并不令人信服，因?yàn)槭褂萌?xì)胞進(jìn)行熒光測(cè)量，且其結(jié)果并沒有被體內(nèi)細(xì)胞成像數(shù)據(jù)證實(shí)(Krishnan B，Szymanska A，& Gierasch LM (2007) Chem Biol Drug Des 69(1)：31-40)。因此很大可能是在用探針處理全細(xì)胞之后所觀察到的熒光將最可能衍生自來自細(xì)胞膜的含多組氨酸的蛋白質(zhì)的結(jié)合。

最近報(bào)道了含有α-氯乙酰胺、靶向Cys-添加的His-標(biāo)簽(Cys-His₆-標(biāo)簽)的基于二NTA的熒光探針能夠標(biāo)記活細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)帶Cys-His₆-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。(Uchinomiya S, Nonaka H, Wakayama S, Ojida A，& Hamachi I (2013) Chem Commun,49(44): 5022-5024)。然而，二NTA熒光團(tuán)綴合物本身幾乎不能進(jìn)入細(xì)胞，除非該綴合物與貨物附接，所述貨物由細(xì)胞穿透肽和熒光猝滅劑(具有丹磺酰基、四His和八Arg的丹磺?；郊拥亩?組成，促使探針進(jìn)入細(xì)胞以標(biāo)記帶Cys-His₆-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)而不是帶His₆-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。除了該探針相對(duì)較大且制備起來復(fù)雜得多之外，所述方法排除其在標(biāo)記許多現(xiàn)有His₆-標(biāo)簽庫而不重新亞克隆每一個(gè)單獨(dú)基因的應(yīng)用。而且，對(duì)標(biāo)記相對(duì)慢的動(dòng)力學(xué)(在1小時(shí)內(nèi)80%的產(chǎn)率)還防止其用于蛋白質(zhì)實(shí)時(shí)成像。因此，高度優(yōu)選設(shè)計(jì)小且簡(jiǎn)單的熒光探針，其具有良好膜滲透性以快速標(biāo)記任何細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)(只要與His₆-標(biāo)簽融合)。

本公開提供了新熒光探針Ni-NTA-AC的設(shè)計(jì)、合成和應(yīng)用，其呈現(xiàn)優(yōu)異的膜滲透性，可以快速進(jìn)入細(xì)胞以使細(xì)胞內(nèi)帶His₆-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)成像(圖3A)。該探針通過Ni²⁺-NTA特異性靶向帶His₆-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)，具有約13倍熒光接通響應(yīng)。將芳基疊氮化物摻入探針，起初目的在于克服Ni²⁺和組氨酸之間的弱結(jié)合性質(zhì)，然而意料不到地，對(duì)于熒光增強(qiáng)其亦是必不可少的。我們的探針可以用于使不同類型的細(xì)胞甚至植物組織中的His-標(biāo)簽蛋白質(zhì)成像。快速顯現(xiàn)與His₆-標(biāo)簽基因融合的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的能力為不同類型的活細(xì)胞中的大量現(xiàn)有帶His₆-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的空間和功能分析提供巨大潛在性。

結(jié)論。(組氨酸)₆-Ni²⁺-次氮基三乙酸體系(Ni-NTA)在蛋白質(zhì)純化中的巨大成功引起開發(fā)使帶His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)成像的基于小Ni-NTA的熒光探針的極大興趣?？紤]到現(xiàn)有帶His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)庫較大，這種探針提供在生理學(xué)有關(guān)條件下功能研究各種細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的廣泛實(shí)用性和多功能性。本發(fā)明公開了第一個(gè)小細(xì)胞可滲透熒光探針Ni-NTA-AC，其能夠快速標(biāo)記(約2分鐘)且觀察到許多不同類型的活細(xì)胞且甚至植物組織中的細(xì)胞內(nèi)帶組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)，且具有大量潛在應(yīng)用。該探針對(duì)細(xì)胞內(nèi)His-標(biāo)簽蛋白質(zhì)呈現(xiàn)高特異性和標(biāo)記效率。而且，該探針由于其小尺寸對(duì)活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)功能和定位具有較少干擾，且當(dāng)標(biāo)記小蛋白質(zhì)時(shí)，其相對(duì)于大熒光蛋白具有顯著優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明開辟了用于原位分析不同類型的細(xì)胞中所有蛋白質(zhì)的空間分布和功能的高度有教益的方法。

雖然業(yè)已解釋了本發(fā)明的實(shí)施方案，但應(yīng)當(dāng)理解在本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀說明書之后，其各種修改將變得顯而易見。因此，應(yīng)當(dāng)理解文中所公開的發(fā)明旨在涵蓋落入隨附權(quán)利要求內(nèi)的這些修改。

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