本公開整體涉及用于檢測生物樣品中的分析物的側(cè)流免疫測定系統(tǒng)、裝置和方法。更具體地，本公開涉及基于合成線的側(cè)流免疫熒光測定系統(tǒng)、裝置和方法。

背景

診斷學的一個重要領(lǐng)域是使用快速免疫診斷測定來對受試者提供快速、準確且簡單的診斷和檢驗，例如對疾病、病癥、微生物或藥物的檢驗。這種測定的常見形式為側(cè)流免疫測定，側(cè)流免疫測定常用于諸如妊娠測試試劑盒的裝置中。

側(cè)流免疫測定由于其簡單、快速且可靠而廣泛用于自行檢驗以及臨床環(huán)境中，并且涉及用于快速檢測液體樣品中特定分析物的存在的非電方法，例如，如美國專利申請No.2005/0227371中所述。

側(cè)流免疫測定通常涉及將懷疑包含預定分析物的液體樣品施加到多孔載體上，液體樣品然后通過毛細管作用橫穿多孔載體。不同的多孔材料可用于多孔載體，并且可在諸如以下的方面不同：孔尺寸、芯吸或流速、蛋白結(jié)合方面和預處理。基本上，所有的物理活動和化學反應均在多孔載體中進行。將液體樣品施加到多孔載體的取樣端(例如‘近端’或‘潤濕端’)上達測量的時間或體積(例如5秒或2滴)。然后，液體樣品通過毛細管作用沿著多孔載體遷移至‘遠’端或‘干燥’端?？捎昧硗獾脑噭├鏿H試劑或緩沖劑、表面活性劑和/或封閉劑對液體樣品進行預處理以優(yōu)化反應，這些另外的試劑通常浸漬到多孔載體中。可通過使用具有結(jié)合預定分析物的親和力的標記試劑(例如‘檢測試劑’)來‘標記’樣品中的分析物以供檢測。可將樣品在與多孔載體接觸之前進行標記，或替代地，多孔載體可包括‘標記區(qū)’，在標記區(qū)中，樣品調(diào)動已可逆地(暫時地)固定化到多孔載體中的標記試劑。當分析物與調(diào)動的標記試劑反應時，液體樣品和調(diào)動的標記試劑在多孔載體中進一步遷移至檢測區(qū)(例如‘捕獲區(qū)’)，在捕獲區(qū)中，結(jié)合相同分析物的捕獲試劑(例如固定化捕獲抗體)通常以線條的形式固定化到多孔載體。當分析物存在于液體樣品中時，形成呈標記試劑:分析物:捕獲抗體的‘夾心’，并且標記試劑的所得濃度導致出現(xiàn)于檢測區(qū)中的可檢測線條，其指示陽性結(jié)果。任何剩余的樣品液體與其余標記試劑繼續(xù)遷移至對照區(qū)和/或多孔接收區(qū)。未與預定分析物反應并且保留在多孔載體的未結(jié)合的標記試劑促成可降低檢測準確性的背景信號。

硝酸纖維素膜在側(cè)流免疫測定中通常用作多孔載體材料。然而，硝酸纖維素膜材料中存在由制備該材料的方法所引起的某種變異，這可導致測試的準確性和精確性降低。在生產(chǎn)硝酸纖維素膜時，這種導致芯吸速率變化的變異引起再現(xiàn)性問題，其中對于定量測量而言，側(cè)流測試歷來表現(xiàn)不佳，其中測定變異系數(shù)(CV)通常在20％至40％的范圍內(nèi)，如J Agric.Food Chem.2012年11月21日；60(46):11491-7和Anal.Chim.Acta.2013年4月15日；772:75-80中所述。25％的測定CV意指測試結(jié)果的95％置信區(qū)間為平均值+/-50％。在測定樣品中目標分析物的濃度的過程中，此類不良的不精確性不適于準確測量，特別是不適于定量測量，而此類測量可為臨床決策的基礎。不正確的診斷可導致做出不正確的臨床決策，這繼而導致不利的健康結(jié)果。盡管已使用其他類型的多孔材料作為硝酸纖維素膜材料的替代物，但這些材料也通常具有不良的不精確性，特別是在分析物檢測方法依賴于低背景噪聲的情況下。

可使用一系列的方法來標記分析物以及檢測樣品中標記的分析物的存在，例如可使用對預定分析物具有結(jié)合親和力的比色標簽、放射性同位素和熒光標簽。例如，使用比色膠乳珠粒進行標記在美國專利No.5,451,504中已有描述。已知使用可視標記物(例如膠體金標簽)的常規(guī)側(cè)流測試就靈敏度而言表現(xiàn)不佳。當用于檢測樣品中的少量特定分析物的快速診斷測定中時，其他標記技術(shù)也可存在問題。已在一些類型的免疫測定系統(tǒng)中使用熒光標簽，但他們的靈敏度通常受限于天然發(fā)熒光的多孔載體及其組分的背景熒光，或受到未結(jié)合的熒光標簽的存在的限制。

因此，需要鑒別替代的具有改善的側(cè)流免疫測定裝置和系統(tǒng)，所述側(cè)流免疫測定裝置和系統(tǒng)能夠準確、高性價比且快速地實現(xiàn)樣品中目標分析物的檢測。

概述

本公開基于發(fā)明人對側(cè)流免疫測定的研究和開發(fā)，其可用作準確測定樣品中目標分析物的存在的快速且高性價比的診斷工具。

本公開提供基于合成線的免疫熒光測定系統(tǒng)、裝置和方法，所述系統(tǒng)、裝置和方法至少在一些實施方案中可用于目標分析物的定性鑒定和定量測量。發(fā)明人在他們的研究過程中發(fā)現(xiàn)了問題，這些問題與使用側(cè)流免疫熒光測定以及具體而言涉及使用用于結(jié)合并且檢測目標分析物的熒光微粒的測定來確定來自樣品的目標分析物的準確性和水平相關(guān)。本公開因此涉及提供側(cè)流免疫熒光測定裝置，其包括通過毛細管作用用作流體樣品的載體的一個或多個合成聚合物線；和包括所述裝置的系統(tǒng)和方法，所述系統(tǒng)和方法涉及使用用于檢測目標分析物的熒光標記的微粒。

在一個方面，提供一種用于對樣品進行免疫熒光測定的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：

側(cè)流免疫測定裝置，其包括一個或多個合成聚合物線，所述合成聚合物線界定至少樣品裝載區(qū)；檢測區(qū)，其包括對樣品中的預定分析物具有親和力的固定化捕獲試劑；以及任選的中間區(qū)，其設置在樣品裝載區(qū)和捕獲區(qū)之間，其中所述一個或多個合成聚合物線能夠通過毛細管作用將流體樣品從至少樣品裝載區(qū)運載至檢測區(qū)；

熒光檢測試劑，其用于與樣品中的預定分析物結(jié)合以形成熒光標記的分析物，其中所述熒光檢測試劑包含熒光標記的微粒，所述熒光標記的微粒與對樣品中的預定分析物具有親和力的分析物結(jié)合試劑締合、配位或連接；和

熒光激發(fā)源和檢測器，其用于檢測預定分析物，所述預定分析物與熒光檢測試劑結(jié)合并且通過捕獲試劑固定化到裝置的檢測區(qū)中。

所述系統(tǒng)可用于檢測樣品中目標分析物的存在或水平。在一個實施方案中，所述系統(tǒng)用于定量測量樣品中目標分析物的水平(例如濃度)。目標分析物的檢測或測量可用于診斷病癥或作為臨床測定的基礎。

免疫熒光測定系統(tǒng)可為一步免疫熒光測定系統(tǒng)。免疫熒光測定系統(tǒng)可為濕式免疫熒光測定系統(tǒng)，其中在樣品接觸裝置的樣品裝載區(qū)之前將樣品與熒光檢測試劑混合。免疫熒光測定系統(tǒng)可為干式免疫熒光測定系統(tǒng)，其中免疫熒光測定裝置包括熒光檢測試劑。在一個實施方案中，免疫熒光測定裝置的一個或多個合成聚合物線界定中間區(qū)，所述中間區(qū)設置在樣品裝載區(qū)和檢測區(qū)之間。在另一個實施方案中，熒光檢測試劑可逆地固定化到裝置的中間區(qū)上以用于標記檢測區(qū)中供檢測的預定分析物。

樣品可用選自pH試劑或緩沖劑、表面活性劑、過濾劑和封閉劑的一種或多種試劑進行預處理。裝置的樣品裝載區(qū)可包括選自pH試劑或緩沖劑、表面活性劑、過濾劑和封閉劑的一種或多種試劑。所述一種或多種試劑可固定化到樣品裝載區(qū)上。檢測區(qū)可包括包含固定化捕獲試劑的一個或多個線條。捕獲試劑可為捕獲抗體。一個或多個合成聚合物線或裝置還可包括一個或多個多孔接收區(qū)或另外的區(qū)，例如對照區(qū)、試劑區(qū)、散布區(qū)、封閉區(qū)或過濾區(qū)、阻擋區(qū)或緩沖區(qū)。

在一個實施方案中，分析物結(jié)合試劑為對預定目標分析物具有結(jié)合親和力的抗體。在另一個實施方案中，捕獲試劑為對預定目標分析物具有結(jié)合親和力的固定化捕獲抗體。

免疫熒光測定系統(tǒng)可提供單一或多重測定。例如，免疫測定裝置可包括用于檢測樣品中的兩種或更多種預定分析物的多個線。

在一個實施方案中，一個或多個合成聚合物線由選自聚酰胺、聚酯、聚醚、聚烯烴、聚碳酸酯和聚氨酯的合成聚合物形成。在另一個實施方案中，一個或多個合成聚合物線由合成聚酯形成。聚酯可選自聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚羥基鏈烷酸酯(PHA)、聚羥基丁酸酯(PHB)、聚己二酸乙二醇酯(PEA)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚(3-羥基丁酸酯-共-3-羥基戊酸酯(PHBV)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚對苯二甲酸丁二醇酯(PBT、聚對苯二甲酸丙二醇酯(PTT)和聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)。在另一個實施方案中，一個或多個合成聚合物線由合成聚酰胺形成。聚酰胺可為尼龍，例如選自尼龍-6,6；尼龍-6；尼龍-6,9；尼龍-6,10；尼龍-6,12；尼龍-11；尼龍-12和尼龍-4,6的尼龍。

熒光標記的微?？蔀闊晒鈽擞浀木酆衔镂⒘！？捎脽晒庀⊥两饘俳j合物對微粒進行熒光標記。在一個實施方案中，熒光標記的微粒包括與熒光稀土金屬絡合物締合、配位或連接的聚合物微粒。稀土金屬絡合物可包含鑭系金屬。鑭系金屬可選自銪、鋱和釤。在一個實施方案中，稀土金屬為銪。熒光稀土金屬絡合物可為銪、鋱和釤的金屬螯合物。

聚合物微粒可具有在100至5000、150至2000、200至1000或300至600范圍內(nèi)的平均直徑(以nm計)。聚合物微粒的平均直徑(以nm計)可為至少約100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000。在一個實施方案中，聚合物微粒的平均直徑為至少約200nm。

在另一方面，提供一種用于對樣品進行免疫熒光測定的側(cè)流免疫熒光測定裝置，其中所述裝置包括一個或多個合成聚合物線，所述合成聚合物線界定至少樣品裝載區(qū)；檢測區(qū)，其包括對樣品中的預定分析物具有親和力的固定化捕獲試劑；以及設置在樣品裝載區(qū)和捕獲區(qū)之間的中間區(qū)，所述中間區(qū)包括用于與樣品中的預定分析物結(jié)合以形成熒光標記的分析物的熒光檢測試劑，其中所述熒光檢測試劑包含熒光標記的微粒，所述熒光標記的微粒與對樣品中的預定分析物具有親和力的分析物結(jié)合試劑締合、連接或配位，并且其中一個或多個合成聚合物線能夠通過毛細管作用將流體樣品從至少樣品裝載區(qū)運載至檢測區(qū)。

免疫測定裝置可包括用于支撐合成聚合物線的基板或殼體。

應當理解，上文針對免疫熒光測定系統(tǒng)描述的實施方案(其中這些實施方案涉及免疫測定裝置)也可與針對上述裝置的實施方案一樣適用。

在另一方面，提供一種用于檢測樣品中的分析物的方法，所述方法包括以下步驟：

a)通如下方式獲得包含熒光標記的分析物的預處理樣品：使待測試預定分析物的存在的樣品與熒光檢測試劑接觸，從而形成熒光標記的分析物，并且其中熒光檢測試劑包含熒光標記的微粒，所述熒光標記的微粒與對樣品中的預定分析物具有親和力的分析物結(jié)合試劑締合、連接或配位；

b)提供側(cè)流免疫測定裝置，其包括一個或多個合成聚合物線，所述合成聚合物線界定至少樣品裝載區(qū)；檢測區(qū)，其包括對樣品中的預定分析物具有親和力的固定化捕獲試劑；以及任選的中間區(qū)，其設置在樣品裝載區(qū)和捕獲區(qū)之間；

c)使側(cè)流免疫測定裝置的樣品裝載區(qū)與獲自步驟a)的預處理樣品接觸，由此通過毛細管作用將預處理樣品從樣品裝載區(qū)運載至檢測區(qū)，并且熒光標記的分析物與捕獲試劑結(jié)合以固定化到檢測區(qū)中；和

d)通過熒光光譜法來檢測檢測區(qū)中的熒光標記的分析物。

在另一方面，提供一種用于檢測樣品中的分析物的方法，所述方法包括以下步驟：

a)提供側(cè)流免疫熒光測定裝置，其包括一個或多個合成聚合物線，所述合成聚合物線界定至少樣品裝載區(qū)；檢測區(qū)，其包括對樣品中的預定分析物具有親和力的捕獲試劑；以及中間區(qū)，其設置在樣品裝載區(qū)和捕獲區(qū)之間，其中所述中間區(qū)包括用于與樣品中的預定分析物結(jié)合以形成熒光標記的分析物的可逆固定化的熒光檢測試劑，其中所述熒光檢測試劑包含熒光標記的微粒，所述熒光標記的微粒與對樣品中的預定分析物具有親和力的分析物結(jié)合試劑締合、連接或配位；

b)使側(cè)流免疫測定裝置的樣品裝載區(qū)與待測試預定分析物的存在的樣品接觸，由此通過毛細管作用將樣品從樣品裝載區(qū)運載至中間區(qū)并且樣品與可逆固定化的熒光檢測試劑結(jié)合以形成熒光標記的分析物，然后通過毛細管作用將所述熒光標記的分析物運載至檢測區(qū)以與捕獲試劑結(jié)合，從而固定化到檢測區(qū)中；和

c)通過熒光光譜法來檢測檢測區(qū)中的熒光標記的分析物。

上述方法可用于檢測樣品中目標分析物的存在或水平。在一個實施方案中，所述方法可用于定量測量樣品中目標分析物的水平(例如濃度)。目標分析物的檢測或測量可用于診斷病癥或作為臨床測定的基礎。

應當理解，上文針對免疫熒光測定系統(tǒng)和裝置描述的實施方案也可與針對上述方法的實施方案一樣適用。

本公開及其實施方案的其他特征、目的和優(yōu)點將通過下文的詳細描述、實施例和權(quán)利要求而變得顯而易見。

附圖簡述

現(xiàn)將僅以舉例的方式通過參照附圖來對本公開的實施方案進行進一步的描述和闡釋，在附圖中：

圖1提供以平面圖示出根據(jù)本發(fā)明的第一實施方案的免疫測定裝置的示意圖；

圖2提供以平面圖示出用于免疫測定裝置的盒的示意圖；

圖3提供以正視圖示出用于免疫測定裝置的盒的示意圖；

圖4提供以平面圖示出用于免疫測定裝置的盒中的測試區(qū)窗口和對照區(qū)窗口的放大圖的示意圖；

圖5提供示出根據(jù)本發(fā)明的第二實施方案的免疫測定裝置的示意圖；

圖6a提供兩張照片，其示出根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的使用常規(guī)硝酸纖維素膜(圖6a)相比于使用合成聚合物線(圖6b)的側(cè)流免疫測定中的C-反應蛋白的分析物檢測；

圖7提供當C-反應蛋白存在于滴定系列中時來自用于熒光微粒標記的免疫測定中的硝酸纖維素膜的熒光和背景信號的掃描的重復數(shù)據(jù)；

圖8提供當C-反應蛋白存在于滴定系列中時來自用于熒光微粒標記的免疫測定中的棉線的熒光和背景信號的掃描；

圖9提供當C-反應蛋白存在于滴定系列中時來自熒光微粒標記的免疫測定中的尼龍線(用于本發(fā)明中)的熒光和背景信號的掃描的重復數(shù)據(jù)；

圖10提供用于側(cè)流免疫測定中的常規(guī)硝酸纖維素膜的電子顯微鏡10,000倍放大圖像；

圖11示出當使用陰性C-反應蛋白樣品時并且在檢測標簽為300nm銪微粒的情況下常規(guī)硝酸纖維素膜的縱向熒光掃描；

圖12提供基于天然纖維的棉線的電子顯微鏡橫截面；

圖13提供合成尼龍線的電子顯微鏡橫截面；以及

圖14為在檢測區(qū)位置處的合成尼龍線的呈2500倍放大圖像的電子顯微鏡圖像。

詳述

在下列多個非限制性實施方案中描述本發(fā)明，這些實施方案涉及為發(fā)現(xiàn)用于快速且準確地測定樣品溶液中目標分析物的水平的具有改善的替代側(cè)流免疫測定裝置、系統(tǒng)和方法而進行的研究。至少在一些實施方案中，已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)包括通過毛細管作用而用作流體樣品的載體的一個或多個合成聚合物線的側(cè)流免疫測定裝置可提供目標分析物的具有改善的定性和定量檢測，特別是使用基于微粒的熒光標簽的免疫熒光測定裝置、系統(tǒng)和方法。合成聚合物線在免疫測定裝置中的使用可實現(xiàn)具有改善的芯吸速率一致性和再現(xiàn)性以及裝置診斷能力，并且在至少在一些實施方案中，可通過減少可用于多孔載體中的未結(jié)合的熒光微粒的截留來減少背景熒光并從而改善目標分析物檢測。

一般術(shù)語

在本說明書通篇中，除非另外特別地說明或上下文另有要求，否則提及單個步驟、物質(zhì)構(gòu)成、步驟的組或物質(zhì)構(gòu)成的組應當被理解成包括這些步驟、物質(zhì)構(gòu)成、步驟的組或物質(zhì)構(gòu)成的組的一個和多個(即一個或更多個)。因此，如本文所用，單數(shù)形式“一種”和“一個”包括復數(shù)個方面，除非上下文文中另外明確指示。例如，提到"一個"包括一個以及兩個或更多個；提到"一種"，包括一種以及兩種或更多種；提到"所述(該)"，包括一個(種)以及兩個(種)或更多個(種)等等。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解本文的公開內(nèi)容是容易進行改變和變更的，除外特別說明的那些。應當理解的是本公開包括所有此類改變和變更。本公開還包括在本說明書中逐個地或共同地提及或指出的所有這些步驟、特征、組合物和化合物，以及所述步驟或特征的任何和所有的組合或其中的任何兩種或更多種。

本文所述的本公開的每個實施例加以必要的變通將適用于各個其他實施例，除非另外特別說明。本公開并不局限于本文所述的特定實例的范圍內(nèi)，這些實例僅旨在用于舉例說明目的。功能上等效的產(chǎn)物、組合物和方法顯然地在本公開的范圍內(nèi)，如本文所述。

除非另外指明，本公開使用側(cè)流免疫熒光測定中使用的常規(guī)技術(shù)(包括熒光標記、激發(fā)和檢測技術(shù))來進行。此類工序描述于例如美國專利4719182或參考文獻“Lateral Flow Immunoassay,Wong等，Humana Press,2007年，第170-181頁”。

術(shù)語“和/或”例如“X和/或Y”應被理解為表示“X和Y”或“X或Y”，并且應當用來明確支持兩種含義或任一種含義。

在本說明書全文中，詞語“包含”或變型形式諸如“包括”或“含有”將被理解為意在包含所述的要素、整數(shù)或步驟，或要素、整數(shù)或步驟的群組，但不排除任何其他要素、整數(shù)或步驟，或要素、整數(shù)或步驟的群組。

將清楚地理解，盡管本文中提及許多現(xiàn)有技術(shù)公布，但此提及并不會構(gòu)成對這些文獻中的任一篇在澳大利亞或在任意其他國家形成本領(lǐng)域的公知常識的一部分的認同。

除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所普遍理解的含義相同。雖然與本文所述的那些類似或等同的方法和材料可用于本發(fā)明的實施和測試，但合適的方法和材料在下文也有所描述。如有沖突，以本說明書(包括定義)為準。此外，材料、方法和實例僅出于示例性目的，而不旨在進行限制。

具體術(shù)語

本文中對“樣品”的提及應理解為對來源于受試者的任何樣品的提及，例如但不限于體液(例如，血液或血液級分如血清或血漿、淚液、尿液、腹水、淚液、汗液、唾液、排泄物、齦溝液、組織提取液、滑液或腦脊液)、細胞材料(例如，組織抽吸物)、組織活檢樣本或手術(shù)樣本。“生物流體樣品”、“流體樣品”或“體液”是指可取自生物體作為樣品的任何流體，其可包含可檢測的分析物或遺傳物質(zhì)，例如，取自人或動物受試者的血液或血漿。對于側(cè)流免疫測定，應當理解，施加于免疫測定裝置的樣品呈能夠在裝置中進行毛細流動的液體形式，并且樣品可經(jīng)處理或添加另外的試劑或化學物來促進這種液性和毛細流動。

“分析物”包括但不限于可在體液中檢測到的蛋白、大分子和小分子，例如獲自人或動物受試者的血液或血漿樣品中存在的抗原或抗體。

如本文所用，術(shù)語“熒光標記的分析物”意指已被能夠發(fā)出熒光的熒光物質(zhì)例如熒光檢測試劑標記的分析物。

如本文所用，術(shù)語“抗體”意指多克隆或單克隆全免疫球蛋白例如IgG、IgM、IgA、IgE等，或免疫球蛋白片段例如F(ab)2、F(ab')2、Fab、Fab'等，或它們的混合物，并且包括合成抗體。

如本文所用，術(shù)語“診斷”及其變型形式包括臨床狀態(tài)的任何初步診斷或復發(fā)性疾病的診斷。

如本文所用，術(shù)語“微?！币庵钢睆浇橛诩s0.1μm和100μm之間(例如大于約100nm)的顆粒。

如本文所用，術(shù)語“合成聚合物線”是指由多個單獨的合成聚合物纖維形成的線。

術(shù)語“聚合物”包括共聚物，術(shù)語“單體”包括共聚單體。

診斷免疫測定系統(tǒng)、裝置和方法

本文所述的側(cè)流免疫測定系統(tǒng)可提供高性價比的便攜且快速的診斷系統(tǒng)，該系統(tǒng)需要少量的樣品體積進行檢驗，對目標分析物具有改善的檢測，特別是當例如在側(cè)流免疫熒光測定中與熒光檢測方法一起使用時。

本文所述的免疫熒光測定系統(tǒng)包括使用側(cè)流免疫測定裝置，所述側(cè)流免疫測定裝置包括提供多孔載體系統(tǒng)的一個或多個合成聚合物線。合成聚合物線可被多種試劑涂布或浸漬并且被配置用于通過利用毛細管作用來測定流體樣品。免疫熒光測定系統(tǒng)包括使用熒光檢測試劑，所述熒光檢測試劑包含熒光標記的微粒，所述熒光標記的微粒與分析物結(jié)合試劑締合、連接或配位，以標記樣品中的預定分析物并通過使用熒光光譜法來檢測分析物。應當理解，在免疫測定中，分析物結(jié)合試劑和分析物將通常通過互補抗體和抗原來提供。還應當理解，用于將目標分析物固定化到裝置中檢測區(qū)中的捕獲試劑將通產(chǎn)由互補抗體或抗原提供，這取決于目標分析物是抗原還是抗體。

合成聚合物線界定至少樣品裝載區(qū)，所述樣品裝載區(qū)用于將流體樣品裝載到線上；和檢測區(qū)，所述檢測區(qū)用于固定化和檢測樣品中目標分析物的存在。檢測區(qū)包括對樣品中的預定分析物具有親和力的固定化捕獲試劑。應當理解，合成聚合物線適用于將流體樣品通過毛細管作用從至少樣品裝載區(qū)運載至檢測區(qū)。然而，可提供線中的其他區(qū)以及構(gòu)型的變型。其他區(qū)可包括一個或多個試劑區(qū)、散布區(qū)、封閉區(qū)或過濾區(qū)、阻擋區(qū)或緩沖區(qū)等。這些區(qū)通過毛細管作用彼此流體連通，這意味著除了固定化到檢測區(qū)中的捕獲試劑外，流體、試劑和反應產(chǎn)物可在各區(qū)間通過。這些區(qū)可分隔、疊置或相鄰。

可通過使用具有結(jié)合預定分析物的親和力的熒光檢測試劑來‘標記’樣品中的分析物以供檢測?？蓪悠吩谂c多孔載體接觸之前進行熒光標記，或替代地，多孔載體可包括‘標記’或‘檢測區(qū)’(例如中間區(qū))，在所述區(qū)中，樣品調(diào)動已可逆地(暫時地)固定化到多孔載體中的熒光檢測試劑。熒光檢測試劑可包含與分析物結(jié)合試劑締合、連接或配位的熒光標記的微粒。例如，當目標分析物為抗原時，分析物結(jié)合試劑通常為互補抗體。當分析物與調(diào)動的熒光檢測試劑反應時，液體樣品和調(diào)動的檢測試劑沿著多孔載體進一步遷移至檢測區(qū)(其可也被稱為‘捕獲區(qū)’或‘固定化區(qū)’)，在所述區(qū)中，結(jié)合相同分析物(例如抗原)的捕獲試劑(例如抗體)通常以線條的形式固定或固定化到多孔載體。當分析物存在于液體樣品中時，通過捕獲試劑與調(diào)動的熒光標記的分析物結(jié)合而形成復合物，并且所得熒光標記的分析物濃度導致出現(xiàn)于檢測區(qū)中的可檢測線條，其指示陽性結(jié)果。任何剩余的樣品液體與其余熒光標記的試劑繼續(xù)遷移通過檢測區(qū)(例如)到達對照區(qū)，所述對照區(qū)可被配置成提供第二線條，所述第二線條指示樣品已前移穿過檢測區(qū)和對照區(qū)并且指示測定已提供有效的測試結(jié)果。其余樣品和剩余的熒光標記的試劑可隨后被配置成遷移至多孔接收區(qū)。應當理解，未與預定分析物反應并且在多孔載體的整個其他區(qū)域上被截留的任何流動的熒光標記的試劑促成可降低檢測準確性的背景信號。

合成聚合物線可設有中間區(qū)，所述中間區(qū)設置在之間樣品裝載區(qū)和檢測區(qū)之間。中間區(qū)可用于進一步將樣品裝載區(qū)和檢測區(qū)分隔，并且可能包括或可能不包括任何另外的試劑。在一個實施方案中，熒光檢測試劑可以可逆地固定化到裝置的中間區(qū)上。所述方法包括通過毛細管作用從樣品區(qū)運載至中間區(qū)的樣品，在所述中間區(qū)中，樣品中的分析物可結(jié)合并且調(diào)動可逆固定化的熒光檢測試劑以形成熒光標記的分析物。熒光標記的分析物隨后通過毛細管作用從中間區(qū)運載至檢測區(qū)。熒光標記的分析物可隨后通過與對預定分析物(例如抗原)具有親和力的固定化捕獲試劑(例如捕獲抗體)結(jié)合而被固定化到(‘捕獲’)捕獲區(qū)中。

免疫測定裝置可包括單個線或多個線。免疫測定裝置可用于單一或多重測定中，例如用于測定一種或多種預定分析物?？商峁┒喾N構(gòu)型的裝置。例如，免疫測定裝置可包括各自連接在中心點處的多個線，其中中心點提供樣品裝載區(qū)并且各線的遠端構(gòu)成檢測區(qū)。至少在一些實施方案中，本文所述的側(cè)流免疫測定裝置和系統(tǒng)可被稱為“一步”免疫測定。一步免疫測定可為“濕式”或“干式”免疫測定。

“濕式”一步免疫測定包括一個或多個合成聚合物線(作為多孔載體)，其界定至少樣品裝載區(qū)，所述樣品裝載區(qū)可位于線的近端，和檢測區(qū)，所述檢測區(qū)可位于線的遠端?？稍诟鳂悠费b載區(qū)和檢測區(qū)之前、之間或之后提供其他區(qū)。在此“濕式”系統(tǒng)中，在樣品接觸線的樣品裝載區(qū)之前將樣品與熒光檢測試劑混合。在與樣品裝載區(qū)接觸之前，熒光檢測試劑(例如熒光標記的抗體)與樣品溶液中的預定分析物(例如抗原)特異性結(jié)合而形成熒光標記的分析物。在將樣品溶液置于線的樣品裝載區(qū)上時，樣品溶液通過毛細管作用在整個檢測區(qū)上移動，其中熒光標記的分析物被固定至檢測區(qū)中的固定化捕獲試劑(例如固定化抗體)。因為分析物是熒光標記的，所以如果溶液中存在任何分析物，則可檢測到檢測區(qū)的熒光。

“干式”一步免疫測定包括一個或多個合成聚合物線(作為多孔載體)，其界定至少樣品裝載區(qū)、檢測區(qū)和設置在樣品裝載區(qū)和檢測區(qū)之間的中間(標記)區(qū)?！案墒健睖y定與濕式測定的不同之處在于包括直接位于線上的熒光檢測試劑，所述熒光檢測試劑可逆地(暫時地)固定化到中間區(qū)中。將包含所關(guān)注分析物的樣品溶液首先置于樣品區(qū)上。通過毛細管作用，樣品溶液橫穿線。當樣品中的分析物通過中間(標記)區(qū)時，任何分析物均被熒光檢測試劑所標記以形成熒光標記的分析物。熒光標記的分析物被固定化并且連同樣品溶液一起繼續(xù)橫穿線的長度而到達檢測區(qū)。如針對“濕式”測定所論述，樣品溶液通過毛細管作用在整個檢測區(qū)上移動，其中熒光標記的分析物被固定至檢測區(qū)中的固定化捕獲試劑(例如固定化抗體)。因為分析物是熒光標記的，所以如果溶液中存在任何分析物，則可檢測到檢測區(qū)的熒光。

圖1中示出用于干式“一步”免疫測定的免疫測定裝置的第一實施方案。在此示意圖中，免疫測定裝置(1)由示例性的五個獨立且平行的線道(2a-2e)組成以提供五重免疫測定測試。如前所述，免疫測定裝置可由一個線道或多個線道組成，這取決于需要測量多少分析物靶標。

在圖1中示出的實例中，第一，樣品被裝載到多孔樣品墊(7)上。樣品墊的作用是接納樣品，或?qū)悠愤M行處理以使得樣品與測定相容并且針對測定釋放分析物。示例性樣品墊可由纖維素、玻璃纖維、人造絲或其他過濾介質(zhì)制成。

第二，樣品從樣品墊(7)釋放，樣品能夠流入多個獨立且平行的綴合物墊(3a-3e)中，其中每個綴合物墊與樣品墊7流體連通。這些結(jié)合物墊中的每一個將包含干透的固定化綴合物，這種綴合物為與熒光標記的微粒結(jié)合的所關(guān)注的特定靶標的檢測器抗體。當樣品流入綴合物墊中時，干透的綴合物被再水化并且釋放。隨后，每個線道中的釋放的再水化結(jié)合物將與對線道中的綴合物具有特異性的任何靶抗原形成免疫復合物。綴合物墊可由玻璃纖維、聚酯或人造絲制成。

第三，分析物(可能包含與靶抗原的免疫復合物)從綴合物墊(3a-3e)釋放到線道(2a-2e)中，各線道與其各自的綴合物墊流體連通。各線道將允許分析物沿著每個線的縱向軸線芯吸直至抵達檢測區(qū)(4a-4e)。在每個線道內(nèi)的檢測區(qū)處，干透的捕獲抗體存在于線上，并且所述捕獲抗體對靶抗原具有特異性。因此，在特定的線道中如果存在包含靶抗原的熒光標記的免疫復合物，則其將結(jié)合檢測區(qū)處固定化到線上的捕獲抗體，并且這將隨后被檢測為與陽性測試結(jié)果相關(guān)聯(lián)的機器可讀熒光信號?；蛘?，如果不存在靶抗原，則檢測區(qū)中應當不存在熒光標記的微粒的結(jié)合，并且這將隨后被檢測為與陰性測試結(jié)果相關(guān)聯(lián)的機器可讀的零(或近零)熒光信號。

第四，分析物流動通過檢測區(qū)(4a-4e)到對照區(qū)(5a-5e)中。在對照區(qū)(5a-5e)，另一捕獲抗體被固定化到線上。此另一捕獲抗體通常為種特異性抗體，對綴合物中的檢測器抗體具有特異性。這樣，對照區(qū)(5a-5e)處的陽性熒光信號被用作質(zhì)量控制信號以確保測定已始終正確運行。

第五，分析物流動通過對照區(qū)(5a-5e)到吸芯或絨墊(8)中。吸芯與線道流體連通并且被設計成將流體從線中拉出(利用線內(nèi)的毛細管作用)，并且將其保持測定的持續(xù)時間。吸芯材料通常為高密度纖維素材料。

圖1中示出的免疫測定裝置可容納在圖2中示出的塑料盒(9)中。塑料盒在其上表面中可具有引入樣品的孔口(10)，此孔口使樣品墊(7)暴露(如圖1中所示)。塑料盒可由上半部和下半部(11a和11b)構(gòu)成，如圖3中所示。線上的檢測區(qū)(4a-4e)和對照區(qū)(5a-5e)也通過盒上半部中的窗口暴露，如圖4中所示。這些窗口中的每一個均可被來自外部器械(未示出)的熒光激發(fā)光照亮。因此，在位置(4a-4e，檢測區(qū))或位置(5a-5e，對照區(qū))處存在于線上或存在于其中的任何熒光微粒將發(fā)出與這些區(qū)中的微粒量成比例的熒光射線信號。這些熒光射線可被外部器械(未示出)中的任何已知的光檢測器讀取。熒光射線可經(jīng)由圖3中示出的透鏡12而被引導或聚焦到光檢測器中。這樣，示例性五重測定的結(jié)果可報導為圖4中示出的獨立讀取的熒光射線T1-T5。出于質(zhì)量控制的目的，圖4中示出的對照C1-C5也必須各自被檢測為陽性熒光信號以確認測試已正確運行。

圖5中示出用于干式“一步”免疫測定的免疫測定裝置的第二實施方案(100)。此實施方案使用與第一實施方案相同的條件，除省去了結(jié)合物墊3a-3e外。這些綴合物墊被綴合物區(qū)(103a-103b)代替，所述綴合物區(qū)為線道(2a-2e)內(nèi)綴合物被干透進入線本身中的區(qū)。在此實施方案中，從樣品墊(7)芯吸樣品，穿過線道(2a-2e)并進入綴合物區(qū)(103a-103e)使得線中的區(qū)(103a-103e)內(nèi)的綴合物再水化并釋放。在所有其他方面，免疫測定裝置的第二實施方案(100)以與第一實施方案(1)相同的方式工作，包括提供圖2-4中示出的塑料盒(9)。

在免疫測定裝置的第二實施方案(100)中，還可在“濕式”一步免疫測定的情況下省去綴合物區(qū)(103a-103e)。

可用另外的試劑例如pH試劑或緩沖劑、表面活性劑和/或封閉劑、添加劑以及其他試劑對液體樣品進行預處理以優(yōu)化反應，從而提高測定靈敏度。這些試劑通常浸漬到多孔載體中或浸漬到裝置的其他部件(例如，綴合物墊)中，然而當免疫測定裝置為測試試劑盒的一部分時，它們還可與液體樣品混合作為單獨的試劑。

樣品可單獨使用，如常常以尿液或血清相容的測試完成，或其可與測試專用的緩沖液混合。此緩沖液可僅為稀釋劑/電泳緩沖液例如PBS或類似物，或者其可更加復雜并且具有有利于進行測試的特定組分或萃取特性，例如細胞溶解緩沖液。

樣品裝載區(qū)是含分析物樣品的流體毛細流動開始的地方，并且是優(yōu)選地表現(xiàn)出低分析物保持的區(qū)。通常，樣品裝載區(qū)可設有中性蛋白封閉試劑，然后進行處理以固定化封閉劑(例如凍干)，這可增加芯吸作用。至少在一些實施方案中，如本文所述的合成聚合物線可在不使用封閉試劑的情況下提供合適的芯吸作用。樣品區(qū)還可設有另外的固定化劑以通過截留樣品溶液中任何不可取的顆粒來起到機械過濾器的作用。

樣品區(qū)內(nèi)的樣品處理通常包括濾除顆?；蚣t血球；改變樣品的pH；主動結(jié)合可妨礙測定的樣品組分；以及破壞或裂解樣品中的基質(zhì)組分以針對測定釋放分析物。

檢測區(qū)可包括固定化捕獲試劑(例如捕獲抗體)的捕獲線條。在檢測區(qū)中提供捕獲抗體的情況下，所述捕獲抗體通常被選擇來與目標分析物上的第二表位結(jié)合(例如靶抗原，因為抗原的第一表位與熒光檢測試劑結(jié)合)。目標分析物從而通過與合成聚合物線上的抗體薄線條結(jié)合而在捕獲線條處集中。當熒光標記的分析物在檢測區(qū)上方運載時，分析物上的表位與捕獲線條處的抗體結(jié)合。因此，如果樣品中存在目標分析物，則捕獲線條會發(fā)熒光。通過將捕獲抗體置于薄線條中的合成聚合物線上，免疫測定系統(tǒng)可檢測樣品中的極少量的分析物。因為每個分析物分子可與熒光檢測試劑結(jié)合，所以樣品中的分析物濃度與結(jié)合于捕獲線條處的熒光標記的微粒的濃度相關(guān)聯(lián)。因此，包含目標分析物的樣品將在整個線的捕獲線條上產(chǎn)生熒光帶，熒光帶的水平與樣品中的分析物的量成正比。

可通過一系列熟知的方法來進行檢測區(qū)處的熒光檢測。例如，可使用處于接近熒光微粒的激發(fā)波長的特定激發(fā)波長的LED來輸送激發(fā)光。也可使用激發(fā)濾光片。來自捕獲線條的發(fā)射光(可能被激發(fā)濾光片過濾)隨后可被熒光檢測器檢測到。這種熒光檢測器可由一個或多個光檢測器組成，其中每個光檢測器專門用于分析來自特定線道的熒光射線。熒光檢測器可替代地由線(一維)或面(二維)像素陣列組成，其中來自特定線道的熒光響應專門針對所述陣列上的特定像素地址。光檢測器可為將入射光轉(zhuǎn)換成矩形波(例如TAOS T235裝置)的類型，其中矩形波的頻率與入射光強度成比例，并且該頻率通過微處理器進行測量。光可經(jīng)由光導裝置從激發(fā)LED引導至檢測區(qū)，所述光導裝置可為例如一體模制部件或由纖維光束構(gòu)成。發(fā)出的熒光可經(jīng)由類似的光導裝置從檢測區(qū)引導至光檢測器。激發(fā)和發(fā)射光導裝置(就光導纖維而言)可束集在一起以在檢測區(qū)處形成分叉的探頭。掃描機構(gòu)可用于將各檢測區(qū)窗口移動穿過分叉的探頭以檢測測定結(jié)果。

在一個優(yōu)選的實施方案中，來自LED的光應處于大約365nm(UV)的激發(fā)波長，并且應適于激發(fā)來自內(nèi)部用銪染色的微粒的熒光響應。這些銪微粒在615nm處發(fā)出熒光響應(橙色)，其可被光檢測器捕獲。常規(guī)熒光檢測或時間分辨熒光檢測可與方法一起使用。在使用時間分辨熒光檢測的情況中，不需要發(fā)射和激發(fā)濾光片。

本文所述的免疫測定裝置可包括用于支撐合成聚合物線的基板或殼體?；寤驓んw可由不妨礙測定工序的任何惰性材料制成，例如柔性片材、帶材或模制塑料。殼體可用作支撐件來在處理和儲存期間將合成聚合物線維持成所需構(gòu)型并且保護合成聚合物線免于污染和損壞。殼體還可用于密封合成聚合物線并且將合成聚合物線彼此分隔(例如用于多重測定)以防止交叉污染。殼體可由透明材料制成。

樣品和目標分析物

本文所述的免疫測定裝置、系統(tǒng)和方法可用于測定小體積的生物樣品，例如流體液體樣品。可使用本文所述的診斷系統(tǒng)測定的生物樣品包括例如尿液、全血、血漿、血清、腦脊液、腹水、淚液、汗液、唾液、排泄物、齦溝液或組織提取液。在一些實施方案中，待測定的流體樣品的體積可為例如來自指刺的血滴，或例如來自新生或小動物的小尿液樣品。

通過如本文所述的免疫測定裝置可檢測的合適的分析物可以為可發(fā)現(xiàn)特異性結(jié)合搭配物的任何分析物。一般來講，具有醫(yī)學和生物學顯著性的大多數(shù)分析物可在抗體中找到特異性結(jié)合搭配物，所述搭配物是針對這些抗體或其片段來制備。合適的分析物包括可溶性分析物例如激素、酶、脂蛋白、細菌或病毒抗原、免疫球蛋白、淋巴因子、細胞因子、藥物、可溶性癌抗原等等。作為合適的分析物，還包括激素，例如人絨毛膜促性腺激素(hCG)、胰島素、胰高血糖素、松弛素、促甲狀腺激素、生長激素、促性腺激素(gonadotropiπ)、促卵泡激素、促胃液素、緩激肽(bradykiπin)、加壓素和各種釋放因子。還可例如由衣原體(Chlamvdia)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrheae)、鼠疫桿菌(Pasteurella pestis)確定各種各樣的抗原性多糖。痢疾志賀氏菌(Shigella dvsentereae)和某些真菌例如小孢子菌屬(Mycosporum)和曲霉屬(Aspergillus)。另一主群包括與其他寡核苷酸或蛋白質(zhì)靶標特異性反應的寡核苷酸序列。可通過如本文所述的裝置、系統(tǒng)和方法測定的可溶性分析物的清單在美國專利No.3,996,345中提供，該專利以引用的方式并入本文。

基于本文所述的任一方面和實施方案對分析物的第一示例性測定是針對沙眼衣原體(chlamydia trachomatis)(CT)。當前基于使用包括硝酸纖維素膜連同膠體金可視標記物的測定的CT的快速測試通常面臨靈敏度不良。例如，在對772名婦女的研究中，發(fā)現(xiàn)典型的商業(yè)快速衣原體測試(Quidel Quickvue Chlamydia Test)與核酸金標檢驗相比具有27％的靈敏度[來源：“Alarmingly poor performance in Chlamydia trachomatis point-of-care testing”,van Dommelen等，J.Sexually Transmitted Infections 2010年；86；第355-359]頁。因此，可對CT提供80-90％靈敏度的快速診斷裝置將具有高臨床實用性。此外，本發(fā)明還可用于同時診斷其他具有CT的性傳播疾病，例如CT和NG(淋病奈瑟氏菌)的雙重測定或CT、NG和陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)的三重測定。本發(fā)明準確和快速地并行診斷若干種性傳播疾病的能力也具有高臨床實用性。

基于本文所述的任一方面和實施方案的對分析物的第二示例性測定是針對蛋白質(zhì)生物標記物肌鈣蛋白I，其在急診室中使用以診斷急性心肌梗塞(AMI)。準確測量此生物標記物需要能夠測量的低分析物濃度低至100pg/ml或更佳的分析物濃度，并且具有高再現(xiàn)性(變異系數(shù)<10％)。

基于本文所述的任一方面和實施方案的對分析物的第三示例性測定是針對蛋白質(zhì)生物標記物原降鈣素(PCT)，其為急診室中急性敗血病的診斷標記物。PCT可在多重診斷形式中與其他標記物例如C-反應蛋白(CRP)和白介素-6(IL-6)結(jié)合來增強診斷特異性。

應當理解，(熒光檢測試劑的)分析物結(jié)合試劑和捕獲試劑各自對預定目標分析物提供互補的結(jié)合搭配物。例如，如果目標分析物為蛋白質(zhì)性物質(zhì)，則分析物結(jié)合試劑和捕獲試劑各自對蛋白質(zhì)性物質(zhì)提供單獨的互補結(jié)合搭配物。通常，蛋白質(zhì)性物質(zhì)為抗體或抗原。在目標分析物為抗原的實例中，則分析物結(jié)合試劑和捕獲試劑可各自對單獨的靶抗原表位提供結(jié)合搭配物，例如以下情況：分析物結(jié)合試劑提供用于與靶抗原的第一表位結(jié)合的第一抗體，捕獲試劑提供用于與相同靶抗原的第二表位結(jié)合的第二抗體。應當理解，如本文所用，術(shù)語“抗體”意指多克隆或單克隆全免疫球蛋白例如IgG、IgM、IgA、IgE等，或免疫球蛋白片段例如F(ab)2、F(ab')2、Fab、Fab'等，或它們的混合物，并且包括合成抗體。結(jié)合多種配體的抗體和抗體片段是已知的，并且將易于被本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解。

合成聚合物線

應當理解，單獨的合成聚合物線是通過將多個單獨的合成聚合物纖維捻在一起而形成。在將各單獨的纖維扭絞在一起的過程中，在線中的各單獨的纖維之間形成間隙。除了可存在于材料中的由線的各單獨的纖維所形成的孔隙之外，形成合成聚合物線的過程中所產(chǎn)生的間隙也向線提供一定的孔隙度。間隙所提供的孔隙可橫穿線的長度并且提供一個或多個毛細管(即，通道)。當液體沿著由位于各單獨的纖維之間的間隙形成的毛細管移動時，單獨的線中產(chǎn)生毛細管作用(或芯吸)，這是由液體和環(huán)繞表面內(nèi)的和兩者間的分子間力所導致。如果空隙的直徑足夠小，則表面張力(其由液體內(nèi)的內(nèi)聚力，即，液體與液體之間的吸引力導致)和纖維/線的液體與表面間的粘合力(即，液體與表面之間的吸引力)的組合起作用以通過毛細管作用沿著線抽吸(即，芯吸)液體。

可通過已知的制造方法以高性價比再現(xiàn)地制備具有尺寸基本上均勻的毛細管的合成聚合物線，所述制造方法通常涉及形成合成聚合物纖維并將合成聚合物纖維紡成線。具有尺寸基本上均勻的毛細管的合成聚合物線可對側(cè)流免疫熒光測定提供芯吸速率的一致性得以改善的多孔載體材料，這可對分析物提供更加準確的診斷例如定量測定。具有尺寸基本上均勻的毛細管的合成聚合物線還可對側(cè)流免疫熒光測定提供較低背景熒光的多孔載體材料，特別是當使用呈熒光微粒形式的熒光檢測劑時，這也導致更加準確的診斷。盡管不希望受任何理論束縛，但據(jù)信具有基本上均勻的尺寸分布的線可降低截留流動的未結(jié)合的熒光檢測劑、特別是截留微粒的可能性。使用各單獨的合成纖維還可提供另外的優(yōu)點，所述合成纖維基本上無孔或至少具有相當小的孔尺寸(即，最大孔的直徑)和孔尺寸分布(即，孔尺寸的范圍)。同樣，不希望受任何理論束縛，據(jù)信基本上無孔的纖維會進一步降低將流動的未結(jié)合的熒光檢測劑截留在各單獨的纖維內(nèi)、特別是截留微粒的可能性。換句話講，任何可能存在的微粒將橫穿線的毛細管，這與可存在于單獨纖維中的任何較小的孔或通道相反(其中微?？赡鼙唤亓?。

如上文所提及的，由纖維形成的合成聚合物線具有由纖維之間的間隙形成的毛細管所產(chǎn)生的孔隙。毛細管提供液體分子可通過其中的通道。由一個或多個毛細管提供的平均孔尺寸可在約5-30微米的范圍內(nèi)。應當理解，可使用電子掃描顯微術(shù)容易地測定平均孔尺寸和孔密度。

應當理解，合成聚合物線的每個合成聚合物纖維是由合成聚合物形成。還應當理解，合成聚合物將不包括天然聚合物材料，例如木纖維素、棉、絲和天然橡膠。例如，合成聚合物纖維由通常獲自石化來源的合成化學物(單體和共聚物)制成，并且可包括由下列制成的纖維：聚酰胺例如尼龍、聚酯例如聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、丙烯酸類聚酯、芳族聚酰胺、苯酚-甲醛(PF)、聚氯乙烯(PVC)、聚烯烴例如聚丙烯(PP)和聚乙烯(PE)和聚氨酯。合成聚合物纖維通常由可特別適用于形成纖維和線材料并且可特別適用于免疫測定的合成聚合物(包括單體和共聚物)形成。例如，合成聚合物可具有合適的親水性(由表面官能團所導致)和合適的機械特性(例如彈性和抗拉強度)。合成聚合物可經(jīng)選擇和/或改性以控制纖維和線的多孔特性以及特定的表面化學性質(zhì)。

在一個實施方案中，(線的)各單獨的合成聚合物纖維由選自聚酰胺、聚酯、聚醚、聚烯烴、聚碳酸酯和聚氨酯的合成聚合物形成。合成聚合物可為鹵化的，例如氟化的，例如聚偏二氟乙烯或聚氯乙烯。在另一個實施方案中，線的各單獨的合成聚合物纖維由選自聚酰胺和聚酯的合成聚合物形成。由一系列合成聚合物制備聚合物纖維和線的一般方法是為熟知的?？蓪⒕酆衔锢w維或材料進一步改性以增加親水性?？蓪⒕酆衔锕不旎蚪M合不同類型的聚合物纖維。

在一個實施方案中，線的各單獨的合成聚合物纖維由聚酯形成。應當理解，聚酯為包含被酯官能團連接的重復單元的聚合物。聚酯可為熱塑性的或熱固性的。聚酯可為均聚物或共聚物。聚酯可為脂族的、半芳族的或芳族的。脂族聚酯可選自聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚羥基鏈烷酸酯(PHA)、聚羥基丁酸酯(PHB)、聚己二酸乙二醇酯(PEA)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)和聚(3-羥基丁酸酯-共-3-羥基戊酸酯(PHBV)。半芳族聚酯可選自聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚對苯二甲酸丁二醇酯(PBT、聚對苯二甲酸丙二醇酯(PTT)和聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)。芳族聚酯可為vectran，其可由4-羥基苯甲酸和6-羥基萘-2-羧酸縮聚形成。

在一個實施方案中，線的各單獨的合成聚合物纖維由聚酰胺形成。應當理解，聚酰胺為包含被酰胺官能團連接的重復單元的聚合物。聚酰胺可為脂族聚酰胺、聚鄰苯二甲酰胺或芳族聚酰胺(芳族聚酰胺(aramide))。在一個實施方案中，脂族聚酰胺為尼龍。尼龍可選自尼龍-6,6；尼龍-6；尼龍-6,9；尼龍-6,10；尼龍-6,12；尼龍-11；尼龍-12和尼龍-4,6。

合成纖維可為由兩種不同的形成纖維的聚合物共擠出的纖維。共擠出的纖維可以芯-皮或并列構(gòu)型的形式提供。

在一些實施方案中，使用多種已知的物質(zhì)和方法中的任一種對線進行功能化以增強吸收和/或芯吸特性。纖維或線可用試劑涂布或摻入以改變毛細管作用。還可提供此類試劑以增強蛋白質(zhì)(例如抗體)與僅處于測試線位置處的纖維或線結(jié)合的能力，或阻礙蛋白質(zhì)與僅處于遠離測試線的位置處的纖維或線結(jié)合的能力。在形成纖維時可將試劑摻入聚合物材料或纖維可與試劑接觸以在其上進行吸收。試劑可為可光活化的，例如通過紫外光。可在線的一個或多個選定的區(qū)(例如僅處于測試線位置處)中提供選定試劑中的一種或多種。

熒光檢測試劑

熒光光譜法是熟知的、靈敏的且通用的光學分析技術(shù)。在免疫熒光測定中，用具有已知的在熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜內(nèi)的光譜分布的光照射包含用熒光物質(zhì)標記的分析物的樣品。測定熒光物質(zhì)的所得特征發(fā)射光譜的強度并且其與樣品中的目標分析物有關(guān)。

如本文所述的側(cè)流免疫熒光測定裝置、系統(tǒng)和方法涉及使用‘熒光檢測試劑’來通過線的檢測區(qū)中的熒光射線對供檢測的標靶的分析物進行標記。如前所述，熒光檢測試劑可與樣品在裝載到線上之前進行混合(例如‘濕式’一步免疫測定)或可暫時地固定化到樣品裝載區(qū)和檢測區(qū)之間的線的位置(例如中間區(qū))處(例如‘干式’一步免疫測定)，以與此前裝載到線上的樣品中的目標分析物結(jié)合。

應當理解，熒光檢測試劑包含可選擇性地與目標分析物結(jié)合的熒光標簽。為了提供具有此類結(jié)合目標分析物的選擇性的熒光標簽，使熒光標簽與對樣品中的預定分析物具有親和力的分析物結(jié)合試劑締合、連接或配位。對于免疫測定，分析物結(jié)合試劑通常為經(jīng)選擇對樣品中的預定目標分析物(例如抗原)具有親和力的抗體?；蛘撸谀繕朔治鑫餅榭贵w的情況下，分析物結(jié)合試劑可為經(jīng)選擇對樣品中的靶抗體具有親和力的抗原。在分析物結(jié)合試劑為抗體的情況下，可通過熟知的技術(shù)來實現(xiàn)抗體與熒光標簽的連接，例如使熒光標簽與對抗體具有親和力的抗原配位，然后抗體經(jīng)締合以與熒光標簽的抗原結(jié)合，或可使用連接基團將抗體直接共價結(jié)合至熒光標簽。

免疫測定中使用的范圍廣泛的包括熒光標簽的熒光檢測試劑為熟知的，例如美國專利No.4,058,732、No.4,283,382和No.4,719,182中所述，這些專利以引用方式并入本文。熒光標簽可包括熒光標記的顆粒，例如熒光微粒。

應當理解，如本文所提及，術(shù)語“微粒”意指直徑介于0.1μm和100μm之間，例如大于100nm的顆粒，這與指直徑小于100nm的顆粒的術(shù)語“納米粒子”相反。

用作標簽的熒光顆粒的一個實例描述于美國專利No.4,283,382中，其中標簽為包含與膠乳微粒結(jié)合的的銪的稀土鑭系元素絡合物的熒光微粒。包含銪(和其他鑭系元素)的熒光標簽已在商業(yè)免疫測定中使用一段時間。已開發(fā)出將所關(guān)注的特定信號與背景信號分離的時間分辨技術(shù)。遺憾的是，這些時間分辨技術(shù)要費時完成并且涉及測定熒光信號是從結(jié)合的分析物產(chǎn)生還是從背景熒光產(chǎn)生。這些技術(shù)未解決未結(jié)合的標記試劑在多孔載體的檢測區(qū)中的任何截留所導致的問題。因此，在側(cè)流免疫測定中使用熒光顆粒仍面臨未結(jié)合的熒光標簽在多孔材料中的截留相關(guān)的高背景噪聲。在使用側(cè)流免疫測定來檢測少量的目標分析物或定量測定目標分析物的水平或濃度時，這種背景噪聲是特別成問題的。

得自單個熒光微粒的熒光射線的量與微粒的直徑相關(guān)聯(lián)，因為較大的微?？赏ㄟ^與更多的熒光物質(zhì)締合來標記，如Harma等的研究中所描述，該研究的題目為“Europium Nanoparticles and Time-resolved Fluorescence for Ultrasensitive Detection of Prostate-specific Antigen”,Clinical Chemistry，2001年3月，第47卷第3期第561-568頁。例如，107nm直徑的微?？砂s3.1×10⁴個螯合的銪離子，而408nm的微?？砂s2×10⁶個螯合的銪離子。因此，約400nm的較大直徑微?？梢l(fā)的熒光響應為約100nm的較小直徑微粒的大約100倍。鑒于此，可通過使用較大的熒光微粒來提高免疫熒光測定的靈敏度。例如，美國專利No.4719182描述了使用熒光微粒來在免疫測定中獲得改善的靈敏度。然而，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)較大的熒光微?？稍趥?cè)流免疫測定中使用的常規(guī)多孔載體系統(tǒng)中導致較高的背景噪聲，據(jù)推測這是由于較大的微粒在多孔載體材料中的截留所導致。因此，使用較大的微粒在提供目標分析物的檢測準確性方面可能日益成問題并且造成妨礙。意外的是，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)使用合成聚合物線可減少此類免疫測定系統(tǒng)中的微粒截留導致的背景噪聲。

在如本文所述的免疫熒光測定裝置、系統(tǒng)和方法的一個實施方案中，提供一種包含熒光標記的微粒的熒光檢測試劑，所述熒光標記的微粒與對樣品中的預定分析物具有親和力的分析物結(jié)合試劑締合、連接或配位。在另一個實施方案中，分析物結(jié)合試劑為對樣品中的預定目標分析物具有結(jié)合親和力的抗體。

用于將抗體偶聯(lián)至此類熒光微粒的方法為熟知的，并且進行這種偶聯(lián)的示例性方案可見于Bangs Laboratories,Inc.的Technical Note#205。此工序?qū)е滦纬蓹z測器抗體/檢測器微粒綴合物，所述綴合物可裝載到如前所述的線的綴合物墊或綴合物區(qū)中。

熒光標記的微粒

如本文所述，熒光標記的微粒可為熒光標記的聚合物微粒(即，由聚合物、共聚物或單體形成的熒光標記的顆粒)。可通過用熒光稀土金屬絡合物標記聚合物微粒來形成熒光標記的聚合物微粒。換句話講，熒光標記的聚合物微?？砂ㄅc熒光稀土金屬絡合物締合、配位或連接的聚合物微粒。

范圍廣泛的熒光稀土金屬絡合物可適于作為聚合物微粒的熒光標簽。特別合適的稀土金屬絡合物為熟知的，其提供檢測靈敏度并且具有相對長使用期的熒光。稀土金屬絡合物包含稀土金屬例如鑭系金屬。鑭系金屬可選自銪、鋱和釤。在一個實施方案中，稀土金屬為銪。熒光稀土金屬絡合物可以金屬螯合物的形式提供，例如銪、鋱和釤的芳族二酮螯合物，例如苯甲酰丙酮銪和苯甲酰三氟丙酮酸銪。適于稀土金屬的螯合劑的其他例子可包括1,3-二酮(例如乙酰丙酮酸鹽、苯甲酰丙酮酸鹽、苯甲酰苯甲酸鹽、三氟-2-呋喃基乙酰丙酮)、鄰苯二甲酸鹽、萘甲酸鹽(例如二萘酰甲基化物)、聯(lián)吡啶(例如2,2'-聯(lián)吡啶-1,1'-二氧化物、4,4'-二甲基-2,2'-聯(lián)吡啶)、四吡啶(例如2,2',6',2"-四吡啶)和菲咯啉(例如異硫氰酸菲咯啉)。

應當理解，可選擇、制備或加工聚合物微粒以提供低粒度分布。聚合物微粒的平均直徑(以nm計)可在100至5000、125至2000、150至1000、175至500或200至400的范圍內(nèi)。聚合物微粒的平均直徑(以nm計)可為至少約100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000?？商峁┢骄睆教幱谶@些值的范圍內(nèi)或為這些值的微粒。在另外的特定實施方案中，聚合物微粒的平均直徑為至少約200nm，在約200至400nm的范圍內(nèi)，或約300nm。

適用于形成可裝載微粒的方法和聚合物為熟知的。例如，合適的聚合物可包括由一個或多個乙烯基芳族單體例如任選取代的苯乙烯和乙烯基萘基，或一個或多個任選取代的烯鍵式不飽和單體形成的那些。合適的單體可包括苯乙烯、丙烯酰胺和丙烯酸。應當理解，其他聚合物(以及單體和共聚物)可為合適的。

用于制備(裝載)熒光標記的聚合物微粒的方法為熟知的，并且可通常涉及將稀土金屬絡合物摻入聚合物微粒中，方式是通過在未凝結(jié)、未溶解的可裝載聚合物微粒的存在下將疏水物在水混溶性溶劑中的親水性逐漸增加到基本上沒有疏水物在水混溶性溶劑中保持溶解的時點。裝載到微粒中的金屬絡合物的量可以變化。

熒光檢測

用于檢測裝置中檢測區(qū)處的熒光標記的分析物的合適的熒光檢測器在本領(lǐng)域中為熟知的。

如本文所述的側(cè)流免疫熒光測定裝置、系統(tǒng)和方法可具有許多應用，包括低成本快速診斷，例如運動醫(yī)學、嬰兒/兒童診斷、糖尿病監(jiān)測、軍用、工業(yè)化程度較低的國家可負擔起的診斷、環(huán)境或現(xiàn)場檢驗。此外，所述方法在臨床上可用于輔助患者管理決策。就此而言，定量測量可改善關(guān)于藥物劑量或治療選擇的臨床決策。例如，使用如本文所述的裝置和系統(tǒng)，所述方法可用于確定受試者的疾病進程。疾病進程是指疾病狀態(tài)隨時間推移的變化，包括診斷、疾病進展(惡化)和疾病退行或緩解(改善)。因此，所述方法可涉及在兩個或更多個不同的時間點(例如第一時間和第二時間)對受試者進行診斷測量，并且比較量的變化(如果有的話)，其中基于這些比較來確定疾病進程。

通過以下實施例對本發(fā)明進行進一步闡述。提供這些實施例僅僅是為了進行闡述。這些實施例不應理解為以任何方式限制本發(fā)明的范圍或內(nèi)容。

實施例

根據(jù)本公開的實施方案，包括合成聚合物線作為多孔載體材料的側(cè)流免疫測定，特別是其中分析物檢測試劑包含熒光微粒的免疫熒光測定，經(jīng)證實可提供適用于定量測量目標分析物的準確診斷系統(tǒng)。以下實施例提供了包括根據(jù)本公開的一些實施方案的呈合成聚合物線形式的多孔載體材料的側(cè)流免疫測定系統(tǒng)與包括常規(guī)硝酸纖維素膜和天然纖維棉線的多孔載體材料的側(cè)流免疫測定系統(tǒng)之間的比較。

實施例1：目視可檢側(cè)流免疫測定中的多孔載體材料的比較研究

首先對兩種類型的多孔載體材料，即基于天然棉纖維的線(DMC Cebelia)和硝酸纖維素膜進行側(cè)流免疫測定比較研究。多孔載體材料構(gòu)成近端處的樣品裝載區(qū)和遠端處的包括捕獲抗體的檢測區(qū)(與取樣區(qū)分隔)。比較研究涉及使用這樣的樣品，所述樣品包括呈稀釋系列的C-反應蛋白(CRP)形式的預定分析物，和包括與CRP抗體配位的膠體金標記物檢測標簽的檢測試劑。所用的抗體對為得自R&D Systems Inc.的MAB17071人CRP單克隆抗體(克隆232007)的配對。

進行免疫測定研究以測定棉線和硝酸纖維素膜檢測不同濃度的CRP的能力。

發(fā)現(xiàn)棉線和硝酸纖維素膜兩者的檢測限(LOD)為約12.5ng/ml。此結(jié)果表明，就檢測目標分析物的存在的能力而言，使用棉線和使用硝酸纖維素膜基本上沒有差別。然而，發(fā)現(xiàn)市售棉線的芯吸速率的變異系數(shù)(CV)為26％，這與甚至商業(yè)硝酸纖維素膜相比也是較不良的結(jié)果。芯吸速率的此不良CV導致檢測器抗體-抗原復合物(標簽-抗體-CRP復合物)橫穿檢驗區(qū)的速度發(fā)生變化。在相同的分析物濃度下，快芯吸速率導致不太密集的測試線，而慢芯吸速率導致更加密集的測試線。測試線密集度的此變化(如使用硝酸纖維素膜出現(xiàn)的)無法提供獲得準確定量測定的足夠穩(wěn)健的平臺。

鑒于這些結(jié)果，認為作為快速側(cè)流免疫測定中的多孔載體材料的天然棉纖維線和硝酸纖維素膜無法提供目標分析物水平的檢測準確性，并且特別不適于作為其中需要定量測量目標分析物的快速側(cè)流免疫測定中的多孔載體材料。

在嘗試發(fā)現(xiàn)天然纖維棉線和硝酸纖維素膜的可能替代物的過程中，制備并測試了合成聚合物線。合成聚合物線的檢測能力通過使用常規(guī)的著紅色的膠體金標簽和系列稀釋的CRP來測定，如前所述。合成聚合物線在檢測能力方面顯示具有良好的性能。制備并測試兩種類型的合成線，基于聚酯的線和基于尼龍-6的線。兩種合成線均通過如下制備：通過噴絲頭擠出圓形合成纖維，然后將纖維用機器捻成線。

尼龍-6合成線顯示使用膠體金可視標記物的CRP的檢測限為約12.5ng/ml(如圖6b中所示)，這與針對硝酸纖維素膜的結(jié)果相同(在圖6a中并行示出)。然而，意外的是，合成線在芯吸速率的再現(xiàn)性方面有著顯著更佳的表現(xiàn)。在豎直芯吸速率試驗的多個平行測定中，發(fā)現(xiàn)尼龍紗表現(xiàn)出的CV為5％，這與棉線和硝酸纖維素膜中可得到的芯吸速率CV相比改善了2.5-5倍。因此，機器擠出和機器紡成的合成線例如尼龍中的高芯吸速率再現(xiàn)性導致進行可重復定量測定的能力。

實施例2：包括熒光標記的微粒的側(cè)流免疫熒光測定中的多孔載體材料的比較研究

在作為多孔載體材料的合成聚合物線與常規(guī)硝酸纖維素膜和天然纖維棉線之間進行比較研究，該比較研究涉及在側(cè)流免疫熒光測定中使用熒光標記的微粒。免疫熒光測定涉及使用包含熒光微粒的熒光檢測試劑。此研究中使用的熒光標記的微粒為銪染色的微粒，如美國專利No.4719182中所述，并且根據(jù)前一實施例所述使用CRP免疫測定系統(tǒng)。

該研究涉及使用Millipore HFP 90硝酸纖維素膜、300nm銪染色的微粒和Ocean Optics USB2000+光譜儀并結(jié)合Ocean Optics365nmLED激發(fā)源以分析銪標記的CRP測定的熒光響應。將測試條裝載到位于無光外殼中的夾具中，并且通過速度受控的伺服馬達來驅(qū)動夾具。使用激發(fā)和激發(fā)濾光片來阻擋任何進入光譜儀的光，該光與來自615nm下銪微粒的發(fā)射無關(guān)。

在CRP測定中，使用BioDot可編程分配器將CRP捕獲抗體固定化到測試條上(在如圖1中所示的位置4)。在單獨的步驟中使CRP檢測器抗體綴合至300nm銪染色的微粒，然后在從150ng/ml低至0.15ng/ml的2倍稀釋步驟中與CRP抗原混合，其中對單獨的測試條運行這些稀釋中的每一者(在6次平行測定中)。在通過測試條運行每次CRP稀釋后，使用電泳緩沖液進行洗滌步驟以確保任何未結(jié)合的銪標記的抗體復合物(未結(jié)合的熒光檢測試劑)脫離條。還實施膜封閉措施來減少銪標記的抗體(未結(jié)合的熒光檢測試劑)的存在，所述銪標記的抗體通常結(jié)合至硝酸纖維素膜的全部區(qū)域(并且歸因于問題較多的背景熒光)。將陰性樣品(CRP＝0ng/ml)用作對照以提供任何銪標記的抗體與硝酸纖維素膜結(jié)合的指示。

在分析不同CRP濃度的平行測定測試條后，意外地發(fā)現(xiàn)，遠離測試線位置的區(qū)域中的背景的熒光讀數(shù)較高并且還廣泛變化。圖7中包括示出這些結(jié)果的劑量響應曲線。開發(fā)診斷測試中的信號背景比的準則為信號背景比應高于比率3。在此基礎上，僅發(fā)現(xiàn)高于9.375ng/ml的CRP濃度具有始終高于3.0的信號:背景比。因此，認為這是硝酸纖維素膜的銪微粒測定的LOD。

使用銪熒光微粒的硝酸纖維素的此LOD與常規(guī)膠體金標簽相比大致相同，如實施例1中所述(LOD＝12.5ng/ml)，意外地發(fā)現(xiàn)，使用銪微粒的LOD不如預期那么低，并且僅優(yōu)于膠體金結(jié)果1.3倍。這似乎歸因于存在不需要的高背景熒光信號，該高背景熒光信號存在于遠離測試線位置的區(qū)域中的膜上。盡管不希望受任何理論束縛，但據(jù)推測，高背景信號的出現(xiàn)是由于300nm銪微粒被卡在硝酸纖維素膜的高度可變的孔結(jié)構(gòu)中。圖10中示出硝酸纖維素膜的10,000倍放大率的電子顯微鏡圖像。此膜為高流量膜(Millipore HF90)，已知該膜對于側(cè)流測試中所用的膜而言具有較大的孔尺寸。在圖10中，我們意外地發(fā)現(xiàn)，膜中的一些孔小于銪微粒的直徑(<300nm)(201)，這將潛在地導致此類微粒不利地存納在膜的除檢測區(qū)或?qū)φ諈^(qū)之外的位置處。此外，我們還意外地發(fā)現(xiàn)，銪微?？稍谛疚陂g簇集在一起(參照圖14，以及下文所附描述)，例如呈2或3個銪微粒的聚簇，并且此類聚簇更有可能不利地存納在膜的除測試線或控制線之外的位置處。銪微粒在膜中這些位置處的不利存納不太可能能夠通過多個洗滌步驟，或通過傳統(tǒng)的膜封閉措施(例如施加酪蛋白或類似物)來防止非特異性結(jié)合，或通過圖像分析軟件補償來解決，因為這些顆粒的不利存納是由膜結(jié)構(gòu)本身的物理限制所致。這些顆粒的不利存納有可能在除檢測區(qū)或?qū)φ諈^(qū)之外的位置處引起高的不需要的背景熒光信號，并且這些高背景信號將顯著降低測定的潛在靈敏度。

在圖11中，我們示出沿著硝酸纖維素膜的縱向方向的掃描，其中使用C-反應蛋白的陰性樣品(0ng/ml)。在此掃描可看到，在沿著測試條長度的所有位置處具有大量的熒光信號，并且測量的背景熒光在此掃描中具有高達6000次計數(shù)。此掃描示出上述的不利存納問題，并且結(jié)果是，信號水平低于6000次計數(shù)的陽性CRP測定將不利地記錄為假陰性。

不想要的存納問題的唯一解決方案可為使用銪納米粒子(例如50nm直徑，類似于膠體金)。然而，較小的此類納米粒子具有比較大微粒低數(shù)個數(shù)量級的熒光響應，因此這種解決方案將損失使用較大銪微粒的靈敏度益處。

對商業(yè)棉線(DMC Cebelia)進行相同的熒光CRP測定滴定系列，并且發(fā)現(xiàn)棉線的信號:背景比和LOD類似于常規(guī)硝酸纖維素膜，如圖8中的劑量響應曲線中所示。同樣，不希望受理論束縛，據(jù)推測這種情況的出現(xiàn)是由于棉線的橫截面結(jié)構(gòu)(圖12中示出)是高度可變的，并且可不利地將較大的直徑微粒截留在除測試區(qū)或?qū)φ諈^(qū)之外的位置處。

對由尼龍-6纖維形成的合成聚合物線進行相同的熒光CRP測定滴定系列，并且意外地發(fā)現(xiàn)LOD比針對硝酸纖維素或棉的LOD低得多。圖9中包括示出這些結(jié)果的劑量響應曲線。通過對處于低至0.05ng/ml的不同稀釋的平行測定尼龍線的測量，測量>3.0的信號:背景比。因此預期針對尼龍線的CRP的LOD將為大約50pg/ml-比常規(guī)硝酸纖維素膜低大約187倍。此意外發(fā)現(xiàn)的意義非常重大，因為許多診斷測定需要高診斷靈敏度。例如，心臟肌鈣蛋白I標記物的測量(為診斷急性心肌梗塞)需要100pg/ml或更佳的靈敏度，因此認為合成線(例如尼龍)將允許將此診斷標記物的快速測試用于急診室中，而常規(guī)硝酸纖維素膜將是不適合的。

盡管不希望受任何理論束縛，但據(jù)信獲得尼龍線的高靈敏度，因為300nm銪珠粒未截留在尼龍長絲(203)之間的間隙(202)中，如圖13中所示。這導致產(chǎn)生低背景讀數(shù)，這進而又產(chǎn)生比硝酸纖維素膜更高的信號:背景比。此觀察被以下事實驗證，即就以0.1ng/ml測量的樣品而言，遠離測試線的背景讀數(shù)在尼龍線的情況中為平均1085次計數(shù)，這比處于相同CRP濃度的硝酸纖維素膜的計數(shù)低大約10倍。

圖14示出在以12.5ng/ml進行的CRP測定的情況中，具有與線表面結(jié)合的銪微粒的40微米直徑尼龍線上的檢測區(qū)位置的2500倍放大率的電子顯微鏡術(shù)圖像。在此圖像中可看出，一些銪微粒已與線表面單獨結(jié)合(作為單一顆粒201)，然而其他銪微粒已形成較大的聚簇206。盡管這些聚簇較大，但它們?nèi)匀荒軌蛲ㄟ^毛細管芯吸作用透過線中的間隙202進行運送，而不會不利地存納在線結(jié)構(gòu)的除檢測區(qū)或?qū)φ諈^(qū)之外的位置處。

除了合成線上的所需的低背景信號特征外，在使用合成線時的另一意外的發(fā)現(xiàn)是檢測區(qū)和對照區(qū)處的熒光信號與使用硝酸纖維素膜所獲得的那些熒光信號具有類似的強度。已知硝酸纖維素膜對于捕獲檢測區(qū)處的標記的分析物靶標而言具有非常高的表面積，并且已知這種高表面積為促進靈敏度增強的期望特征。相反，已知線具有較低的表面積，這在理論上應當會導致分析物靶標在測試區(qū)的相當?shù)偷臒晒庑盘枴Ｈ欢?，就硝酸纖維素膜而言，膜材料為不透明的白色，這意味著僅靠近膜的上表面的熒光微粒能夠被激發(fā)源激發(fā)。然而，就許多類型的合成線(包括尼龍線)而言，能夠使用透明纖維。如圖13中所示，這意味著激發(fā)光204能夠穿透若干個線203以激發(fā)所有間隙202中的銪微粒。此外，來自微粒的熒光發(fā)射光205能夠穿透若干個線回到檢測源。這樣，本發(fā)明中使用的合成線允許透過線結(jié)構(gòu)的整個深度讀取熒光信號，而在硝酸纖維素膜中，這僅在表面處有可能。我們認為這種能夠透過線的深度讀取的能力可補償線中可用于結(jié)合的表面積的損失。

因此，已意外低發(fā)現(xiàn)，當使用合成聚合物線而非常規(guī)硝酸纖維素膜作為多孔載體材料(即，芯吸基板)進行測定時，利用以熒光標記物包封的微粒的快速熒光側(cè)流免疫測定具有顯著改善的診斷靈敏度和再現(xiàn)性。包括合成聚合物線作為多孔載體材料(特別是當與熒光標記的微粒一起使用時)的免疫熒光測定因此可用于其中需要高靈敏度或也可能需要定量分析物靶標的快速診斷測定。