本申請(qǐng)要求2014年4月7日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)No.61/976,380的權(quán)益。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于診斷和在其他情況下評(píng)估外傷性腦損傷和神經(jīng)退行性疾病的指標(biāo)的生物標(biāo)記物、方法和系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

近年來(lái)基因組的進(jìn)展已經(jīng)顯著地提高了我們對(duì)于分子變化的理解，這促進(jìn)了病理學(xué)的成果。蛋白質(zhì)組的技術(shù)革新已經(jīng)將該知識(shí)轉(zhuǎn)化為快速發(fā)現(xiàn)不同病癥的早期檢測(cè)和預(yù)后的潛在生物標(biāo)記物的步伐。

外傷性腦損傷是一種復(fù)雜的病癥，其由輕微的到劇烈的頭部受傷引起，今年大約1400000美國(guó)公民將遭受腦損傷，每年有一到四百萬(wàn)與運(yùn)動(dòng)有關(guān)的腦震蕩。外傷性腦損傷(TBI)和爆炸相關(guān)的腦震蕩在軍隊(duì)中也是顯著的問(wèn)題，從2000年以來(lái)在美國(guó)軍隊(duì)中有確診超過(guò)300,000例TBI。早期干預(yù)和改善患者結(jié)局需要客觀(guān)的分析以確定腦損傷的嚴(yán)重程度和預(yù)后。

輕微的外傷性腦損傷(mTBI)目前被限定為頭部創(chuàng)傷，其導(dǎo)致以下中的一種：高達(dá)24小時(shí)的精神狀態(tài)改變(暈眩，混亂，辨不清方向)，失去意識(shí)小于30分鐘，或在外傷之前或之后立即失去對(duì)事件的記憶。臨床醫(yī)生的初步評(píng)估和診斷是基于格拉斯哥昏迷等級(jí)(GCS)，其將TBI識(shí)別為輕微，中等或嚴(yán)重。雖然嚴(yán)重的頭部創(chuàng)傷可以被臨床醫(yī)生容易地識(shí)別，但mTBI是病因復(fù)雜的，其經(jīng)常被誤診，并且目前不存在用于輕微TBI也通稱(chēng)為腦震蕩的客觀(guān)的基于生物標(biāo)記物的標(biāo)準(zhǔn)。

在醫(yī)院通常使用計(jì)算機(jī)化軸向斷層掃描(CAT或CT)識(shí)別腦損傷，雖然它們對(duì)于檢測(cè)mTBI來(lái)說(shuō)經(jīng)常是沒(méi)用的，在mTBI中大腦沒(méi)有明顯的損傷。CT正常的輕微TBI區(qū)別于在TBI中出血并且CT掃描正常的中度TBI。成像(CT或MRI)是腦損傷的客觀(guān)檢查并且不夠敏感或特異，或作為識(shí)別腦損傷的程度的臨床工具成本過(guò)高，以及作為篩查工具不易獲得。

盡管有所進(jìn)步，但對(duì)于用于識(shí)別成年人和兒童人群二者的mTBI的生物標(biāo)記物仍然具有很大的需要，以在方法和系統(tǒng)中使用這樣的生物標(biāo)記物以提高mTBI的快速診斷、評(píng)估(例如對(duì)治療的反應(yīng))、和患有mTBI的患者的預(yù)后指標(biāo)。對(duì)于不同神經(jīng)退行性病癥的蛋白質(zhì)標(biāo)記物也存在需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本公開(kāi)一方面涉及腦損傷的生物標(biāo)記物，特別是與外傷性腦損傷的識(shí)別、評(píng)估和預(yù)后指標(biāo)相關(guān)的生物標(biāo)記物。

在一些實(shí)施方式中，提供了用于確定受試者(成人或兒童)的腦損傷的方法。一種方法包括從受試者收集樣品，檢測(cè)樣品中指示外傷性腦損傷的一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)記物的存在或含量，并且將這些標(biāo)記物的水平和患有或未患有腦損傷的患者的相同生物標(biāo)記物的預(yù)定水平進(jìn)行比較，其中與預(yù)定水平中的一個(gè)的關(guān)聯(lián)提供了診斷。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，生物標(biāo)記物是以下中的一個(gè)或多個(gè)：泛素C-末端水解酶L1(UCH-L1)，膠質(zhì)標(biāo)記物例如膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)，醛脫氫酶1家族成員L1(ALDH1L1)和其他膠質(zhì)蛋白，磷酸化神經(jīng)絲重鏈(pNFH)，神經(jīng)絲中鏈或神經(jīng)絲輕鏈(NFM和輕鏈(NFL))，α-突觸核蛋白，視椎蛋白樣蛋白1(VILIP-1)和S100B。樣品通常為血液或腦脊液(CSF)。生物標(biāo)記物的水平或濃度可以被用于確定腦損傷的開(kāi)始，診斷決策和臨床管理，腦損傷進(jìn)程的監(jiān)測(cè)或腦損傷的處置進(jìn)程的監(jiān)測(cè)。這些生物標(biāo)記物對(duì)于mTBI以及TBI的更嚴(yán)重形式是有用的。

其他實(shí)施方式涉及變化的蛋白質(zhì)水平或異常和變化的基因表達(dá)或剪接的檢測(cè)或評(píng)估，其與額顳葉退化癥、血管性癡呆、皮克氏病、神經(jīng)肌障礙、和其他神經(jīng)退行性病癥有關(guān)。

本發(fā)明的其他方面和益處將通過(guò)以下具體實(shí)施方式和附圖、以及權(quán)利要求變得清楚。

附圖說(shuō)明

圖1描繪了血液中的生物標(biāo)記物UCH-L1將TBI患者與健康對(duì)照區(qū)分開(kāi)。歐洲前瞻性單中心研究于ED(67例TBI，60例對(duì)照(包括創(chuàng)傷對(duì)照))，醫(yī)療標(biāo)準(zhǔn)(GCS，CT)。

圖2描繪了15例mTBI患者的血液樣品中的生物標(biāo)記物水平。許多呈現(xiàn)3個(gè)標(biāo)記物中的2個(gè)，表明生物標(biāo)記物的結(jié)合/組可以提供理想的試驗(yàn)結(jié)果。

圖3描繪了與對(duì)照相比，嚴(yán)重TBI患者超過(guò)7天的UCH-L1的血清和CSF中的水平。顯示的數(shù)據(jù)是平均+/-SEM濃度。對(duì)于對(duì)照，僅顯示單時(shí)間點(diǎn)作為最左邊一欄。

圖4描繪了在全部臨床隊(duì)列并且損傷后4小時(shí)內(nèi)，血液中生物標(biāo)記物UCH-L1和磷酸化神經(jīng)絲重鏈區(qū)分開(kāi)了CT正常與異常受試者，這支持了它們作為T(mén)BI的診斷生物標(biāo)記物的用途。67例TBI患者中的UCHL1和pNFH的血中水平(頂部)。兩種生物標(biāo)記物區(qū)分開(kāi)了CT正常(mTBI)與CT異常患者(中度TBI)(底部)。該區(qū)分可以在受傷后4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。

圖5描繪了UCH-L1和pNHF可以基于CT區(qū)分TBI的亞型，同時(shí)血液中磷酸化神經(jīng)絲重鏈水平區(qū)分正常CT、蛛網(wǎng)膜下出血(SAH)、和硬腦膜下血腫(SDH)的受試者。

具體實(shí)施方式

在腦損傷期間，由于快速的加速和減速、與爆炸相關(guān)的超壓沖擊波、或外來(lái)物體的穿透而對(duì)大腦造成損傷。血-腦屏障和脈管系統(tǒng)可以由于這些傷害被破壞或破裂，造成血液直接到達(dá)大腦組織以及在大腦和血液循環(huán)內(nèi)的蛋白質(zhì)成分的交換。從中樞神經(jīng)系統(tǒng)釋放到血液中的蛋白質(zhì)可以代表腦損傷以及多種神經(jīng)退行性病癥的生物標(biāo)記物。

本文中所用的術(shù)語(yǔ)“樣品”指的是從人體和或動(dòng)物體分離的生物材料。樣品可以包括任何適合的生物材料，特定組織或生物液體。樣品可以從任何適合的組織或生物液體中分離。在這方面，樣品可以是血液、血清、血漿、尿液、CSF或脊髓組織。因?yàn)門(mén)BI影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，樣品優(yōu)選地被從中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)(即大腦和脊髓)的組織或生理液體中分離。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述樣品從血液中分離。

樣品能夠以本領(lǐng)域已知的任何適合的方式獲得，例如通過(guò)活檢、血液取樣、尿液取樣、腰椎穿刺(即脊椎穿刺)、腦室穿刺、和小腦延髓池穿刺。在優(yōu)選實(shí)施方式中，樣品通過(guò)腰椎穿刺獲得，其也指的是脊椎穿刺或CSF收集。腰椎穿刺包括通常在第三和第四節(jié)腰椎之間將脊椎穿刺針插入蛛網(wǎng)膜下隙中，在那里收集CSF。在腰椎畸形或感染而將導(dǎo)致腰椎穿刺不能進(jìn)行或者不可靠的情況下，所述樣品可以通過(guò)腦室穿刺或小腦延髓池穿刺收集。腦室穿刺通常對(duì)可能即將發(fā)生腦疝的人體受試者實(shí)施。腦室穿刺包括在顱骨上鉆孔，并且將針直接插入大腦的側(cè)腦室以收集CSF。小腦延髓池穿刺包括將針插入枕骨下方(顱骨的背面)，并且由于針靠近腦干可能發(fā)生危險(xiǎn)。

許多神經(jīng)退行性疾病，例如阿爾茲海默病、帕金森病、亨廷頓病和ALS，其特征在于異常蛋白質(zhì)的積累或存在，其促成了疾病表征。除了蛋白質(zhì)，樣品中的代謝異常可以用作疾病階段的指示劑。因此，本文涉及對(duì)蛋白質(zhì)水平變化或異常和基因表達(dá)或剪接的變化的檢測(cè)和評(píng)估的實(shí)施方式，包括但不限于額顳葉退化癥、血管性癡呆、皮克氏病、神經(jīng)肌紊亂。

術(shù)語(yǔ)“個(gè)人的”、“宿主”、“受試者”、和“患者”在本文中可交換地使用，并且指的是哺乳動(dòng)物，包括但是不限于人類(lèi)、嚙齒目動(dòng)物例如小鼠和大鼠、和其他實(shí)驗(yàn)室用動(dòng)物。

術(shù)語(yǔ)“生物標(biāo)記物”指的是由有機(jī)體產(chǎn)生的有機(jī)分子，其對(duì)于疾病階段或病癥有指示作用或與其相關(guān)。生物標(biāo)記物包括但不限于蛋白質(zhì)、代謝物、翻譯后修飾蛋白質(zhì)等。

我們已經(jīng)制備了抗體并開(kāi)發(fā)出了對(duì)UCH-L1特異性和高靈敏度的分析方法。ELISA具有從10ng/mL下至20pg/mL的檢測(cè)范圍。所述分析方法使用EnCor^TM單克隆抗體MCA-BH7用于俘獲以及兔多克隆RPCA-UCHL1用于檢測(cè)。

用于VSNL1/Vilip1的原型ELISA型分析具有從100ng/mL到1ng/mL的檢測(cè)范圍，并且具有足夠的靈敏度以基于公布的數(shù)據(jù)而檢測(cè)預(yù)期出現(xiàn)在CSF、血漿和血清中的該蛋白質(zhì)的升高的水平。這使用了單克隆MCA-3A9來(lái)俘獲以及兔多克隆RPCA-VSNL1用于檢測(cè)。我們先前公開(kāi)了SNCA/α-突觸核蛋白的抗體和ELISA的廣泛的表征，其可以可靠地檢測(cè)從100ng/mL到1ng/mL范圍的該蛋白質(zhì)。這使用了單克隆MCA-2A7來(lái)俘獲以及兔多克隆RPCA-aSyn用于檢測(cè)。

所述實(shí)施方式將通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步描述，其沒(méi)有限定由權(quán)利要求限定的本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

診斷mTBI的方法。一個(gè)實(shí)施方式包括檢測(cè)從受試者獲得的樣品中的生物標(biāo)記物水平和將這些生物標(biāo)記物的水平與已知患有mTBI、中等或嚴(yán)重TBI的患者或沒(méi)有腦損傷的患者的生物標(biāo)記物的預(yù)定水平進(jìn)行關(guān)聯(lián)。生物標(biāo)記物包括以下的一種或多種：泛素C-末端水解酶L1(UCH-L1)，膠質(zhì)標(biāo)記物例如膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)，醛脫氫酶1家族成員L1(ALDH1L1)和其他膠質(zhì)蛋白，磷酸化神經(jīng)絲重鏈(pNFH)，磷酸化神經(jīng)絲中鏈或磷酸化神經(jīng)絲輕鏈(pNFM和輕鏈(pNFL))，α-突觸核蛋白，視椎蛋白樣蛋白1(VILIP-1)和S100B。

圖1描繪了在急診科進(jìn)行臨床評(píng)估和CT掃描的67例受試者的組的血清中的UCH-L1和pNFH的不同水平。在抵達(dá)急診科時(shí)獲取血液樣品并且對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫測(cè)定。正常的CT掃描代表mTBI，且異常CT掃描代表中等或嚴(yán)重TBI。頂部圖顯示了UCH-L1和pNHF蛋白質(zhì)水平，顯示了在異常CT掃描的患者相對(duì)于正常CT掃描的患者中，UCH-L1和pNFH兩者均呈現(xiàn)水平的增加。

那些具有正常CT掃描的患者相對(duì)于健康對(duì)照來(lái)說(shuō)在血液中的UCH-L1和pNFH仍然呈現(xiàn)較高的水平。較低的圖描繪了在傷后4小時(shí)內(nèi)抵達(dá)急診科的受試者血清中的UCH-L1和pNFH水平的比較。在輕微(CT正常)相對(duì)于中等(CT異常)TBI組中UCH-L1和pNFH水平均存在顯著差別。單獨(dú)地或組合地限定這些生物標(biāo)記物的臨界值產(chǎn)生了mTBI的診斷和輕微與中等TBI之間的區(qū)分，其將能夠進(jìn)行不同的臨床管理。

本文所述的檢測(cè)生物標(biāo)記物濃度的方法的實(shí)施方式包括免疫分析或采用質(zhì)譜法的系統(tǒng)。已經(jīng)發(fā)展了對(duì)于不同的生物標(biāo)記物的特異性的免疫分析(ELISA)，使用中尺度探索(Meso-Scale Discovery)平臺(tái)和已知的免疫分析條件。這些是基于使用生物標(biāo)記物特異性小鼠單克隆俘獲抗體和使用與釕紅耦連的多克隆檢測(cè)抗體以通過(guò)電化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)。免疫分析的校準(zhǔn)物從牛脊髓(對(duì)于pNFH)中純化和/或表達(dá)為重組蛋白(對(duì)于UCH-L1)。

對(duì)于神經(jīng)絲蛋白的血液檢測(cè)，用尿素處理血液樣品以減少蛋白質(zhì)聚集，其加強(qiáng)了某些樣品中的免疫分析檢測(cè)并且因此改善了整體結(jié)果。

質(zhì)譜方法可以包括胰蛋白酶消化(或用其他已知酶消化)和然后液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法以對(duì)肽進(jìn)行識(shí)別和測(cè)序，以識(shí)別每個(gè)生物標(biāo)記物。定量質(zhì)譜法可以被用于對(duì)生理液體中的每種肽進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

監(jiān)測(cè)TBI治療處理的方法。一個(gè)實(shí)施方式包括檢測(cè)樣品中的生物標(biāo)記物水平，樣品是隨時(shí)間在治療前和治療后從TBI受試者獲得的，并且將這些生物標(biāo)記物水平隨時(shí)間的變化進(jìn)行關(guān)聯(lián)。生物標(biāo)記物包括以下的一種或多種：泛素C-末端水解酶L1(UCH-L1)，膠質(zhì)標(biāo)記物例如膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)，醛脫氫酶1家族成員L1(ALDH1L1)和其他膠質(zhì)蛋白，磷酸化神經(jīng)絲重鏈(pNFH)，磷酸化神經(jīng)絲中鏈或磷酸化神經(jīng)絲輕鏈(pNFM和輕鏈(pNFL))，α-突觸核蛋白，視椎蛋白樣蛋白1(VILIP-1)和S100B。

檢測(cè)血-腦屏障完整性或血-腦脊液完整性的方法。優(yōu)選方法包括檢測(cè)從受試者的血液或CSF獲得的樣品的生物標(biāo)記物水平。生物標(biāo)記物包括以下的一種或多種：泛素C-末端水解酶L1(UCH-L1)，膠質(zhì)標(biāo)記物例如膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)，醛脫氫酶1家族成員L1(ALDH1L1)和其他膠質(zhì)蛋白，磷酸化神經(jīng)絲重鏈(pNFH)，磷酸化神經(jīng)絲中鏈或磷酸化神經(jīng)絲輕鏈(pNFM和輕鏈(pNFL))，α-突觸核蛋白，視椎蛋白樣蛋白1(VILIP-1)和S100B。

檢測(cè)損傷機(jī)制、損傷區(qū)域、腦損傷造成的異質(zhì)性和結(jié)果的方法。我們的優(yōu)選方法包括檢測(cè)從受試者的血液或CSF獲得的樣品的生物標(biāo)記物水平。生物標(biāo)記物包括以下的一種或多種：泛素C-末端水解酶L1(UCH-L1)，膠質(zhì)標(biāo)記物例如膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)，醛脫氫酶1家族成員L1(ALDH1L1)和其他膠質(zhì)蛋白，磷酸化神經(jīng)絲重鏈(pNFH)，磷酸化神經(jīng)絲中鏈或磷酸化神經(jīng)絲輕鏈(pNFM和輕鏈(pNFL))，α-突觸核蛋白，視椎蛋白樣蛋白1(VILIP-1)和S100B。

TBI異質(zhì)性由TBI患者血液中存在或不存在不同蛋白而產(chǎn)生，并且可以被用于區(qū)分患者和幫助臨床管理。TBI的預(yù)后指標(biāo)通過(guò)將生物標(biāo)記物水平與具有已知臨床結(jié)果的患者的生物標(biāo)記物的預(yù)定水平進(jìn)行關(guān)聯(lián)，對(duì)預(yù)后指標(biāo)使用生物標(biāo)記物臨界值。

應(yīng)該指出的是本文的實(shí)施方式可以進(jìn)一步包括監(jiān)測(cè)一種或多種生物標(biāo)記物的時(shí)間動(dòng)力學(xué)和加工(processing)，作為治療功效和結(jié)果的度量。

因此應(yīng)該理解雖然本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合它的具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，前述實(shí)施方式旨在進(jìn)行展示而不是限定本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求限定。其他方面、益處和修飾在權(quán)利要求的范圍內(nèi)。