本發(fā)明涉及用于通過(guò)不完全抗體確定血型抗原、特別地用于同時(shí)確定血型抗原的裝置及方法。

現(xiàn)有技術(shù)

在血型血清學(xué)診斷中，通常檢測(cè)特別地與輸血或新生兒溶血性疾病有關(guān)的重要參數(shù)。這尤其包括檢測(cè)紅細(xì)胞表面上血型特征性抗原。在血小板、粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞上還發(fā)現(xiàn)了更重要的抗原系統(tǒng)，該抗原系統(tǒng)同樣在輸血和/或移植中起作用。

已知的是，為了確定血型抗原，將待測(cè)試的人(捐贈(zèng)者或接受者)的紅細(xì)胞與包含血型特異性抗體的試劑放在一起。測(cè)試通常是液體測(cè)試，其中測(cè)試批次通過(guò)將包含紅細(xì)胞的樣品與包含針對(duì)特定血型特征的抗體的樣品混合來(lái)制備。然后將測(cè)試批次在限定的條件下孵育限定的時(shí)間段，并且當(dāng)孵育完成時(shí)或直接在離心步驟之后，在視覺(jué)上或通過(guò)光學(xué)方法檢查批次的可能的紅細(xì)胞凝集或吸附。血型血清學(xué)中的主要終點(diǎn)測(cè)量仍然是血細(xì)胞凝集。直接凝集抗體在血型血清學(xué)中還被稱(chēng)為完全抗體(complete antibody)。不能直接凝集紅細(xì)胞的抗體在血型血清學(xué)中類(lèi)似地被稱(chēng)為不完全抗體(incomplete antibody)。

從WO 2005/005991中已知使用側(cè)流測(cè)試(lateral flow test)形式同時(shí)確定血型抗原。WO 2005/005991的實(shí)施例公開(kāi)了通過(guò)IgM抗體確定血型抗原，IgM抗體是完全抗體并直接導(dǎo)致血細(xì)胞凝集。然而，該WO說(shuō)明書(shū)未公開(kāi)借助于側(cè)流測(cè)試使用不完全抗體確定血型抗原。

側(cè)流測(cè)試現(xiàn)今廣泛用作快速測(cè)試，例如作為妊娠測(cè)試，用于確定感染標(biāo)志物或作為藥物篩選物。側(cè)流測(cè)試布置由固體載體、分離膜及吸收劑吸收區(qū)組成，其中將用于待測(cè)試樣品的裝載區(qū)施加至所述固體載體，結(jié)合元件例如捕獲抗體或抗原被結(jié)合在所述分離膜上，并且在所述分離膜上可檢測(cè)結(jié)合反應(yīng)，所述吸收劑吸收區(qū)允許待測(cè)試樣品流過(guò)所述分離膜。

常規(guī)側(cè)流測(cè)試的測(cè)試膜通常被描述為具有層析樣分離。樣品中的分析物特異性地結(jié)合至固定在膜中的結(jié)合元件，所述結(jié)合元件通常以一個(gè)位于另一個(gè)之后或者一個(gè)位于另一個(gè)之上的條帶被布置作為指示物區(qū)。通過(guò)指示物顆粒使結(jié)合復(fù)合物可見(jiàn)，指示物顆粒通常已經(jīng)以在綴合物釋放墊中的干燥形式存在于布置中。綴合物釋放墊通常被設(shè)置在裝載區(qū)和膜之間。預(yù)涂覆的有色指示物顆粒，例如，用針對(duì)所尋求的分析物的抗體來(lái)涂覆。

現(xiàn)今在對(duì)患者和對(duì)捐贈(zèng)者的輸血前測(cè)試中必須常規(guī)地澄清的最重要的血型特征為：A、B、D、C、E、c、e、Cw、K、k、Jka、Jkb、Fya、Fyb、M、N、S、s、P1、Lea、Leb、Kpa、Kpb、Lua、Lub。待測(cè)試的抗原或抗原表位為，例如，ABO血型系統(tǒng)的那些，Rh、Kell、Lewis-Hh、Duffy-Kidd、MNS、Lutheran及P系統(tǒng)的那些，血型系統(tǒng)Diego、Yt、Scianna、Dombrock、Colton、Chido/Rodgers、Gerbich、Cromer、Knops、Landsteiner-Wiener、Xg、Kx、Indian、Ok、Raph、John Milton Hagen、Langereis、Sid、FORS、JR和/或LAN的那些，特別是A1、A2、AB、B、D、C、c、E、e、Cw、K、k、M、N、S、s、Jka、Jkb、Fya、Fyb、Kpa、Kpb、Jsa、Jsb、Lea、Leb、Lua、Lub、P1、I、H、Xga、U、Vw、Wra、Lan、Vel、Dia和/或Mia。

由于紅細(xì)胞的負(fù)的凈表面電荷及由此表現(xiàn)的ζ電位，紅細(xì)胞在細(xì)胞之間具有約300埃的天然統(tǒng)計(jì)學(xué)最小距離。由于分子尺寸，該最小距離可通過(guò)生理學(xué)介質(zhì)中的IgM類(lèi)抗體橋接，但天然并不通過(guò)IgG類(lèi)抗體橋接。這意味著，通常，在血型血清學(xué)中僅IgM類(lèi)抗體可用于通過(guò)血細(xì)胞凝集的直接終點(diǎn)測(cè)量。直接凝集抗體在血型血清學(xué)中還被稱(chēng)為完全抗體(大部分IgM抗體為完全抗體)。

根據(jù)目前的現(xiàn)有技術(shù)，血型通常不能通過(guò)直接血細(xì)胞凝集通過(guò)IgG抗體來(lái)檢測(cè)。不能直接凝集紅細(xì)胞的抗體在血型血清學(xué)中類(lèi)似地被稱(chēng)為不完全抗體(大部分IgG抗體為不完全抗體)。

這導(dǎo)致以下情形：需要根據(jù)是(單克隆)IgM或者另一方面是單克隆IgG或還是多克隆抗體可用于檢測(cè)特定血型特性而用所謂的不同相(phase)及反應(yīng)時(shí)間和溫度進(jìn)行操作，這使得協(xié)調(diào)的或相應(yīng)的操作程序更困難。

如果IgM抗體是可用的，用血細(xì)胞凝集作為終點(diǎn)的直接確定經(jīng)常是可能的，而不需混合另外的抗體或增強(qiáng)劑或蛋白水解酶且不需孵育(立即旋轉(zhuǎn))。利用廣泛使用的凝膠技術(shù)，孵育對(duì)于此類(lèi)測(cè)試的性能不是必需的；僅需用移液器將包含待測(cè)試的紅細(xì)胞和抗體試劑的反應(yīng)混合物吸取進(jìn)凝膠卡的裝載區(qū)，并在中性生理介質(zhì)(換言之，不包含抗體的生理介質(zhì))中離心9-10分鐘(例如來(lái)自Diagnostic Grifols的DG凝膠中性卡(DG Gel Neutral Card))。在相同技術(shù)的另一變化形式中，IgM類(lèi)的血型特異性抗體已經(jīng)被引入凝膠基質(zhì)中。然后僅需用移液器將待測(cè)試的紅細(xì)胞吸取進(jìn)凝膠卡的裝載區(qū)(例如來(lái)自Diagnostic Grifols的DG Gel ABO RH(2D))。

如果可用于確定特定血型特征的抗體不屬于IgM類(lèi)，則需要技術(shù)變化/相變，以使血細(xì)胞凝集可能地作為終點(diǎn)。例如，對(duì)于以上提及的特征的以下特征，情況就是這樣，根據(jù)目前現(xiàn)有技術(shù)對(duì)于其沒(méi)有商購(gòu)可得的IgM抗體是可用的：k、Fya、Kpa、Kpb和Lua。以下另外的特征同樣是感興趣的，諸如Dia、Jsa、Jsb、Coa、Cob、Wra、Xga。商業(yè)單克隆IgM抗體不可用于檢測(cè)這些抗原的任一種。

由于IgG抗體通常不能克服由于天然排斥而存在于兩個(gè)紅細(xì)胞之間的距離，與抗原特異性IgG抗體的反應(yīng)僅可實(shí)現(xiàn)對(duì)于特定抗原為陽(yáng)性的細(xì)胞的敏化(換言之，抗體結(jié)合，而不是血細(xì)胞凝集，因此無(wú)診斷終點(diǎn))，無(wú)可見(jiàn)的血細(xì)胞凝集終點(diǎn)，這轉(zhuǎn)而對(duì)簡(jiǎn)單的視覺(jué)診斷檢測(cè)是必需的：如果，例如，將攜帶血型特征Duffy a(Fya)的紅細(xì)胞與IgG類(lèi)抗-Fya抗體孵育，則抗體-抗原反應(yīng)(敏化)發(fā)生，但這不導(dǎo)致可見(jiàn)的血細(xì)胞凝集終點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，敏化的細(xì)胞必須另外與類(lèi)別特異性抗體(在本情況下為抗IgG)孵育，借助于類(lèi)別特異性抗體，可橋接用IgG抗體敏化的細(xì)胞，并且可產(chǎn)生血細(xì)胞凝集的終點(diǎn)(間接庫(kù)姆斯測(cè)試(Coombs test))。對(duì)于該測(cè)試，廣泛用于該目的的凝膠技術(shù)要求在37℃、10-15分鐘的孵育時(shí)間，隨后在抗人球蛋白或庫(kù)姆斯卡(例如來(lái)自Diagnostic Grifols的DG凝膠庫(kù)姆斯卡(DG Gel Coombs Card))中離心9-10分鐘。

在同樣廣泛使用的管技術(shù)中，在立即旋轉(zhuǎn)的情況下，在離心之前孵育約20秒不是必需的。對(duì)于間接庫(kù)姆斯測(cè)試，首先用血型特異性不完全抗體在37℃持續(xù)15至60分鐘進(jìn)行孵育，其后要求多個(gè)洗滌步驟，然后添加抗人球蛋白試劑，并然后進(jìn)行20秒離心。

因此，需要用于確定標(biāo)準(zhǔn)化的IgM抗體、特別地商購(gòu)可得的IgM抗體對(duì)其是不可得的細(xì)胞結(jié)合分析物、特別地血型抗原的裝置及方法。在標(biāo)準(zhǔn)化的IgM抗體諸如商購(gòu)可得的抗體僅可用于兩種細(xì)胞結(jié)合分析物之一，使得現(xiàn)有技術(shù)中確定兩種分析物要求相變或技術(shù)變化的情況中，對(duì)用于同時(shí)確定至少兩種細(xì)胞結(jié)合分析物的裝置及方法還存在需求。

發(fā)明概述

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于確定液體樣品中的細(xì)胞結(jié)合分析物的裝置，所述裝置包含分離基質(zhì)，所述分離基質(zhì)具有至少一個(gè)指示物區(qū)，其特征在于，所述指示物區(qū)包含針對(duì)所述細(xì)胞結(jié)合分析物的第一抗體或其片段和針對(duì)所述第一抗體的結(jié)合元件，所述第一抗體為不完全抗體。

根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述裝置包含膜(2)、至少一個(gè)指示物區(qū)及至少一個(gè)吸收區(qū)(3)，所述膜(2)具有用于施加液體樣品的裝載區(qū)(5)，所述至少一個(gè)指示物區(qū)能夠與細(xì)胞結(jié)合分析物相互作用，所述至少一個(gè)吸收區(qū)(3)在液體通過(guò)所述指示物區(qū)之后吸收所述液體，所述指示物區(qū)位于所述裝載區(qū)(5)和吸收區(qū)(3)之間，其特征在于，所述指示物區(qū)包含針對(duì)所述細(xì)胞結(jié)合分析物的抗體或其片段和針對(duì)第一抗體的結(jié)合元件，所述第一抗體為不完全抗體。

根據(jù)另外的優(yōu)選實(shí)施方案，裝置包含填充有凝膠材料的管。凝膠技術(shù)被用來(lái)確定紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)。凝膠柱用作過(guò)濾器，其減緩凝集的紅細(xì)胞相對(duì)于未凝集的紅細(xì)胞的遷移或使其停止，并從而實(shí)現(xiàn)分離。根據(jù)本發(fā)明，凝膠的指示物區(qū)包含針對(duì)細(xì)胞結(jié)合分析物的抗體或其片段和針對(duì)第一抗體的結(jié)合元件，所述第一抗體為不完全抗體。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于同時(shí)確定液體樣品中的第一細(xì)胞結(jié)合分析物和第二細(xì)胞結(jié)合分析物的裝置，所述裝置包含膜(2)、至少兩個(gè)指示物區(qū)及至少一個(gè)吸收區(qū)(3)，所述膜(2)具有用于施加液體樣品的裝載區(qū)(5)，所述至少兩個(gè)指示物區(qū)能夠與細(xì)胞結(jié)合分析物相互作用，所述至少一個(gè)吸收區(qū)(3)在液體通過(guò)指示物區(qū)之后吸收所述液體，所述指示物區(qū)位于所述裝載區(qū)(5)和所述至少一個(gè)吸收區(qū)(3)之間，其特征在于，(i)第一指示物區(qū)包含針對(duì)所述第一細(xì)胞結(jié)合分析物的第一抗體或其片段和針對(duì)所述第一抗體的結(jié)合元件，所述第一抗體為不完全抗體，及(ii)第二指示物區(qū)(a)包含針對(duì)所述第二細(xì)胞結(jié)合分析物的第一抗體，所述第一抗體為完全抗體；或(b)包含針對(duì)所述第二細(xì)胞結(jié)合分析物的第一抗體和針對(duì)該抗體的結(jié)合元件，所述第一抗體為不完全抗體。

出人意料地，本申請(qǐng)的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在指示物區(qū)中一起施加第一不完全抗體和針對(duì)該第一抗體的第二抗體，配置具有分離基質(zhì)的裝置是可能的，所述分離基質(zhì)優(yōu)選地呈側(cè)流測(cè)試裝置的膜的形式或作為凝膠基質(zhì)，以這樣的方式，通過(guò)作為第一抗體的不完全抗體確定細(xì)胞結(jié)合分析物是可能的。結(jié)果，首次使得使用分離基質(zhì)諸如側(cè)流測(cè)試裝置來(lái)確定細(xì)胞結(jié)合分析物是可能的，對(duì)于該細(xì)胞結(jié)合分析物，標(biāo)準(zhǔn)化的、諸如商購(gòu)可得的IgM型抗體是不可得的。這導(dǎo)致確定此類(lèi)分析物所需的時(shí)間的顯著縮短，確定此類(lèi)分析物先前通常僅可通過(guò)需要另外的孵育步驟的間接庫(kù)姆斯測(cè)試來(lái)確定。根據(jù)本發(fā)明的程序?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員也是出人意料的，因?yàn)樗麑⒓俣ǎ绠?dāng)使用抗-IgG分子作為第二抗體時(shí)，它們會(huì)被在全血中以高濃度存在的非分析物特異性IgG分子中和。

因此，在現(xiàn)有技術(shù)中同時(shí)確定兩種血型抗原(換言之，在單個(gè)側(cè)流裝置中或在具有用于確定多個(gè)參數(shù)的多個(gè)凝膠管的單個(gè)凝膠卡中)，第一血型抗原通過(guò)IgG抗體確定，且第二血型抗原通過(guò)IgM抗體確定，而不需要技術(shù)變化或相變是不可能的。因此，本發(fā)明提供了使用單個(gè)側(cè)流設(shè)置的同時(shí)確定的優(yōu)勢(shì)，其僅需要單個(gè)勻相方法(homogeneous method)步驟，而不需要不同的介質(zhì)和不同的孵育。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了一種用于制備以上裝置的方法，所述方法包括：

施加針對(duì)細(xì)胞結(jié)合分析物的第一抗體或其片段和針對(duì)所述第一抗體的第二抗體或其片段，其中所述第一抗體為不完全抗體。

根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了一種用于確定至少一種細(xì)胞結(jié)合分析物的方法，所述方法包括：

在指示物區(qū)中施加針對(duì)細(xì)胞結(jié)合分析物的第一抗體或其片段和針對(duì)所述第一抗體的結(jié)合元件，其中所述第一抗體為不完全抗體。

根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的裝置用于分析血液，特別地用于確定血型抗原或抗原表位的用途。

發(fā)明詳述

定義

關(guān)于本發(fā)明，以下措辭(expression)具有下文給出的含義：

措辭“完全抗體”意指導(dǎo)致紅細(xì)胞在生理鹽水介質(zhì)中凝集的抗體。完全抗體包括IgM抗體或其片段，條件是片段仍能夠凝集。IgM抗體可以為單克隆的或多克隆的。

措辭“不完全抗體”意指當(dāng)與紅細(xì)胞孵育時(shí)不導(dǎo)致紅細(xì)胞凝集的抗體。不完全抗體包括IgG抗體、IgA抗體、IgD抗體及IgE抗體，包括它們的亞類(lèi)或抗體片段，條件是片段仍能夠結(jié)合針對(duì)整個(gè)抗體的第二抗體。這些抗體可以為單克隆的或多克隆的。制備各種類(lèi)型的抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。

措辭“細(xì)胞結(jié)合分析物”意指與細(xì)胞，優(yōu)選地人細(xì)胞，特別地紅細(xì)胞的表面天然地結(jié)合的任何分子。它們包括，例如，受體或血型抗原，血型抗原是優(yōu)選的。

措辭“血型抗原”包括以下的抗原：ABO血型系統(tǒng)，Rh、Kell、Lewis-Hh、Duffy-Kidd、MNS、Lutheran及P系統(tǒng)，血型系統(tǒng)Diego、Yt、Scianna、Dombrock、Colton、Chido/Rogers、Gerbich、Cromer、Knops、Landsteiner-Wiener、Xg、Kx、Indian、Ok、Raph、John Milton Hagen、Langereis、Sid、FORS、JR和/或LAN的那些，特別是A1、A2、AB、B、D、C、c、E、e、Cw、K、k、M、N、S、s、Jka、Jkb、Fya、Fyb、Kpa、Kpb、Jsa、Jsb、Lea、Leb、Lua、Lub、P1、I、H、Xga、U、Vw、Wra、Lan、Vel、Dia和/或Mia。

側(cè)流裝置的制備

在DE 10330982 A1和WO 2005/005986中描述了原則上適合于制備側(cè)流裝置的方法，但該方法如下文指示的被改變。DE 10330982 A1和WO 2005/005986的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。

用于制備根據(jù)本發(fā)明的裝置的方法包括：

在指示物區(qū)中施加針對(duì)細(xì)胞結(jié)合分析物的第一抗體或其片段和針對(duì)所述第一抗體的結(jié)合元件，其中所述第一抗體為不完全抗體。

針對(duì)細(xì)胞結(jié)合分析物的第一抗體和針對(duì)所述第一抗體的結(jié)合元件可以一起或彼此單獨(dú)地被施加至指示物區(qū)的區(qū)域中的膜。當(dāng)它們彼此單獨(dú)地施加時(shí)，優(yōu)選的是，在施加結(jié)合元件之前，在施加第一抗體之后進(jìn)行干燥步驟。第一抗體的濃度根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定，并且取決于對(duì)細(xì)胞結(jié)合分析物的親和力。結(jié)合元件的濃度可基于第一抗體的濃度及其性質(zhì)通過(guò)測(cè)試系列優(yōu)化。

待確定的分析物優(yōu)選地為血型抗原。第一抗體特別優(yōu)選地針對(duì)選自血型抗原A、B、AB、D、C、E、c、e、Cw、K、k、Jka、Jkb、Fya、Fyb、M、N、S、s、P1、Kpa、Kpb、Lua、Lub、Lea、Leb、Mia、Dia、Jsa、Jsb、Coa、Cob、Wra及Xga的細(xì)胞結(jié)合分析物，特別優(yōu)選地針對(duì)k、S、Fya、Kpa、Kpb、Lua、Lea、Leb、Mia、Lua、Lub、Dia、Jsa、Jsb、Coa、Cob、Wra及Xga。第一抗體在這種情況下為不完全抗體，優(yōu)選地為IgG抗體或IgA抗體，特別優(yōu)選地為IgG抗體。例如，可使用以下抗體：抗-Fya：克隆P3TIM(Merck Millipore,VL)；抗-S：克隆P3S13JS123(Diagast,參考78007)；抗-k：克隆P3A118OL67(Merck Millipore,FA)；以及抗-D：克隆ESD-1(Alba Bioscience)。

結(jié)合元件優(yōu)選地選自針對(duì)第一抗體的抗體或其片段以及凝集素或其片段。針對(duì)第一抗體的抗體特別優(yōu)選地為抗IgG抗體?？?IgG抗體是商購(gòu)可得的，特別優(yōu)選的是克隆MS-278(Merck Millipore)且作為多克隆抗體，例如，單型(mono-type)或抗-IgG抗人球蛋白(Medion Grifols Diagnostics)。當(dāng)?shù)谝豢贵w為IgA抗體時(shí)，第二抗體為抗-IgA抗體。抗-IgA抗體是商購(gòu)可得的?？?IgG或抗-IgA抗體可以為IgM型或IgG型，IgM類(lèi)的單克隆抗-IgG是優(yōu)選的。優(yōu)選的凝集素為蛋白A和蛋白G。

當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的第二方面制備用于同時(shí)確定第一細(xì)胞結(jié)合分析物和第二細(xì)胞結(jié)合分析物的裝置時(shí)，(i)第一指示物區(qū)包含針對(duì)第一細(xì)胞結(jié)合分析物的第一抗體或其片段和針對(duì)所述第一抗體的結(jié)合元件，其中所述第一抗體為不完全抗體，以及

(ii)第二指示物區(qū)包含(a)針對(duì)所述第二細(xì)胞結(jié)合分析物的第一抗體，其中所述第一抗體為完全抗體；或(b)針對(duì)所述第二細(xì)胞結(jié)合分析物的第一抗體和針對(duì)該抗體的結(jié)合元件，其中第一抗體為不完全抗體。

第一細(xì)胞結(jié)合分析物優(yōu)選地選自血型抗原k、Fya、Kpa、Kpb、Lua、Lub、Mia、Dia、Jsa、Jsb、Coa、Cob、Wra、Xga及S，且第二細(xì)胞結(jié)合分析物優(yōu)選地選自A、B、AB、C、D、E、c、e、Cw、K、Lea、Leb、Jka、Jkb、Fyb、P1及s。

根據(jù)可選方案(a)的針對(duì)第二細(xì)胞結(jié)合分析物的第一抗體為完全抗體，特別是IgM抗體，其直接導(dǎo)致血細(xì)胞凝集。根據(jù)可選方案(b)的針對(duì)第二細(xì)胞結(jié)合分析物的第一抗體為不完全抗體，優(yōu)選地，根據(jù)可選方案(b)的第一抗體為IgG抗體或IgA抗體。根據(jù)可選方案(b)的針對(duì)第一抗體的結(jié)合元件允許通過(guò)血細(xì)胞凝集進(jìn)行確定。結(jié)合元件優(yōu)選地為IgG抗體或IgM抗體?？蛇x地，還可使用凝集素諸如蛋白A或蛋白G。

根據(jù)本發(fā)明使用的裝置的膜為多孔膜。優(yōu)選的膜材料為，例如，硝化纖維素(例如來(lái)自Sartorius的UniSart、來(lái)自Millipore的HiFlow、來(lái)自Whatman Schleicher&Schuell的Whatman、AE99或FF85/100)、聚乙烯(來(lái)自Porex Corporation的Lateral Flo)或尼龍(來(lái)自CUNO的Novylon)。膜優(yōu)選地具有盡可能大的孔徑，因?yàn)槟さ母呖紫堵蚀龠M(jìn)特別地待確定的樣品的細(xì)胞組分，例如紅細(xì)胞滲透進(jìn)多孔結(jié)構(gòu)中。使用吸收劑膜是特別有利的。然而，根據(jù)本發(fā)明的裝置并不局限于那些特性。優(yōu)先考慮具有高毛細(xì)管流速的任何膜，其中毛細(xì)管流速為染料溶液覆蓋在給定膜上的40mm距離所需的時(shí)間[s]。特別優(yōu)選毛細(xì)管流速為<100的膜。

在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，密封元件被布置在相對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的裝置的裝載區(qū)的流動(dòng)方向下游的多孔膜上。使用被放置在多孔膜上的兩維或三維密封元件，并且用該密封元件創(chuàng)建與多孔膜的表面的剩余部分分離的樣品分配區(qū)。根據(jù)本發(fā)明，密封元件主要用作液體屏障并允許樣品液體和測(cè)試試劑定向分布進(jìn)多孔膜中。根據(jù)本發(fā)明，密封元件進(jìn)一步密封樣品分配區(qū)，以防止液體不期望地進(jìn)入側(cè)流裝置的其他區(qū)域。

密封元件的優(yōu)選的實(shí)施方案為網(wǎng)形或槽形或漏斗形。密封元件的形成由用于制造該密封元件所使用的材料通過(guò)切削加工過(guò)程實(shí)現(xiàn)。在漏斗形或槽形的情況下，密封元件裝備有內(nèi)開(kāi)口，該內(nèi)開(kāi)口的優(yōu)選的變型為圓形、正方形或矩形形狀，在漏斗形的情況下，內(nèi)開(kāi)口朝向密封元件的下側(cè)(膜接觸側(cè))錐形化。用于密封元件的優(yōu)選材料為不吸水(疏水性)的材料。在特定的實(shí)施方案中，材料被涂覆在具有粘合劑膜，例如壓敏或自粘丙烯酸酯粘合劑的一側(cè)上。如此，密封元件可直接結(jié)合至多孔膜的表面?？蛇x地，密封元件可被連接，例如粘合性地結(jié)合至側(cè)流殼體，在該實(shí)施方案中，側(cè)流殼體按壓在多孔膜的表面上的密封元件，并從而實(shí)現(xiàn)密封元件的功能。

用于形成二維密封元件的優(yōu)選的材料為任何形式的粘合帶或粘合箔(例如來(lái)自Beiersdorf AG的Tesa 4124、來(lái)自Adhesives Research的ARcare 7815)。用于形成三維密封元件的優(yōu)選的材料為具有不同材料厚度，優(yōu)選地3-5mm的柔性閉孔彈性體材料或柔性硅酮材料(例如來(lái)自Pitzner的EPDM140海綿橡膠、來(lái)自Castan的硅橡膠或固體橡膠，硬度40度或更少)。

在另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，由具有例如20個(gè)單獨(dú)腔(槽形)的單件(one piece)構(gòu)成的多個(gè)密封元件被布置在一個(gè)膜上。

作為該設(shè)計(jì)的結(jié)果，根據(jù)本發(fā)明的裝置能夠吸收包含細(xì)胞的液體樣品，諸如全血，從而不過(guò)濾掉細(xì)胞。此外，密封元件允許將大樣品體積施加至多孔膜(裝載區(qū))而不使其溢流。如此，密封元件支持多孔膜的吸收性能的使用。此外，密封元件確保了定向性樣品流動(dòng)。然而，根據(jù)本發(fā)明的裝置可在具有或不具有密封元件的情況下很好地起作用。

對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的裝置的吸收區(qū)域(吸收墊)，優(yōu)先考慮機(jī)械穩(wěn)定的材料，優(yōu)選地具有20-30g/100cm²的吸水能力的機(jī)械穩(wěn)定的材料(例如Millipore)。根據(jù)本發(fā)明的裝置的吸收墊和側(cè)流膜之間的接觸通過(guò)壓力和與多孔膜的重疊來(lái)建立。吸收墊在膜上的精確定位通過(guò)將吸收墊粘合性地結(jié)合至攜帶側(cè)流膜的襯背板上來(lái)實(shí)現(xiàn)。

在另外的實(shí)施方案中，出于機(jī)械加固的目的，將根據(jù)本發(fā)明的裝置的組件施加至基底或襯背板。然而，根據(jù)本發(fā)明的裝置可在具有或不具有襯背板的情況下起作用。優(yōu)先考慮不吸水的、優(yōu)選地具有100μm或更大的材料厚度的機(jī)械穩(wěn)定材料，該材料被涂覆在具有粘合劑膜的一側(cè)或兩側(cè)，粘合劑例如壓敏或自粘丙烯酸酯粘合劑(例如0.005"聚酯W/GL-187,G&L)。多孔膜和吸收墊被固定至襯背板。在粘合在兩側(cè)上的襯背板的情況下，粘合劑第二側(cè)用于將堆疊體(stack)固定至例如在側(cè)流殼體內(nèi)部的另外的表面。

在另外的實(shí)施方案中，具有或不具有根據(jù)本發(fā)明的裝置的組件被施加至其的襯背板的根據(jù)本發(fā)明的裝置被集成在殼體中，由此膜組件彼此壓靠，且殼體支持密封元件的功能。然而，在這種情況下，根據(jù)本發(fā)明的裝置在具有或不具有殼體的情況下也可同樣起作用。

確定方法

該方法通過(guò)施加液體樣品進(jìn)行。液體樣品優(yōu)選地由血液或血液的成分，特別優(yōu)選地全血、紅細(xì)胞濃縮物、凝結(jié)的血液或測(cè)試液體諸如對(duì)照血液組成。在這種情況下，樣品可在施加之前用緩沖液稀釋。

下文將通過(guò)附圖和實(shí)施例更詳細(xì)地解釋本發(fā)明，但不限于此。

圖1為，通過(guò)例示的方式，用于同時(shí)確定血型抗原的測(cè)流測(cè)試的根據(jù)本發(fā)明的裝置的透視圖。在本實(shí)施例中，該裝置由襯背板1、多孔膜2、吸收墊3和密封元件4組成，該密封元件4為二維網(wǎng)狀形式或三維槽狀形式。多孔膜2從而被固定至裝備有壓敏或自粘丙烯酸酯粘合劑的襯背板1。吸收墊3同樣被固定至襯背板1，吸收墊3的部分與多孔膜2重疊。被固定至多孔膜2的上側(cè)的密封元件4將裝載區(qū)5與膜表面的剩余部分分離，并允許樣品液體和測(cè)試試劑定向分配進(jìn)多孔膜2中。指示物區(qū)的區(qū)域6被布置在裝載區(qū)5和多孔膜2的與吸收墊3接觸的區(qū)域之間。

圖2示出了血型抗原Jka、Jkb、Fya、Fyb、S、s、k及P1的成功同時(shí)確定。捐贈(zèng)者為Jka-Jkb+Fya-Fyb+S-s+k+P1+。此處，樣品被施加至位于中間的裝載區(qū)。樣品流動(dòng)通過(guò)位于裝載區(qū)左側(cè)的指示物區(qū)和位于裝載區(qū)右側(cè)的指示物區(qū)。

圖3示出了一方面用針對(duì)血型抗原D、Fya和k的第一IgG抗體和針對(duì)第一抗體的第二抗-IgG抗體的根據(jù)本發(fā)明的方法，與另一方面沒(méi)有第二抗體的比較方法的比較。在右側(cè)，抗-IgG被施加三次作為另外的陰性對(duì)照。圖3a示出了使用的分配計(jì)劃。圖3b至3e示出了使用來(lái)自不同捐贈(zèng)者的樣品獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

實(shí)施例

實(shí)施例1：血型確定

測(cè)試條的制備：

測(cè)試條由位于膜中間的裝載區(qū)、以及在中心裝載區(qū)兩側(cè)的等距離的兩個(gè)指示物區(qū)和兩個(gè)吸收區(qū)組成。將Millipore HiFlow Plus 065類(lèi)型的膜修剪成19x48mm的尺寸(寬度/長(zhǎng)度；x/y)的條，以用于8-條帶至10-條帶設(shè)計(jì)，并粘合性地結(jié)合至襯背板(例如來(lái)自G&L)。測(cè)量為19×17mm并且與膜重疊7mm的兩個(gè)吸收墊(Millipore)粘合性地結(jié)合至遠(yuǎn)離裝載區(qū)的膜的端部。將以下不同血型特異性抗體的溶液的6mm長(zhǎng)的條帶(各0.6μl)使用分配器例如AD3200(Biodot)，施加至指示物區(qū)的區(qū)域，以使得以?xún)蓚€(gè)線性行位移(offset)：

抗-Jka：克隆P3HT7(Diagast，參考78003)；抗-Jkb：克隆P3 143(Diagast，參考78004)；抗-Fya：克隆P3TIM+抗-IgG克隆MS278(Merck Millipore,VL+JZ)；抗-Fyb：克隆SpA264LBg1(Merck Millipore,FF)；抗-S：克隆P3S13JS123+抗-IgG克隆MS278(Diagast，參考78007+Merck Millipore,JZ)；抗-s：克隆P3BER(Merck Millipore,FE)；抗-P1：克隆P3MON2(Merck Millipore,VN)；抗-k：克隆P3A118OL67+抗-IgG克隆MS278(Merck Millipore,FA+JZ)。在配制之前將所有抗體濃縮約10倍。

將抗-Jka抗體放置在裝載區(qū)的左側(cè)的位置x＝3mm/y＝9mm至y＝15中。三種其他抗體(抗-Jkb、抗-Fya和抗-Fyb)與抗-Jka抗體的位置平行以x＝2.5mm的間隔迭代地分配。將抗-S抗體放置在裝載區(qū)的右側(cè)的位置x＝3mm/y＝34mm至y＝40中。三種其他抗體(抗-s、抗-k和抗-P1)相對(duì)抗-S抗體的位置以x＝2.5mm的間隔迭代地分配。

將抗紅細(xì)胞特異性驗(yàn)證抗體(Val＝過(guò)程對(duì)照；抗人RBC的兔IgG級(jí)分，Rockland,209-4139)施加作為相對(duì)于一系列血型特異性抗體的最后條帶位移x＝2.5mm/y＝3mm的點(diǎn)。對(duì)照點(diǎn)(Ctl＝陰性對(duì)照；包含除抗體以外的各種抗體制劑的所有成分)被施加在相對(duì)于Val點(diǎn)位移y＝3mm中。所有的抗體溶液包含1％BSA和9.4％APP3溶液[32.4％(w/v)D(+)-海藻糖二水合物、0.055％(v/v)Genapol PF10、21.8％(v/v)甲醇、PPB緩沖液：15mM磷酸鉀緩沖液/10mM NaCl/0.05％(w/v)NaN₃]。除了抗-P1在具有pH為4的0.01M檸檬酸鹽緩沖液中稀釋以外，將抗體如下在具有pH為7的0.07MTris/HCl緩沖液中稀釋?zhuān)嚎?Jka 1:5、抗-Jkb 1:5、抗-Fya 1:5+抗-IgG 1:25、抗-S 1:5+1:100、抗-s(小(small))1:16.7、抗-k 1:10+抗-IgG 1:100、抗-P11:10以及抗-RBC 1:10。在分配抗體之后，將膜在45℃干燥1小時(shí)并用在聚碳酸酯殼體(Medion Grifols Diagnostics AG)中的密封元件焊合在一起。

測(cè)試設(shè)置：

可將血液樣品采集在包含常規(guī)抗凝劑(例如EDTA、CPDA-1、ACD、檸檬酸鹽)管中或在天然形式的管中。

在測(cè)試管中，將1滴(50μl)抗凝全血與4滴(200μl)稀釋劑F(Medion Grifols Diagnostics)混合，或?qū)?滴紅細(xì)胞沉淀物與8滴(400μl)稀釋劑F混合，或?qū)?滴(100μl)凝固的血液細(xì)胞與2滴稀釋劑F混合。

將兩滴(100μl)所得懸浮液施加至描述的測(cè)試布置的裝載區(qū)。在30秒之后，將6滴(300μl)稀釋劑F施加至裝載區(qū)。在5分鐘之后，讀出結(jié)果并記錄。

結(jié)果：

如果抗-RBC驗(yàn)證點(diǎn)(val)顯示清晰的陽(yáng)性信號(hào)(紅色點(diǎn))并且對(duì)照點(diǎn)(ctl)顯示陰性結(jié)果，則測(cè)試有效。紅色條帶的存在指示測(cè)試的血液樣品對(duì)于特定血型特征為陽(yáng)性的。在裝載區(qū)的對(duì)應(yīng)位置中的條帶的不存在意味著所測(cè)試的血液樣品對(duì)于對(duì)應(yīng)的血型特征為陰性的。

圖2示出了血型抗原Jka、Jkb、Fya、Fyb、S、s、k及P1的成功同時(shí)確定。捐贈(zèng)者為Jka-Jkb+Fya-Fyb+S-s+k+P1+。

實(shí)施例2：借助根據(jù)本發(fā)明的方法和比較例的血型確定

測(cè)試條類(lèi)似于實(shí)施例1來(lái)制備。使用以下抗體：抗-D，克隆ESD-1(Alba)，人IgG；抗-k(cellano)，克隆P3A118OL67(Millipore)，人IgG；抗-Fya，克隆P3TIM(Millipore)，人IgG，且使用以下作為第二抗體：抗-IgG，克隆MS278(Millipore)，小鼠IgM。

圖3a示出了使用的分配計(jì)劃。圖3b至3e示出了用來(lái)自不同捐贈(zèng)者的樣品獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。清楚可見(jiàn)的是，只有借助于針對(duì)血型抗原的IgG類(lèi)的第一抗體和針對(duì)該第一抗體的第二抗體的確定導(dǎo)致清晰可檢測(cè)的條帶，而使用IgG類(lèi)的第一抗體的確定未導(dǎo)致清楚可識(shí)別的條帶。在右側(cè)，抗-IgG被施加三次作為另外的陰性對(duì)照。圖3b至3e示出了在該陰性對(duì)照的情況下未獲得條帶。