本申請(qǐng)依據(jù)35U.S.C.§119(e)要求于2014年5月13日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/992,814和2015年3月13日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)62/132,989的優(yōu)先權(quán)，通過(guò)引用將其每個(gè)的全部?jī)?nèi)容結(jié)合于本文中。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物分子組成(biologicalmoleculecomposition)的分析，以及特別涉及利用固態(tài)納米孔的生物分子組成的選擇性檢測(cè)和量化。
背景技術(shù)：
：免疫沉淀和拉下試驗(yàn)是生物化學(xué)中的主要方法。通過(guò)區(qū)分非均勻混合物中的具體基質(zhì)的能力，它們?cè)诎ǖ鞍踪|(zhì)組學(xué)、表觀基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的廣泛領(lǐng)域中起到重要作用。然而，盡管它們的實(shí)用性廣泛，但是這些得到確定的策略具有局限性。除了要求大樣本尺寸之外，它們是勞動(dòng)密集型的且不能固有地量化，一般要求隨后的PCR或提純用于下游分析。出于這些原因，利用單分子靈敏度的量化技術(shù)可提供重要的優(yōu)勢(shì)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：一方面，本文描述了用于生物分子組成的選擇性檢測(cè)和量化分析的方法。本文所描述的方法包括提供包含與易位試劑(translocatingagent)絡(luò)合的生物分子和非絡(luò)合的生物分子的混合物。使混合物與包括至少一個(gè)納米孔的膜接觸，并穿過(guò)納米孔施加電場(chǎng)以通過(guò)至少一個(gè)納米孔易位與易位試劑絡(luò)合的生物分子，其中，選擇性檢測(cè)絡(luò)合的生物分子的易位。在一些實(shí)施方式中，本文所描述的方法進(jìn)一步包括在絡(luò)合的生物分子的一個(gè)或多個(gè)易位事件期間測(cè)量通過(guò)納米孔的電流的變化。此外，該方法可以進(jìn)一步包括測(cè)量絡(luò)合的生物分子的易位事件的頻率(速率，rate)和由易位事件的頻率確定絡(luò)合的生物分子的濃度。重要地，可以從溶液中回收易位的絡(luò)合的生物分子，從而將其從初始混合物的非絡(luò)合的生物分子中分離出來(lái)。適用于根據(jù)本文所描述的方法的分析的生物分子包括核酸和蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，例如，生物分子包括單鏈和雙鏈脫氧核糖核酸(DNA)以及核糖核酸(RNA)和具有鏈內(nèi)雙螺旋的RNA。在以下詳細(xì)描述中更加詳細(xì)地描述了這些和其它實(shí)施方式。附圖說(shuō)明圖1示出了根據(jù)本文所描述的一個(gè)實(shí)施方式的生物分子組成分析的方法。圖2示出了根據(jù)本文所描述的一些實(shí)施方式在相同的化學(xué)計(jì)量范圍內(nèi)與電泳遷移試驗(yàn)相比的在各種電場(chǎng)電壓下絡(luò)合的生物分子易位事件頻率(translocationeventrate)。圖3示出了根據(jù)本文所描述的一個(gè)實(shí)施方式的最高達(dá)1:1摩爾比的易位試劑和絡(luò)合的生物分子的絡(luò)合的生物分子事件頻率。圖4示出了根據(jù)本文所描述的一個(gè)實(shí)施方式相對(duì)于易位事件頻率的絡(luò)合的生物分子濃度的量化。圖5示出了根據(jù)本文所描述的一個(gè)實(shí)施方式的易位事件頻率與絡(luò)合的易位試劑和非絡(luò)合的易位試劑的施加電壓的關(guān)系。圖6示出了根據(jù)本文所描述的一個(gè)實(shí)施方式的易位事件頻率與絡(luò)合的易位試劑、非絡(luò)合的易位和未絡(luò)合的單鏈核酸的施加電壓的關(guān)系。圖7示出了根據(jù)本文所描述的一個(gè)實(shí)施方式的易位事件頻率與絡(luò)合的ds-DNA和非絡(luò)合的ds-DNA的施加電壓的關(guān)系。圖8示出了根據(jù)本文所描述的一個(gè)實(shí)施方式相對(duì)于絡(luò)合的生物分子濃度的易位事件頻率。圖9示出了根據(jù)本文所描述的一個(gè)實(shí)施方式相對(duì)于ds-DNA長(zhǎng)度的易位事件頻率。具體實(shí)施方式通過(guò)參考以下詳細(xì)描述和實(shí)施例和它們的以上和以下描述可以更容易地理解本文所描述的實(shí)施方式。然而，本文所描述的元件、設(shè)備和方法并不限于在詳細(xì)描述和實(shí)施例中提供的具體實(shí)施方式。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，這些實(shí)施方式僅僅說(shuō)明了本發(fā)明的原理。在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員許多修改和調(diào)整將是顯而易見的。一方面，本文描述了用于生物分子組成的選擇性檢測(cè)和量化分析的方法。本文所描述的方法包括提供包含與易位試劑絡(luò)合的生物分子和非絡(luò)合的生物分子的混合物。使混合物與包括至少一個(gè)納米孔的膜接觸，并穿過(guò)納米孔施加電場(chǎng)以通過(guò)至少一個(gè)納米孔易位與易位試劑絡(luò)合的生物分子，其中，選擇性檢測(cè)絡(luò)合的生物分子的易位。在一些實(shí)施方式中，本文所描述的方法進(jìn)一步包括在絡(luò)合的生物分子的一個(gè)或多個(gè)易位事件期間測(cè)量通過(guò)納米孔的電流的變化。此外，該方法可以進(jìn)一步包括測(cè)量絡(luò)合的生物分子的易位事件的頻率和由易位事件的頻率確定絡(luò)合的生物分子的濃度。重要地，可以從溶液中回收易位的絡(luò)合的生物分子，從而將其從初始混合物的非絡(luò)合的生物分子中分離出來(lái)。現(xiàn)在轉(zhuǎn)向具體步驟，本文所描述的方法包括提供包含與易位試劑絡(luò)合的生物分子和非絡(luò)合的生物分子的混合物。根據(jù)本文所描述的方法可以選擇性檢測(cè)和量化與本發(fā)明的目的不相矛盾的任何生物分子。適用于根據(jù)本文所描述的方法的分析的生物分子包括核酸。在一些實(shí)施方式中，例如，生物分子包括ss-DNA、ds-DNA以及RNA和具有鏈內(nèi)雙螺旋的RNA。RNA可以包括mRNA、miRNA、rRNA、tRNA、tmRNA、aRNA或它們的混合物。核酸可以具有與本發(fā)明的目的不相矛盾的任何期望數(shù)目的核苷酸。在一些實(shí)施方式中，例如，用于分析的核酸具有25至1000個(gè)核苷酸。另外，核酸可以具有選自表I的核苷酸數(shù)。表I-核酸長(zhǎng)度核苷酸100-600200-500250-40050-300100-2001-500混合物中的核酸可以源自真核的、原核的和/或病毒來(lái)源。進(jìn)一步地，生物分子可以包括核酸片段或寡核苷酸。根據(jù)本文所描述的方法可以選擇性檢測(cè)和量化不與本發(fā)明的目的相矛盾的任何長(zhǎng)度的寡核苷酸。進(jìn)一步地，用于分析的生物分子可以包括單個(gè)核苷酸和/或它們的衍生物。除核酸之外，適用于根據(jù)本文所描述的方法分析的生物分子包括蛋白質(zhì)。在本文所描述的方法中可以采用不與本發(fā)明的目的相矛盾的任何蛋白質(zhì)。如本文所描述的，混合物中的生物分子與易位試劑選擇性絡(luò)合。易位試劑是具有足夠的電荷和/或結(jié)構(gòu)以允許通過(guò)施加電壓設(shè)定的施加電場(chǎng)選擇性檢測(cè)絡(luò)合的生物分子的易位的化學(xué)物質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，例如，易位試劑是生物分子，包括蛋白質(zhì)、核酸或核酸片段。生物分子可以處于天然存在的狀態(tài)?？商鎿Q地，可以改性生物分子以表明特異性結(jié)合、合適的電荷和/或結(jié)構(gòu)以允許選擇性檢測(cè)絡(luò)合的生物分子易位。在一些實(shí)施方式中，易位試劑包括用親和標(biāo)記物改性的單鏈核酸，所述親和標(biāo)記物用于在絡(luò)合的生物分子的易位之前結(jié)合一種或多種分子物質(zhì)。例如，易位試劑可以包括已知具體序列的單鏈核酸，其中，單鏈核酸是用蛋白質(zhì)標(biāo)記物改性的。在與易位試劑絡(luò)合的生物分子易位之前，蛋白質(zhì)標(biāo)記物可以結(jié)合生物分子的混合物中的合適的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物素化單鏈核酸的易位試劑，用于在互補(bǔ)序列的靶核酸的易位之前結(jié)合鏈霉親和素。在其他實(shí)施方式中，易位試劑是非生物的化學(xué)物質(zhì)，如納米顆粒?？梢圆捎貌慌c本發(fā)明的目的相矛盾的任何納米顆粒。納米顆粒例如可以包括有機(jī)納米顆粒，包括碳納米顆粒(碳納米管、石墨烯、富勒烯等)。納米顆粒也可以包括無(wú)機(jī)納米顆粒如半導(dǎo)體納米顆粒、陶瓷納米顆粒和/或金屬納米顆粒。將易位試劑添加至生物分子混合物，且易位試劑選擇性結(jié)合生物分子以提供絡(luò)合的生物分子。不與易位試劑選擇性結(jié)合的生物分子形成混合物中的非絡(luò)合的生物分子。為了絡(luò)合用于選擇性易位檢測(cè)的生物分子，易位試劑可以包含位點(diǎn)特異性結(jié)合區(qū)域。根據(jù)待絡(luò)合的生物分子的身份，位點(diǎn)特異性結(jié)合區(qū)域可以是結(jié)合DNA或RNA的結(jié)構(gòu)域。例如，在一些實(shí)施方式中，保證(warranting)使用結(jié)合核酸的結(jié)構(gòu)域，易位試劑可以直接結(jié)合至核酸。單鏈核酸易位試劑可以選擇性地與生物分子的混合物中的互補(bǔ)序列的靶單鏈核酸混合。易位之前的選擇性混合可以允許量化混合物中的靶單鏈核酸。在一些實(shí)施方式中，可以使用不同序列的多種單鏈核酸易位試劑來(lái)識(shí)別混合物中的若干靶單鏈核酸的存在和/或?qū)⑵淞炕?。例如，可以在易位試劑中采用高度保守的序列，允許識(shí)別混合物中的具體物質(zhì)，如各種細(xì)菌物質(zhì)。還可以監(jiān)測(cè)同源性，其中在分析結(jié)果中記錄了一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)不匹配的地方。進(jìn)一步地，通過(guò)采用單鏈核酸易位試劑可以闡明DNA熔融和/或退火特征。單鏈形式(未與易位試劑絡(luò)合)和雙鏈形式(與易位試劑絡(luò)合)之間的轉(zhuǎn)變可以暫時(shí)性地與易位事件有關(guān)?？商鎿Q地，位點(diǎn)特異性結(jié)合區(qū)域可以是結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域。在其他實(shí)施方式中，可以向核酸提供用于結(jié)合易位試劑的親和標(biāo)記物，從而保證結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域。易位試劑通過(guò)幾種機(jī)制(取決于絡(luò)合的生物分子的身份)可以允許選擇性檢測(cè)絡(luò)合的生物分子易位。在一些實(shí)施方式中，例如，感興趣的生物分子在選定的施加電場(chǎng)條件下和/或其他溶液條件下不具有足夠的電荷來(lái)易位通過(guò)納米孔。在這種實(shí)施方式中，易位試劑向感興趣的生物分子提供足夠的電荷以在選定的施加電場(chǎng)和/或其他溶液條件下經(jīng)歷易位。因此，可以選擇性檢測(cè)絡(luò)合的生物分子的易位，因?yàn)榛旌衔镏蟹墙j(luò)合的生物分子不能在選定的條件下易位?？商鎿Q地，感興趣的生物分子具有高電荷并在納米孔分析中采用的傳統(tǒng)電子設(shè)備不可檢測(cè)的頻率下經(jīng)歷易位。例如，蛋白質(zhì)往往在傳統(tǒng)電子設(shè)備不可檢測(cè)的頻率下易位，從而致使納米孔裝置不適用于蛋白質(zhì)檢測(cè)和量化。在這種實(shí)施方式中，易位試劑可以具有足夠的相反電荷和/或尺寸以減緩蛋白質(zhì)易位頻率，用于通過(guò)傳統(tǒng)的納米孔體系和電子設(shè)備檢測(cè)和量化。類似地，單鏈核酸往往在傳統(tǒng)電子設(shè)備不可檢測(cè)的頻率下易位，從而致使納米孔裝置不適用于核酸檢測(cè)和量化。在這種實(shí)施方式中，采用具有與生物分子的混合物中的單鏈核酸靶互補(bǔ)的序列的單鏈核酸易位試劑。單鏈核酸易位試劑表現(xiàn)出允許檢測(cè)與靶單鏈核酸形成的絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)。如本文所描述的，可以用親和標(biāo)記物如蛋白質(zhì)標(biāo)記物改性單鏈核酸易位試劑，用于在絡(luò)合的靶單鏈核酸易位之前結(jié)合一種或多種分子物質(zhì)。進(jìn)一步地，易位試劑可以提供可以與混合物中的其他物質(zhì)充分區(qū)分開的易位頻率或納米孔停留時(shí)間。如本文所描述的，使包含與易位試劑絡(luò)合的生物分子和非絡(luò)合的生物分子的混合物與包括至少一個(gè)納米孔的膜接觸。在一些實(shí)施方式中，膜包括一排(anarrayof)納米孔。膜可以具有與本發(fā)明的目的不相矛盾的任何厚度并可以由任何材料形成。在一些實(shí)施方式中，膜是非金屬的。非金屬膜可以包含一種或多種電氣絕緣材料，包括陶瓷材料。合適的陶瓷包括金屬氧化物、金屬氮化物、金屬碳化物或金屬碳氮化物或它們的組合。在一些實(shí)施方式中，適用作膜的陶瓷是氮化硅(SiN，Si3N4)。另外，膜陶瓷可以包含氧化硅、碳化硅、氧化鋁或過(guò)渡金屬氧化物。在一些實(shí)施方式中，陶瓷膜在本質(zhì)上是多晶的。在一些實(shí)施方式中，陶瓷膜在本質(zhì)上是單晶的。此外，陶瓷膜可以是多層的。多層膜的各層可以包含相同的材料或不同的材料。在一些實(shí)施方式中，陶瓷膜的各層可以獨(dú)立地選自由過(guò)渡金屬碳化物、過(guò)渡金屬氮化物、過(guò)渡金屬碳氮化物、過(guò)渡金屬氧化物、氧化鋁、二氧化硅和氮化硅組成的組。進(jìn)一步地，膜可以包含一種或多種半導(dǎo)體材料。在一些實(shí)施方式中，合適的半導(dǎo)體材料包括II/VI半導(dǎo)體、第IV族半導(dǎo)體或III/V半導(dǎo)體。在一些實(shí)施方式中，半導(dǎo)體材料包括三元半導(dǎo)體或四元半導(dǎo)體。合適的半導(dǎo)體材料可以具有無(wú)定形結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)或它們的混合物。晶體半導(dǎo)體材料可以是多晶或單晶的。在一些實(shí)施方式中，膜是金屬的。在這種實(shí)施方式中，膜可以是金屬或金屬的各種合金。在一些實(shí)施方式中，例如，合適的金屬是過(guò)渡金屬，包括貴金屬如金?？商鎿Q地，在一些實(shí)施方式中，膜不是金。可以用本文所描述的方法中使用的介電或電氣絕緣材料涂覆金屬膜。在一些實(shí)施方式中，膜包含有機(jī)材料。例如，膜可以包含一種或多種聚合物材料。合適的聚合物材料包括熱塑性塑料、熱固性塑料或彈性體。在一些實(shí)施方式中，聚合物材料包含聚乙烯、聚丙烯和聚碳酸酯中的一種或多種。適用于在本文所描述的方法中使用的膜可以具有任何期望的厚度。在一些實(shí)施方式中，膜具有適用于檢測(cè)和/或進(jìn)行一種或多種核酸片段(包括單鏈核酸片段)的分析的厚度。在一些實(shí)施方式中，膜具有小于約200nm或小于約100nm的平均厚度。在一些實(shí)施方式中，膜具有根據(jù)表II的平均厚度。表II-納米孔膜厚度(nm)膜厚度(nm)<501-3010-2020-5050-100100-500250-750進(jìn)一步地，膜可以具有原子標(biāo)度上的厚度。在一些實(shí)施方式中，膜具有小于1nm的厚度，如0.1nm至0.9nm。在一些實(shí)施方式中，在根據(jù)本文所描述的方法形成納米孔之前，測(cè)量膜的厚度。另外，本文所描述的膜的納米孔可以具有與本發(fā)明的目的不相矛盾的任何尺寸和形狀。在一些實(shí)施方式中，例如，至少一個(gè)納米孔具有大于約1nm或大于約5nm的直徑。本文所描述的膜的納米孔可以具有根據(jù)表III的直徑。表III-納米孔直徑(nm)納米孔直徑>101-201-101-55-1010-1510-201.5-4進(jìn)一步地，納米孔可以具有與膜的平均厚度相同的厚度。因此，在一些實(shí)施方式中，納米孔可以具有選自本文的表II的厚度?？商鎿Q地，納米孔具有小于膜的平均厚度的厚度。此外，可以基于本文所描述的測(cè)量如與易位事件相關(guān)的電流測(cè)量的期望信噪比(SNR)選擇納米孔的直徑和/或厚度。在一些實(shí)施方式中，易位事件的SNR對(duì)于較大直徑的納米孔較高，以及對(duì)于較小直徑的納米孔較低。另外，在一些實(shí)施方式中，基于期望的納米孔中的易位物質(zhì)的停留時(shí)間或期望的易位事件的持續(xù)時(shí)間選擇納米孔的直徑和/或厚度。在一些實(shí)施方式中，易位事件的停留時(shí)間和/或持續(xù)時(shí)間對(duì)于較厚的納米孔比對(duì)于較薄的納米孔長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，停留時(shí)間是從納米孔中初始電導(dǎo)系數(shù)下降直到其回到基準(zhǔn)值所經(jīng)過(guò)的時(shí)間?？梢砸圆慌c本發(fā)明的目的相矛盾的任何方式形成本文所描述的膜。在一些實(shí)施方式中，例如，根據(jù)專利合作條約(PCT)申請(qǐng)公開WO2012/170499中所描述的方法形成膜，通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容結(jié)合于此。如本文所描述的，穿過(guò)納米孔施加電場(chǎng)以使與易位試劑絡(luò)合的生物分子易位通過(guò)至少一個(gè)納米孔，其中，選擇性檢測(cè)易位事件?？梢愿鶕?jù)不與本發(fā)明的目的相矛盾的任何施加電壓設(shè)定電場(chǎng)。合適的施加電壓例如可以在1mV至5V的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，施加電壓在10mV至1V或50mV至500mV的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，本文所描述的方法進(jìn)一步包括在絡(luò)合的生物分子的一個(gè)或多個(gè)易位事件期間測(cè)量通過(guò)納米孔的電流的變化。此外，該方法可以進(jìn)一步包括測(cè)量絡(luò)合的生物分子的易位事件的頻率和由易位事件的頻率確定絡(luò)合的生物分子的濃度。在一些實(shí)施方式中，例如，絡(luò)合的生物分子的濃度重要地，可以從溶液中回收易位的絡(luò)合的生物分子，從而將其從初始混合物的非絡(luò)合的生物分子中分離出來(lái)。在以下非限制性實(shí)施例中進(jìn)一步示出了這些和其他實(shí)施方式。實(shí)施例1-雙鏈DNA的選擇性檢測(cè)和量化在該實(shí)施例中詳述了通過(guò)用于結(jié)合單價(jià)鏈霉親和素(MS)易位試劑的生物素改性的ds-DNA的選擇性檢測(cè)和量化。圖1示出了在該實(shí)施例中采用的單生物素化的ds-DNA的SS-納米孔區(qū)分。在圖1a中，穿過(guò)浸漬在電解液中的具有單個(gè)納米孔的薄膜片(thin-filmmembrane)施加電偏壓。這有助于分子(或分子絡(luò)合物)通過(guò)孔的動(dòng)電學(xué)易位，其每個(gè)可以產(chǎn)生離子電流事件。該技術(shù)分別用于測(cè)量各自在8μM和1μM濃度下的MS(圖1b，左)和單生物素化的90bpds-DNA(bio90，圖1b，中)。在50-200mV的范圍內(nèi)，針對(duì)任一分子識(shí)別了很少的事件。然而，當(dāng)在測(cè)量之前以8:1(MS:bio90)的摩爾比一起溫育MS和bio90時(shí)，觀察到每單位時(shí)間易位事件數(shù)的顯著升高(圖1b，右)?；旌衔锏氖录l率一致大于比任一單獨(dú)的構(gòu)成分子的數(shù)量級(jí)大的數(shù)量級(jí)；例如在200mV施加電壓下，MS-bio90絡(luò)合物產(chǎn)生23.3±0.9s-1的頻率，而MS和bio90各自的事件頻率分別是0.09±0.04s-1和1.1±0.2s-1。為了驗(yàn)證MS-bio90事件對(duì)應(yīng)于實(shí)際的易位而不是絡(luò)合物和納米孔之間的偶然相互作用，在測(cè)量期間反向施加電壓的極性并觀察再捕獲事件(recaptureevent)。為了進(jìn)一步探究該體系，進(jìn)行一系列SS-納米孔測(cè)量，其中，針對(duì)恒量(1μM)的bio90滴定MS。在所有探究的電壓內(nèi)，測(cè)量的事件頻率急劇升高達(dá)到1:1的摩爾比(圖2a)。然而，從一達(dá)到8:1(MS:bio90)的摩爾比，另外的MS沒(méi)有進(jìn)一步升高事件頻率。這是限制供應(yīng)形成核蛋白質(zhì)絡(luò)合物所需的ds-DNA的結(jié)果；蛋白質(zhì)具有極低的頻率(～10-5s-1)以及各種寡核苷酸僅包含單個(gè)生物素部分，所以預(yù)期以等摩爾濃度或在等摩爾濃度以上結(jié)合溶液中的幾乎所有的bio90。比較易位結(jié)果與在相同化學(xué)計(jì)量范圍內(nèi)通過(guò)MS和bio90進(jìn)行的電泳遷移試驗(yàn)(EMSA)，觀察到驚人類似的趨勢(shì)(圖2b)。這些數(shù)據(jù)支持對(duì)于混合物觀察到的實(shí)際上所有的易位事件對(duì)應(yīng)于MS-bio90絡(luò)合物的結(jié)論。通過(guò)對(duì)照測(cè)量提供了該方法高度特異性的另外證據(jù)，在對(duì)照測(cè)量中，與MS溫育的非生物素化的dsDNA產(chǎn)生可忽略的事件頻率，等于單獨(dú)的bio90。改性的寡核苷酸的選擇性量化：在圖3中，檢查最高達(dá)1:1的摩爾比的事件頻率并發(fā)現(xiàn)與施加電壓的線性相關(guān)性。這意味著針對(duì)MS-bio90絡(luò)合物的捕獲過(guò)程由擴(kuò)散而不是由與孔的相互作用支配，這與之前的研究一致。重要地，觀察到的趨勢(shì)提供了量化溶液中的MS-bio90絡(luò)合物的途徑，因?yàn)槭录l率可以隨分子濃度改變。因?yàn)樵诒倔w系中觀察到的幾乎所有的事件唯一歸因于絡(luò)合物的易位，所以圖3中的線性擬合將溶液中的MS-bio90的濃度與給定電壓下產(chǎn)生的具體的事件頻率聯(lián)系起來(lái)。迄今在限于蛋白質(zhì)的方案中進(jìn)行了所描述的測(cè)量(MS:bio90<1:1)，所以測(cè)量的事件頻率有助于未結(jié)合的bio90的背景下的MS-bio90絡(luò)合物的量化。然而，原則上也可將相同的方法用于量化與非生物素化的DNA的多相溶液中的生物素化的寡核苷酸。為了探究這種可能性，在由第三者制備的兩個(gè)樣品上執(zhí)行盲試。這些樣品中的每個(gè)包含混合至1μM的總濃度(等于以上所描述的測(cè)量的總濃度)的生物素化的和非生物素化的90bpds-DNA的不同混合物。為了確保所有bio90絡(luò)合，溫育兩份溶液與4μM的濃度的MS。如在之前的部分中描述的，單獨(dú)的MS產(chǎn)生可忽略的可測(cè)量事件數(shù)，所以過(guò)多的蛋白質(zhì)沒(méi)有干擾測(cè)量。如所預(yù)期的，對(duì)于兩個(gè)樣品，SS-納米孔分析顯示了施加電壓和事件頻率之間的線性關(guān)系。比較由兩個(gè)盲樣得到的事件頻率與現(xiàn)有的測(cè)量數(shù)據(jù)(圖4)得出每個(gè)中對(duì)于bio90濃度的值：樣品1中的850±35nM和樣品2中的520±20nM。顯著地，這些實(shí)驗(yàn)確定的濃度分別與800±20和480±20nM的預(yù)留值(preparedvalue)相當(dāng)一致。這些結(jié)果表明我們的SS-納米孔方法獨(dú)一無(wú)二地能夠選擇性量化具有單核苷酸生物素變體的DNA，甚至在混合樣品中。方法SS-納米孔設(shè)備制作和電氣測(cè)量使用在WO2012/170499中別處所描述的技術(shù)制作納米孔。簡(jiǎn)要地，將掃描氦離子顯微鏡(CarlZeissOrionPlus)的波束聚集在硅支撐片中懸掛的氮化硅薄膜片(厚度30nm)上。將校準(zhǔn)的暴露時(shí)間用于研磨具有7.3-7.7nm范圍內(nèi)直徑的納米孔。然后將包括單孔的支撐片定位在其中流體通向膜的兩側(cè)的定制流動(dòng)池中。在流動(dòng)池的任一側(cè)引入測(cè)量溶液(900mMNaCl和6mMPBS緩沖液)，并將Ag/AgCl電極浸漬在該溶液中。使用電氣測(cè)量(Axopatch200B)來(lái)驗(yàn)證設(shè)備表現(xiàn)出低RMS噪音(一般<20pA)和匹配校準(zhǔn)的納米孔直徑的線性電流-電壓特征。通過(guò)用包含生物分子的測(cè)量溶液置換設(shè)備的一側(cè)的溶液進(jìn)行易位測(cè)量。記錄200kHz帶寬下的電導(dǎo)系數(shù)并用四極貝塞耳濾波器在100kHz下過(guò)濾。通過(guò)定制軟件進(jìn)行分析，通過(guò)該軟件我們將另外的25kHz的低通濾波器應(yīng)用于所有測(cè)量。將用于分析的事件閾值設(shè)定在4標(biāo)準(zhǔn)偏差處，并僅考慮12-2000μs持續(xù)時(shí)間的事件。生物分子購(gòu)買(集成DNA技術(shù),Coralville,IA)具有以下序列的Bio90寡核苷酸：TGTATACCATGGCCAGGATCCTGGGCCATCTGGTATBGTAATTCATAAAGAATTCTCATTCTGCAGGTGCACATGTTAACACTAGTCGTGA。TB表示單個(gè)內(nèi)部生物素化的dT。相對(duì)鏈(形成dsDNA)不包含改性的核苷酸。用于混合物(盲測(cè))的非生物素化的寡核苷酸具有相同的序列但是不具有生物素部分。采用的鏈霉親和素變體(SAe1D3)包含一個(gè)活性生物素結(jié)合位點(diǎn)且是由Howarth實(shí)驗(yàn)室(牛津大學(xué))供應(yīng)的。該突變體蛋白質(zhì)(54.5kDa)保持與野生型鏈霉親和素類似的結(jié)合親和力和穩(wěn)定性，并包含用于分離的六谷氨酸標(biāo)記物，該六谷氨酸標(biāo)記物在可比較的pH條件下賦予-17.1e的負(fù)電荷。電泳遷移率變動(dòng)分析在室溫下以0:1至8:1(MS:bio90)范圍內(nèi)的摩爾比溫育MS與bio90持續(xù)20分鐘。然后將混合物負(fù)載到含有用于可視化的溴化乙錠的1.5％瓊脂糖凝膠上。將電泳單元的緩沖液儲(chǔ)存器浸沒(méi)在冰浴中以使蛋白質(zhì)-DNA絡(luò)合物的分解最小化。實(shí)施例2-雙鏈DNA的選擇性檢測(cè)和量化表明由于通過(guò)兩類DNA分子賦予的阻力的改變區(qū)分生物素化形式的dsDNA和ssDNA的能力。通過(guò)在MS存在下通過(guò)納米孔分析34堿基對(duì)(bp)單生物素化的寡核苷酸的兩個(gè)單鏈(ss)和雙鏈(ds)變型表明了該效果。如圖5所示，針對(duì)dsDNA-MS觀察到事件頻率的顯著升高，且針對(duì)ssDNA-MS沒(méi)有觀察到提高?；谠摻Y(jié)果，可以將生物素化的ssDNA采用為可以結(jié)合至生物分子的混合物中的其互補(bǔ)靶序列的序列特異性易位試劑。在包含同源序列的單鏈核酸和四種非同源ss-DNA序列的背景的混合物上測(cè)試34bp生物素化的ssDNA的序列特異性易位能力。將MS引入至混合物中并進(jìn)行熱循環(huán)以促進(jìn)退火。圖6示出了觀察到生物素化的dsDNA-MS的混合絡(luò)合物的易位位置的結(jié)果。重要地，沒(méi)有觀察到未絡(luò)合的ss-DNA和未絡(luò)合的生物素化的ss-DNA-MS易位試劑的易位。實(shí)施例3-ds-DNA的易位特征進(jìn)行一系列SS-納米孔測(cè)量，其中針對(duì)納米孔施加電壓和150bpds-DNA鏈的濃度，測(cè)量具有用生物素酶法標(biāo)記的單羥基甲基胞嘧啶以及隨后結(jié)合至MS的150bpds-DNA鏈的易位事件頻率。納米孔結(jié)構(gòu)和操作參數(shù)與實(shí)施例1中提供的那些一致，其中施加電壓在50-600mV范圍內(nèi)。圖7示出了ds-DNA-生物素-MS易位事件頻率隨電壓升高而升高的測(cè)試結(jié)果。為了比較，測(cè)試沒(méi)有采用生物素-MS易位試劑構(gòu)造的150bpds-DNA鏈，且其不能導(dǎo)致易位響應(yīng)。還探測(cè)了易位事件頻率與ds-DNA-生物素-MS濃度的相關(guān)性。如圖8所示，在200mV的恒定施加電壓下，易位事件頻率通常隨ds-DNA-生物素-MS濃度線性改變。圖8的陰影部分表示本底噪聲。還探究了易位事件頻率與ds-DNA長(zhǎng)度的相關(guān)性。如圖9所提供的，易位頻率表現(xiàn)出與ds-DNA長(zhǎng)度的基本線性的相關(guān)性。通過(guò)建立的這些關(guān)系，本文所描述的方法提供了用于表征和量化生物分子(包括核酸)的有利工具。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的各種目的，對(duì)本發(fā)明的各種實(shí)施方式進(jìn)行了描述。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，這些實(shí)施方式僅僅說(shuō)明了本發(fā)明的原理。在不違背本發(fā)明的精神和范圍的情況下，對(duì)本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員，許多的修改和調(diào)整將是易于顯而易見的。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3