本發(fā)明涉及使用激光燒蝕-電感耦合等離子體-質(zhì)譜法(LA–ICP–MS)或質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)(mass cytometry)的組織樣品的成像。

背景技術(shù)：

分子靶的單細(xì)胞測(cè)量和多重定量檢測(cè)可以對(duì)單獨(dú)細(xì)胞的狀態(tài)和表現(xiàn)提供洞察。已用于單細(xì)胞分析的技術(shù)包括與特異的標(biāo)記技術(shù)(例如使用免疫細(xì)胞化學(xué))、單細(xì)胞成像質(zhì)譜法、表面增強(qiáng)的拉曼散射光譜和LA–ICP–MS結(jié)合的顯微術(shù)。

這些技術(shù)中的一些可以容易地延伸到組織的原位成像(例如使用免疫組織化學(xué))，但其他的不能。例如，方法諸如免疫熒光顯微術(shù)(IFM)可用于低至納米分辨率的成像，但實(shí)踐中局限于同時(shí)測(cè)量七個(gè)或更少的靶。與之相比，LA–ICP–MS提供單細(xì)胞中的抗原表達(dá)的高度多重的定量分析，但其目前缺少對(duì)于組織樣品內(nèi)的單細(xì)胞的成像必需的分辨率。

本發(fā)明的目標(biāo)是提供用于組織樣品成像的另外的并且改進(jìn)的技術(shù)，并特別地使LA-ICP-MS適于用作單細(xì)胞成像技術(shù)。

詳述

ICP–MS已被用于單細(xì)胞分析，但僅用于懸浮液中的細(xì)胞[1]。發(fā)明人現(xiàn)已使激光燒蝕(LA)適合于ICP–MS，以使得該技術(shù)適用于組織樣品中的單細(xì)胞成像。盡管先前已經(jīng)報(bào)道了經(jīng)由LA–ICP–MS的組織成像，公開的過程尚未實(shí)現(xiàn)高的空間分辨率。例如，LA-ICP-MS已被用于獲得腦切片的[2]和癌癥組織的[3、4]圖像，但未實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞或亞細(xì)胞分辨率。在所有的情況中，分辨率被燒蝕激光的光斑尺寸和/或被在連續(xù)燒蝕中釋放的材料的分析之間的重疊/混合限制。例如，40μm的光斑尺寸[2]不能以對(duì)組織樣品中單細(xì)胞成像足夠高的分辨率燒蝕材料。類似地，如果燒蝕的材料不能在少于100ms內(nèi)運(yùn)輸?shù)絀CP-MS，那么以10Hz的頻率燒蝕將導(dǎo)致重疊信號(hào)；例如，參考文獻(xiàn)3中使用的以該燒蝕頻率的燒蝕單元具有大大超過1秒的沖洗時(shí)間(作者未提示)。

現(xiàn)在發(fā)明人提供了LA–ICP–MS系統(tǒng)，其克服了這些缺點(diǎn)并且能夠?qū)崿F(xiàn)亞細(xì)胞分辨率，因此第一次使適用于組織的單細(xì)胞成像的LA–ICP–MS技術(shù)可用。因此，本發(fā)明提供了一種使包含多個(gè)細(xì)胞的組織樣品成像的方法，所述方法包括以下的步驟：(i)用多個(gè)不同的標(biāo)記原子標(biāo)記所述組織樣品中的多個(gè)不同的靶分子，以提供標(biāo)記的組織樣品；(ii)使所述標(biāo)記的組織樣品的多個(gè)細(xì)胞在多個(gè)已知的位置經(jīng)受具有亞細(xì)胞分辨率的激光燒蝕，以形成多個(gè)煙流；和(iii)使煙流經(jīng)受電感耦合等離子體質(zhì)譜法，借此檢測(cè)所述煙流中的標(biāo)記原子允許構(gòu)造所述組織樣品的圖像。本發(fā)明的一個(gè)一般的優(yōu)勢(shì)是其與已在免疫組織化學(xué)(IHC)中使用的技術(shù)和方案兼容，但通過LA-ICP-MS檢測(cè)的標(biāo)記物的使用現(xiàn)在允許更多的靶定位在樣品中。

本發(fā)明還提供了一種使包含多個(gè)細(xì)胞的組織樣品成像的方法，所述方法包括以下的步驟：(i)用多個(gè)不同的標(biāo)記原子標(biāo)記所述組織樣品中的多個(gè)不同的靶分子，以提供標(biāo)記的組織樣品；(ii)使所述標(biāo)記的組織樣品的多個(gè)細(xì)胞在多個(gè)已知的位置經(jīng)受激光燒蝕，以形成多個(gè)煙流；和(iii)使煙流經(jīng)受使用飛行時(shí)間質(zhì)量分析器的電感耦合等離子體質(zhì)譜法，借此所述煙流中的標(biāo)記原子的檢測(cè)允許構(gòu)造所述組織樣品的圖像。

本發(fā)明還提供了一種使包含多個(gè)細(xì)胞的組織樣品成像的方法，所述方法包括以下的步驟：(i)用不同的標(biāo)記原子標(biāo)記所述組織樣品中的至少四種不同的靶分子，以提供標(biāo)記的組織樣品；(ii)使所述標(biāo)記的組織樣品的多個(gè)細(xì)胞在多個(gè)已知的位置經(jīng)受激光燒蝕，以形成多個(gè)煙流；和(iii)使煙流經(jīng)受電感耦合等離子體質(zhì)譜法，借此所述煙流中的標(biāo)記原子的檢測(cè)允許構(gòu)造所述組織樣品的圖像。

本發(fā)明還提供了一種使包含多個(gè)細(xì)胞的組織樣品成像的方法，所述方法包括以下的步驟：(i)用多個(gè)不同的標(biāo)記原子標(biāo)記所述組織樣品中的多個(gè)不同的靶分子，以提供標(biāo)記的組織樣品；(ii)劃分所述樣品中的單獨(dú)的細(xì)胞；(iii)使所述標(biāo)記的組織樣品的多個(gè)細(xì)胞在多個(gè)已知的位置經(jīng)受激光燒蝕，以形成多個(gè)煙流；(iii)和使煙流經(jīng)受電感耦合等離子體質(zhì)譜法，借此所述煙流中的標(biāo)記原子的檢測(cè)允許構(gòu)造所述組織樣品的圖像。

本發(fā)明還提供了一種使包含多個(gè)細(xì)胞的組織樣品成像的方法，所述方法包括以下的步驟：(i)用標(biāo)記原子標(biāo)記所述組織樣品中的一個(gè)或更多個(gè)靶分子，以提供標(biāo)記的組織樣品；(ii)使用4μm或更少的激光光斑尺寸使所述標(biāo)記的組織樣品的多個(gè)細(xì)胞在多個(gè)已知的位置經(jīng)受激光燒蝕，以形成多個(gè)煙流；和(iii)使煙流經(jīng)受電感耦合等離子體質(zhì)譜法，借此所述煙流中的標(biāo)記原子的檢測(cè)允許構(gòu)造所述組織樣品的圖像。

本發(fā)明還提供了一種使包含多個(gè)細(xì)胞的組織樣品成像的方法，所述方法包括以下的步驟：(i)提供標(biāo)記的組織樣品，其中多個(gè)不同的靶分子已用多個(gè)不同的標(biāo)記原子標(biāo)記；(ii)使所述標(biāo)記的組織樣品的多個(gè)細(xì)胞在多個(gè)已知的位置經(jīng)受具有亞細(xì)胞分辨率的激光燒蝕，以形成多個(gè)煙流；和(iii)使煙流經(jīng)受電感耦合等離子體質(zhì)譜法，借此所述煙流中的標(biāo)記原子的檢測(cè)允許構(gòu)造所述組織樣品的圖像。

本發(fā)明還提供了用四種或更多種(例如5、6、7、8、9、10、12、13、14、15或更多)不同的過渡金屬原子標(biāo)記組織樣品的方法。這些原子與特定的細(xì)胞靶相關(guān)，因此允許通過LA-ICP-MS的下游檢測(cè)。然后，來自LA-ICP-MS的數(shù)據(jù)可被用于創(chuàng)建樣品的圖像。

本發(fā)明還提供了使組織樣品成像的方法，其中所述組織樣品的多個(gè)細(xì)胞經(jīng)受為亞細(xì)胞分辨率的質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)。

本發(fā)明還提供了LA-ICP-MS的方法，其中單個(gè)標(biāo)記的細(xì)胞的基本所有的內(nèi)含物被用單一激光射出燒蝕，并且然后經(jīng)受ICP-MS。因此，完整細(xì)胞的基本所有內(nèi)含物可被質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)分析。燒蝕提供含有基本所有的細(xì)胞的內(nèi)含物的煙流，并且然后該煙流可以被引入到ICP并且經(jīng)受MS，因此檢測(cè)標(biāo)記的材料并且允許在單個(gè)分析中對(duì)完整細(xì)胞的多重分析。

LA-ICP-MS和質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)

本發(fā)明在組織樣品成像方法中使用耦合到電感耦合等離子體質(zhì)譜法的激光燒蝕(LA-ICP-MS)。用不同的標(biāo)記原子標(biāo)記樣品中的不同的靶分子，并且然后LA-ICP-MS跨越標(biāo)記的組織樣品的多個(gè)細(xì)胞使用。通過將所檢測(cè)的信號(hào)與引起那些信號(hào)的激光燒蝕的已知位置聯(lián)系起來，方法允許將所標(biāo)記的靶分子定位到樣品上的特定位置，并因此構(gòu)造樣品的圖像。

LA-ICP-MS涉及使組織樣品經(jīng)受激光脈沖，所述激光脈沖從樣品生成燒蝕材料的煙流，并且這些煙流被作為氣霧劑傳送到ICP-MS儀器以用于分析。樣品中的標(biāo)記原子可由MS區(qū)分，并且因此它們的檢測(cè)揭示煙流中多個(gè)靶的存在或缺乏。

以該方式生成的信號(hào)的空間分辨率取決于兩種主要因素：(i)當(dāng)信號(hào)在被燒蝕的總面積上積分時(shí)，激光的光斑尺寸；以及(ii)相對(duì)于以其正在生成煙流的速度，以其可分析煙流以便避免來自如以上提到的連續(xù)煙流的信號(hào)的重疊的速度。

因此，為了分析單獨(dú)的細(xì)胞，本發(fā)明使用不大于這些細(xì)胞的激光光斑尺寸，并且更具體地，使用可燒蝕材料的具有亞細(xì)胞分辨率的激光光斑尺寸。該尺寸將取決于樣品中的特定細(xì)胞，但通常激光光斑將具有小于4μm的直徑(例如，在范圍0.2--4μm、0.25-3μm或0.4-2μm之內(nèi))。因此，激光光斑可具有大約3μm、2μm、1μm或0.5μm的直徑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，激光光斑直徑在0.5--1.5μm的范圍內(nèi)，或?yàn)榇蠹s1μm?？墒褂每s小的較寬激光束和近場(chǎng)光學(xué)器件來實(shí)現(xiàn)小的光斑尺寸。1μm的激光光斑直徑對(duì)應(yīng)于1μm的激光聚焦點(diǎn)，但由于將激光束傳送到樣品表面上的物鏡的數(shù)值孔徑，激光聚焦點(diǎn)可改變±20％。

為了組織樣品的快速分析，需要高頻率(例如，10Hz或更大(即，每秒10次燒蝕，每秒產(chǎn)生10次煙流))的燒蝕。在優(yōu)選實(shí)施方案中，燒蝕的頻率在范圍10-200Hz內(nèi)、在范圍15-100Hz內(nèi)或者在范圍20-50Hz內(nèi)。至少20Hz的燒蝕頻率允許在合理的時(shí)間中實(shí)現(xiàn)典型組織樣品的成像。如以上所指出的，在這些頻率下，儀器必須能夠足夠快速地分析燒蝕的材料，以便避免連續(xù)燒蝕之間的大量信號(hào)重疊。優(yōu)選地是，源自連續(xù)煙流的信號(hào)之間的重疊在強(qiáng)度上<10％(更優(yōu)選地<5％，并且理想地<1％)。煙流的分析所需的時(shí)間將取決于燒蝕單元的沖洗時(shí)間、煙流氣霧劑到達(dá)和通過ICP的渡越時(shí)間、以及分析電離的材料所花費(fèi)的時(shí)間。

因此，具有短的沖洗時(shí)間(例如100ms或更少)的燒蝕單元與本發(fā)明一起使用是有利的。具有長(zhǎng)沖洗時(shí)間的單元將限制可以生成圖像的速度，或?qū)?dǎo)致來自連續(xù)樣品斑點(diǎn)的信號(hào)之間的重疊(例如，參考文獻(xiàn)5，其具有超過10秒的信號(hào)持續(xù)時(shí)間)。因此，氣霧劑沖洗時(shí)間是對(duì)于實(shí)現(xiàn)高分辨率而不增加總掃描時(shí)間的關(guān)鍵限制因素。具有<100ms的沖洗時(shí)間的燒蝕單元在本領(lǐng)域是已知的。例如，參考文獻(xiàn)6公開了具有低于100ms的沖洗時(shí)間的燒蝕單元。在參考文獻(xiàn)7中公開了特別地適合的燒蝕單元(還參見參考文獻(xiàn)8)，其具有30ms或更少的沖洗時(shí)間，因此允許高燒蝕頻率(例如在20-40Hz之間)并且因此快速分析。本文的實(shí)例論證，由20Hz激光燒蝕射出生成的煙流的信號(hào)可被該燒蝕單元完全分離，因此使短時(shí)間中大面積成像能夠?qū)崿F(xiàn)。因此使用本發(fā)明的方法，實(shí)現(xiàn)最終的圖像中每空間分辨的像素的時(shí)間小于100ms是可能的。

通過將燒蝕單元定位在ICP附近以及通過確保足夠的氣體流用于以適當(dāng)?shù)乃俣葘忪F劑直接運(yùn)輸?shù)絀CP來簡(jiǎn)單地控制煙流氣霧劑到達(dá)和通過ICP的渡越時(shí)間。使用如參考文獻(xiàn)7中描述的氬氣和氦氣的運(yùn)輸提供良好的結(jié)果。

分析電離的材料所花費(fèi)的時(shí)間將取決于用于離子的檢測(cè)的質(zhì)量分析器的類型。例如，使用法拉第杯的儀器通常對(duì)于分析快速信號(hào)來說太慢?？偟膩碚f，期望的成像速度(并因此燒蝕頻率)、分辨率(并因此激光光斑尺寸和燒蝕單元)以及多路復(fù)用的程度將指示應(yīng)使用的質(zhì)量分析器的一種類型或多種類型(或相反地，質(zhì)量分析器的選擇將決定可實(shí)現(xiàn)的速度、分辨率和多路復(fù)用)。

例如使用點(diǎn)離子檢測(cè)器，每次檢測(cè)在僅一個(gè)質(zhì)荷比(m/Q，在MS中通常被稱為m/z)的離子的質(zhì)譜儀儀器將給出使用多個(gè)標(biāo)記物的單個(gè)細(xì)胞成像中的不良結(jié)果。第一，在質(zhì)荷比之間切換所花費(fèi)的時(shí)間限制以其可確定多個(gè)信號(hào)的速度，并且第二，如果離子處于低豐度，那么當(dāng)儀器聚焦于其他質(zhì)荷比時(shí)，信號(hào)可被遺漏。因此，盡管在參考文獻(xiàn)2和3中使用的儀器(Agilent 4500)是靈敏的，其基于四極的檢測(cè)器不很好地適用于多個(gè)標(biāo)記物成像，因?yàn)橥ㄟ^設(shè)計(jì)，不同質(zhì)荷比的離子順序地通過并且所以對(duì)于多個(gè)標(biāo)記物的數(shù)據(jù)獲得是慢的。類似的，在參考文獻(xiàn)4和7中使用的儀器(Thermo Fisher ElementXR and Element2)一次僅分析一個(gè)m/Q，并且當(dāng)測(cè)量在超過靜電場(chǎng)跳躍的范圍的范圍內(nèi)的多個(gè)m/Q值時(shí)，具有關(guān)于磁體跳躍(magnet jump)的大的建立時(shí)間。

因此，優(yōu)選地使用該技術(shù)，其提供具有不同m/Q值的離子的基本同時(shí)檢測(cè)。例如，可能使用陣列檢測(cè)器(例如，參見參考文獻(xiàn)9的29章)而不是使用點(diǎn)離子檢測(cè)器?？墒褂枚嗍占魃刃螆?chǎng)ICP-MS儀器(例如，Thermo ScientificNeptune Plus、Nu Plasma II和Nu Plasma 1700系統(tǒng))，并且特別是具有Mattauch-Herzog幾何結(jié)構(gòu)的那些儀器(例如，SPECTRO MS，其可使用半導(dǎo)體直接電荷檢測(cè)器在單個(gè)測(cè)量中同時(shí)記錄從鋰到鈾的所有元素)。這些儀器可基本同時(shí)測(cè)量多個(gè)m/Q信號(hào)。可通過在檢測(cè)器中包括電子倍增器來增加它們的靈敏度。然而，陣列扇形儀器不是理想的，因?yàn)楸M管它們對(duì)檢測(cè)正在增大的信號(hào)有用，但是當(dāng)信號(hào)水平正在減小時(shí)，它們不太有用，并且因此它們不很好地適用于其中標(biāo)記物以高度可變的濃度存在的情況中。

用于與本發(fā)明一起使用的最優(yōu)選的MS方法基于飛行時(shí)間(TOF)檢測(cè)，其可準(zhǔn)同時(shí)地在單個(gè)樣品中記錄多個(gè)質(zhì)量。理論上，由于它們的空間電荷特征，TOF技術(shù)并不理想地適用于ICP離子源，但發(fā)明人已經(jīng)示出TOF儀器可足夠快速地和足夠靈敏地分析ICP離子氣霧劑，以允許可行的單細(xì)胞成像。然而，TOF質(zhì)量分析器對(duì)于原子分析來說通常是不受歡迎的，這是因?yàn)橛糜谔幚鞹OF加速器和飛行管中的空間電荷效應(yīng)所需的折衷，本發(fā)明的組織成像方法通過檢測(cè)僅標(biāo)記的原子可為有效的，并且因此可移除其他原子(例如，具有低于100的原子質(zhì)量的那些原子)。這導(dǎo)致富集于(例如)100-250道爾頓區(qū)域中的質(zhì)量的不那么密集的離子束，其可被更有效地操縱和聚集，從而促進(jìn)TOF檢測(cè)并利用TOF的高光譜掃描率。因此，可通過使TOF檢測(cè)與選擇樣品中不常見的標(biāo)記原子結(jié)合以及例如通過使用較高質(zhì)量過渡元素理想地使質(zhì)量高于未標(biāo)記樣品中所看到的質(zhì)量來實(shí)現(xiàn)快速成像。使用標(biāo)記物質(zhì)量的較窄窗口因此意味著TOF檢測(cè)將被用于有效的成像。

合適的TOF儀器可獲得自Tofwerk、GBC科學(xué)儀器(例如，Optimass9500ICP-TOFMS)和加拿大富魯達(dá)(例如，CyTOF^TM和CyTOF^TM2儀器)。這些CyTOF^TM儀器具有比Tofwerk和GBC儀器更大的靈敏度，并且由于它們可快速地和靈敏地檢測(cè)稀土金屬的質(zhì)量范圍中的離子(特別在100-200的m/Q范圍中)[10]，因此已知被用于質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)。因此這些為用于本發(fā)明的優(yōu)選儀器，并且它們可用于通過本領(lǐng)域中已知的儀器設(shè)置進(jìn)行成像，例如參考文獻(xiàn)11&12。它們的質(zhì)量分析器可以以高頻率激光燒蝕的時(shí)間標(biāo)度上的高質(zhì)譜獲取頻率準(zhǔn)同時(shí)地檢測(cè)大量的標(biāo)志物[4]。它們可測(cè)量標(biāo)記原子的豐度，其中每個(gè)單元的檢測(cè)極限約為100，從而允許組織樣品的圖像的靈敏構(gòu)造。由于這些特征，質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)可現(xiàn)在用于滿足以亞細(xì)胞分辨率的組織成像的靈敏度和多路復(fù)用需要。先前，質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)僅被用于分析懸浮液中的細(xì)胞，并且關(guān)于組織或腫瘤微環(huán)境內(nèi)的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的信息已經(jīng)因此丟失。通過使質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)儀器與高分辨率激光燒蝕系統(tǒng)和快速渡越低分散燒蝕腔室結(jié)合，可能允許通過實(shí)際時(shí)間標(biāo)度上的高多路復(fù)用來構(gòu)造組織樣品的圖像?？稍趨⒖嘉墨I(xiàn)1和13中找到關(guān)于質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)的進(jìn)一步細(xì)節(jié)。

用于樣品的燒蝕的激光器的波長(zhǎng)和功率的選擇可遵循通過ICP-MS的細(xì)胞分析的正常使用。激光必須具有足夠的能量密度(fluence)，以導(dǎo)致燒蝕到達(dá)所需的深度，而基本上不燒蝕支撐樣品保持器。以20Hz的在2-5J/cm²之間的激光能量密度(例如，從3-4J/cm²或大約3.5J/cm²)通常為合適的。理想地，單個(gè)激光脈沖將足以燒蝕細(xì)胞材料以用于分析，使得激光脈沖頻率匹配通過其生成燒蝕煙流的頻率。激光器將通常為準(zhǔn)分子激光器或復(fù)合受激態(tài)激光器。可使用氟化氬激光器(λ＝193nm)獲得合適的結(jié)果。使用25μm的孔徑，通過25倍的縮小可將該激光成像到組織樣品上，以便產(chǎn)生具有1μm直徑的光斑尺寸。這些激光器的10-15ns的脈沖持續(xù)時(shí)間可實(shí)現(xiàn)充分的燒蝕。還可使用飛秒激光器(即，脈沖持續(xù)時(shí)間<1ps)，并且由于傳送到樣品中的熱量減少，所述飛秒激光器將是有益的，但它們非常昂貴且可在沒有它們的情況下實(shí)現(xiàn)良好的成像結(jié)果。

總的來說，結(jié)合MS檢測(cè)器的響應(yīng)特征來選擇激光脈沖頻率和強(qiáng)度，以便允許區(qū)分單獨(dú)的激光燒蝕煙流。結(jié)合使用小的激光光斑以及具有短沖洗時(shí)間的燒蝕單元，快速和高分辨率成像現(xiàn)在是可行的。

構(gòu)造圖像

LA-ICP-MS可為煙流中的多個(gè)標(biāo)記原子提供信號(hào)。煙流中的標(biāo)記的檢測(cè)揭示其同源靶在燒蝕位置處的存在。通過在樣品的表面上的已知空間位置處生成一系列煙流，MS信號(hào)揭示樣品上標(biāo)記的位置，并且因此信號(hào)可被用于構(gòu)造樣品的成像。通過用可區(qū)分的標(biāo)記物來標(biāo)記多個(gè)靶，可能使標(biāo)記原子的位置與同源靶的位置相關(guān)聯(lián)，所以本發(fā)明可以構(gòu)建復(fù)雜圖像，從而達(dá)到遠(yuǎn)超過使用現(xiàn)在技術(shù)可實(shí)現(xiàn)的那些的多路復(fù)用水平。發(fā)明人已經(jīng)示出通過本發(fā)明的方法所生成的圖像可重現(xiàn)染色模式以及如通過IFM確定的表達(dá)給定標(biāo)志物的細(xì)胞的比例，從而證實(shí)本發(fā)明適合用于成像。

理想地，將通過在組織樣品上執(zhí)行激光的光柵掃描來構(gòu)造圖像。光柵掃描中連續(xù)燒蝕的間距(步長(zhǎng))以及光柵掃描中相鄰線之間的間距理想地與所使用的激光光斑尺寸相同(例如，對(duì)于1μm激光光斑，間距為1μm)，以便實(shí)現(xiàn)感興趣的區(qū)域的完整覆蓋。然而，在一些實(shí)施方案中，方法可使用小于激光光斑尺寸的步長(zhǎng)(例如，至少2倍、4倍或5倍更小)，因?yàn)檫@可導(dǎo)致更小的燒蝕面積并因此提高成像分辨率。為了實(shí)現(xiàn)掃描，可能移動(dòng)激光器，但通常移動(dòng)燒蝕單元(或單元的內(nèi)含物)是更方便的。移動(dòng)速度將取決于燒蝕頻率和光柵間距，例如，在1μm光柵間距和20Hz燒蝕的情況下，燒蝕單元將具有20μm/s的平移速度?？蓪?shí)現(xiàn)1μm或更小的步長(zhǎng)的支撐平臺(tái)是可用的(例如，具有500nm或200nm步長(zhǎng)(或甚至更小))。

通?；跓g表面層的內(nèi)含物，本發(fā)明的方法用于創(chuàng)建樣品的二維(2D)圖像?？赏ㄟ^組合來自在z軸中相鄰的單個(gè)樣品的切片的大量的2D圖像的堆疊(在x,y平面中)來制備組織的3D圖像。然而，作為以該方式組合2D圖像的可選方案，本發(fā)明方法還可用于直接3D成像。這可以以多種方式來實(shí)現(xiàn)。例如，如果燒蝕導(dǎo)致具有基本恒定深度的氣化，然后在單一x,y點(diǎn)的重復(fù)的燒蝕揭示z軸中逐漸地更深的信息。如果燒蝕不具有基本上恒定的深度，那么可測(cè)量燒蝕材料的體積(例如，相對(duì)于已知體積標(biāo)準(zhǔn))，并且該體積可被容易地轉(zhuǎn)化為z軸深度。在執(zhí)行3D成像的情況下，可能執(zhí)行多個(gè)z軸燒蝕，同時(shí)維持x,y位置(“鉆孔”)，或者逐層燒蝕樣品(即，在移動(dòng)到更深的z軸層之前執(zhí)行x,y區(qū)域的燒蝕)。逐層燒蝕為優(yōu)選的。3D成像的準(zhǔn)確性由諸如燒蝕材料的再沉積、維持恒定燒蝕深度的能力以及標(biāo)記物刺入樣品中的能力的因素限制，但仍可在這些限制的范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)有用的結(jié)果。

將信號(hào)組合為圖像將使用計(jì)算機(jī)，并且可使用已知的技術(shù)和軟件包來實(shí)現(xiàn)。例如，參考文獻(xiàn)3使用來自Kylebank軟件的GRAPHIS包，但還可使用諸如TERAPLOT的其他包。使用來自諸如MALDI-MSI的技術(shù)的MS數(shù)據(jù)的成像在本領(lǐng)域中是已知的，例如，參考文獻(xiàn)i公開了用于在Matlab平臺(tái)上查看和分析MS成像文件的“MSiReader”界面，并且參考文獻(xiàn)14公開了兩種軟件儀器(例如，“Datacube Explorer”程序)，其用于全空間和光譜分辨率中2D MSI數(shù)據(jù)集和3D MSI數(shù)據(jù)集兩者的快速數(shù)據(jù)探索和可視化。

可以進(jìn)一步分析(例如以分析IHC結(jié)果的相同的方式)使用本發(fā)明的方法獲得的圖像。例如，圖像可用于描繪樣品內(nèi)的細(xì)胞亞群體，并且可提供對(duì)臨床診斷有用的信息。類似地，SPADE分析可用于從本發(fā)明方法提供的高維細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)提取細(xì)胞層次結(jié)構(gòu)[16]。

組織樣品的標(biāo)記

本發(fā)明提供了已經(jīng)用多個(gè)不同的標(biāo)記原子標(biāo)記的樣品的圖像，其中在激光燒蝕的煙流中通過ICP-MS檢測(cè)標(biāo)記原子。對(duì)多個(gè)不同原子的提及意味著多于一個(gè)的原子種類用于標(biāo)記樣品?？墒褂肐CP-MS區(qū)分這些原子種類(例如，它們具有不同的m/Q比)，使得煙流內(nèi)兩種不同標(biāo)記原子的存在產(chǎn)生兩種不同的MS信號(hào)。

本發(fā)明適合用于比兩種多得多的不同的標(biāo)記原子的同時(shí)檢測(cè)，從而允許多重標(biāo)記物檢測(cè)(例如，至少3種、4種、5種、10種、20種、30種、32種、40種、50種或甚至100種不同的標(biāo)記原子)。標(biāo)記原子還可以以組合方式來使用，以便甚至進(jìn)一步增加可區(qū)分的標(biāo)記物的數(shù)目。實(shí)例論證成像方法中32種不同標(biāo)記原子的使用，但LA-ICP-MS本質(zhì)地適用于較高數(shù)目的不同原子的并行檢測(cè)(例如，甚至超過100種不同原子種類[10])。通過以不同的標(biāo)記原子來標(biāo)記不同的靶，在單個(gè)圖像中確定多個(gè)靶的細(xì)胞位置是可能的。

可與本發(fā)明一起使用的標(biāo)記原子包括任何種類，其通過LA-ICP-MS是可檢測(cè)的并且基本上不存在于未標(biāo)記的組織樣品中。因此，例如，¹²C原子將不適于用作標(biāo)記原子，因?yàn)樗鼈兪亲匀唤绱罅看嬖诘模?sup>11C原子在理論上可以使用，因?yàn)槠錇椴蛔匀话l(fā)生的人造同位素。然而，在優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記原子為過渡金屬，諸如稀土金屬(15號(hào)鑭系元素，加上鈧和釔)。這些17種元素提供可容易地被ICP-MS區(qū)分的許多不同的同位素?？色@得以濃縮同位素的形式的這些元素的很多種，例如，釤具有6種穩(wěn)定同位素，并且釹具有7中穩(wěn)定同位素，其全部以濃縮形式可獲得。15號(hào)鑭系元素提供具有非冗余唯一質(zhì)量的至少37種同位素。適于用作標(biāo)記原子的元素的實(shí)例包括鑭(La)、鈰(Ce)、鐠(Pr)、釹(Nd)、钷(Pm)、釤(Sm)、銪(Eu)、釓(Gd)、鋱(Tb)、鏑(Dy)、鈥(Ho)、鉺(Er)、銩(Tm)、鐿(Yb)、镥(Lu)、鈧(Sc)和釔(Y)。例如，本發(fā)明可使用如表1至5中列出的鑭系元素的任何同位素。除了稀土金屬之外，其他金屬原子(例如，金(Au)、鉑(Pt)、銥(Ir)、鐒(Rh)、鉍(Bi)等等)適用于通過ICP-MS進(jìn)行檢測(cè)。放射性同位素的使用不是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈儾槐阌谔幚砬也环€(wěn)定，例如，在鑭系元素當(dāng)中，Pm不是優(yōu)選的標(biāo)記原子。

為了促進(jìn)TOF分析(參見以上)，使用具有在范圍80-250內(nèi)(例如，在范圍80-210內(nèi)或在范圍100-200內(nèi))的原子質(zhì)量的標(biāo)記原子是有用的。該范圍包括全部的鑭系元素，但排除Sc和Y。100-200的范圍通過使用不同的標(biāo)記原子允許理論上的101-重(plex)分析，同時(shí)允許本發(fā)明利用TOF MS的高光譜掃描率。如以上所提及的，通過選擇其質(zhì)量位于高于未標(biāo)記樣品中所看到的那些的窗口中的標(biāo)記原子(例如，在100-200的范圍內(nèi))，TOF檢測(cè)可用于提供生物學(xué)顯著水平的快速成像。

標(biāo)記組織樣品通常要求標(biāo)記原子附接到特定結(jié)合對(duì)(sbp)的一個(gè)成員。該標(biāo)記的sbp與組織樣品接觸，使得其可與sbp的另一個(gè)成員(靶sbp成員)交互(如果其存在)，從而將標(biāo)記原子定位到樣品中的特定位置。本發(fā)明的方法然后檢測(cè)標(biāo)記原子在該特定位置的存在，并且將該信息轉(zhuǎn)化為其中靶sbp成員在所述位置存在的圖像。稀土金屬和其他標(biāo)記原子可通過已知的技術(shù)結(jié)合到sbp成員，例如，參考文獻(xiàn)17描述鑭系元素原子到用于ICP-MS檢測(cè)的寡核苷酸探針的附接，參考文獻(xiàn)18描述使用釕以標(biāo)記寡核苷酸，并且Fluidigm Canada出售MaxPar^TM金屬標(biāo)記試劑盒，其可用于將超過30種不同的標(biāo)記原子結(jié)合到蛋白質(zhì)(包括抗體)。

各種數(shù)目的標(biāo)記原子可附接到單個(gè)sbp成員，并且當(dāng)更多標(biāo)記原子附接到任何sbp成員時(shí)，可實(shí)現(xiàn)更大的靈敏度。例如，大于10、20、30、40、50、60、70、80、90或100個(gè)標(biāo)記原子可附接到sbp成員。例如，可使用包含多個(gè)單體單元的單分散性聚合物，每個(gè)包含諸如DTPA的螯合劑。例如，DTPA結(jié)合具有解離常數(shù)為大約10^-6M的3+鑭系元素離子[1]。這些聚合物可在巰基反應(yīng)性基團(tuán)(例如，馬來酰亞胺)中終止，所述巰基反應(yīng)性基團(tuán)可用于附接到sbp成員。例如，巰基反應(yīng)性基團(tuán)可結(jié)合到抗體的Fc區(qū)域。其他功能性基團(tuán)(例如，諸如N-羥基琥珀酰亞胺酯的胺反應(yīng)性基團(tuán)，或者針對(duì)羧基或針對(duì)抗體的糖基化具有反應(yīng)性的基團(tuán))還可用于這些聚合物的結(jié)合。任何數(shù)目的聚合物可結(jié)合到每個(gè)sbp成員?？墒褂玫木酆衔锏奶囟▽?shí)例包括直鏈(“X8”)聚合物或第三代樹枝狀(“DN3”)聚合物，這兩者都可用作MaxPar^TM試劑。金屬納米顆粒的使用還可用于增加標(biāo)記物中原子的數(shù)目。

如以上所提及的，標(biāo)記原子附接到sbp成員，并且該標(biāo)記的sbp成員與組織樣品接觸，其中其可發(fā)現(xiàn)靶sbp成員(如果存在的話)，從而形成標(biāo)記的sbp。標(biāo)記的sbp成員可包括任何化學(xué)結(jié)構(gòu)，其適用于附接到標(biāo)記原子并然后根據(jù)本發(fā)明用于成像。

一般來說，本發(fā)明的方法可基于任何sbp，所述任何sbp已經(jīng)已知用于在確定組織樣品中靶分子的位置(例如，如在IHC中或熒光原位雜交FISH中使用)中使用，但與樣品接觸的sbp成員將攜帶通過ICP-MS可檢測(cè)的標(biāo)記原子。因此可容易地通過使用可用的IHC和FISH試劑、僅僅通過修改標(biāo)記物來實(shí)施本發(fā)明，所述標(biāo)記物先前已經(jīng)用于例如修改FISH探針以便攜帶可被ICP-MS檢測(cè)的標(biāo)記物。

sbp可包括以下項(xiàng)中的任一項(xiàng)：核酸雙鏈體；抗體/抗原復(fù)合物；受體/配體對(duì)；或適體/靶對(duì)。因此，標(biāo)記原子可附接到核酸探針，其然后與組織樣品接觸，使得探針可在其中與互補(bǔ)核酸雜交(例如，以便形成DNA/DNA雙鏈體、DNA/RNA雙鏈體或RNA/RNA雙鏈體)。類似地，標(biāo)記原子可附接到抗體，抗體然后與組織樣品接觸，使得其可結(jié)合到其抗原。標(biāo)記原子可附接到配體，配體然后與組織樣品接觸，使得其可結(jié)合到其受體。標(biāo)記原子可附接到適體配體，適體配體然后與組織樣品接觸，使得其可結(jié)合到其靶。因此，標(biāo)記的sbp成員可用于檢測(cè)樣品中的多種靶(包括DNA序列、RNA序列、蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)或代謝物)。

在本發(fā)明的典型實(shí)施方案中，標(biāo)記的sbp成員為抗體。可以通過將結(jié)合分子的一個(gè)或更多個(gè)標(biāo)記原子結(jié)合到抗體來實(shí)現(xiàn)抗體的標(biāo)記(例如，使用如以上所描述的MaxPar^TM結(jié)合試劑盒)。識(shí)別對(duì)成像有用的細(xì)胞蛋白質(zhì)的抗體已經(jīng)廣泛地可用于IHC用途，并且通過使用標(biāo)記原子而不是當(dāng)前標(biāo)記技術(shù)(例如，熒光)，這些已知的抗體可容易地適用于本發(fā)明的方法，但具有增加的多重能力的益處。與本發(fā)明一起使用的抗體可識(shí)別細(xì)胞表面上的靶或細(xì)胞內(nèi)的靶?？贵w可識(shí)別多種靶，例如，它們可特異地識(shí)別單獨(dú)的蛋白質(zhì)，或可識(shí)別共享共同表位的多個(gè)相關(guān)蛋白質(zhì)，或可識(shí)別蛋白質(zhì)上的特定翻譯后修飾(例如，以便在感興趣的蛋白質(zhì)上的酪氨酸和磷酸-酪氨酸之間進(jìn)行區(qū)分、以便在賴氨酸和乙?；?賴氨酸之間進(jìn)行區(qū)分、以便檢測(cè)泛素化等等)。在結(jié)合到其靶之后，結(jié)合到抗體的標(biāo)記原子可被檢測(cè)以揭示樣品中該靶的位置。

標(biāo)記的sbp成員通常將直接與樣品中的靶sbp成員相互作用。然而，在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記的sbp成員與靶sbp成員間接地相互作用是可能的，例如，在夾心分析法模式中，第一抗體可結(jié)合到靶sbp成員，并且標(biāo)記的第二抗體可然后結(jié)合到第一抗體。然而，本發(fā)明通常依賴于直接相互作用，因?yàn)樗鲋苯酉嗷プ饔每筛菀椎貙?shí)現(xiàn)并允許較高的多重化。然而，在兩種情況下，樣品與可結(jié)合到樣品中的靶sbp成員的sbp成員接觸，并且在稍后階段，檢測(cè)附接到靶sbp成員的標(biāo)記物。

本發(fā)明的一個(gè)特征是其檢測(cè)樣品中多個(gè)(例如，10個(gè)或多于10個(gè)，并且甚至高達(dá)100個(gè)或多于100個(gè))不同靶sbp成員的能力(例如，以便檢測(cè)多個(gè)不同的蛋白質(zhì)和/或多個(gè)不同的核酸序列)。為了允許這些靶sbp成員的差異檢測(cè)，它們各自的sbp成員應(yīng)攜帶不同的標(biāo)記原子，使得它們的信號(hào)可由ICP-MS區(qū)分。例如，在檢測(cè)十種不同蛋白質(zhì)的情況下，可使用十種不同的抗體(每個(gè)對(duì)不同的靶蛋白質(zhì)特異)，其每個(gè)攜帶獨(dú)特的標(biāo)記物，使得來自不同抗體的信號(hào)可被區(qū)分。在一些實(shí)施方案中，期望的是針對(duì)單個(gè)靶使用多個(gè)不同的抗體(例如，所述多個(gè)不同的抗體識(shí)別相同蛋白質(zhì)上的不同表位)。因此，由于該類型的冗余性，方法可使用多于靶的抗體。然而，通常，本發(fā)明將使用多個(gè)不同的標(biāo)記原子以檢測(cè)多個(gè)不同的靶。

如果多于一個(gè)標(biāo)記抗體與本發(fā)明一起使用，那么優(yōu)選的是，抗體應(yīng)具有針對(duì)它們各自抗原的類似親和性，因?yàn)檫@幫助確保通過LA-ICP-MS檢測(cè)的標(biāo)記原子的數(shù)量和組織樣品中靶抗原的豐度之間的關(guān)系將在全部不同sbp內(nèi)更加一致(特別在高掃描頻率下)。

如果靶sbp成員位于細(xì)胞內(nèi)，則通常有必要在樣品與標(biāo)記物接觸之前或期間透化細(xì)胞膜。例如，當(dāng)靶為DNA序列但標(biāo)記的sbp成員不能透過活細(xì)胞的膜時(shí)，可固定和透化組織樣品的細(xì)胞。然后標(biāo)記的sbp成員可進(jìn)入細(xì)胞并與靶sbp成員形成sbp。在這方面，可利用用于IHC和FISH的已知方案。

通常，本發(fā)明的方法將檢測(cè)至少一個(gè)細(xì)胞內(nèi)靶和至少一個(gè)細(xì)胞表面靶。然而，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可用于檢測(cè)多個(gè)細(xì)胞表面靶同時(shí)忽略細(xì)胞內(nèi)靶?？偟膩碚f，由于本發(fā)明將提供樣品中所選擇靶的位置的圖像，因此靶的選擇將通過從方法所需的信息來確定。

組織樣品

本發(fā)明提供對(duì)組織樣品進(jìn)行成像的方法。組織樣品包括多個(gè)相互作用的細(xì)胞，并且方法使多個(gè)這些細(xì)胞經(jīng)受激光燒蝕，以便提供組織樣品中這些細(xì)胞的圖像。通常，本發(fā)明可用于分析目前通過IHC技術(shù)研究但是使用了適用于通過LA-ICP-MS進(jìn)行檢測(cè)的標(biāo)記的組織樣品。

任何合適的組織樣品可在本文描述的方法中使用。例如，組織可以是上皮組織、肌肉組織、神經(jīng)組織等等以及它們的組合。出于診斷或預(yù)測(cè)目的，組織可來自腫瘤。在一些實(shí)施方案中，樣品可來自已知的組織，但樣品是否包含腫瘤細(xì)胞可為未知的。成像可揭示指示腫瘤的存在的靶的存在，因此促進(jìn)診斷。組織樣品可包括乳腺癌組織(例如，人類乳腺癌組織或人類乳腺上皮組織(HMLE))。組織樣品可包含福爾馬林固定的、石蠟包埋(FFPE)組織?？蓮娜魏位畹亩嗉?xì)胞有機(jī)體(但通常將是人類)獲得組織。

通常組織樣品將為切片(例如，具有在2-10μm范圍內(nèi)(諸如在4-6μm之間)的厚度)。用于制備此類切片的技術(shù)(例如，使用切片機(jī)，包括脫水步驟、包括包埋等等)在IHC的領(lǐng)域是所眾所周知的。因此，組織可為化學(xué)上固定的并且然后可在所需平面中制備切片。冷凍切片或激光捕獲顯微切割還可用于制備組織樣品。樣品可被透化(例如，以便允許用于細(xì)胞內(nèi)靶的標(biāo)記的試劑(參見以上內(nèi)容))。

盡管最大尺寸將由激光燒蝕裝置指定，并且特別地由可適合其燒蝕單元的樣品的尺寸指定，但是將被分析的組織樣品的尺寸將類似于當(dāng)前IHC方法。多達(dá)5mm x 5mm的尺寸為典型的，但更小的樣品(例如，1mm x1mm)也是有用的(這些維度指的是切片的尺寸，不是其的厚度)。

除了對(duì)組織樣品進(jìn)行成像是有用的之外，本發(fā)明反而可用于細(xì)胞樣品(諸如貼壁細(xì)胞單層或固體表面上固定的細(xì)胞單層(如在傳統(tǒng)免疫細(xì)胞化學(xué)中))的成像。這些實(shí)施方案對(duì)分析貼壁細(xì)胞是特別地有用的，所述貼壁細(xì)胞不可被容易地溶解用于細(xì)胞懸浮液質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)。因此，和對(duì)增強(qiáng)當(dāng)前免疫組織化學(xué)分析有用一樣，本發(fā)明可用于增強(qiáng)免疫細(xì)胞化學(xué)。

根據(jù)本發(fā)明，在被制備之后，樣品將被放置在激光燒蝕單元中，并且然后經(jīng)受分析。

單細(xì)胞分析

本發(fā)明的方法包括樣品中的多個(gè)細(xì)胞的激光燒蝕，并且因此分析來自多個(gè)細(xì)胞的煙流，并且將它們的內(nèi)含物映射到樣品中的特定位置，以提供圖像。在大多數(shù)情況中，方法的使用者將需要將信號(hào)定位到樣品內(nèi)的特定的細(xì)胞，而不是將信號(hào)定位到作為整體的樣品。為了實(shí)現(xiàn)將信號(hào)定位到樣品內(nèi)的特定細(xì)胞，可以劃分樣品中細(xì)胞的界限(例如質(zhì)膜，或在一些情況中細(xì)胞壁)。

劃分細(xì)胞的界限可以以多種方式實(shí)現(xiàn)。例如，可使用可劃分細(xì)胞界限的傳統(tǒng)的技術(shù)研究樣品，諸如顯微術(shù)。然后可使用本發(fā)明的方法制備該樣品的圖像，并且該圖像可疊加在較早的結(jié)果上，因此允許LCP-MS信號(hào)定位到特定的細(xì)胞。

然而，為了避免使用多個(gè)技術(shù)的需要，劃分細(xì)胞界限作為本發(fā)明的成像方法的一部分是可能的。從IHC和免疫細(xì)胞化學(xué)此類界限劃分策略是熟悉的，并且通過使用可被ICP-MS檢測(cè)的標(biāo)記物，這些方法可被適用。例如，方法可包括標(biāo)記已知定位在細(xì)胞界限的靶分子，并且然后來自這些標(biāo)記物的信號(hào)可被用于界限劃分。合適的靶分子包括細(xì)胞界限的豐富的或普遍的標(biāo)志物，諸如粘附復(fù)合體的成員(例如β-連環(huán)蛋白或E-鈣粘素)。一些實(shí)施方案可標(biāo)記多于一種膜蛋白以便增強(qiáng)劃分。

除了通過包括合適的標(biāo)記物劃分細(xì)胞界限之外，以該方式劃分特定的細(xì)胞器也是可能的。例如，抗原諸如組蛋白(例如H3)可被用于鑒定細(xì)胞核，并且標(biāo)記線粒體特異的抗原、細(xì)胞骨架特異的抗原、高爾基體特異的抗原、核糖體特異的抗原等也是可能的，因此通過本發(fā)明的方法允許分析細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

可通過肉眼評(píng)價(jià)，或可通過計(jì)算機(jī)使用圖像加工分析劃分細(xì)胞(或細(xì)胞器)的界限的信號(hào)。此類技術(shù)在本領(lǐng)域?qū)τ谄渌上窦夹g(shù)是已知的，例如參考文獻(xiàn)19描述了分割方案，其使用空間濾波從熒光圖像來確定細(xì)胞界限，參考文獻(xiàn)20公開了算法，其從明視野顯微鏡圖像確定界限，參考文獻(xiàn)21公開了CellSeT方法來從共聚焦顯微鏡圖像提取細(xì)胞幾何形狀，以及參考文獻(xiàn)22公開了CellSegm MATLAB工具箱用于熒光顯微鏡成像?？膳c本發(fā)明一起使用的方法使用分水嶺轉(zhuǎn)化(watershed transformation)和高斯模糊(Gaussian blurring)。這些圖像加工技術(shù)可以獨(dú)立地使用，或其可被使用并且然后肉眼檢查。

已劃分細(xì)胞的界限后，將來自特定的靶分子的信號(hào)分配到單獨(dú)的細(xì)胞是可能的。定量單獨(dú)的細(xì)胞中的靶分析物的量也可以是可能的(例如，通過針對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)校正方法)。本發(fā)明的方法是高度定量的。與已知的方法比較，本發(fā)明的方法不經(jīng)受樣品的自發(fā)熒光，當(dāng)與MALDI和SIMS成像中共有的那些方法相比，基體效應(yīng)最小或不存在，不存在對(duì)于放大步驟的需要，諸如在IHC中通常采用的，組織可被完全地取樣，并且方法具有～10⁵的寬的動(dòng)態(tài)范圍。

與其他技術(shù)的結(jié)合

本發(fā)明的方法可以與其他成像技術(shù)結(jié)合，并且從不同技術(shù)獲得的圖像可以結(jié)合以給出更豐富的綜合圖像。例如，首先可以通過傳統(tǒng)的技術(shù)諸如顯微術(shù)使用熒光和/或可見標(biāo)記物(例如IHC分析)使樣品成像。由于此類技術(shù)是非破壞性的，并且由于它們的標(biāo)記物通常不包括給出有用的LCP-MS信號(hào)的原子(通常它們由與樣品自身相同的原子組成；如果它們確實(shí)含有在MS光譜中將是可見的原子，那么它們的存在可在MS步驟中被容易地補(bǔ)償，例如通過不使用這些原子作為標(biāo)記原子)，然后樣品可通過本發(fā)明的方法成像，并且顯微術(shù)和質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)結(jié)果可結(jié)合使用。

如果本發(fā)明的方法與另一種破壞性成像技術(shù)(例如MALDI成像[23])結(jié)合，那么對(duì)同一組織的相鄰切片使用這兩種技術(shù)是優(yōu)選的。

一般

術(shù)語“包含(comprising)”涵蓋“包括(including)”以及“組成(consisting)”例如“包含”X的組合物可以獨(dú)一地由X組成或可包括另外的一些例如X+Y。

與數(shù)值x有關(guān)的術(shù)語“約”是任選地并且意味著例如x+10％。

術(shù)語“基本地(substantially)”不排除“完全地(completely)”例如“基本不含”Y的組合物可以完全沒有Y。必要時(shí)，單詞“基本地”可以從本發(fā)明的定義省略。

附圖簡(jiǎn)述

圖1a示出了使用識(shí)別五種標(biāo)志物(從上到下：H3；HER2；CK8/18；E-Cad；Vim)的未標(biāo)記的(左)和金屬標(biāo)記的(右)抗體，對(duì)管腔HER2+亞型(病例號(hào)37)的連續(xù)乳腺癌組織切片的IFM。字母指示標(biāo)記物顏色，其中c＝藍(lán)綠色，r＝紅色，y＝黃色。

圖1b示出了使用識(shí)別與圖1a相同的五種標(biāo)志物的金屬標(biāo)記的抗體，對(duì)管腔HER2+亞型(病例號(hào)210、23和37)的乳腺癌組織切片的IFM(左)和CyTOF成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)(右)。

圖2a示出了管腔HER2+乳腺癌組織樣品(病例號(hào)210)的質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)圖像。以1-μm分辨率同時(shí)測(cè)量了總共32個(gè)蛋白和磷酸化位點(diǎn)(表1和2)。細(xì)胞角蛋白8/18(紅色)、H3(藍(lán)綠色)和波形蛋白(黃色)的疊加。

圖2b示出了管腔HER2+乳腺癌組織樣品(病例號(hào)210)的質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)圖像。以1-μm分辨率同時(shí)測(cè)量了總共32個(gè)蛋白和磷酸化位點(diǎn)(表1和2)。細(xì)胞角蛋白7(紅色)、H3(藍(lán)綠色)和CD44(黃色)的疊加。

圖2c示出了管腔HER2+乳腺癌組織樣品(病例號(hào)210)的質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)圖像。以1-μm分辨率同時(shí)測(cè)量了總共32個(gè)蛋白和磷酸化位點(diǎn)(表1和2)。泛-肌動(dòng)蛋白(紅色)、孕酮受體(藍(lán)色)和CD68(黃色)的疊加。

圖2d示出了管腔HER2+乳腺癌組織樣品(病例號(hào)23)的質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)圖像。以1-μm分辨率同時(shí)測(cè)量了總共32個(gè)蛋白和磷酸化位點(diǎn)(表1和2)。HER2(紅色)、H3(藍(lán)綠色)和波形蛋白(黃色)的疊加。

圖2e示出了管腔HER2+乳腺癌組織樣品(病例號(hào)23)的質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)圖像。以1-μm分辨率同時(shí)測(cè)量了總共32個(gè)蛋白和磷酸化位點(diǎn)(表1和2)。E-鈣粘蛋白(紅色)、細(xì)胞角蛋白7(黃色)和S6上的S235/S236上的磷酸化(藍(lán)色)的疊加。

圖2f示出了管腔HER2+乳腺癌組織樣品(病例號(hào)23)的質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)圖像。以1-μm分辨率同時(shí)測(cè)量了總共32個(gè)蛋白和磷酸化位點(diǎn)(表1和2)。β-連環(huán)蛋白(紅色)、雌激素受體(藍(lán)色)和CD68(黃色)的疊加。比例尺，25μm。

圖3示出了通過成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)(上兩行；C)或IFM(下兩行；IFM)的貼壁細(xì)胞的分析。顯微照片示出了如用金屬標(biāo)記的抗體所指示的，標(biāo)記的和成像的人類乳腺上皮細(xì)胞，所述金屬標(biāo)記的抗體識(shí)別一組磷酸化殘基(從左向右：PLCγ2，pY759；ERK，pT202/pY204；p38，pT180/pY182；S6，pS235/pS236)，該人類乳腺上皮細(xì)胞經(jīng)(行1&3；+)或未經(jīng)(行2&4；–)酪氨酸磷酸酶抑制劑釩酸酯處理30-min。比例尺，25μm。對(duì)于每個(gè)對(duì)照刺激的比較，保持恒定的曝光，但不同的抗體之間不保持恒定的曝光。

圖4a示出了以指示的標(biāo)志物模式鑒定重疊的細(xì)胞群體的SPADE樹。淺灰色區(qū)域含有在所有通道具有低標(biāo)志物表達(dá)的細(xì)胞。Vim，波形蛋白；E-Cad，E-鈣粘蛋白；CK8/18，細(xì)胞角蛋白8/18；CK7，細(xì)胞角蛋白7；β-Cat，β-連環(huán)蛋白；ER，雌激素受體；CAH IX，碳酸酐酶IX；PR，孕酮受體；med，培養(yǎng)基。

圖4b示出了顯示對(duì)腫瘤病例號(hào)201的CD20側(cè)群的聚類樹。顏色表示指示的標(biāo)志物的表達(dá)水平，并且結(jié)節(jié)的尺寸對(duì)應(yīng)來自給定患者的落在細(xì)胞聚類內(nèi)的細(xì)胞的百分比。

圖4c到4i示出了聚類樹，所述聚類樹示出了HER2+樣品的細(xì)胞亞群。病例號(hào)是(c)359(d)254(e)210(f)199(g)201(h)294(i)276，其是管腔樣品。

圖5示出燒蝕小室在20Hz的信號(hào)分離。示出的信號(hào)是所有感興趣的同位素相加的強(qiáng)度。讀數(shù)是對(duì)所有測(cè)量的通道相加。

圖6示出了通過IFM(左)和CyTOF成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)(右)對(duì)管腔HER2+亞型的乳腺癌組織切片分析的金屬標(biāo)記的抗體的特異性的比較(PR病例號(hào)210、HER2和細(xì)胞角蛋白8/18病例號(hào)23)。Hoechst 33258和H3以藍(lán)綠色示出，而三種特異的標(biāo)志物以紅色示出(上：PR；中：Her2；下：CK8/18)。指示每激光射出計(jì)數(shù)的比例最大值被調(diào)整如下：H3,200(病例號(hào)210)和400(病例號(hào)23)；PR,10；HER2,50；細(xì)胞角蛋白8/18,30。圖像中白色尺寸條指示25μm。

圖7a示出了組織號(hào)210的圖像，顯示β-連環(huán)蛋白(紅色)、H3(藍(lán)綠色)和pS6(黃色)的疊加。對(duì)于圖7a-d，指示每激光射出計(jì)數(shù)的比例最大值被調(diào)整如下：pS6，15(組織號(hào)210)和20(組織號(hào)23)；H3，200(組織號(hào)210)和400(組織號(hào)23)；β-連環(huán)蛋白，20；HER2，30；CAH IX，15；E-鈣粘蛋白，20；波形蛋白，400；細(xì)胞角蛋白8/18,25。圖像中白色尺寸條指示25μm。

圖7b示出了組織號(hào)210的圖像，顯示HER2(紅色)、H3(藍(lán)綠色)和CAH IX(黃色)的疊加。

圖7c示出了組織號(hào)210的圖像，顯示E-鈣粘蛋白(紅色)、H3(藍(lán)綠色)和波形蛋白(黃色)的疊加。

圖7d示出了組織號(hào)23的圖像，顯示細(xì)胞角蛋白8/18(紅色)、H3(藍(lán)綠色)和S6上磷酸化(黃色)的疊加。

圖8A-E示出了病例號(hào)37的連續(xù)切片上金屬標(biāo)記的抗體(左上)和未標(biāo)記的抗體(右上)的IFM圖像。示出了金屬標(biāo)記的抗體(左下)和未標(biāo)記的抗體(右下)的IFM分析的單細(xì)胞強(qiáng)度分布，其描繪針對(duì)事件的強(qiáng)度。事件數(shù)目未被標(biāo)準(zhǔn)化。平均信號(hào)由紅色線代表。中值信號(hào)由綠色方形代表。

圖9a和9b示出了在單重IHC(左側(cè)兩個(gè)插圖)和32重成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)(右側(cè)的插圖)測(cè)量結(jié)果之間的比較。使用了管腔HER2+腫瘤(病例號(hào)210)的切片，但切片不是連續(xù)的。指示每激光射出計(jì)數(shù)的比例最大值被調(diào)整如下：HER2，30；PR，10；CK8/18，80；H3，200。圖像中白色尺寸條指示25μm。

進(jìn)行本發(fā)明的模式

以下提出的實(shí)施例論證成像技術(shù)，所述成像技術(shù)延伸基于CyTOF的質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)的多重分析能力來進(jìn)行使用LA-ICP-TOFMS的空間分辨的測(cè)量。進(jìn)一步的詳述公開在參考文獻(xiàn)24以及其補(bǔ)充信息中(全部通過引用并入本文)，包括圖1-4和6-9的彩色拷貝。

實(shí)施例1-使用質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)使組織樣品成像

已經(jīng)開發(fā)了將質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)、ICC和IHC分析與高分辨率激光燒蝕系統(tǒng)耦合的工作流程，以允許貼壁細(xì)胞和組織切片的具有1μm的亞細(xì)胞分辨率的分析。

第一步中，使用常規(guī)ICC和IHC方案，制備細(xì)胞樣品或組織切片用于抗體標(biāo)記[25]。選擇抗體以靶向與乳腺癌相關(guān)的32種蛋白和蛋白修飾。在染色之前，用限定原子質(zhì)量的獨(dú)特稀土金屬同位素對(duì)抗體加標(biāo)簽。

空氣干燥后，將樣品安置在參考文獻(xiàn)7中描述的激光燒蝕小室內(nèi)，該激光燒蝕小室使氣霧劑分散最小化，用于高分辨率、高通量和高靈敏度分析。然后，逐光斑和逐行燒蝕組織，并且然后通過混合的氬氣和氦氣的流將燒蝕的材料運(yùn)輸?shù)紺yTOF質(zhì)譜細(xì)胞儀。

圖5示出了，對(duì)所有測(cè)量的通道相加的、在20Hz的單獨(dú)的激光射出的信號(hào)被完全地分開。假設(shè)泊松統(tǒng)計(jì)，檢測(cè)的極限是近似六個(gè)離子計(jì)數(shù)(對(duì)應(yīng)～500分子)。

在數(shù)據(jù)預(yù)處理之后，使用每個(gè)單一激光射出的坐標(biāo)描繪32個(gè)瞬時(shí)的、單一的同位素信號(hào)，并且通過疊加所有分析的測(cè)量通道生成樣品的高維度圖像。下一步，使用分水嶺算法在計(jì)算機(jī)上分割單細(xì)胞特征，并且使標(biāo)志物表達(dá)數(shù)據(jù)與單獨(dú)的細(xì)胞匹配。單細(xì)胞數(shù)據(jù)被用于所有的下游數(shù)據(jù)分析，并且來研究總共來自20個(gè)乳腺癌患者的一組21個(gè)腫瘤和正常樣品內(nèi)的細(xì)胞亞群。

患者和標(biāo)本特征

組織微陣列(TMA)含有如先前描述的[26]主要亞型的FFPE乳腺癌組織和正常的乳腺組織。通過成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)分析的所有腫瘤被兩個(gè)有經(jīng)驗(yàn)的臨床病理學(xué)家通過蘇木精和曙紅染色再評(píng)價(jià)，以鑒定代表性區(qū)域。根據(jù)國(guó)際癌癥控制聯(lián)盟(UICC)和世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)，分配腫瘤階段和Bloom-Richardson-Elston(BRE)級(jí)別。乳腺癌亞型的分類是基于ER、PR和HER2的IHC表達(dá)模式。通過HER2IHC和HER2FISH評(píng)價(jià)HER2狀態(tài)[27]。

準(zhǔn)備HMLE細(xì)胞用于成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)

使人類乳腺上皮(HMLE)細(xì)胞[28]在玻璃蓋玻片上生長(zhǎng)到～80％匯合，并且在37℃用模擬物處理或用125μM釩酸酯處理持續(xù)30min。使用標(biāo)準(zhǔn)的ICC方案[25]，準(zhǔn)備細(xì)胞用于成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)和IFM。

抗體

獲得在無載體/蛋白的緩沖液中的抗體并且然后根據(jù)供應(yīng)商的說明書[29]使用抗體綴合試劑盒制備。在我們通過在280nm的吸光度的測(cè)量，確定百分產(chǎn)率之后，在穩(wěn)定液中稀釋金屬標(biāo)記的抗體用于在4℃的長(zhǎng)期儲(chǔ)存。在該研究中使用的抗體在表1至5中列出。

準(zhǔn)備乳腺癌組織切片用于IHC、IFM和成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)

這些實(shí)施例中論證的TMA的所有經(jīng)典IHC染色在Ventana Benchmark XT上使用Ventana預(yù)稀釋的抗體和標(biāo)準(zhǔn)的方案進(jìn)行。將樣品對(duì)HER2、PR、細(xì)胞角蛋白8/18和H3染色。對(duì)于每個(gè)抗體的比較分析，保持給定標(biāo)志物的曝光時(shí)間恒定。通過ImageJ軟件加工圖像。

將組織號(hào)23和FFPE乳腺癌TMA及相應(yīng)的健康組織切成5-μm厚度用于成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)。在二甲苯中過夜使切片脫蠟，然后在梯度系列的乙醇中復(fù)水(純乙醇、乙醇：去離子水為90:10、80:20、70:30、50:50、0:100；每次10min[30])。在88℃水浴中的pH為9的Tris-EDTA緩沖液中，進(jìn)行熱誘導(dǎo)的表位修復(fù)持續(xù)20min。在立即冷卻之后，用在PBS/0.1％Triton X-100中的1％BSA封閉TMA持續(xù)30min。為了染色，使TMA樣品與抗體預(yù)混液在4℃孵育過夜(表1、4和5)。然后用PBS/0.1％Triton X-100洗滌樣品五次。

對(duì)于在圖1b、2和7中示出的TMA核心號(hào)210，使用了以下的方案：在92–94℃在pH為9的Tris-EDTA緩沖液中熱誘導(dǎo)的表位修復(fù)持續(xù)20min。在立即冷卻之后，用TBS/0.1％Triton X-100中的3％BSA封閉TMA切片持續(xù)45min。使TMA樣品與抗體預(yù)混液在4℃孵育過夜(表2)，該抗體預(yù)混液含有除了抗-pSHP2、抗-CD31、抗-TWIST、抗-CD3、抗-SLUG和抗-EGFR之外的所有抗體。在用2×TBS/0.1％Triton X-100和2×TBS的洗滌步驟之后，添加那些抗體，并且在室溫孵育樣品2.5小時(shí)，以及然后在4℃孵育1小時(shí)。在洗滌之后，在成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)之前，使樣品在室溫干燥。

高空間分辨率激光燒蝕

通過如以上討論的成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)分析組織切片。修改的ArF準(zhǔn)分子GeoLas C激光系統(tǒng)(Coherent)將均質(zhì)的UV激光束(λ＝193nm)遞送到25μm的孔，所述均質(zhì)的UV激光束通過25倍縮小在組織樣品上成像。得到的1μm直徑和3.5J/cm²激光能量密度的激光束被用于以20Hz的頻率燒蝕抗體染色的組織。得到的組織的激光燒蝕坑直徑為～1μm(如通過掃描電子顯微術(shù)確定的)。激光燒蝕小室的平移速度是20μm/s。為了完全取出在感興趣的區(qū)域內(nèi)的組織層，以1-μm距離光柵掃描單獨(dú)的線掃描。用于使在激光燒蝕系統(tǒng)上的高空間分辨率、高靈敏度成像成為可能的激光燒蝕小室在參考文獻(xiàn)7中被詳述。燒蝕的樣品氣霧劑通過氬氣和氦氣氣流被直接地運(yùn)輸?shù)紺yTOF質(zhì)譜細(xì)胞儀。CyTOF儀器設(shè)置[11、12]先前被關(guān)于CyTOF軟件版本5.1.598描述。

單細(xì)胞分割

在單細(xì)胞蛋白表達(dá)分析之前，拓?fù)鋯渭?xì)胞分割是必需的。為了檢測(cè)圖像中的細(xì)胞界限，將細(xì)胞膜蛋白β-連環(huán)蛋白、HER2和細(xì)胞角蛋白8/18摻入實(shí)驗(yàn)方案；對(duì)蛋白H3染色，用于鑒定細(xì)胞核。圖像示出了對(duì)齊良好的形態(tài)學(xué)細(xì)胞界限和中央。通過分水嶺轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)了進(jìn)一步的細(xì)胞分割[31、32]。首先，使膜圖像和陰性細(xì)胞核圖像疊加，以產(chǎn)生最大的細(xì)胞界限信息。然后圖像被高斯模糊以使成像偽跡和噪音最小化。最后，用Matlab成像工具箱(Matlab R2011b)沿著細(xì)胞膜尋找分水嶺。用先前的高斯模糊(3–4.5像素的核心寬度)和用于分水嶺的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)[30]，實(shí)現(xiàn)了最佳分割結(jié)果。如果必要的話，視覺評(píng)價(jià)以及修正所有的單細(xì)胞界限。然后，使界限罩的內(nèi)含物經(jīng)受單細(xì)胞分析。最后，將單細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)對(duì)從每個(gè)圖像獲得的中值H3信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化。

單細(xì)胞標(biāo)志物強(qiáng)度的比較

對(duì)于免疫熒光圖像，使用CellProfiler[33]分割流水線進(jìn)行單細(xì)胞分割。所有強(qiáng)度被從0至1重新修改比例，并且移除異常值(<0.1％樣品尺寸)。對(duì)于成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)，分析自分水嶺算法提取的細(xì)胞事件(參見以上)。由于正態(tài)分布不能被假定，使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)作為Student’s t檢驗(yàn)的可選方案，在Matlab 2013a中進(jìn)行預(yù)處理和進(jìn)一步分析。通過對(duì)每個(gè)方法全局定義的閾值，估計(jì)陽性和陰性單細(xì)胞。對(duì)于每個(gè)比較，一個(gè)生物學(xué)重復(fù)是可得的。

計(jì)算檢測(cè)極限

對(duì)于與對(duì)單激光射出的積分時(shí)間(50ms或一個(gè)圖像像素)一致的一段持續(xù)時(shí)間中的信號(hào)計(jì)算檢測(cè)極限(LOD)。大多數(shù)通道的平均的背景信號(hào)少于每激光射出的一個(gè)計(jì)數(shù)。然后基于泊松統(tǒng)計(jì)，根據(jù)以下的公式確定離子計(jì)數(shù)中的LOD[34]:LOD＝3.29×S+2.71，其中S是在該時(shí)間持續(xù)期間積分的背景信號(hào)的s.d.(假定S是平均背景的平方根；因此，保守地估計(jì)，S≈1)。因此，估計(jì)圖像的LOD(平均背景修正的)將是每圖像像素六個(gè)計(jì)數(shù)。

數(shù)據(jù)分析和圖像可視化

使用Matlab常規(guī)(Matlab R2012a)進(jìn)行所有的數(shù)據(jù)加工。以文本格式從質(zhì)譜細(xì)胞器輸出瞬時(shí)信號(hào)數(shù)據(jù)。文檔由成行的推進(jìn)數(shù)(即，時(shí)間)和成列的質(zhì)量通道組成，并且測(cè)量的值作為離子計(jì)數(shù)給出。每個(gè)通道中記錄的信號(hào)經(jīng)768個(gè)推進(jìn)被積分，等于10-ms時(shí)間窗(1推進(jìn)≈13μs)。隨后，瞬時(shí)信號(hào)中的每個(gè)激光生成的脈沖(50-ms持續(xù)時(shí)間)被積分成為單激光射出信號(hào)。最后，通過以其被記錄的相同的順序描繪激光射出信號(hào)，逐行掃描重構(gòu)每個(gè)質(zhì)量通道的圖像。對(duì)于進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析，從每個(gè)單獨(dú)的圖像數(shù)據(jù)集中減去在第一行掃描開始之前獲得的每個(gè)單獨(dú)的通道經(jīng)～1秒的持續(xù)時(shí)間確定的平均背景。

僅為了可視化，每個(gè)單獨(dú)通道的圖像被放大取樣到1,500像素的寬度，其中使用Adobe Photoshop v.13中的雙立體自動(dòng)重新取樣保持圖像比。對(duì)于圖像偽跡修正，在Adobe Photoshop v.13中用以下的這些設(shè)置實(shí)施噪音減少：強(qiáng)度5、保留細(xì)節(jié)2％、減少顏色噪音0％和銳化細(xì)節(jié)40％。對(duì)于PR(病例號(hào)23和210)和裂解的半胱天冬酶3(病例號(hào)210)，在放大取樣之前，施加“去除雜點(diǎn)”和高斯模糊(核心寬度，0.25像素)。對(duì)于所有的數(shù)據(jù)分析步驟，除非另外提出，僅使用原始數(shù)據(jù)。對(duì)于圖1b，對(duì)于成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)指示每激光射出計(jì)數(shù)的比例最大值如下調(diào)整，從上到下：H3，200；HER2，30和H3,200；CK8/18，80和H3，200；E-鈣粘蛋白，40和H3，400；波形蛋白，80和H3，400。對(duì)于圖2，指示每激光射出計(jì)數(shù)的比例最大值被調(diào)整如下：組織號(hào)210:H3，200；CK8/18，80；波形蛋白，400；CK7，25；CD44，50；PR，10；泛-肌動(dòng)蛋白，40；CD68，20。組織號(hào)23:HER2，50；H3，400；波形蛋白，100；E-鈣粘蛋白，30；細(xì)胞角蛋白7，25；pS6，20；β-連環(huán)蛋白，40；ER，40；和CD68，10。對(duì)于圖3，對(duì)于每個(gè)蛋白磷酸化位點(diǎn)示出的最大離子計(jì)數(shù)在處理和對(duì)照條件之間一致，并且指示每激光射出計(jì)數(shù)的比例最大值被調(diào)整如下：PLCγ2，600；ERK，100；p38，60和S6，60。

實(shí)施例2-標(biāo)記原子對(duì)抗體特異性的影響

使用FFPE乳腺癌樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定抗體的標(biāo)記是否將干擾它們的靶特異性。對(duì)來自同一類型的腫瘤的組織號(hào)210和號(hào)37的連續(xù)切片使用IFM分析，比較未標(biāo)記的和標(biāo)記的抗體。圖1a示出，未觀察到由于金屬標(biāo)記導(dǎo)致的抗體特異性的明顯的變化。

圖1a示出了使用識(shí)別指示的標(biāo)志物的未標(biāo)記的和金屬標(biāo)記的抗體，對(duì)管腔HER2+亞型(病例號(hào)37)的連續(xù)乳腺癌組織切片的IFM。

定量分析示出了，在未標(biāo)記的和金屬標(biāo)記的抗體之間的每種標(biāo)志物的平均單細(xì)胞熒光強(qiáng)度的差異，盡管顯著，是小的。這些差異完全在實(shí)驗(yàn)過程中通常觀察到的可變性的范圍內(nèi)并且在連續(xù)組織切片之間是類似但不相同的。通過在所有測(cè)試的抗體對(duì)的分析的強(qiáng)度范圍內(nèi)的單細(xì)胞標(biāo)志物熒光強(qiáng)度分布的一致性，進(jìn)一步證實(shí)了在未標(biāo)記的和金屬標(biāo)記的抗體之間的相似性(圖8a-e)。

圖8a-e示出了在病例號(hào)37的連續(xù)切片上，針對(duì)H3、HER2、細(xì)胞角蛋白8/18、E-鈣粘蛋白和波形蛋白的金屬標(biāo)記的和未標(biāo)記的抗體的IFM圖像。這些圖像被用于定量地比較單細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度。金屬標(biāo)記的抗體和未標(biāo)記的抗體的IFM分析的單細(xì)胞強(qiáng)度分布是相當(dāng)?shù)?。事件?shù)目未被標(biāo)準(zhǔn)化。

實(shí)施例3-通過與IFM比較驗(yàn)證成像方法

如被IFM確定的，通過質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)生成的圖像重現(xiàn)相同的染色模式和表達(dá)給定標(biāo)志物的細(xì)胞的百分比。對(duì)每個(gè)來自相同的管腔HER2+亞型的腫瘤切片使用IFM和成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)；兩種方法給出對(duì)該亞型預(yù)期的抗體染色模式(圖1b、圖6和表1和2)。核小體DNA包裝蛋白標(biāo)志物H3通常在細(xì)胞核中觀察到。孕酮受體(PR)、管腔乳腺癌中激活的轉(zhuǎn)錄因子、HER2、表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員以及細(xì)胞角蛋白8/18和上皮細(xì)胞-細(xì)胞連接組分E-鈣粘蛋白通常在質(zhì)膜中觀察到。波形蛋白指示基質(zhì)區(qū)室。這些模式與通過其他的抗體驗(yàn)證一致。

表達(dá)分析的標(biāo)志物的腫瘤細(xì)胞的百分比在IFM和成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)中的連續(xù)組織切片上是類似的。圖1b示出了對(duì)于H3分別為100％和100％；對(duì)于HER2為75％和79％；以及對(duì)于細(xì)胞角蛋白8/18，為63％和66％。圖2和圖7示出了另外的標(biāo)志物的質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)圖像。

圖1b示出了使用識(shí)別指示的標(biāo)志物的金屬標(biāo)記的抗體，對(duì)管腔HER2+亞型(病例號(hào)210、23和37)的乳腺癌組織切片的IFM和CyTOF成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)。未在連續(xù)切片上分析E-鈣粘蛋白(E-Cad)和波形蛋白(Vim)。

圖6示出了通過IFM和通過CyTOF成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)對(duì)管腔HER2+亞型的乳腺癌組織切片分析的金屬標(biāo)記的抗體的特異性的比較(PR病例號(hào)210、HER2和細(xì)胞角蛋白8/18病例號(hào)23)。未發(fā)現(xiàn)特異性的明顯改變。

實(shí)施例4-多重對(duì)抗體表現(xiàn)的影響

單重IHC、雙重IFM和32重成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)分析產(chǎn)生一致的結(jié)果。在同一管腔HER2+腫瘤(210號(hào))中使用同一抗體(細(xì)胞角蛋白8/18和H3)或使用不同的抗體克隆但針對(duì)同一靶(HER2和PR)的單重IHC分析產(chǎn)生類似的染色模式。對(duì)于IHC和成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)二者，>90％的上皮細(xì)胞表達(dá)這些標(biāo)志物，如圖9a和b中示出的。同一管腔HER2+腫瘤(病例號(hào)210)的切片被用于圖9a和9b中示出的質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)和IHC，但切片不是連續(xù)的。染色模式中未發(fā)現(xiàn)明顯差異。指示每激光射出計(jì)數(shù)的比例最大值被調(diào)整如下：HER2，30；PR，10；CK8/18，80；H3，200。對(duì)于圖9a，對(duì)于成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)和IHC分析使用同一抗體克隆。對(duì)于圖9b，對(duì)于成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)和IHC分析使用不同抗體克隆(成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)：HER2，BD(3B5)；PR，Epitomics(EP2)和IHC:HER2，Ventana(4B5)；PR，Ventana(1E2))。

在IFM分析中以一式兩份測(cè)量的抗體在表達(dá)給定分析的標(biāo)志物的腫瘤細(xì)胞的空間分布和百分比方面示出與32重CyTOF分析中的那些相當(dāng)?shù)男再|(zhì)(圖1b和圖6)。總之，這些結(jié)果指示，多重化不導(dǎo)致抗體表現(xiàn)的可觀察的變化。

因此，這些實(shí)施例中展示的結(jié)果示出，成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)使具有亞細(xì)胞分辨率的同時(shí)且高度多重化的組織成像成為可能。在未標(biāo)記的和標(biāo)記的抗體之間，或在單重IHC、雙重IFM和使用成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)的多重分析之間不存在特異性和性能的明顯變化。

實(shí)施例5-評(píng)價(jià)ICC方案中的貼壁細(xì)胞系

測(cè)試成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)以確定其是否可以被用于評(píng)價(jià)ICC方案中的貼壁細(xì)胞系。通過模擬物處理的和磷酸酪氨酸磷酸酶抑制劑處理的HMLE細(xì)胞的質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)的28個(gè)標(biāo)志物的分析揭示了預(yù)期的信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)。表3示出了該分析中使用的標(biāo)志物和抗體的細(xì)節(jié)。如圖3中示出的，在PLCγ2上的Y759上、在ERK1上的T202和Y204上(在ERK2上的T184和Y186上)以及在p38上的T180和Y182上觀察到增加的磷酸化。

圖3示出了通過IFM和成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)對(duì)貼壁細(xì)胞的分析。圖3中示出的顯微照片中示出了如用識(shí)別一組磷酸化殘基的抗體所指示的，標(biāo)記的且成像的人類乳腺上皮細(xì)胞，該人類乳腺上皮細(xì)胞未經(jīng)酪氨酸磷酸酶抑制劑釩酸酯(“對(duì)照”)和經(jīng)(“刺激”)的30-min的處理。對(duì)于每個(gè)對(duì)照刺激的比較保持恒定的曝光，但不同的抗體之間不保持恒定的曝光。注意，一抗和二抗檢測(cè)被分別用于成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)和IFM。

對(duì)質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)獲得的結(jié)果與來自類似地處理的和制備的HMLE細(xì)胞的IFM分析的數(shù)據(jù)一致(圖3)。對(duì)于其他非酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，包括在S6上的S235和S236上，未觀察到誘導(dǎo)。

因此，本發(fā)明的方法適用于成像貼壁細(xì)胞單層以及離體樣品。

實(shí)施例6-乳腺癌中的腫瘤異質(zhì)性分析

乳腺癌中，HER2、雌激素受體(ER)和PR的表達(dá)被用于定義主要的亞型，包括管腔HER2-、管腔HER2+、HER2+和三陰性[35]和[36]。測(cè)試本發(fā)明的方法具有以下的目的：(i)使用我們的多重測(cè)量結(jié)果描繪細(xì)胞亞群的表型和(ii)評(píng)價(jià)是否可以使用成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)先前觀察到的在那些亞型內(nèi)和之間的乳腺癌異質(zhì)性[37]、[38]和[39]。使用32重成像大量細(xì)胞分析法來分析組織微陣列(TMA)上的21個(gè)FFPE樣品，所述21個(gè)FFPE樣品先前已被病理學(xué)家分類為主要的乳腺癌亞型或?yàn)檎５摹?/p>

使用密度標(biāo)準(zhǔn)化事件的生成樹級(jí)數(shù)分析(spanning-tree progression analysis of density-normalized events，SPADE)[16]，鑒定細(xì)胞亞群和細(xì)胞轉(zhuǎn)變。對(duì)于分析的腫瘤的SPADE分析，在http://cytobank.org/上并且使用軟件工具SPADE[16]分析從分水嶺算法中提取的細(xì)胞事件。以下概括了在基于成像的該單細(xì)胞分析的條件內(nèi)的SPADE算法。首先，進(jìn)行所有的提取的細(xì)胞事件的密度依賴的縮小取樣到預(yù)定的靶數(shù)目。實(shí)施以下的設(shè)置：Arcsinh Cofactor＝5，聚類的靶數(shù)目＝150，縮小取樣到事件的靶數(shù)目＝5。通過使用軟件Cytoscape_v.2.8.3，運(yùn)行分析。然后，根據(jù)19種標(biāo)志物(ER、PR、CD68、CD20、c-MYC、HER2、pAMPK、H3、pERK、pBad、CD44、β-連環(huán)蛋白、波形蛋白、細(xì)胞角蛋白7、CAH IX、E-鈣粘蛋白、pS6、半胱天冬酶3和細(xì)胞角蛋白8/18)的表達(dá)，將縮小取樣的細(xì)胞事件聚類為細(xì)胞的表型上類似的團(tuán)塊。細(xì)胞的表型上類似的團(tuán)塊經(jīng)由邊緣連接，以畫出最小生成樹。下一步，進(jìn)行放大取樣步驟以將來自初始數(shù)據(jù)集的每個(gè)細(xì)胞事件分配到最具代表性的團(tuán)塊。最后，最小生成樹投射到兩個(gè)維度，并且代表細(xì)胞團(tuán)塊的樹的圈被給定的測(cè)量參數(shù)的中值強(qiáng)度水平著色，允許跨越整個(gè)細(xì)胞層次的標(biāo)志物的表達(dá)可視化。對(duì)于代表細(xì)胞群體的SPADE樹，結(jié)節(jié)尺寸作為總百分比被給出(例如，來自給定圖像的細(xì)胞的數(shù)目落入細(xì)胞聚類)。使用屬性值：0/5/7/15/最大，結(jié)節(jié)尺寸：60/120/150/200/200。圖4中，對(duì)于HER2，在4-9的范圍中設(shè)定彩色條具有步長(zhǎng)4/4.5/5/6/7/8.5/9。展示了CD20陽性細(xì)胞亞群，并且在以下步長(zhǎng)的0-9的范圍中設(shè)定彩色條：1/3/5/6/7/8/9。

圖4示出了腫瘤異質(zhì)性的成像質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)分析。分析了來自20個(gè)乳腺癌患者的21個(gè)樣品。SPADE樹鑒定了具有指示的標(biāo)志物模式的重疊細(xì)胞群體。淺灰色區(qū)域含有在所有通道中具有低標(biāo)志物表達(dá)的細(xì)胞(圖4a)。圖4b示出了顯示對(duì)腫瘤病例號(hào)201的CD20側(cè)群的聚類樹。圖4c-g示出了通過乳腺癌亞型HER2+細(xì)胞亞群反映以下這些細(xì)胞的潛在的異質(zhì)性：示出了病例號(hào)359(c)、254(d)、210(e)、199(f)和201(g)。圖4h-i示出了聚類樹，所述聚類樹示出了HER2+(病例號(hào)294；h)和管腔HER2+樣品(病例號(hào)276；i)的細(xì)胞亞群。顏色表示指示的標(biāo)志物的表達(dá)水平，并且結(jié)節(jié)的尺寸對(duì)應(yīng)來自給定患者的落在細(xì)胞聚類內(nèi)的細(xì)胞的百分比。

SPADE樹反映表達(dá)波形蛋白的基質(zhì)細(xì)胞亞群、表達(dá)寬范圍的標(biāo)志物的上皮腫瘤細(xì)胞亞群、和CD20+免疫細(xì)胞(圖4a和b)。HER2(圖4a、c–i)、波形蛋白、PR、ER、β-連環(huán)蛋白、碳酸酐酶(CAH)IX、E-鈣粘蛋白、c-MYC和其他的水平變化相當(dāng)大(圖4a)。甚至在同一腫瘤內(nèi)，可見表達(dá)的明顯差異，特別對(duì)于細(xì)胞角蛋白8/18、細(xì)胞角蛋白7、HER2和E-鈣粘蛋白染色(圖2)。當(dāng)分支被用于患者分類的標(biāo)志物驅(qū)動(dòng)時(shí)，鑒定的細(xì)胞亞群還部分地反映預(yù)期的乳腺癌亞型：例如，HER2+和管腔HER2+(圖4e、f、h、i)。

SPADE分析部分地反映了腫瘤亞型，如圖4中可見的。然而，這不減損SPADE工具對(duì)于高維度單細(xì)胞數(shù)據(jù)的強(qiáng)大的可視化能力，允許細(xì)胞亞群的人工分配并且因此描繪如以上示出的乳腺癌細(xì)胞亞群的圖。

七個(gè)樣品被分類為HER2+或管腔HER2+。這些樣品構(gòu)成SPADE樹中的HER2陽性分支，但還存在在細(xì)胞角蛋白8/18、E-鈣粘蛋白、β-連環(huán)蛋白和c-MYC的表達(dá)中不同的獨(dú)特亞群(圖4a)。例如，管腔HER2+腫瘤號(hào)210(圖4e)，其過量表達(dá)c-MYC。在同一乳腺癌亞型內(nèi)的這些差異指示患者間的腫瘤異質(zhì)性(圖4e、f、h、i)。

執(zhí)行本發(fā)明的這些模式證實(shí)，質(zhì)譜細(xì)胞術(shù)使細(xì)胞類型標(biāo)志物、癌癥的信號(hào)傳導(dǎo)活性和標(biāo)志諸如缺氧的同時(shí)成像成為可能?？傊?，這些分析描繪在分析的FFPE樣品中存在的乳腺癌細(xì)胞亞群，鑒定了它們的空間排列，并且揭示了在同一患者內(nèi)和患有同一腫瘤分類的患者之間的差異。

將理解的是，以上僅通過實(shí)施例的方式描述了本發(fā)明，并且可作出修改，同時(shí)保持在本發(fā)明的范圍和精神之內(nèi)。

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表1-用于腫瘤病例號(hào)23的抗體(圖1和2)

表2-用于腫瘤病例號(hào)210的抗體(圖1、2和6)

表3-用于粘附細(xì)胞成像的抗體(圖3)

表4-用于組織成像的抗體(TMA1)

表5-用于組織成像的抗體(TMA2)