本發(fā)明涉及包含含有基底和結合在基底上的移動性降低的金屬顆粒的支持的脂質(zhì)雙層(SLB)的人工細胞膜；包括該人工細胞膜和檢查分子之間相互作用的分析裝置或試劑盒，其中一個分子與結合于人工細胞膜的移動性降低的金屬顆粒的表面結合，而其它分子與以低化合價結合于脂質(zhì)的移動性降低的金屬顆粒的表面結合；使用該分析裝置檢查分子之間相互作用的方法；用于通過等離激元散射測量來定量或定性地分析包含該人工細胞膜的靶標材料的試劑盒；以及能夠使用具有不同等離激元散射長度和/或具有在支持的脂質(zhì)雙層上的不同遷移性的多個金屬顆粒來檢測多個靶標材料的多元分析試劑盒。

背景技術：

單納米顆粒分辨率原位測量提供了動態(tài)單納米顆粒的時間依賴性快照，由此納米顆粒之間的異質(zhì)相互作用可以得到闡明并且與整體(ensemble)進行區(qū)分。該方法揭示了關于膠態(tài)納米晶體生長和組裝的機制和反應動力學的直接和詳細的信息。然而，包括電子顯微鏡在內(nèi)的常規(guī)高分辨率成像方法典型地提供了結構的靜態(tài)信息，而沒有原位信息，并且需要在苛刻條件(例如真空)下的復雜設置和程序。出于這些原因，基于熒光團的單分子水平光學成像和分析方法主要用于獲得關于分子間相互作用的動態(tài)信息，但遇到熒光團的閃爍和漂白的問題。此外，識別多種組分與熒光團標記的短程分子相互作用是高度挑戰(zhàn)的，即使利用熒光共振能量傳遞，可測量的距離也被限于10nm，并且對于多組分系統(tǒng)，闡釋變得困難。這些對于分子與納米顆粒之間的相互作用的實時研究以及獲得許多分析的可重復且可靠的定量數(shù)據(jù)而言是嚴重的問題。這些常規(guī)高分辨率光學方法的另一重要的問題是在溶液狀態(tài)不能單獨且可靠地分析和研究動態(tài)移動物體，這歸因于它們不受控的三維移動和光學對所有受關注的物體的軌跡的無能力性。還應注意，當這些物體被固定在用于高分辨率光學分析的表面上時，不能研究這些物體的動態(tài)行為。出于這些原因，開發(fā)出允許以單顆粒靈敏度原位成像和分析自由移動納米顆粒之間的相互作用的方法，會是極其有益的。為了獲得更加可靠的信息以及通過研究相互作用的顆粒推導出新的原理，必須還由單顆粒水平定量數(shù)據(jù)來同時追蹤來自多反應位點的相互作用。

技術實現(xiàn)要素：

技術問題

因此，本發(fā)明人已經(jīng)研究并努力發(fā)現(xiàn)用于以高分辨率觀察在二維平面上的顆粒之間的相互作用、同時確保顆粒的自由移動的方法。由此，他們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，鏈霉親和素-生物素鍵在支持的脂質(zhì)雙層(SLB)上形成的金屬顆粒的流動性能夠通過調(diào)節(jié)該顆粒上的生物素化合價而得以調(diào)節(jié)，以及可以在單顆粒水平下以高分辨率來追蹤和分析由于在金屬顆粒的表面上形成的具有互補序列的DNA鏈之間的相互作用而造成的顆粒之間的相互作用的反應動力學?；谶@些發(fā)現(xiàn)，已完成本發(fā)明。

技術方案

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的第一方面提供了人工細胞膜，其包括：基底；以及布置在基底上的支持的脂質(zhì)雙層(SLB)，其中所述支持的脂質(zhì)雙層包含與第一配體結合的第一脂質(zhì)，在所述支持的脂質(zhì)雙層內(nèi)一些或所有脂質(zhì)能夠轉移位置，并且包含與所述第一配體特異性結合的第二配體的第一金屬顆粒通過第一配體與第二配體之間的結合而以100個/μm²至100,000個/μm²的密度與至少兩個所述第一脂質(zhì)結合，從而將所述支持的脂質(zhì)層中的第一金屬顆粒的移動性降低到0cm²/s至0.5×10^-8cm²/s。

本發(fā)明的第二方面提供了使用人工細胞膜檢查分子A與分子B之間的相互作用的分析裝置，其包括：第一方面的所述人工細胞膜，其中支持的脂質(zhì)雙層還包含與第三配體結合的第三脂質(zhì)，所述第三配體與所述第一配體相同或不同；與所述人工細胞膜中的第一金屬顆粒的表面結合的分子A；包含與所述第三配體特異性結合的第四配體的第二金屬顆粒，其中所述第二金屬顆粒通過所述第三配體與所述第四配體之間的相互作用而與至少一個所述第三脂質(zhì)結合，并且與所述第一金屬顆粒相比具有更高的移動性；以及與所述人工細胞膜中的第二金屬顆粒的表面結合的分子B，其中具有更高移動性的所述第二金屬顆粒接近所述第一金屬顆粒，隨后通過所述分子A與所述分子B之間的相互作用而被限制于所述第一金屬顆粒。

本發(fā)明的第三方面提供了使用第二方面所述的分析裝置檢查所述分子A與所述分子B之間的相互作用的方法。

本發(fā)明的第四方面提供了通過由在人工細胞膜上的與分子A結合的第一金屬顆粒和與分子B結合的第二金屬顆粒的等離激元散射信號測定第一金屬顆粒與第二金屬顆粒之間的距離來測定分子A與分子B之間的結合的分析試劑盒，其包括：人工細胞膜，其包括基底，布置在所述基底上且其內(nèi)的一些或所有脂質(zhì)能夠轉移位置的支持的脂質(zhì)雙層，以及作為所述支持的脂質(zhì)雙層的一部分的與第一配體結合的第一脂質(zhì)和與同所述第一配體相同或不同的第三配體結合的第三脂質(zhì)；包含與所述第一配體特異性結合的第二配體的第一金屬顆粒，其中所述第一金屬顆粒能夠通過所述第一配體與所述第二配體之間的相互作用而與至少一個所述第一脂質(zhì)結合；以及包含與所述第三配體特異性結合的第四配體的第二金屬顆粒，其中所述第二金屬顆粒能夠通過所述第三配體與所述第四配體之間的相互作用而與至少一個所述第三脂質(zhì)結合。

本發(fā)明的第五方面提供了用于定性或定量地分析能夠與分子A和分子B結合的靶標材料的試劑盒，所述試劑盒通過由在人工細胞膜上的與分子A結合的第一金屬顆粒和與分子B結合的第二金屬顆粒的等離激元散射信號測定第一金屬顆粒與第二金屬顆粒之間的距離來測定分子A與分子B之間的結合，所述試劑盒包括：人工細胞膜，其包括基底，布置在所述基底上且其內(nèi)的一些或所有脂質(zhì)能夠轉移位置的支持的脂質(zhì)雙層，以及作為所述支持的脂質(zhì)雙層的一部分的與第一配體結合的第一脂質(zhì)和與同所述第一配體相同或不同的第三配體結合的第三脂質(zhì)；包含與所述第一配體特異性結合的第二配體的第一金屬顆粒，其中所述第一金屬顆粒能夠通過所述第一配體與所述第二配體之間的相互作用而與至少一個所述第一脂質(zhì)結合；分子A，其與所述第一金屬顆粒的表面結合并且與所述靶標材料的一部分特異性結合；包含與所述第三配體特異性結合的第四配體的第二金屬顆粒，其中所述第二金屬顆粒能夠通過所述第三配體與所述第四配體之間的相互作用而與至少一個所述第三脂質(zhì)結合；以及分子B，其與所述人工細胞膜中的第二金屬顆粒的表面結合并且與靶標材料的未結合分子A的另一部分特異性結合。

本發(fā)明的第六部分提供了通過等離激元散射測量來定性或定量地分析i_max×m_max的量的靶標材料的多元分析試劑盒(i_max和m_max分別是以下變量i和m的最大值，并且各自獨立地為1以上的整數(shù)，但不是i_max＝m_max＝1)，其包括：人工細胞膜，其包括基底，布置在所述基底上且其內(nèi)的一些或所有脂質(zhì)能夠轉移位置的支持的脂質(zhì)雙層，以及與配體I_i結合的脂質(zhì)I_i和與配體M_m結合的脂質(zhì)M_m(此處，配體I_i和配體M_m可以彼此相同或不同)；金屬顆粒I_i，其包含與配體I_i特異性結合的配體I’_i，其中所述金屬顆粒I_i通過配體I_i與配體I’_i之間的相互作用而與至少一個脂質(zhì)I_i結合；分子A_i，其與金屬顆粒I_i的表面結合并且與靶標材料的一部分特異性結合；金屬顆粒M_m，其包含與脂質(zhì)M_m特異性結合的配體M’_m，其中金屬顆粒M_m通過配體M_m和配體M’_m之間的相互作用而與至少一個所述脂質(zhì)M_m結合；以及分子B_m，其與所述人工細胞膜中的金屬顆粒M_m的表面結合并且與靶標材料的未結合分子A的另一部分特異性結合，其中所述系列的金屬顆粒I_i具有彼此不同的等離激元散射波長，并且所述系列的金屬顆粒M_m具有彼此不同的等離激元散射波長。

本發(fā)明的第七方面提供了將顆粒集中于流體通道的特定區(qū)域的方法，其包括：在所述流體通道中制備支持的脂質(zhì)雙層，其中所述支持的脂質(zhì)雙層包含與第一配體結合的第一脂質(zhì)，并且一些或所有脂質(zhì)能夠在所述支持的脂質(zhì)雙層中轉移位置；在所述支持的脂質(zhì)雙層上施用包含與所述第一配體特異性結合的第二配體的第一顆粒；以及通過在所述流體通道中施用流體流而將所述第一顆粒轉移到所述流體通道的特定區(qū)域中。

有利效果

根據(jù)包含含有與人工細胞膜附接的金屬顆粒的支持的脂質(zhì)雙層的人工細胞膜，在脂質(zhì)上的金屬顆粒的流動性可以通過調(diào)節(jié)與所述金屬顆粒結合的配體的數(shù)量而得以控制。因此，將在兩種類型的具有不同流動性的金屬顆粒上的用于分析其間相互作用的靶標分子引入到所述人工細胞膜上，由此通過等離激元散射來監(jiān)測所述金屬顆粒的移動，從而分析靶標分子之間的相互作用。在此情況下，可以進行使用本發(fā)明的人工細胞膜、等離激元散射波長和具有不同流動性的多個顆粒的同時檢測和量化多個靶標材料的多元分析。

附圖說明

圖1是表明隨著SLB栓系序列(tethering sequence)的摩爾分數(shù)而變的生物素化DNA序列在PNP探針上的平均數(shù)量的圖。所述值通過對三種不同的獨立制備的樣品求平均值而獲得。使用0.00125至0.0625的實驗值來計算線性擬合。

圖2示出表明生物素化合價對SLB上的PNP探針的擴散動力學的影響的圖。圖2A示出隨時間間隔而變的PNP的均方位移，以及圖2B示出SLB上等離激元探針的平均擴散系數(shù)。

圖3示出表明隨著生物素化合價改變，擴散系數(shù)分布的圖。在圖3A至3D中，每個探針的生物素化合價在圖3A中為1，在圖3B中為5，在圖3C中為25，并且在圖3D中為128。

圖4示出表明在SLB上的PNP探針的圖像的照片。圖4A示出在STV涂覆的SLB上生物素化合價為486的I-PNP的暗視場顯微鏡圖像。圖4B示出在I-PNP修飾的SLB上的Cy3修飾的STV的熒光顯微鏡圖像。比例尺為10μm。

圖5示出隨團聚程度(clustering degree)而變的PNP的散射強度分布的圖。圖5A示出單體的結果，圖5B示出二聚體的結果，圖5C示出三聚體的結果，以及圖5D示出四聚體的結果。

圖6是表明動態(tài)栓系在SLB上的納米顆粒之間的相互作用的示意圖。具體地，圖6示出具有兩種不同類型的探針的等離激元納米探針栓系的SLB(移動和固定的等離激元探針，左圖)以及DNA雜化誘導的二維團簇形成和等離激元耦合(右圖)的示意圖。

圖7是表明動態(tài)栓系在SLB上的納米顆粒的單納米顆粒分辨率原位成像和分析的示意圖。圖7A和7B示出使用具有單納米顆粒分辨率的暗視場顯微鏡的栓系在SLB上的等離激元納米探針的大規(guī)模并行原位觀察和分析(比例尺＝10μm)，以及圖7C示出單等離激元納米探針的散射強度和色譜的基于暗視場顯微鏡圖像的分析。

圖8示出SLB上相互作用的等離激元納米顆粒的擴散動力學控制和光學分析的結果。圖8A示出納米顆粒移動性的基于生物素化合價的控制(增加的化合價導致較低移動性)，圖8B示出等離激元納米顆粒的典型的擴散軌跡線，以及圖8C示出隨著生物素化合價而變的等離激元納米顆粒的動態(tài)比。

圖9示出顆粒的非特異性相互作用的分析。圖9A示出在不存在靶標DNA序列的情況下固定的等離激元探針位點的散射強度的變化的時間追蹤和描述圖，以及圖9B示出其示意圖。

圖10A示出靶標DNA雜化誘導的等離激元納米顆粒團簇的暗視場顯微圖像。用白色實線突出在固定的探針位點(白色虛線圈)內(nèi)捕獲的移動探針的15步軌跡，并且紅色箭頭指示每一軌跡的起始位置。每一軌跡步驟的時間間隔為0.188s。圖10B示出隨著每個團簇的探針數(shù)量而變的探針團簇的暗視場顯微圖像的紅綠比圖(R2＝0.970)。圖10C示出納米顆粒團簇的組裝(頂部)和解組裝(底部)的散射強度的典型的時間追蹤。

圖11示出表明通過M-PNP對修飾的SLB中的PNP團簇之間的單體PNP附接和并合之組合的團簇生長的照片。圖11A示出兩個單體PNP彼此接近，圖11B示出兩個PNP單體的遠端光學重疊，圖11C示出DNA雜化介導的PNP二聚體形成和隨之而來的等離激元偶合，圖11D示出PNP二聚體和PNP三聚體彼此接近，以及圖11E示出PNP二聚體與PNP三聚體之間的并合。

圖12示出等離激元納米顆粒團簇生長動力學的原位成像和分析的結果。圖12A示出大的SLB表面區(qū)域中納米顆粒探針的DNA雜化誘導的等離激元偶合的大規(guī)模并行原位監(jiān)測。在30nM靶標DNA序列加成之后于330s采集左側圖像。示出靶標DNA序列加成之前(0s)和之后(330s)白色虛線區(qū)域的放大圖像。圖12B示出在圖12A中的暗視場顯微圖像中示出的10個單納米顆粒團聚反應的時間依賴性散射強度圖表。散射強度被歸一化成單體探針的平均強度。每隔1s記錄信號，持續(xù)330s。

圖13示出等離激元納米顆粒團簇的生長動力學及其圖像。圖13A示出在30nM靶標DNA序列下等離激元團簇生長的反應動力學圖表(空心圓)。通過監(jiān)測生長的團簇的散射強度的階梯式增長(N＝150個顆粒)來檢測每一單個探針加成反應。團簇形成動力學被擬合成三步連續(xù)反應模型(實線)。圖13B示出團聚的等離激元納米探針的透射電子顯微鏡圖像。

圖14示出用于向二聚體連續(xù)加成等離激元探針以形成三聚體或向三聚體連續(xù)加成等離激元探針以形成四聚體的2D位阻因素的計算方法。灰色區(qū)域代表下一顆粒加成的可能的接近角。在四聚體形成中，位阻因素被繪制成θ的函數(shù)，由第三顆粒的相對位置而測定(插圖中的黑色實線)。平均ftri為0.375(紅色虛線)。

圖15示出SLB上的定量的基于等離激元偶合的DNA檢測檢定。圖15A示出隨著團簇中等離激元探針數(shù)量而變的散射強度校準用基準(R²＝0.999)。圖15B示出4h內(nèi)與300fM靶標DNA反應的PNP修飾的圖案化SLB。圖15C示出隨著DNA濃度而變的靶標DNA檢定結果的圖表(黑色點)。用紅色點繪制單堿基錯配的DNA序列的檢定結果。

圖16是示出通過使用流體調(diào)節(jié)在圖案化SLB上的金屬納米顆粒的移動性而控制納米顆粒之間的相互作用的方法的示意圖。

圖17示出根據(jù)流體流動在SLB上形成的納米顆粒的移動性。圖17A示出根據(jù)流體流量的納米顆粒的移動軌跡，以及圖17B示出根據(jù)流體流量的納米顆粒的漂移速率。

圖18示出在SLB上形成的納米顆粒的移動性。圖18A和18B分別示出通過流體流動在圖案SLB上移動和集中的金納米顆粒和銀納米顆粒的暗視場顯微鏡圖像。

圖19示出通過流體流動在金納米顆粒圖案化的SLB上集中的金屬納米顆粒的散射譜的變化。圖19A示出在多種鹽(NaCl)濃度下金屬納米顆粒的散射譜，圖19B示出金屬納米顆粒的暗視場顯微鏡圖像，以及圖19C示出等離激元散射峰和ζ電勢的變化。

圖20示出通過流體流動在銀納米顆粒圖案化的SLB上集中的金屬納米顆粒的散射譜的變化。圖20A示出在多種鹽(NaCl)濃度下金屬納米顆粒的散射譜，圖20B示出金屬納米顆粒的暗視場顯微鏡圖像，以及圖20C示出等離激元散射峰和ζ電勢的變化。

圖21是表明使用基于納米顆粒栓系的人工細胞膜的細胞界面平臺的分析細胞的信號傳遞機制的方法的示意圖。

圖22示出為了展示出不同顏色而分別以不同尺寸和不同形狀制造的納米顆粒的暗視場顯微鏡和電子顯微鏡圖像，及其吸收/散射譜。

圖23A示出為了分別固定在支持的脂質(zhì)雙層上或通過調(diào)節(jié)化合價自由移動而制造的三色金屬顆粒的9種組合。

圖23B示出為了同時檢測9種類型的miRNA而與選自固定的三色金屬顆粒和自由移動的三色金屬顆粒的各靶標分子非特異性結合的顆粒對。

圖23C示出作為使用三色金屬顆粒的多元分析的實例的三色金屬顆粒在不同時間(0min和60min)的暗視場顯微鏡圖像。

圖23D是示出通過同時檢測9種類型的miRNA的相對于時間的每一靶標材料的累積化合價的圖。

圖24A示出固定的紅色納米顆粒和與固定的紅色納米顆粒相互作用的可移動的紅色納米顆粒的暗視場顯微鏡圖像，以及相對于時間的在固定的紅色納米顆粒的位置處三色等離激元散射譜的強度的變化。

圖24B示出固定的綠色納米顆粒和與固定的綠色納米顆粒相互作用的一個或多個可移動的紅色納米顆粒的暗視場顯微鏡圖像，以及相對于時間的在固定的綠色納米顆粒的位置處三色等離激元散射譜的強度的變化。

圖24C示出固定的藍色納米顆粒和與固定的藍色納米顆粒相互作用的一個或多個可移動的紅色納米顆粒的暗視場顯微鏡圖像，以及相對于時間的在固定的藍色納米顆粒的位置處三色等離激元散射譜的強度的變化。

圖25A示出固定的紅色納米顆粒和與固定的紅色納米顆粒相互作用的一個或多個可移動的綠色納米顆粒的暗視場顯微鏡圖像，以及相對于時間的在固定的紅色納米顆粒的位置處三色等離激元散射譜的強度的變化。

圖25B示出固定的綠色納米顆粒和與固定的綠色納米顆粒相互作用的一個或多個可移動的綠色納米顆粒的暗視場顯微鏡圖像，以及相對于時間的在固定的綠色納米顆粒的位置處三色等離激元散射譜的強度的變化。

圖26A示出固定的紅色納米顆粒和與固定的紅色納米顆粒相互作用的一個或多個可移動的藍色納米顆粒的暗視場顯微鏡圖像，以及相對于時間的在固定的紅色納米顆粒的位置處三色等離激元散射譜的強度的變化。

圖26B示出固定的綠色納米顆粒和與固定的綠色納米顆粒相互作用的一個或多個可移動的藍色納米顆粒的暗視場顯微鏡圖像，以及相對于時間的在固定的綠色納米顆粒的位置處三色等離激元散射譜的強度的變化。

圖26C示出固定的藍色納米顆粒和與固定的藍色納米顆粒相互作用的一個或多個可移動的藍色納米顆粒的暗視場顯微鏡圖像，以及相對于時間的在固定的藍色納米顆粒的位置處三色等離激元散射譜的強度的變化。

圖27是示出具有不同顏色(不同等離激元散射波長)和/或具有移動性的多個顆粒的行為及其使用暗視場顯微鏡的監(jiān)測程序的示意圖。

圖28是示出通過互補序列識別的miRNA檢測的實例(miR-21)的視圖。

最佳實施方式

根據(jù)一方面，本發(fā)明提供了人工細胞膜，其包括：基底；以及布置在基底上的支持的脂質(zhì)雙層(SLB)，其中所述支持的脂質(zhì)雙層包括與第一配體結合的第一脂質(zhì)，在所述支持的脂質(zhì)雙層內(nèi)一些或所有脂質(zhì)能夠轉移位置，以及包含與第一配體特異性結合的第二配體的第一金屬顆粒通過第一配體與第二配體之間的結合而以100個/μm²至100,000個/μm²的密度與至少兩個第一脂質(zhì)結合，從而將支持的脂質(zhì)層中的第一金屬顆粒的移動性降低到0cm²/s至0.5×10^-8cm²/s。支持的脂質(zhì)層中的第一金屬顆粒的移動性可以被降低到0cm²/s至0.1×10^-8cm²/s，并且更優(yōu)選地被降低到0cm²/s至0.01×10^-8cm²/s，其不能被顯微鏡檢測到。當其移動性為0時，脂質(zhì)是完全靜止的。

如本文所用，術語“基底”是能夠支持脂質(zhì)雙層的支持物，并且可以是具有預定形狀的固體基底。優(yōu)選地，基底可以是由玻璃、金、銀、鉑或TiO₂制成的透明固體基底，或可以是由丙烯酸聚合物如聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚醚砜(PES)、聚環(huán)烯烴(PCO)、聚氨酯或聚碳酸酯(PC)制成的透明固體基底。此外，作為基底，還可以使用涂覆有能被水合的涂飾劑如纖維素的基底，只要可以維持被引入到涂膜上的脂質(zhì)雙層的流動性即可。

如本文所用，術語“支持的脂質(zhì)層”可以是在準細胞結構如天然細胞膜或細胞核周圍體外組裝的脂質(zhì)雙層，可以是由合成或天然的脂質(zhì)制成的一類模型脂質(zhì)雙層，并且可以被錨固于固體基底以具有改善的穩(wěn)定性。因此，支持的脂質(zhì)層可以用作不能用于本體溶液的表征工具。不同于通過以閉合圓形的細胞形式來組合脂質(zhì)雙層而獲得的囊泡或細胞膜，支持的脂質(zhì)層是在固體基底上形成的平面結構。因此，僅有脂質(zhì)雙層的上表面被暴露于游離的溶液。這樣的配置對于脂質(zhì)雙層的研究具有優(yōu)勢和劣勢。支持的脂質(zhì)雙層的主要優(yōu)勢是穩(wěn)定性。支持的脂質(zhì)雙層(SLB)即使當其被暴露于快速的流動或振動時也不會嚴重地受損。在支持的脂質(zhì)雙層(SLB)中，與作為另一種模型脂質(zhì)雙層的黑脂膜(BLM)不同，孔的存在不會破壞整個雙層。由于這樣的穩(wěn)定性，可以實施SLB實驗數(shù)周至數(shù)月，而BLM實驗被局限于數(shù)小時。SLB還是有利的，因為其不能用于自由漂浮的樣本，或可以用作用于提供低分辨率的表征工具。

這些優(yōu)勢的最顯著的實例是可以使用需要與樣本直接物理相互作用的機械探測技術。為了在沒有染料標記的情況下成像脂質(zhì)的相分離、產(chǎn)生單蛋白質(zhì)分子吸收的穿膜納米孔的形成、以及具有亞納米精確度的蛋白質(zhì)的組裝，使用原子力顯微鏡(AFM)。最近，為了直接檢測單個脂質(zhì)雙層的機械性質(zhì)，AFM用于在單個膜蛋白上進行能量波譜法(power spectroscopy)。因為細胞或囊泡的表面是相對軟的并且依時間而變，因此前述研究在不使用SLB的情況下可能是困難的或可能是不可能的。

同時，即使在多種現(xiàn)代熒光波譜法中，也需要牢固支持的平面表面。消散場方法，例如全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRF)和表面等離激元共振(SPR)，可以以高靈敏度測量分析物的結合以及雙層的光學性質(zhì)，但僅當在具有光學功能的基底上支持樣本時可以操作。僅適用于支持的雙層的其它方法的實例包括熒光干涉差顯微鏡(FLIC)和反射干涉差顯微鏡(RICM)。

通常，SLB不直接與基底表面接觸，而是通過非常薄的水層與基底分隔開。水層的尺寸和性質(zhì)取決于基底的材質(zhì)和脂質(zhì)的類型，但是對于在二氧化硅上支持的兩性離子型脂質(zhì)，其為最廣泛使用的實驗系統(tǒng)，水層的厚度通常為約1nm。因為水層非常薄，在支持的脂質(zhì)雙層與基底之間存在大量的流體動力學偶合，因此支持的脂質(zhì)雙層具有比游離的脂質(zhì)雙層更低的擴散系數(shù)。在SLB中的一部分脂質(zhì)可以被完全固定。在SLB中固定的脂質(zhì)的分數(shù)為1％至5％。

通常，“人工細胞膜”可以是用于在試管中模擬體內(nèi)細胞膜系統(tǒng)的含脂質(zhì)膜的系統(tǒng)，該系統(tǒng)是為了研究體內(nèi)細胞的表面上發(fā)生的細胞膜相關性現(xiàn)象如細胞膜蛋白質(zhì)、穿膜蛋白質(zhì)及與其相關的相互作用)人工制造的。提供人工細胞膜的模型系統(tǒng)的實例包括黑脂膜(BLM)、支持的脂質(zhì)雙層(SLB)、栓系雙層脂質(zhì)膜(tBLM)、囊泡、膠束、bicelle和納米盤。特別地，SLB是用于鑒定生物物理學細胞膜現(xiàn)象的可用的裝置。SLB可以由于化學組成的變化以及諸如pH和溫度的環(huán)境變量而控制移動性和活性。

第一配體和第二配體可以各自選自抗原、抗體、配體、受體、螯合物、DNA、RNA、適配體、彼此特異性結合的化學分子及其組合，但不限于此。例如，當?shù)谝慌潴w是抗體時，第二配體可以是對該抗體特異性的抗原。此外，可以通過用于形成抗體-抗原-抗體復合物的夾心免疫反應來將第二配體與第一配體結合，所述夾心免疫反應通過組合額外地結合于該抗原的所有抗體與該抗體而形成抗體-抗原-抗體復合物。作為另一實例，第一配體和第二配體可以是具有彼此互補的序列的DNA片段，在此情況下，第一配體和第二配體可以通過這些DNA片段的雜化而彼此結合。

在本發(fā)明的示例性實施方案中，作為第一配體的生物素通過使用生物素作為第一配體和使用生物素和鏈霉親和素(生物素的受體)的結合物作為第二配體而附接于不含鏈霉親和素的其它結合位點。

第一金屬顆?？梢酝ㄟ^在脂質(zhì)上的第一配體與在金屬顆粒表面上的第二配體之間的特異性抗原-抗體結合、配體-受體結合、DNA雜化、螯合、共價結合、靜電結合或化學反應結合而與脂質(zhì)結合。在此情況下，第一金屬顆?？梢园鄠€第二配體，并且一個金屬顆粒可以根據(jù)密度而與多個脂質(zhì)顆粒結合。在此情況下，脂質(zhì)膜上的單個脂質(zhì)分子的運動是自由的。然而，在多個脂質(zhì)分子與一個金屬顆粒結合的情況下，其移動是相對受限的，因為與一個金屬顆粒結合的多個脂質(zhì)分子應在二維平面上有組織地移動，從而使金屬顆粒移動。

根據(jù)本發(fā)明的示例性實施方案，隨著每單位顆粒的化合價增加，顆粒的移動顯著地受限。由此，幾乎不能捕獲顆粒的移動，因為當化合價達到486時，顆粒是固定的(參見圖2和6)。

監(jiān)測第一金屬顆粒的移動的方法不受特別的限制，但優(yōu)選地，可以通過測量等離激元散射而進行。

優(yōu)選地，第二配體包括硫醇基，并且可以通過硫醇基而與第一金屬顆粒共價結合。

本發(fā)明的人工細胞膜的特征在于金屬顆粒與其結合而作為探針。因為金屬顆粒與由聚合物或脂質(zhì)雙層組成的諸如囊泡的顆粒相比是穩(wěn)定的，所以它們即使在相對低或高的鹽濃度或pH的條件下也不分解，從而保持它們的形態(tài)和物理性質(zhì)。此外，優(yōu)選地，因為金屬顆粒包括等離激元金屬顆粒并展現(xiàn)出等離激元散射，因此金屬顆粒本身可以在沒有額外的探針的情況下被檢測到，并且不引起閃爍或消光，從而長時間進行穩(wěn)定的監(jiān)測。此外，因為金屬顆?？梢耘c諸如硫醇基的官能團一起直接形成強共價鍵，可以使用該官能團向金屬顆粒的表面提供配體。

優(yōu)選地，相對于支持的脂質(zhì)雙層中的脂質(zhì)的總量，可以以0.05mol％至0.5mol％的量包含與第一配體結合的第一脂質(zhì)。第一配體處于通過與第二配體結合而布置顆粒的位點。當與第一配體結合的第一脂質(zhì)的量與脂質(zhì)的總量之比小于0.05mol％時，在脂質(zhì)表面上的第一配體的頻率變低，即，第一配體之間的距離增加，因此一個顆粒與多個第一配體結合，因而顆粒難以固定在脂質(zhì)雙層上。當其比例大于0.5mol％時，第一配體的密度變得過高，導致包含與第一配體特異性結合的第二配體的第一顆粒的聚集，從而抑制顆粒的移動或使得其分析變得困難。

優(yōu)選地，支持的脂質(zhì)雙層可以還包含相對于脂質(zhì)總量的1mol％至10mol％的量的與聚乙二醇(PEG)結合的第二脂質(zhì)。在此情況下，聚乙二醇的平均分子量優(yōu)選為500至2000，但不限于此。例如，當使用具有2000以下的相對低的分子量的PEG時，即使與PEG結合的第二脂質(zhì)的含量被增加至10mol％的水平，即其是與用于使脂質(zhì)雙層穩(wěn)定的含量相比稍微更高的含量，也不會引發(fā)屏蔽效應，脂質(zhì)層被物理穩(wěn)定以增加脂質(zhì)雙層的使用壽命和穩(wěn)定性，并且納米顆粒之間以及納米顆粒與脂質(zhì)之間的非特異性結合被有效地降低以增加流動性。然而，當PEG的分子量超過上述范圍或者第二脂質(zhì)的含量超過上述范圍時，納米顆粒向脂質(zhì)膜的接近和/或第一配體與第二配體之間的結合可以通過引發(fā)屏蔽效應而得以抑制，從而優(yōu)選的是，適當?shù)亟M合及選擇所用的PEG的分子量和與PEG結合的第二脂質(zhì)的含量。

根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了使用人工細胞膜檢查分子A與分子B之間的相互作用的分析裝置，其包括：人工細胞膜，其中支持的脂質(zhì)雙層還包含與第三配體結合的第三脂質(zhì)，所述第三配體與所述第一配體相同或不同；與人工細胞膜中的第一金屬顆粒的表面結合的分子A；包含與第三配體特異性結合的第四配體的第二金屬顆粒，其中所述第二金屬顆粒通過第三配體與第四配體之間的相互作用而與至少一個第三脂質(zhì)結合，并且與所述第一金屬顆粒相比具有更高的移動性；以及與人工細胞膜中的第二金屬顆粒的表面結合的分子B，其中具有更高移動性的第二金屬顆粒接近第一金屬顆粒，隨后通過分子A與分子B之間的相互作用而被限制于第一金屬顆粒。

第四配體可以與第二配體相同或不同。

分子A和分子B可以各自選自DNA、RNA、抗原、抗體、配體、螯合物、受體、適配體、聚合物、有機化合物、金屬離子和多肽。

因此，待通過本發(fā)明的分析裝置來檢查的分子A與分子B之間的相互作用可以是抗原-抗體結合、配體-受體結合、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結合、核酸雜化、螯合、共價結合或靜電結合。核酸雜化可以包括DNA、RNA、PNA及其組合的雜化，而沒有限制。

第一金屬顆粒通過與多個脂質(zhì)結合而被固定在支持的脂質(zhì)雙層上，并且第二金屬顆?？梢栽诓淮嬖诜肿覣與分子B之間的相互作用的情況下在支持的脂質(zhì)雙層上進行二維自由布朗運動。

因此，當產(chǎn)生由在第一金屬顆粒上的分子A與在第二金屬顆粒上的分子B之間的相互作用所造成的刺激，即第一金屬顆粒與第二金屬顆粒之間的引力或斥力時，第一金屬顆?？梢允枪潭ǖ模⑶业诙饘兕w?？梢酝ㄟ^引力而移向第一金屬顆粒或者通過斥力而遠離第一金屬顆粒。因此，可以通過觀察第二金屬顆粒相對于固定的第一金屬顆粒的移動而檢查分子A與分子B之間的相互作用。

根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供了使用該分析裝置檢查分子A與分子B之間的相互作用的方法。

如上所述，在分析裝置中，第一金屬顆粒被固定在支持的脂質(zhì)雙層的平面上，并且第二金屬顆粒進行自由布朗運動，只要未施加額外的刺激即可。

因此，可以監(jiān)測第一金屬顆粒的位置以及由第一金屬顆粒造成的散射強度或波長的變化。

此外，可以監(jiān)測第二金屬顆粒的實時移動軌跡或速率，或者由第二金屬顆粒造成的信號強度或波長的變化。

優(yōu)選地，通過測量第一金屬顆粒和/或第二金屬顆粒的等離激元散射來進行所述監(jiān)測。引發(fā)等離激元散射的納米顆粒當其間距離減少時可以通過等離激元偶合而增強散射信號，并且當其間距離在預定距離即等離激元偶合距離內(nèi)進一步減小時，散射波長轉移向長波長。因此，當顆粒彼此遠離時，可以從顆粒的軌跡測量顆粒之間的距離，并且當顆粒在預定距離內(nèi)彼此靠近時，從所測量的散射信號的強度和波長來評估顆粒之間的距離。

在本發(fā)明的示例性實施方案中，使用由互補序列DNA標記的金納米顆粒，并且兩個或更多個DNA與一個金納米顆粒結合，由此多個金納米顆粒通過DNA雜化而彼此靠近。由此，彼此結合的金納米顆粒的數(shù)量增加，因此金納米顆粒以二聚體、三聚體和四聚體的順序生長，以使散射強度階梯式增加，并且散射信號持續(xù)長時間。相反，通過瞬態(tài)非特異性相互作用來觀察信號的增加，但是相對應的信號甚至不能持續(xù)數(shù)秒。因此，確定的是，通過非特異性相互作用的信號的增加和通過特異性相互作用的信號的增加是彼此區(qū)分的(參見圖6)。此外，確定的是，由于顆粒的聚集，信號強度增加，并且散射波長轉變?yōu)殚L波長。

該方法的特征在于通過在預定方向施加額外的力來增加顆粒的密度和顆粒的碰撞頻率，由此改善分析靈敏度和縮短檢測時間。在此情況下，施加的力可以是磁場、電場或流體流，但不限于此。

根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供了通過由在人工細胞膜上的與分子A結合的第一金屬顆粒和與分子B結合的第二金屬顆粒的等離激元散射信號測定第一金屬顆粒與第二金屬顆粒之間的距離來測定分子A與分子B之間的結合的分析試劑盒，其包括：人工細胞膜，其包括基底，布置在基底上且其內(nèi)的一些或所有脂質(zhì)能夠轉移位置的支持的脂質(zhì)雙層，以及作為支持的脂質(zhì)雙層的一部分的與第一配體結合的第一脂質(zhì)和與同第一配體相同或不同的第三配體結合的第三脂質(zhì)；包含與第一配體特異性結合的第二配體的第一金屬顆粒，其中第一金屬顆粒能夠通過第一配體與第二配體之間的相互作用而與至少一個第一脂質(zhì)結合；以及包含與第三配體特異性結合的第四配體的第二金屬顆粒，其中第二金屬顆粒能夠通過第三配體與第四配體之間的相互作用而與至少一個第三脂質(zhì)結合。

如上所述，為了檢查兩個分子之間的相互作用，對于檢測便利性而言優(yōu)選的是，使用這樣的分析裝置，其經(jīng)配置以使與待分析的兩個分子中的一個分子結合的金屬顆粒被固定在人工細胞膜上，并且另一分子與具有相對高的移動性的金屬顆粒結合。然而，根據(jù)當前的光學檢測技術，因為可以監(jiān)測在脂質(zhì)雙層上自由移動的顆粒，因此即使這些顆粒能夠在脂質(zhì)雙層上自由移動，也可以監(jiān)測單個顆粒，因為分子A和分子B二者均與具有高移動性的金屬顆粒結合。因此，該系統(tǒng)還用作用于檢驗分子A與分子B之間的相互作用的分析試劑盒。該分析試劑盒還可以應用于公知的等離激元散射檢測系統(tǒng)。

根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供了用于定性或定量地分析能夠結合于分子A和分子B的靶標材料的試劑盒，所述試劑盒通過由在人工細胞膜上的與分子A結合的第一金屬顆粒和與分子B結合的第二金屬顆粒的等離激元散射信號測定第一金屬顆粒與第二金屬顆粒之間的距離來測定分子A與分子B之間的結合，所述試劑盒包括：人工細胞膜，其包括基底，布置在基底上且其內(nèi)的一些或所有脂質(zhì)能夠轉移位置的支持的脂質(zhì)雙層，以及作為支持脂質(zhì)雙層的一部分的與第一配體結合的第一脂質(zhì)和與同第一配體相同或不同的第三配體結合的第三脂質(zhì)；包含與第一配體特異性結合的第二配體的第一金屬顆粒，其中第一金屬顆粒能夠通過第一配體與第二配體之間的相互作用而與至少一個第一脂質(zhì)結合；分子A，其與第一金屬顆粒的表面結合并且與靶標材料的一部分特異性結合；包含與第三配體特異性結合的第四配體的第二金屬顆粒，其中第二金屬顆粒能夠通過第三配體與第四配體之間的相互作用而與至少一個第三脂質(zhì)結合；以及分子B，其與人工細胞膜中的第二金屬顆粒的表面結合并且與靶標材料的未結合分子A的另一部分特異性結合。

如上所述，靶標材料、分子A、分子B、第一配體和第二配體中的每一個可以選自抗原、抗體、配體、受體、螯合物、DNA、RNA、適配體、彼此特異性結合的化學分子及其組合。

盡管不限于此，但當調(diào)節(jié)化合價以使第一金屬顆粒被固定在支持的脂質(zhì)雙層上并且第二金屬顆?？梢栽诓淮嬖诜肿覣與分子B之間的相互作用時通過靶標材料進行在支持的脂質(zhì)雙層上的二維自由布朗運動時，可以追蹤第二金屬顆粒對于固定的第一金屬顆粒的相對移動，從而促進監(jiān)測。

在此情況下，在存在靶標分子的情況下的分子A與靶標分子之間以及分子B與靶標分子之間的相互作用可以通過測量以下而檢查：在第一金屬顆粒的位置處的等離激元散射信號的強度和/或波長的變化；當具有高移動性的第二金屬顆粒接近第一金屬顆粒時，分子A與靶標分子之間以及分子B與靶標分子之間的結合所引發(fā)的變化。

根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供了通過等離激元散射測量來定性或定量地分析i_max×m_max的量的靶標材料的多元分析試劑盒(i_max和m_max分別是以下變量i和m的最大值，并且各自獨立地為1以上的整數(shù)，但不是i_max＝m_max＝1)，其包括：人工細胞膜，其包括基底，布置在所述基底上且其內(nèi)的一些或所有脂質(zhì)能夠轉移位置的支持的脂質(zhì)雙層，以及與配體I_i結合的脂質(zhì)I_i和與配體M_m結合的脂質(zhì)M_m(此處，配體I_i和配體M_m可以彼此相同或不同)；金屬顆粒I_i，其包含與配體I_i特異性結合的配體I’_i，其中所述金屬顆粒I_i通過配體I_i與配體I’_i之間的相互作用而與至少一個脂質(zhì)I_i結合；分子A_i，其與金屬顆粒I_i的表面結合并且與靶標材料的一部分特異性結合；金屬顆粒M_m，其包括與脂質(zhì)M_m特異性結合的配體M’_m，其中金屬顆粒M_m通過配體M_m和配體M’_m之間的相互作用而與至少一個所述脂質(zhì)M_m結合；以及分子B_m，其與所述人工細胞膜中的金屬顆粒M_m的表面結合并且與靶標材料的未結合分子A的另一部分特異性結合，其中所述系列的金屬顆粒I_i具有彼此不同的等離激元散射波長，并且所述系列的金屬顆粒M_m具有彼此不同的等離激元散射波長。

在本發(fā)明的示例性實施方案中，制備具有不同顏色即紅色、綠色和藍色的金/銀納米顆粒，并且以預定比向金/銀納米顆粒的表面提供具有捕獲序列和互補序列并且在脂質(zhì)雙層上結合的DNA，以控制與脂質(zhì)雙層的化合價，由此提供6種類型的不同金屬顆粒，即，固定在脂質(zhì)雙層上的金屬顆粒和在脂質(zhì)雙層上自由移動的金屬顆粒。此外，向金/銀納米顆粒的表面提供能夠與用作靶標材料的9種類型的miRNAa中的一些結合的互補序列DNA(參見圖23B、圖28和表3)。在此情況下，為了監(jiān)測的便利性，將DNA序列組合，以使每一靶標材料與在脂質(zhì)雙層上固定的一個金屬顆粒和在脂質(zhì)雙層上自由移動的另一金屬顆粒結合。例如，監(jiān)測在脂質(zhì)雙層上固定的紅色金屬顆粒的等離激元散射、接近該紅色金屬顆粒的另一金屬顆粒依時間的軌跡、和在三種顏色波長下等離激元散射的強度，以鑒定在三種顏色波長中的波長，其強度根據(jù)另一金屬顆粒的接近而增加，從而鑒定另一金屬顆粒的類型，并且通過測量增加的強度來測定與一個固定的紅色金屬顆粒結合的其它金屬顆粒的數(shù)量。即，可以確定的是，固定的紅色金屬顆粒的等離激元散射圖案不同于能夠在脂質(zhì)雙層上自由移動的3種類型的金屬顆粒的等離激元散射圖案，所述脂質(zhì)雙層能夠通過監(jiān)測固定的紅色金屬顆粒的位置而與紅色金屬顆粒結合(參見圖24A、25A和26A)。以類似于使用固定的綠色金屬顆粒和固定的藍色金屬顆粒(參見圖24至26B和26C)的情況的方式獲得該結果，并且通過所述金屬顆粒的組合來引發(fā)不同的等離激元散射變化(參見圖23D)。因此，可以確定的是，可以通過使用具有不同移動性和/或等離激元散射波長的多個金屬顆粒來同時定性和定量地分析多個靶標材料。

根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供了將離子集中于流體通道的特定區(qū)域的方法，其包括：在流體通道中制備支持的脂質(zhì)雙層，其中支持的脂質(zhì)雙層包含與第一配體結合的第一脂質(zhì)，并且一些或所有脂質(zhì)能夠在支持的脂質(zhì)雙層中轉移位置；在支持的脂質(zhì)雙層上施用包含與第一配體特異性結合的第二配體的第一顆粒；以及通過在所述流體通道中施用流體流而將第一顆粒轉移到流體通道的特定區(qū)域中。

若需要，作為第一顆粒，可以使用與基因或蛋白質(zhì)結合的顆粒。

當向包括含有通過配體結合而結合在脂質(zhì)上的顆粒的支持的脂質(zhì)雙層的流體通道施用流體流時，顆?？梢栽谥С值闹|(zhì)雙層上進行自由布朗運動，因此顆粒沿著流體的流動方向移動，以在特定部分處集中。慣常，作為將在脂質(zhì)雙層上布置的顆粒集中的方法，已經(jīng)使用施加諸如電磁場的刺激的方法。然而，當施加電磁場時，隨著暴露時間增加，可能使與顆粒結合的蛋白質(zhì)或基因變性，或可能破壞脂質(zhì)雙層本身，由此可能改變諸如pH、溫度和氣泡產(chǎn)生的實驗條件。然而，當使用本發(fā)明的流體流時，可以克服上述劣勢。

在本發(fā)明的示例性實施方案中，在基底上提供流動通道，并且在上載玻片的兩側中形成孔，從而允許流體在預定方向流動。在流動通道中形成本發(fā)明的與金或銀納米顆粒結合的脂質(zhì)雙層，并且監(jiān)測金屬納米顆粒的移動，同時調(diào)節(jié)流體的流量。在施加流體流之前，金屬納米顆粒自由移動和擴散，但是在施加流體流時，這些金屬納米顆粒開始在與流體流相同的方向上移動，并且通過流體流的增加來加速金屬納米顆粒的移動。此外，隨著金屬納米顆粒在一個方向移動，在特定區(qū)域中金屬納米顆粒的密度增加，并且通過等離激元偶合來使散射波長漂移(參見圖11和12)。

具體實施方式

在下文中，參考下列實施例來更詳細地描述本發(fā)明。闡述這些實施例以例示本發(fā)明，并且本發(fā)明的范圍不限于此。

實施例1：材料

1,2-二油?；?sn-甘油基-3-膽堿磷酸(DOPC)、1,2-二油?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(6-氨基己酸生物素基)鈉鹽(生物素化DOPE)和1,2-二油?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-1000]銨鹽(PEG-DOPE)購自Avanti Polar Lipids(Alabaster,AL,USA)。Cy3修飾的鏈霉親和素(STV)購自Molecular Probes(Eugene,OR,USA)。羧甲基聚乙二醇(M.W.5000)購自Laysan Bio Inc.(Arab,AL,USA)。牛血清白蛋白(BSA)、月桂基硫酸鈉(SDS)和二硫蘇糖醇(DTT)購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。通過將NaH₂PO₄、Na₂HPO₄和NaCl(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)溶解在去離子水(DI水)中，產(chǎn)生具有150mM NaCl的10mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)，從而制備0.15M磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液。此外，用相同試劑制備0.025M PBS以包含25mM NaCl。將具有最小電阻(>18MΩ/cm)的Nanopure水用于所有實驗。為了囊泡制備(囊泡擠出)，使用孔直徑為100nm的聚碳酸酯(PC)過濾器(Whatman,Fisher Scientific)。諸如氯仿、丙酮和乙醇的有機溶劑購自Duksan Pure Chemicals Co.Ltd.(Gyeonggi-do,South Korea)。硫酸和過氧化氫購自Daejung Chemicals&Metals Co.Ltd.(Gyeonggi-do,South Korea)。50nm金納米顆粒和寡核苷酸分別購自BBI Life Sciences(Cardiff,UK)和Integrated DNA Technology(Coralville,IA,USA)。I-PNP(固定PNP)的靶標捕獲序列為5’-HS-(CH₂)₆-PEG₆-CTTTGAGCACATCCTTATCAATATT-3’，并且I-PNP的SLB栓系序列為5’-HS-(CH₂)₆-PEG₆-CTTTGAGCACTGTTAGCGTGTGTGGAATTTTAAT-生物素-3’。M-PNP(移動PNP)的靶標捕獲序列為5’-TAACAATAATCCCTCCACGAGTTTC-PEG₆-(CH₂)₃-SH-3’，并且M-PNP(移動PNP)的SLB栓系序列為5’-生物素-TAATTTTAAGGTGTGTGCGATTGTCACGAGTTTC-PEG₆-(CH₂)₃-SH-3’。靶標序列為5’-GAGGGATTATTGTTAAATATTGATAAGGAT-3’。靶標序列的下劃線部分與靶標DNA序列雜化。作為單堿基對錯配DNA序列，使用其中A被T替代的靶標DNA序列。非互補DNS序列為5'-CTGATTACTATTGCATCTTCCGTTACAACT-3'。

實施例2：小單層囊泡(SUV)的制備

通過包含97.4mol％的DOPC、0.1mol％的生物素化DOPE和2.5mol％的PEG-DOPE的SIV的擴散，在蓋玻片上形成支持的脂質(zhì)雙層(SLB)。通過將適量的脂質(zhì)溶解在氯仿中來制備SUV溶液。使用旋轉蒸發(fā)器在50ml圓底燒瓶中蒸發(fā)脂質(zhì)溶液。在N₂流下徹底干燥脂質(zhì)膜。將經(jīng)干燥的混合物再懸浮于DI水中，并經(jīng)歷三次重復的冷凍-解凍循環(huán)。總脂質(zhì)濃度為2mg/ml。在25℃下，通過孔直徑為100nm的PC膜，將溶液擠出多于21次。將所得的SUV溶液保持于4℃，直至使用。

實施例3：使用DNA的金等離激元納米探針的功能化和生物素化合價的量化

通過使用100mM PB(pH 8.0)孵育2小時來還原硫醇化寡核苷酸，并且通過NAP-5柱(GE Healthcare,Buckinghamshire,UK)而分離。對于DNA功能化，將剛還原的4μM寡核苷酸與50nm的50pM AuNP混合，并且在室溫下孵育過夜。對于I-PNP，SLB栓系序列與靶標捕獲序列的摩爾比為200:600(SLB栓系序列的摩爾分數(shù)：0.25)。對于M-PNP，摩爾比為1:799(SLB栓系序列的摩爾分數(shù)：0.00125)。然后，調(diào)節(jié)溶液以產(chǎn)生10mM的磷酸鹽緩沖液和0.1％(wt/vol)SDS。將經(jīng)調(diào)節(jié)的溶液在定軌振蕩器中進一步孵育30min，并且通過0.05M增量添加6等份的2M NaCl以獲得0.3M的最終NaCl濃度。在每次添加2M NaCl之后，將溶液在55℃加熱10min并且在室溫下孵育30min。使DNA-AuNP混合物在室溫下靜置過夜，然后將溶液離心(4500rpm,10min)。去除上清液，并且將沉淀物再分散于DI水(該程序重復三次)。將DNA功能化AuNP溶液保持于4℃，直至使用。為了量化每個AuNP的SLB栓系序列的數(shù)量，使用30mM KCN溶液溶解Cy3標記的寡核苷酸修飾的AuNP。此外，在Xe燈(500W)作為激發(fā)源的Acton光譜儀(Spectra Pro,MA,USA)上進行Cy3的熒光發(fā)射強度的測量。

實施例4：SLB和栓系于SLB的金等離激元納米顆粒的制備

在玻璃流動室中進行SLB和與SLB栓系的Au PNP的制備。玻璃流動室由通過100μm厚熱塑性墊片彼此分隔開的頂部和底部玻璃基底組成。在頂部玻璃基底的兩端上鉆出進入孔和排出孔。用在0.15M BPS中的10mg/ml BSA預處理頂部載玻片1小時，以使其對SLB沉積呈惰性。在氯仿、丙酮和乙醇中通過超聲處理10min來清洗底部蓋玻片。在超聲處理之后，將蓋玻片用DI水沖洗并通過N₂流干燥。接下來，將底部蓋玻片用1M NaOH預處理1小時，然后用DI水徹底沖洗。通過在數(shù)字式加熱板上于120℃加熱，從而用夾心熱塑性墊片組裝玻璃基底。將制備的SUV溶液以1:1v/v與0.15M PBS混合，并且通過進入口而引入玻璃流動室。需要約70μl的SUV溶液來填充流動通道。在25℃下孵育45min之后，用200μl的DI水將過量和未融合的SUV洗出兩次。在用PBS替換流動通道中的DI水之后，使0.15M PBS溶液中的1nM STV與生物素化SLB反應1小時。用0.15M PBS洗出未反應的STV，然后用0.025M PBS填充流動通道。接下來，將2pM的I-PNP和15pM的M-PNP的探針引入并反應10min。將未結合的PNP移除，并且通過使用含1μM的游離生物素的0.025M PBS沖洗來淬滅未反應STV結合位點。在15min之后，將緩沖液換為0.15M PBS。典型地，該程序產(chǎn)生比例為1:3的SLB栓系的I-PNP和M-PNP。

4.1.每個金納米顆粒的生物素化合價的控制和量化

首先，本發(fā)明人通過改變脂質(zhì)栓系的等離激元納米顆粒(PNP)的生物素化合價來控制PNP的擴散。由此，確定的是，每個顆粒的配體數(shù)量具有對脂質(zhì)膜上的納米顆粒的側向移動性的顯著作用。本發(fā)明人通過改變靶標捕獲DNA序列與SLB栓系DNA序列之間的摩爾比來調(diào)節(jié)在DNA功能化步驟期間AuNP上的生物素分子的化合價。該化學計量控制方法產(chǎn)生高度可重復的結果。通過測量Cy3分子的熒光發(fā)射強度來評估每個PNP的SLB栓系序列的數(shù)量，所述Cy3分子在用KCN溶液溶解AuNP之后被修飾于SLB栓系序列。隨著SLB栓系DNA連接物的加成量增加，平均生物素化合價從0.57線性增加至128(參見圖1和表1)。通過生物素-鏈霉親和素相互作用，將制備的PNP探針栓系于SLB表面。生物素化合價為0.57的在SLB上的PNP探針被認為具有一個生物素，因為不含生物素的PNP不會結合于SLB并且會從表面被徹底洗出。

[表1]

4.2.生物素化合價對SLB上PNP探針的擴散動力學的作用

使用暗視場顯微鏡以單納米顆粒分辨率觀察SLB栓系的PNP探針的側向移動性，并且通過成像分析程序(ImageJ軟件；詳細的實驗和分析方法將稍后描述)分析它們的單個軌跡。在圖2中示出隨著具有不同生物素化合價的SLB栓系的PNP探針的時間而變的均方位移(MSD)值。多價PNP顯示出與寡價PNP(paucivalent PNP)相比更加慢地擴散并且行進更短的距離。具有486個生物素的PNP是幾乎固定的，并且停留在幾乎相同的位置。這些軌跡的MSD圖表，除了包括486個生物素的情況之外，明確地展現(xiàn)出MSD與時間間隔之間的線性關系，表明這些納米顆粒處于SLB表面上的隨機二維布朗運動。為了計算PNP探針的擴散系數(shù)，本發(fā)明人分析了每一生物素化合價的100個顆粒軌跡，并且將相對應的MSD圖表擬合于以下方程：<r²>＝4Dt，其中<r²>是MSD，D是擴散系數(shù)，并且t是時間間隔。對于1、5、28和128的生物素化合價，擴散系數(shù)的平均值分別估算為1.79±0.87×10^-8、0.72±0.35×10^-8、0.38±0.29×10^-8和0.18±0.14×10^-8cm²/s(圖2B)。計算的D值的分布繪制在圖3中，并且這些值符合其中為了脂質(zhì)移動的可視化而用30nm至50nm的AuNP修飾SLB的其它文獻結果。隨著PNP變成更多價，更加降低移動分數(shù)，并且當生物素化合價達到486時大部分顆粒是幾乎固定的。本發(fā)明人觀察到并且關聯(lián)了多價PNP的暗視場顯微鏡圖像和SLB上Cy3修飾的STV的熒光顯微鏡圖像，以證實PNP的位置與局部聚集的STV的位置相匹配。結果顯示兩個圖像完全彼此匹配，表明在多價PNP下STV的局部集中是顆粒移動性損失的成因(圖4)。

4.3.金納米顆粒的光學穩(wěn)定性測試

金屬納米顆粒的共振光散射具有與有機染料的熒光不同的物理起源。局部化表面等離激元的輻射阻尼產(chǎn)生散射的光子，并且該過程沒有閃爍和光漂白。為了評價PNP的光穩(wěn)定性，SLB上的50nm AuNP連續(xù)暴露于暗視場顯微鏡照明30min，并且每隔6s記錄散射強度(圖5)。顆粒連續(xù)發(fā)亮，而在整個實驗時間內(nèi)沒有強度的變化。這表明與即使當多種染料用于單顆粒追蹤時在數(shù)分鐘內(nèi)基本損失其信號的熒光染料相比，AuNP對于實時光學研究而言是更加穩(wěn)健的光學標記。

4.4.SLB上栓系的納米顆粒的單納米顆粒分辨率原位成像和分析

PNP動態(tài)地栓系于流體SLB，并且通過控制顆粒的化合價來調(diào)節(jié)PNP的動態(tài)行為。然后，以單顆粒水平分辨率分析原位DNA雜化誘導的顆粒團簇生長動力學，并且使用相互作用的PNP之間的實時等離激元偶合來進行在該平臺上的定量分析(圖6和7)。同時監(jiān)測和分析來自多顆粒反應位點的相互作用，進行用于二聚的、三聚的和四聚的納米顆粒團簇的形成的動力學研究，并且基于多并行單顆粒分析的DNA檢測檢定被示出為該方法的應用。PNP用于該方法，因為它們有效地散射共振光，并且不受光漂白和閃爍的影響，這能夠在長時段內(nèi)以良好的空時分辨率進行單納米顆粒追蹤(在1小時內(nèi)，具有約1.5nm和約10μs的分辨率)。重要地，單個金或銀納米顆粒(AuNP或AgNP)的等離激元以距離依賴性方式彼此相互作用，并且這形成下述的基本原理，其是在沒有進一步標記的情況下通過監(jiān)測散射強度或頻譜響應的變化來測量數(shù)十納米內(nèi)分子相互作用的基礎。SLB是非常強大的平臺，因為其允許合成和控制固體基底上的二維流體表面，并且并入多種具有側向移動性的膜物質(zhì)。通過將納米顆粒栓系于SLB，可以將納米顆粒限制于光學顯微鏡的二維焦平面中，以有效地成像和追蹤所有受關注的納米顆粒，同時由于SLB的流體性質(zhì)而保留納米顆粒的自由移動。因為栓系的PNP共振散射入射光并通常在平面脂質(zhì)雙層表面上行進，因此可以使用暗視場顯微機構(Axiovert 200M,Carl Zeiss,Germany)以單顆粒分辨率來原位記錄二維擴散軌跡和光學信號(參見圖7)。暗視場結果證實栓系的PNP均勻地分散在整個二維膜表面內(nèi)，并且表現(xiàn)出在膜表面上具有自由擴散的優(yōu)異側向移動性。顆粒的這種動態(tài)二維限制和PNP標記的使用允許促進顆粒之間的有效碰撞以及在納米顆粒上的分子之間的幾乎所有反應的原位觀察和分析。

實施例5：圖案化SLB的制備

為了DNA檢定，在玻璃基底上的圖案化金膜中形成120×120μm²的SLB。通過常規(guī)光刻法和常規(guī)剝離法來形成金圖案。SLB會選擇性沉積到通過SUV溶液的引入而暴露的玻璃表面上，因為金的表面對于SLB的形成呈惰性。在SLB形成之后，使用溶解在PBS中的2mg/ml BSA和10μm羧甲基聚乙二醇來鈍化金的表面，從而抑制PNP和靶標DNA的非特異性結合。然后，將PNP栓系以用于DNA檢定實驗的使用。

實施例6：PNP探針的基于暗視場顯微鏡的原位觀察及其光學分析

通過裝備有40×物鏡(NA 0.6)的暗視場顯微鏡(Axiovert 200M,Carl Zeiss,Germany)來觀察SLB栓系的PNP探針的移動和等離激元偶合。使用ImageJ軟件(http://rsb.info.nih.gov/ij/)進行所有的圖像分析程序。為了單個SLB栓系的PNP探針的追蹤和軌跡分析，使用MOSAIC插件(http://www.mosaic.ethz.ch/Downloads/ParticleTracker)。通過ImageJ軟件的基本強度測量和RGB顏色強度分裂函數(shù)分別測量散射強度和RGB顏色譜。通過裝備有60×透鏡(NA 1.49)的落射熒光顯微鏡(TE-2000,Nikon,Tokyo,Japan)在532nm激光激發(fā)下觀察Cy3修飾的STV。

6.1.相互作用的顆粒的高分辨率成像檢定

高分辨率成像檢定的另一重要方面是相互作用的顆粒的穩(wěn)定且可靠的觀察方法。為了有助于此情形，在側向移動性方面具有顯著差異的2種類型的DNA修飾的等離激元納米顆粒(DNA-PNP)經(jīng)設計、制備和栓系于SLB表面，即，分別為高移動和幾乎固定的PNP(M-PNP和I-PNP)探針(參見圖6)。穩(wěn)定地監(jiān)測和分析來自固定的I-PNP位點的散射信號，并且M-PNP擴散到I-PNP位點中以誘導基于等離激元偶合的散射信號的變化。分別用5’-硫醇-修飾的DNA和3’-硫醇-修飾的DNA各自制備I-PNP和M-PNP探針。兩種不同的硫醇化DNA序列(靶標捕獲序列和SLB栓系序列)用于每一PNP探針的功能化。SLB栓系序列具有在與硫醇相對的末端上的生物素基團，并且形成與鏈霉親和素修飾的SLB的穩(wěn)定結合。在DNA修飾操作中，通過具有不同摩爾分數(shù)的SLB栓系序列的探針的生物素化合價來控制PNP探針的移動性。隨著PNP變成更多價，進一步降低擴散系數(shù)和移動分數(shù)，并且當生物素化合價達到486時，其使用0.15625摩爾分數(shù)的SLB栓系序列而獲得，所有顆粒是幾乎固定的(參見圖8)。此處，對于M-PNP探針，加成0.00125摩爾分數(shù)的SLB栓系序列以產(chǎn)生1生物素化合價。M-PNP探針是寡價的，并且可以經(jīng)由隨機二維布朗運動而更加自由地擴散。另一方面，多價I-PNP探針被幾乎完全固定在膜表面上。使用ImageJ軟件，通過求半徑為500nm的I-PNP位點中心的圓形區(qū)域(其相近于用于該研究的顯微鏡設置的光學分辨率d(d＝λ/2NA；λ是50nm AuNP的共振散射波長，即530nm；NA是40×物鏡的數(shù)值孔徑，即0.6))的平均值來分析散射強度。

隨著M-PNP和I-PNP探針經(jīng)由鏈霉親和素連接物而栓系于SLB中的生物素化的脂質(zhì)，可以在暗視場顯微鏡中由共振光散射信號來容易地追蹤PNP結合的脂質(zhì)的局部位置和移動。在不存在顆粒-連接靶標DNA的情況下，M-PNP探針可以接近固定的I-PNP位點，并且這些探針在暗視場顯微鏡中可以是暫時重疊的。因此，I-PNP位點的散射強度是最初恒定的，但隨著M-PNP進入而在光學衍射限度內(nèi)波動(參見圖9)。有趣的是，觀察到在信號中的兩種類型的瞬態(tài)激增。在此更加頻繁的一種情況下，散射強度比初始值高約2倍。這可以歸因于遠端光學重疊，其中兩個PNP存在于光學分辨率內(nèi)，但彼此不足夠靠近以導致等離激元偶合(圖9B-i)。在其它情況下，觀察到散射強度的約3.5倍的上升，并且這種增加起源于兩種等離激元偶合的PNP之間的近場相互作用(圖9B-ii)。應注意，這些信號變化中的大部分持續(xù)少于0.5s，這是因為不存在顆粒之間的特異性相互作用。通過等離激元偶合在亞衍射長度范圍下辨別脂質(zhì)之間的暫時分子間接近。我們的策略和結果表明可以監(jiān)測導致PNP探針之間的對接和等離激元偶合的分子間相互作用。在接下來的一組實驗中，我們觀察到觸發(fā)SLB上DNA修飾的PNP探針的組裝和解組裝的原位DNA雜化和去雜化事件，并且實時地以單納米顆粒分辨率記錄了散射強度的相對應的變化。在存在靶標DNA序列的情況下，寡價M-PNP被多價I-PNP捕獲，并且形成多顆粒團簇，其中I-PNP被固定并且作為追蹤中心而被監(jiān)測。在暗視場顯微圖像中，成功地分辨組裝過程，以觀察單納米顆粒加成事件。觀察到從單體至四聚體的顆粒間PNP團簇生長，并且用白色實線來突出已經(jīng)被捕獲的M-PNP探針的軌跡(參見圖10A)。隨著團簇進化，我們觀察到向I-PNP位點的每個單M-PNP加成步驟中散射強度和顏色二者的突然變化。散射效率和共振波長的變化起因于團聚的AuNP中等離激元偶合。在3nM靶標DNA濃度下，在15min內(nèi)完成反應，并且消耗許多單體M-PNP探針以形成團簇。團簇生長通常被限制于四聚體內(nèi)，并且?guī)缀跤^察不到超過四聚體的進一步生長，因為存在有限數(shù)量的M-PNP，并且在此情況下用于在二維平面上單位點中的多于4個的顆粒的組裝的在顆粒上的DNA鏈之間還存在大的位阻。固定的I-PNP的利用通過有效地消除小團簇之間的并合(其產(chǎn)生不規(guī)則的二維聚集體并且損害量化)來約束單體附接的團簇生長途徑(請參見用于在M-PNP對修飾的SLB中觀察到的并合過程的補充的圖11)。PNP探針之間的等離激元偶合引發(fā)共振波長的紅移，由此在暗視場顯微圖像中的等離激元偶合的綠色AuNP變紅。通過分裂RGB通道來分析等離激元顏色變化(圖7)。隨著團簇生長，綠色和紅色信號增加，而藍色信號保持恒定?；谶@些結果，我們繪制綠紅比圖，并且隨著團聚的顆粒的數(shù)量增加，觀察到該比例的線性增加(圖10B)。顏色校準用基準應該在實際上可用于精確限定和量化顆粒間相互作用的狀態(tài)并且將基于特異性相互作用的等離激元偶合與非特異性光學重疊區(qū)分開。重要的是，示出M-PNP探針經(jīng)由靶標DNA識別和雜化而向I-PNP位點的顆粒間加成，并且以散射強度的時間追蹤而量化(圖10C中的頂部圖)。結果表明當向I-PNP探針加成每一M-PNP以依次形成二聚體、三聚體和四聚體時，以階梯式方式增加散射信號強度。當用包含更加少的鹽(17mM Na⁺)的低鹽PB溶液替換高鹽PBS溶液(167mM Na⁺)時，靶標DNA被去雜化，并且M-PNP從I-PNP探針離解并在SLB表面上再次自由地擴散，這產(chǎn)生散射強度的一系列階梯式降低(圖10C中的底部圖)。應注意，對于每一探針加成步驟，散射信號強度經(jīng)歷多個階梯式改變，并且保持恒定，直至接下來的顆粒被加成或釋放。

6.2.團簇生長動力學的分析

通過假設M-PNP與I-PNP相比過量地存在，將從單體至四聚體的團簇生長動力學擬合成三步一階連續(xù)反應：

每一物質(zhì)的改變速率的微分形式如下。

解析這些微分方程得出解，以描述每一物質(zhì)的時間依賴性濃度：

其中初始I-PNP單體濃度[M]₀為150，其為此處分析的顆粒的數(shù)量。通過使用這些方程擬合動力學數(shù)據(jù)來評價k₁、k₂和k₃的速率常數(shù)值。

通過同時分析在大表面區(qū)域(典型地為約30,000μm²；圖12A)上的PNP探針的單個等離激元偶合來實現(xiàn)多個相互作用的高度并行的原位觀察。本發(fā)明的330s觀察時間(80ms暴露時間和1s時間間隔)的原位并行顆粒團簇生長分析結果表明，盡管典型地觀察了連續(xù)的顆粒間團簇生長(圖12B-i和iv)，還以不同的團聚動力學觀察了許多不同的團聚模型。一些探針僅形成二聚體，并且沒有進一步生長(圖12B-ii和iii)。還存在其中探針團簇生長以形成三聚體而未進一步生長以形成四聚體的情況。有趣的是，還觀察并分辨了兩個探針向I-PNP探針的同時加成(圖12B-iii和vi)和在非常短的時間框架內(nèi)兩個或三個探針向I-PNP探針的背對背加成(圖12B-vii、ix和x；請參見這些情況的插圖)。在本發(fā)明中，基于這種原位并行單顆粒分辨率分析能力，研究DNA雜化誘導的形成團簇的反應動力學。出于該目的，同時監(jiān)測150個單個I-PNP位點的散射強度。通過假設M-PNP相對于I-PNP單體過量地存在，將從單體至四聚體(單體→二聚體→三聚體→四聚體)的生長動力學擬合成三步連續(xù)反應。二聚體、三聚體和四聚體形成的速率常數(shù)被分別估算為k1＝0.0165，k2＝0.0116和k3＝0.0061s^-1。該模型解釋了在180s內(nèi)的納米顆粒團簇生長動力學。該結果是下述假設的直接證據(jù)，即，從二聚體形成三聚體與從單體形成二聚體相比是更加困難且緩慢的過程，并且四聚體形成由于DNA修飾的PNP探針之間的位阻而是最困難且耗時的過程。當考慮位阻因子(f)時，三聚體和四聚體形成的速率常數(shù)可以分別表示為k₂＝f_dimk₁和k₃＝f_trik₁。從擬合的速率常數(shù)來計算空間因子(對于f_dim為0.7030并且對于f_tri為0.3697)。透射電子顯微鏡測量表明PNP團簇形成為不同的幾何構型(圖13)。基于該觀察，本發(fā)明人在幾何學上計算了向二維二聚體和二維三聚體加成接下來的PNP的空間因子(在幾何學上計算的位阻因子：f_dim＝0.6667和f_tri＝0.3750；圖14)。這些結果符合從擬合的速率常數(shù)獲得的空間因子，表明三步連續(xù)反應模型描述和解釋了DNA修飾的PNP探針的二維團簇生長。

最后，本發(fā)明人起草了用于團簇中反應的顆粒數(shù)量的光學校準用標準，并且基于該標準曲線，他們進行了靶標DNA檢測并且評價了PNP栓系的SLB平臺的檢測靈敏度。校準用標準線圖通過同時分析30個單個團簇而獲得，并且通過分辨和記錄全部顆粒加成事件來確定團簇中的顆粒數(shù)量。為了在單次框架獲取內(nèi)同時加成多個PNP探針，在此情形下以5.3個框架/秒來提高框架速率。本發(fā)明人繪制了平均散射強度并發(fā)現(xiàn)與團聚的顆粒數(shù)量的線性關系(R²值為0.999，圖15A)。相對應的分布示于圖5中。顯著地，該結果展現(xiàn)出窄的標準偏差，并且本發(fā)明人可以明確地區(qū)分團聚的狀態(tài)。

6.3.使用與栓系于SLB的互補DNA修飾的PNP的相互作用的靶標DNA檢測限度

在量化團簇形成程度的情況下，通過靶標DNA及其互補序列的相互用作形成的金納顆粒團簇可以用作用于檢測DNA的生物傳感器，因為金納米顆粒團簇的散射信號的強度得以顯著地增加，并且可以以單納米顆粒水平觀察該金納米顆粒團簇。因此，由于根據(jù)靶標DNA濃度而形成金納米顆粒團簇，由此通過分析暗視場顯微鏡圖像的亮度來測定靶標DNA的可檢測的濃度范圍。在嵌于金膜中的120×120μm²SLB圖案上進行DNA檢測(圖15B)。使用從300aM至300fM的不同濃度的靶標DNA，使PNP修飾的SLB反應4小時。包括對照樣品在內(nèi)的所有樣品包含300fM的非互補DNA序列以驗證本發(fā)明的檢定選擇性。在用于本發(fā)明的靶標DNA的濃度范圍，PNP僅形成二聚體而不進一步生長成三聚體和四聚體。代表偶合的二聚體散射強度的I-PNP位點(>3.5倍的增加；參見圖15A)僅被計數(shù)為靶標DNA序列的光學信號(圖15B)。檢定結果表明在沒有優(yōu)化過程的情況下30fM的檢測限度(圖15C)。顯著地，還明確地辨別基于單堿基對錯配的DNA序列(圖15C)。

這樣的高靈敏度表明在SLB上移動的M-PNP和在SLB上固定的I-PNP在二維平面上移動并反應，由此碰撞可能性增加，從而引發(fā)迅速的反應。實際上，觀察到當在不引入支持的脂質(zhì)雙層(SLB)并且不與在SLB上固定的I-PNP反應的情況下，M-PNP被分散在溶液中時，引發(fā)非常緩慢且低效的反應。

6.4.通過外部刺激的栓系于SLB的納米顆粒的分布的調(diào)節(jié)以及等離激元偶合的誘導

當適當?shù)卣{(diào)節(jié)在SLB上栓系的金屬納米顆粒的生物素化合價時，金屬納米顆粒在SLB上具有流動性。流體金屬納米顆粒進行自由的二維擴散移動，并且可以通過外部刺激(例如電場和流體流)而調(diào)節(jié)以使它們在SLB上以期望的方向移動。在此情況下，還可以通過改變電場強度或流量來調(diào)節(jié)金屬納米顆粒的移動速度。如在圖16中所示，當在圖案化SLB中調(diào)節(jié)納米顆粒的空間分布時，可以增加特定部分中的納米顆粒的密度，并且可以大幅改善納米顆粒之間的碰撞頻率。因此，當在SLB上增加納米顆粒之間的相互作用時，反應速率增加，由此改善生物傳感器的靈敏度以縮短檢測時間。此外，調(diào)節(jié)納米顆粒之間的距離以形成用于調(diào)節(jié)等離激元偶合的平臺。

具體地，為了調(diào)節(jié)在SLM平臺中引入的金屬納米顆粒的移動，在玻璃基底上提供流動通道。在上載玻片的兩側中形成孔以引入用于形成流體流的緩沖液。當以此方式在流動通道中引入流體流時，金屬顆粒在自由的二維擴散移動期間以特定方向移動，同時逐漸改變移動路徑。隨著流量增加，明顯觀察到這樣的移動趨勢(圖17A和17B)。在其中用鉻(Cr)圖案化SLB的情況下，金屬納米顆粒被限制在Cr屏障中，而不從Cr屏障出來(圖16的右下圖)。在此情況下，當通過流體流在一個方向調(diào)節(jié)金屬納米顆粒的移動方向時，可以觀察到其中金屬納米顆粒在與流體流相同的方向上移動以被集中的現(xiàn)象(圖18A和18B)。發(fā)現(xiàn)金納米顆粒和銀納米顆粒二者在一個方向累積以展現(xiàn)出特定表面等離激元共振波長的顏色。此外，觀察到，當流體流在相反方向上改變時，累積的金屬納米顆粒在相反的方向移動以被集中。

當將SLB圖案制造成數(shù)平方毫米(mm²)的大尺寸時，可以在一個位置處累積大量的金屬納米顆粒。為了累積大量的金屬納米顆粒，制造梯形圖案，并且在6ml/h的流量下將金屬納米顆粒集中約30min。發(fā)現(xiàn)集中的金屬納米顆粒在梯形圖案的末端處具有特定的等離激元散射顏色。在此情況下，通過流體液動力、DNA修飾的納米顆粒之間的范德華相互作用、DNA分子之間的空間排斥以及靜電排斥，從而將金屬納米顆粒保持平衡。為了降低金屬納米顆粒之間的距離，在該研究中，增加在流體中包含的NaCl的濃度。發(fā)現(xiàn)，通過NaCl濃度的增加，金屬納米顆粒之間的靜電排斥降低，由此金屬納米顆粒之間的距離變得更近，以誘導等離激元偶合。測量和分析此時的散射譜(圖19A、19B、20A和20B)。散射譜的最大峰代表隨著鹽濃度增加的紅移。從金屬納米顆粒的ζ電勢的測量結果，發(fā)現(xiàn)金屬納米顆粒的表面電荷隨著鹽濃度增加而降低，由此金屬納米顆粒之間的靜電排斥降低，從而降低其間的距離(圖19C和20C)。

6.5.仿生人工膜平臺的開發(fā)

細胞膜，其為分離細胞內(nèi)部和外部的結構，是由磷脂和蛋白質(zhì)分子組成的薄的磷脂雙層。細胞膜具有選擇滲透性，并且具有通過多種蛋白質(zhì)來維持細胞功能和細胞組織的功能。與此相同，用于維持細胞的體內(nèi)平衡和必要功能的多種生物學現(xiàn)象發(fā)生在細胞膜中。因此，細胞膜的生物學和細胞學理解是非常重要的。

由此觀點，可以通過使用在實施例6.4中公開的SLB平臺(其為電力或流體力學調(diào)節(jié)的人工細胞膜結構)來觀察細胞的行為。包含生物材料的諸如金屬納米顆粒的標記材料通過使用化學或生物學方法而被引入SLB，其為人工膜，并且檢測標記材料的光學性質(zhì)，由此監(jiān)測細胞的行為。被引入SLB的生物材料可以細胞內(nèi)誘導信號傳遞，或可以細胞外誘導表型調(diào)節(jié)反應。這樣的觀察可以有助于鑒定還未被公開的新的生物學機制，因為其類似于在真實的細胞膜中發(fā)生的生物學反應。

具有光學性質(zhì)例如等離激元共振的金屬納米顆粒可以根據(jù)金屬納米顆粒與鄰近的金屬顆粒之間的距離而雜化。由于這樣的特性，這些金屬納米顆粒根據(jù)金屬納米顆粒與鄰近的金屬顆粒之間的距離以及在用暗視場顯微鏡觀察時金屬納米顆粒的團聚程度而展現(xiàn)出不同的顏色。此外，可以在一時間段內(nèi)以高信噪比(S/N比)觀察金屬納米顆粒，這歸因于強的等離激元散射?？梢酝ㄟ^將產(chǎn)生多元可檢測的表面增強拉曼散射信號以及等離激元散射信號的細胞監(jiān)測探針引入細胞膜中，從而觀察細胞應答。

因此，將包含生物材料的金屬納米顆粒引入SLM表面，培養(yǎng)細胞，然后可以光學分析由于細胞造成的金屬納米顆粒的移動。因此，可以更精確地分析細胞信號傳遞機制，因為可以實時觀察細胞的行為，并且可以實時以納米尺度監(jiān)測細胞與生物材料之間的相互作用(圖21)。

實施例7：使用三色(紅/綠/藍(RGB))納米探針的多元檢測

諸如銀納米顆粒和金納米顆粒的貴金屬納米顆粒的特征在于，它們根據(jù)其形狀和/或尺寸而展現(xiàn)出多種顏色，因為它們引發(fā)等離激元共振。由于這些特性，可以通過改變納米顆粒的組成、形狀和/或尺寸來提供發(fā)射紅光、藍光或綠光的納米顆粒。因為這些納米顆粒展現(xiàn)出彼此不同的顏色，因此它們可以通過暗視場顯微鏡而彼此區(qū)分。因此，通過使不同組合之間的區(qū)別成為可能，從而發(fā)現(xiàn)這些不同的三色納米顆粒對于miRNA多元檢測的適用性。同時，因為已知miRNA(其為控制體內(nèi)功能的短RNA鏈)在患有諸如癌癥的疾病的患者中錯誤地表達，因此其可以用作診斷諸如癌癥的疾病的生物標記。在以下表2中示出在多種癌癥中發(fā)現(xiàn)的錯誤表達的miRNA的實例。

[表2]

7.1.三色(RGB)納米顆粒的制備

通過用銀殼涂覆尺寸為15nm×15nm×45nm的金納米棒，直至約5nm的厚度，從而制備紅色納米顆粒。作為綠色納米顆粒，使用直徑為50nm的球形金納米顆粒。通過用銀殼涂覆直徑為20nm的球形金納米顆粒，直至約10nm的厚度，從而制備藍色納米顆粒。通過使用暗視場顯微鏡和電子顯微鏡觀察所制備的納米顆粒中的每一種的顏色和形狀，并且其結果示于圖22中。此外，測量所述納米顆粒中每一種的吸收/散射譜，并且其結果也示于圖22中(右圖)。

7.2.通過組合三色納米探針的微RNA的多元檢測

以與實施例3相同的方式將DNA引入從實施例7.1獲得的每一納米顆粒中，并且使這些納米顆粒功能化以合成三色納米探針。以與實施例4相同的方式調(diào)節(jié)三色納米探針的移動性，由此將總計6種類型的I-PNP納米探針(在下文，表示為IR、IG和IB)和M-PNP納米探針(在下文，表示為MR、MG和MB)引入到SLB上。如在實施例6.1中所述，引發(fā)等離激元共振散射的金屬納米顆粒根據(jù)與金屬納米顆粒結合的互補序列DNA的雜化而彼此接近，以形成兩個或更多個金屬納米顆粒的團簇，由此改變等離激元散射強度以及等離激元顏色(圖5至7)。因此，當施用展現(xiàn)出不同顏色的三種金屬納米顆粒時，可以預期由其組合導致的總計9種類型的變化(圖23A)，并且這些變化得到示例性實施方案的確認(圖23B至23D)。具體地，確認的是，納米探針被組合，并且經(jīng)互補DNA修飾，以與9種類型的miRNA偶合(圖23B)，由此可以實時分析每一偶合，并且可以定量地分析9種類型的miRNA。在結合之前(0min)和60min反應之后于相同框架中測量的暗視場顯微鏡圖像示于圖23C中，并且相對于反應時間的累積化合價的變化示于圖23D中。相對于時間的通過與固定的單個顆粒(IR、IG和IB)中的相同或不同的顆粒偶合所導致的等離激元散射譜的變化示于圖24至26中，并且具有不同顏色(不同等離激元散射波長)和移動性的多個顆粒的行為及其使用暗視場顯微鏡的監(jiān)測程序示于圖27中。因此，由于本發(fā)明的多元檢測方法可以同時定性和/或定量地分析9種或更多種類型的miRNA，因此該多元檢測方法可以用于分類和診斷6種或更多種類型的不同癌癥。

通過互補序列識別的miRNA檢測的實例示于圖28中。在以下表3中給出用于確認上述多元檢測適用性的9種類型的miRNA的序列以及為了檢測miRNA序列而引入各顆粒中的DNA序列。

[表3]