本申請基于35U.S.C.§119(e)要求2014年4月10日提交的美國臨時申請?zhí)?1/978,158的優(yōu)先權(quán)，通過引用將其全部內(nèi)容并入本文。領(lǐng)域本發(fā)明的諸方面涉及診斷和預(yù)后領(lǐng)域。背景先兆子癇(PE)是妊娠特異性高血壓病癥，并且是全世界產(chǎn)婦和圍產(chǎn)期發(fā)病率和死亡的主要原因。世界衛(wèi)生組織(WHO)估計，全球產(chǎn)婦死亡率(每年約63,000例產(chǎn)婦死亡)有16％是單由PE所致。在美國，先兆子癇影響所有妊娠的5-8％或27萬婦女，每年造成18％的產(chǎn)婦死亡并且發(fā)生率正在上升。嬰兒也有風(fēng)險；由于先兆子癇，在美國每年有10,500名嬰兒死亡。先兆子癇根據(jù)觀察到的癥狀診斷。沒有用于先兆子癇的準(zhǔn)確診斷產(chǎn)品。在資源有限的情況下，產(chǎn)婦死亡的風(fēng)險要高得多。導(dǎo)致大部分產(chǎn)婦和胎兒死亡的最常見的因素是未能及時識別先兆子癇。這是一個主要障礙，因為它不能將具有先兆子癇的女性轉(zhuǎn)移到更高水平的醫(yī)療機(jī)構(gòu)，在那里她可以用鎂、類固醇治療和/或在子癇，產(chǎn)婦高血壓中風(fēng)或因剝離導(dǎo)致的胎兒死亡之前緊急分娩。先兆子癇是一種不斷發(fā)展的病癥。因此，改善對臨床上無癥狀或不清楚有先兆子癇癥狀的婦女的先兆子癇的檢測將具有顯著的臨床重要性。這種策略稱為二級先兆子癇預(yù)防，并且具有通過預(yù)防由于驚厥、中風(fēng)、肺水腫、肝和/或腎衰竭和產(chǎn)婦死亡引起的子癇和末端器官系統(tǒng)損傷而減少妊娠相關(guān)死亡率和發(fā)病率的潛力。一旦診斷出嚴(yán)重先兆子癇(sPE)，硫酸鎂、抗高血壓藥物和醫(yī)學(xué)指示的分娩是已經(jīng)被證明可以挽救生命的策略(稱為三級先兆子癇預(yù)防的策略)。對于早產(chǎn)，安排醫(yī)學(xué)指示分娩的正確時間以允許保守治療(例如類固醇)對于改善新生兒結(jié)果也是已知的。用于預(yù)防先兆子癇并發(fā)癥的治療策略的使用是以對這種病癥的準(zhǔn)確診斷為條件。簡述先兆子癇是人類妊娠特有的高血壓蛋白尿綜合征。診斷先兆子癇的一個問題是高血壓和蛋白尿都不靈敏或特異，特別是在具有非典型表現(xiàn)的婦女中。先兆子癇婦女的尿高度富集錯誤折疊蛋白。由于錯誤折疊蛋白的這種富集，使用對錯誤折疊蛋白具有親和力的染料的簡單染色試驗可用作先兆子癇的診斷和臨床預(yù)后工具。一種這樣的染料測試的實例是剛果紅點測試(CongoRedDottest)，其包括使用對錯誤折疊蛋白具有親和力(例如，結(jié)合能力)的偶氮染料剛果紅。在一些實施方案中，本文提供了解決用于評估蛋白尿的典型尿液試紙的限制的科學(xué)和技術(shù)方法。在一些實施方案中，本文提供了允許在短時間(例如2分鐘)內(nèi)產(chǎn)生半定量結(jié)果的基于紙的方法(在一些實施方案中，稱為剛果紅點簡易試劑盒)。在一些實施方案中，本文還提供了用于圖像分析的基于智能手機(jī)的方法(在一些實施方案中，稱為剛果紅點定量試劑盒)，其有潛力地允許在短時間(例如，7分鐘)內(nèi)定量和無偏差地評估尿中的錯誤折疊蛋白，例如，以解決在醫(yī)療機(jī)構(gòu)(例如資源有限的醫(yī)療機(jī)構(gòu))中不能完成24小時蛋白尿評估。應(yīng)當(dāng)理解，剛果紅是可以根據(jù)本發(fā)明使用的染料的一個非限制性實例。為了簡單起見，本文所述的測試和試劑盒具體參考剛果紅(例如剛果紅點簡易試劑盒)；然而，在一些實施方案中，可以使用除了剛果紅之外的對錯誤折疊蛋白具有親和力的染料，并且如下所述，可以使用纖維素。類似地，提及“尿嗜剛果紅性(urinecongophilia)”，其指具有結(jié)合剛果紅的錯誤折疊蛋白的尿。應(yīng)當(dāng)理解，該術(shù)語并不意在限制。嗜剛果紅的蛋白質(zhì)也可以對可用作剛果紅替代品的其它染料具有親和力。本發(fā)明的一些方面提供了確定從受試者(例如，孕婦)獲得的樣品(例如，尿樣)含有或不含有錯誤折疊蛋白的方法。在一些實施方案中，所述方法包括(a)將從受試者(例如，孕婦)獲得的樣品(例如，尿樣)與結(jié)合錯誤折疊蛋白和含有游離羥基的材料(例如纖維素)的染料混合，從而產(chǎn)生一溶液(例如，尿液和染料的溶液)；(b)在染料結(jié)合錯誤折疊蛋白和含有游離羥基的材料(例如纖維素)的條件下，將溶液施加到包含含有游離羥基的材料(例如，纖維素)的表面，從而在表面上產(chǎn)生斑點(例如，包含染料的斑點)；(c)在溶液(例如，包含錯誤折疊蛋白和染料的尿液)發(fā)生擴(kuò)散的條件下，保持表面上的斑點；和(d)如果染料從表面上的斑點擴(kuò)散(例如，徑向擴(kuò)散)至可感知的程度，則確定樣品(例如，尿樣)包含錯誤折疊蛋白，或者如果染料不從表面上的斑點擴(kuò)散(例如，徑向擴(kuò)散)到可感知的程度，則確定樣品(例如，尿樣)不包含錯誤折疊蛋白。在一些實施方案中，染料結(jié)合錯誤折疊蛋白和含有游離羥基的材料的條件包括室溫(例如)條件下30分鐘至3小時或更長(例如30分鐘，1小時，2小時或3小時)。本發(fā)明的一些方面提供了檢測從受試者(例如，孕婦)獲得的樣品(例如，尿樣)中的錯誤折疊蛋白的方法。在一些實施方案中，所述方法包括(a)將從受試者(例如，孕婦)獲得的樣品(例如，尿樣)與結(jié)合錯誤折疊蛋白和包含含有游離羥基的材料(例如，纖維素)的表面的染料混合，從而產(chǎn)生該樣品(例如，尿液)和染料的溶液；(b)在所述染料結(jié)合錯誤折疊蛋白、結(jié)合包含含有游離羥基的材料的表面、或結(jié)合錯誤折疊蛋白和包含含有游離羥基的材料的表面的條件下，將所述溶液施加到包含含有游離羥基的材料的表面，例如包含纖維素的表面，從而在表面上產(chǎn)生斑點；(c)在溶液(例如，包含錯誤折疊蛋白和染料的尿液)發(fā)生擴(kuò)散的條件下，保持表面上的斑點；和(d)如果染料從表面上的斑點擴(kuò)散(例如，徑向擴(kuò)散)至可感知的程度，則檢測樣品(例如，尿樣)中的錯誤折疊蛋白，如果染料不從表面上的斑點擴(kuò)散(例如，不以徑向擴(kuò)散)到可感知的程度，則不檢測樣品(例如，尿樣)中的錯誤折疊蛋白。本發(fā)明的一些方面提供了檢測從受試者(例如，孕婦)獲得的樣品(例如，尿樣)中的錯誤折疊蛋白的方法。在一些實施方案中，所述方法包括(a)將從受試者(例如，孕婦)獲得的樣品(例如，尿樣)與結(jié)合錯誤折疊蛋白和包含含有游離羥基的材料(例如，纖維素)的表面的染料混合，從而產(chǎn)生樣品(例如，尿液)和染料的溶液；(b)在所述染料結(jié)合錯誤折疊蛋白、結(jié)合包含含有游離羥基的材料的表面、或結(jié)合錯誤折疊蛋白和包含含有游離羥基的材料的表面的條件下，將所述溶液施加到包含含有游離羥基的材料的表面，例如包含纖維素的表面，從而在表面上產(chǎn)生斑點；(c)在溶液(例如，包含錯誤折疊蛋白和染料的尿液)發(fā)生擴(kuò)散的條件下，保持表面上的斑點；和(d)確定染料是否從表面上的斑點擴(kuò)散到可感知的程度，其中，如果染料擴(kuò)散到可感知的程度，則在樣品(例如，尿樣)中檢測到錯誤折疊蛋白，如果染料不擴(kuò)散到可感知的程度，則在尿樣中沒有檢測到錯誤折疊蛋白。本發(fā)明的一些方面提供了確定從孕婦獲得的樣品(例如，尿樣)含有或不含錯誤折疊蛋白的方法，包括(a)將從孕婦獲得的樣品(例如尿樣)與結(jié)合錯誤折疊蛋白和包含含有游離羥基的材料(例如，纖維素)的表面的染料混合，從而產(chǎn)生樣品(例如尿)和染料的溶液；(b)在所述染料結(jié)合錯誤折疊蛋白、結(jié)合包含含有游離羥基的材料的表面，或結(jié)合錯誤折疊蛋白和包含含有游離羥基的材料的表面的條件下，將所述溶液施加到包含含有游離羥基的材料(例如，纖維素)的表面，從而在所述表面上產(chǎn)生斑點；(c)在溶液(例如，包含錯誤折疊蛋白和染料的尿液)發(fā)生擴(kuò)散的條件下，保持表面上的斑點；和(d)如果通過表面的溶液被著色，則確定樣品(例如，尿樣)包含錯誤折疊蛋白，或者如果通過表面的溶液是無色的，則確定樣品(例如，尿樣)不包含錯誤折疊蛋白。在一些實施方案中，方法還包括比較溶液(例如尿液和染料的溶液)從表面上的斑點擴(kuò)散(例如，徑向擴(kuò)散)的程度與陽性對照擴(kuò)散的程度，并且，如果溶液(例如，尿液和染料的溶液)從表面上的斑點擴(kuò)散(例如，徑向擴(kuò)散)的程度與陽性對照中擴(kuò)散發(fā)生的程度相當(dāng)，則確定樣品(例如，尿樣)包含錯誤折疊蛋白。在一些實施方案中，方法還包括比較溶液(例如尿液和染料的溶液)從表面上的斑點擴(kuò)散(例如，徑向擴(kuò)散)的程度與陰性對照擴(kuò)散的程度，并且，如果溶液(例如，尿液和染料的溶液)從表面上的斑點擴(kuò)散(例如，徑向擴(kuò)散)的程度與在陰性對照中擴(kuò)散發(fā)生的程度相當(dāng)，則確定樣品(例如，尿樣)不包含錯誤折疊蛋白。在一些實施方案中，方法還包括(e)稀釋孕婦的另外樣品(例如尿樣)，從而產(chǎn)生稀釋的樣品(例如稀釋的尿樣)；(f)將稀釋的樣品(例如尿樣)與結(jié)合錯誤折疊蛋白和包含含有游離羥基的材料(例如纖維素)的表面的染料混合，從而產(chǎn)生溶液(例如尿液和染料的溶液)；(g)在染料結(jié)合錯誤折疊蛋白、結(jié)合包含含有游離羥基的材料的表面、或結(jié)合錯誤折疊蛋白和包含含有游離羥基的材料的表面的條件下，將溶液(f)施加到包含纖維素的表面，從而在表面上產(chǎn)生斑點；(h)在溶液(例如，包含錯誤折疊蛋白和染料的尿液)發(fā)生擴(kuò)散的條件下，保持表面上的斑點；和(i)如果染料從步驟(h)的表面上的斑點擴(kuò)散(例如，徑向擴(kuò)散)，則確定稀釋的樣品(例如，尿樣)包含錯誤折疊蛋白，或如果染料不從維持在(h)的表面上的斑點擴(kuò)散(例如，徑向擴(kuò)散)，則確定樣品(例如，尿樣)不包含錯誤折疊蛋白。在一些實施方案中，將另外樣品(例如，尿樣)稀釋至進(jìn)行該方法的條件所需的程度，例如，5倍至15倍(例如，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，11倍，12倍，13倍，14倍或15倍)。在一些實施方案中，受試者是孕婦。在一些實施方案中，受試者是懷疑患有先兆子癇的孕婦。在一些實施方案中，受試者是處于先兆子癇發(fā)展風(fēng)險(例如，遺傳易患的或先前患有的)的孕婦。在一些實施方案中，如果樣品(例如，尿樣)含有錯誤折疊蛋白或如果檢測到錯誤折疊蛋白，則所述方法還包括診斷孕婦患有先兆子癇或可能發(fā)展為先兆子癇。在一些實施方案中，染料是剛果紅。在一些實施方案中，溶液中染料的濃度為0.05％至0.2％。例如，溶液中染料的濃度可以為0.1％。在一些實施方案中，含有游離羥基的材料是纖維素。在一些實施方案中，表面是紙或含有紙。在一些實施例中，表面還包括粘合劑背襯。本發(fā)明的一些方面提供了確定從受試者(例如，孕婦)獲得的樣品(例如，尿樣)含有或不含有錯誤折疊蛋白的方法。在一些實施方案中，所述方法包括(a)將從受試者(例如，孕婦)獲得的樣品(例如，尿樣)與結(jié)合錯誤折疊蛋白和含有游離羥基的材料(例如，纖維素)的第一染料和第二染料混合，從而產(chǎn)生溶液(例如尿液和兩種染料的溶液)，所述第二染料與第一染料顏色不同并且不結(jié)合錯誤折疊蛋白和含有游離羥基的材料(例如纖維素)；(b)在第一染料結(jié)合錯誤折疊蛋白、結(jié)合包含含有游離羥基的材料(例如纖維素)的表面，或結(jié)合錯誤折疊蛋白和包含含有游離羥基的材料的表面的條件下，將溶液施加到包含含有游離羥基的材料(例如，纖維素)的表面，從而在表面上產(chǎn)生斑點；(c)在溶液(例如，包含錯誤折疊蛋白和染料的尿液)發(fā)生擴(kuò)散的條件下，保持表面上的斑點；和(d)如果第一染料和第二染料從表面上的斑點擴(kuò)散(例如，徑向地)到可感知的程度，則確定樣品(例如，尿樣)包含錯誤折疊蛋白，如果第二染料，而不是第一染料，從表面上的斑點擴(kuò)散(例如，徑向地)到可感知的程度，則確定樣品(例如，尿樣)不含有錯誤折疊蛋白。本發(fā)明的一些方面提供了檢測受試者(例如，孕婦)中錯誤折疊蛋白的方法。在一些實施方案中，所述方法包括(a)將從受試者(例如，孕婦)獲得的樣品(例如，尿樣)與(i)結(jié)合錯誤折疊蛋白和含有游離羥基的材料(例如，纖維素)的第一染料和(ii)與第一染料顏色不同并且不結(jié)合錯誤折疊蛋白和含有游離羥基的材料(例如纖維素)的第二染料混合，從而產(chǎn)生溶液(例如，尿液和兩種染料的溶液)；(b)在第一染料結(jié)合錯誤折疊蛋白和纖維素的條件下，將溶液施加于包含纖維素的表面，從而在表面上產(chǎn)生斑點；(c)在溶液(例如，包含錯誤折疊蛋白和染料的尿液溶液)發(fā)生擴(kuò)散的條件下，保持表面上的斑點；和(d)如果第一染料和第二染料從表面上的斑點擴(kuò)散(例如，徑向擴(kuò)散)到可感知的程度，則檢測到樣品(例如，尿樣)中的錯誤折疊蛋白，如果第二染料，而不是第一染料，從表面上的斑點擴(kuò)散(例如，徑向地)到可感知的程度，則未檢測到樣品(例如，尿樣)中的錯誤折疊蛋白。在一些實施方案中，所述方法還包括比較溶液(例如尿液和兩種染料的溶液)從表面上的斑點擴(kuò)散(例如，徑向擴(kuò)散)的程度與陽性對照中擴(kuò)散發(fā)生的程度，并且，如果溶液(例如尿液和兩種染料的溶液)從表面上的斑點徑向擴(kuò)散的程度與陽性對照中發(fā)生擴(kuò)散的程度相當(dāng)，則確定樣品(例如，尿樣)含有錯誤折疊蛋白。在一些實施方案中，所述方法還包括比較溶液(例如尿液和兩種染料的溶液)從表面上的斑點擴(kuò)散(例如，徑向擴(kuò)散)的程度與陰性對照中發(fā)生擴(kuò)散的程度，以及，如果溶液(例如，尿液和兩種染料的溶液)從表面上的點徑向擴(kuò)散的程度與陰性對照中發(fā)生擴(kuò)散的程度相當(dāng)，則確定樣品(例如，尿樣)含有錯誤折疊蛋白。在一些實施例中，所述方法還包括獲取表面上的斑點的圖像。可以例如使用移動電話來獲取圖像。在一些實施方案中，所述方法還包括定量測定第一染料從表面上的斑點徑向擴(kuò)散的程度與第二染料從表面上的斑點徑向擴(kuò)散的程度之間的差異?？梢允褂脙煞N不同的染料，例如，在本文提供的校準(zhǔn)程序中。在一些實施方案中，所述方法還包括計算第一染料從表面上的點徑向擴(kuò)散的程度與第二染料從表面上的點徑向擴(kuò)散的程度之間的相關(guān)系數(shù)。例如，可以使用算法(例如，評估用智能手機(jī)拍攝的圖片的不同顏色通道中的信號之間的相關(guān)系數(shù)(ρ)的算法)來計算相關(guān)系數(shù)。在一些實施方案中，第一染料是剛果紅。在一些實施方案中，第二染料是羊毛罌紅(erioglaucine)。在一些實施方案中，第一染料在溶液中的濃度為0.05％至0.2％。例如，第一染料在溶液中的濃度可以為0.1％。在一些實施方案中，第二染料在溶液中的濃度為0.05％至0.2％。例如，第二染料在溶液中的濃度可以為0.1％。在一些實施方案中，所述方法還包括(e)稀釋孕婦的另外樣品(例如尿樣)，從而產(chǎn)生稀釋的樣品(例如，尿樣)，(f)將樣品(例如尿樣)與結(jié)合錯誤折疊蛋白和含有游離羥基的材料(例如纖維素)的第一染料和第二染料混合，從而產(chǎn)生溶液(例如，尿液和兩種染料的溶液)，所述第二染料不同于第一染料并且不結(jié)合錯誤折疊蛋白和含有游離羥基的材料(例如纖維素)；(g)在第一染料結(jié)合錯誤折疊蛋白和含有游離羥基的材料(例如纖維素)的條件下，將(f)的溶液施加到包含含游離羥基的材料(例如纖維素)的表面，從而在表面上產(chǎn)生斑點；(h)在溶液(例如，包含錯誤折疊蛋白和染料的尿液)發(fā)生擴(kuò)散的條件下，保持步驟(g)的表面上的斑點；和(i)如果第一染料和第二染料從(h)的表面上的斑點擴(kuò)散(例如，徑向擴(kuò)散)，則確定稀釋的樣品(例如，尿樣)包含錯誤折疊蛋白，或如果第二染料，而不是第一染料，從(h)的表面上的斑點擴(kuò)散(例如，徑向擴(kuò)散)，則確定樣品(例如尿樣)不包含錯誤折疊蛋白。在一些實施方案中，將另外的樣品(例如，尿樣)稀釋5倍至15倍。本文還描述了用于確定從受試者(例如，孕婦)獲得的樣品(例如，尿樣)含有或不含錯誤折疊蛋白的試劑盒。一些實施方案是用于檢測從受試者(例如，孕婦)獲得的樣品(例如，尿樣)中的錯誤折疊蛋白的試劑盒。在一些實施方案中，試劑盒包含(a)與錯誤折疊蛋白和纖維素結(jié)合的染料，(b)包含含有游離羥基的材料(例如纖維素)的表面，和任選的施加器。在一些實施方案中，包含含有游離羥基的材料(例如，纖維素)的表面固定在另外的表面上。在一些實施方案中，染料是在水溶液中(例如，預(yù)加載在施加器內(nèi))。水溶液可以包含例如水或其它緩沖液(例如磷酸緩沖鹽水)。在一些實施方案中，水溶液不含醇(例如，乙醇，甲醇，異丙醇)。在一些實施方案中，染料在水溶液中的濃度為0.2％至1.0％。例如，染料在水溶液中的濃度可以為0.5％。在一些實施方案中，水溶液的體積為1μl至10μl。例如，水溶液的體積可以為5μl。在一些實施方案中，試劑盒還包括施加器(例如，移液管，如一次性移液管)。在一些實施例中，施加器預(yù)先裝載有染料。在一些實施方案中，試劑盒還包含陽性對照、陰性對照、或陽性對照和陰性對照兩者。在一些實施方案中，試劑盒還包含陽性和陰性結(jié)果的圖像，用于與測試結(jié)果比較以確定樣品對于錯誤折疊蛋白的存在是陽性還是陰性。本文還描述了用于確定從受試者(例如，孕婦)獲得的樣品(例如，尿樣)含有或不含有錯誤折疊蛋白的試劑盒。一些實施方案是用于檢測從受試者(例如，孕婦)獲得的樣品(例如，尿樣)中的錯誤折疊蛋白的試劑盒。在一些實施方案中，試劑盒包含(a)結(jié)合錯誤折疊蛋白和含有游離羥基的材料(例如纖維素)的第一染料，(b)與第一染料顏色不同且不結(jié)合錯誤折疊蛋白和含有游離羥基的材料(例如纖維素)的第二染料，(c)包含含有游離羥基的材料(例如纖維素)的表面，和(d)任選的施加器。在一些實施方案中，第一染料是剛果紅。在一些實施方案中，第二染料是羊毛罌紅。在一些實施方案中，表面是紙。在一些實施方案中，將第一染料和第二染料在水溶液中合并，從而產(chǎn)生兩種染料的水溶液。在一些實施方案中，兩種染料在水溶液中的濃度為0.2％至1.0％。例如，兩種染料在水溶液中的濃度可以為0.5％。在一些實施方案中，水溶液的體積為1μl至10μl。例如，水溶液的體積可以為7.5μl。在一些實施方案中，施加器預(yù)負(fù)載有兩種染料的水溶液。在一些實施方案中，施加器是移液管(例如，一次性移液管)。在一些實施方案中，試劑盒還包含陽性對照、陰性對照、或陽性對照和陰性對照兩者。本文還描述了包含尿液(例如，從孕婦獲得)，結(jié)合錯誤折疊蛋白和纖維素的染料和包含纖維素的表面的組合物。本文進(jìn)一步描述的是包括本文所述的任何一種試劑盒和從孕婦獲得的尿樣的裝置。在一些實施方案中，該方法還包括治療先兆子癇的受試者(例如，施用藥物以降低血壓，施用皮質(zhì)類固醇，施用抗驚厥藥物)。一些方面涉及確定孕婦是否患有先兆子癇或處于患有先兆子癇的風(fēng)險的方法，所述方法包括(a)將來自孕婦的尿樣與剛果紅混合，從而產(chǎn)生尿液和剛果紅的溶液；(b)將所述溶液施加到包含纖維素的表面，從而在所述表面上產(chǎn)生斑點；(c)在包括染料的尿液溶液發(fā)生擴(kuò)散的條件下，保持所述表面上的斑點；和(d)如果剛果紅從表面上的斑點擴(kuò)散到可感知的程度，則確定孕婦患有先兆子癇或處于先兆子癇的風(fēng)險中。一些方面提供了檢測從孕婦獲得的尿樣中錯誤折疊蛋白的方法，包括(a)向吸附有剛果紅的表面施用從孕婦獲得的尿樣，從而產(chǎn)生含有尿液和剛果紅的表面，和(b)使含有尿液和剛果紅的表面進(jìn)行等電聚焦，和(c)確定剛果紅的遷移程度或速率。在一些實施方案中，所述方法還包括比較剛果紅與適當(dāng)?shù)年栃曰蜿幮詫φ盏倪w移程度或速率，其中剛果紅相對于適當(dāng)對照的遷移程度或速率的差異說明尿樣中有錯誤折疊蛋白?！暗入娋劢埂笔侵竿ㄟ^其等電點(pI)的差異分離不同分子的技術(shù)。等電聚焦是一種區(qū)域電泳，通常應(yīng)用于凝膠(或其他多孔基質(zhì))中的蛋白質(zhì)，利用目的分子上的總電荷與其周圍pH呈函數(shù)關(guān)系的事實。在一些實施方案中，表面是允許蛋白質(zhì)和染料移動(例如，如朝向正或負(fù)電極的遷移)的多孔表面。例如，表面可以是瓊脂糖凝膠或瓊脂糖珠。本文考慮了其它多孔表面。附圖簡述圖1顯示了使用“普通”紙和從三個不同測試受試者獲得的尿樣的本發(fā)明方法的實施例的比較：患有嚴(yán)重先兆子癇的孕婦(病例1)；患有先兆子癇的孕婦(病例2)；和無先兆子癇的孕婦?！翱瞻住北硎九c水混合的剛果紅染料；“樣品”(兩個彼此相鄰)表示與指定的尿樣混合的剛果紅染料。圖2示出了“良好”測試紙，“可接受”測試紙和“差”測試紙的實施例的比較。示出的實施例用作評估利用智能電話拍攝的圖片的不同顏色通道(在該特定情況下，紅色通道和藍(lán)色通道)中信號之間的相關(guān)系數(shù)(ρ)的算法的基礎(chǔ)。ρNorm計算是基于來自沒有先兆子癇的孕婦的樣品；ρPE計算是基于來自患有先兆子癇的孕婦的樣品。圖3A-3C顯示了本發(fā)明的三種不同診斷試劑盒的實施例的照片。圖3A描繪了剛果紅簡易試劑盒；圖3B描繪了剛果紅定量試劑盒；圖3C描繪了剛果紅定量陣列。圖4示出了剛果紅定量陣列分析的實例的每個步驟的照片。圖5顯示了研究設(shè)計的流程圖以及捐贈用于實施例2的剛果紅點測試的尿樣的婦女。圖6A-6I顯示了患有嚴(yán)重先兆子癇(sPE)的婦女的尿液中的光譜特征蛋白質(zhì)聚集和嗜剛果紅性的實例。圖7A-7F示出了尿液嗜剛果紅性的診斷和預(yù)后特征的實例。圖8A-8D顯示了尿寡聚免疫反應(yīng)性和與先兆子癇嚴(yán)重程度相關(guān)性的實例。圖9A-9K顯示了從患有嚴(yán)重先兆子癇(sPE)的婦女的尿中分離的嗜剛果紅聚集體的微觀和免疫反應(yīng)特征的實例。圖10A-10F顯示了患有嚴(yán)重先兆子癇的女性的尿中的淀粉樣前體蛋白(APP)蛋白形式的實例。圖11A-11C顯示了人胎盤中淀粉樣前體蛋白和原型淀粉樣前體蛋白加工酶的mRNA表達(dá)的實例。圖11D顯示了在統(tǒng)計上未改變的轉(zhuǎn)錄物的相對定量。圖12A-12P顯示了人胎盤中淀粉樣前體蛋白和原型淀粉樣前體蛋白加工酶的免疫定位的實例。圖13顯示了尿嗜剛果紅性與24小時尿蛋白尿的定量關(guān)系的實例。圖14顯示了與先兆子癇錯折疊體相關(guān)的蛋白質(zhì)身份的蛋白印跡驗證的實例。圖15A-15F顯示了干擾素誘導(dǎo)蛋白6-16(G1P3)同種型的比較性聚集預(yù)測的實例。同種型A(SEQIDNO：1)；同種型B(SEQIDNO：2)；和同種型C(SEQIDNO：3)。圖16A-16D顯示了來自患有先兆子癇的孕婦的尿中的淀粉樣前體蛋白免疫反應(yīng)性的模式的實例：白蛋白消耗的影響(圖16A，16B)和APP免疫反應(yīng)性的模式(圖16C，16D)。圖17A-17D顯示了ALZ90和G1P3表位在先兆子癇胎盤中鈣化的阿爾茨海默病樣斑中的免疫定位的實例。圖18A-18J顯示了來自患有先兆子癇的婦女的胎盤中的β-分泌酶BACE1和BACE2的免疫反應(yīng)性模式的實例。圖19A-19C顯示了具有根據(jù)SERPINA1序列(SEQIDNO：4)所作的生物標(biāo)記組分和先兆子癇(PE)的尿蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜的實例。圖19C：SERPINA1(蛋白形式)的C端片段--SEQIDNO：5(上部)和SEQIDNO：6(下部)。圖20A-20F示出了在實施例3中描述的研究的階段1期間，自動剛果紅保留計算算法的實例的比較。圖21示出了剛果紅點測試和圖像處理例程的示例的工作流程圖。圖22A-22C示出了在實施例3中描述的研究的階段2中，智能手機(jī)輔助的剛果紅保留計算的實例的評價和等效性測試。圖23示出了剛果紅點測試陣列智能電話應(yīng)用的示例的逐屏幕工作流程。圖24示出了用于陣列分析的樣本定位模板的示例。圖25A-25B示出了本發(fā)明的剛果紅點簡易試劑盒的示例。圖25A示出了三折疊-構(gòu)造試劑盒的前部。圖25B示出了三折疊-構(gòu)造試劑盒的背部。圖26A-26B描繪了本發(fā)明的剛果紅點定量試劑盒的實例。圖26A示出了三折疊-構(gòu)造試劑盒的前部。圖26B示出了三折疊-構(gòu)造試劑盒的背部。圖27A顯示了從左到右對照尿滴隨著漸增的剛果紅/食物染料比率的擴(kuò)散的實例。圖27B顯示了從左到右先兆子癇尿滴隨著漸增的剛果紅/食物染料比率的擴(kuò)散的實例。圖28顯示了含有施用于含有剛果紅的瓊脂糖凝膠(例如，吸附在凝膠表面上)的非先兆子尿樣(泳道1和3)和先兆子癇尿樣(泳道4和5)的圖像。當(dāng)凝膠進(jìn)行等電聚焦時，尿中的蛋白質(zhì)被推過凝膠，當(dāng)它們到達(dá)吸附的剛果紅染料時，蛋白質(zhì)插入染料。與嗜剛果紅蛋白(在先兆子癇尿液中)結(jié)合的剛果紅以不同于未與嗜剛果紅蛋白結(jié)合的剛果紅的速率(或程度)遷移通過凝膠。詳述一個重大的挑戰(zhàn)是，先兆子癇(PE)診斷、高血壓和蛋白尿的基石依賴于血壓(BP)和尿蛋白的定量測量，其是先兆子癇的癥狀，但不是特異性的。此外，這些測量在低資源配置環(huán)境中難以實現(xiàn)。此外，即使在高資源配置環(huán)境中，當(dāng)先兆子癇與慢性高血壓(crHTN)(例如稱為spPE)或慢性腎臟疾病共存時，先兆子癇的診斷繼續(xù)是母胎醫(yī)學(xué)專家的難題。其他難題由“非典型”臨床表現(xiàn)(如孤立的神經(jīng)癥狀、右上腹痛、升高的肝酶和少尿)構(gòu)成，其有時表現(xiàn)為高血壓或蛋白尿最低或不存在。在高資源配置環(huán)境下，這些婦女被允許進(jìn)入三級醫(yī)院，并且每4-6小時進(jìn)行大量的血液和尿液實驗室檢查以及連續(xù)的血壓和胎兒監(jiān)測。在許多低資源配置環(huán)境和不發(fā)達(dá)國家中，這實際上是不可能實現(xiàn)的。根據(jù)聯(lián)合國兒童基金會(UNICEF)的資料，在發(fā)展中世界，80％的婦女從熟練的保健提供者處接受產(chǎn)前護(hù)理(ANC)，至少在懷孕期間接受一次。然而，ANC訪問的質(zhì)量和數(shù)量對于有效檢測先兆子癇仍然是次優(yōu)的。由于單獨的產(chǎn)前護(hù)理實踐已被證明在預(yù)防子癇中是無效的，錯過的機(jī)會是不能在每次產(chǎn)前護(hù)理訪問時測量血壓和蛋白尿。事實上，在產(chǎn)前護(hù)理訪問期間，更多的女性似乎會測量血壓，但是不會篩尿液的蛋白質(zhì)。顯然，在不評估蛋白尿的情況下，不能獲得來自更良性的妊娠相關(guān)的高血壓病癥(例如crHTN和妊娠高血壓(gestHT))的先兆子癇的正確篩選或鑒別診斷。在低資源配置環(huán)境中改進(jìn)對蛋白尿的評估以檢測先兆子癇可能填補(bǔ)空白。為了對在臨床機(jī)構(gòu)中劃入或排除先兆子癇有意義，可以定量評估蛋白尿。生理變化以及水合(hydration)、姿勢和妊娠本身改變尿中蛋白質(zhì)的存在量。由于這些原因，懷孕中蛋白尿評估的“黃金”標(biāo)準(zhǔn)來自定時(24小時)尿液收集。在美國和加拿大，大多數(shù)懷疑患有先兆子癇的婦女在收集期間住院，但有些可作為門診病人管理，并被指示在家里收集24小時尿樣。收集完整樣品的負(fù)擔(dān)以及每個空隙之間的冷藏要求導(dǎo)致不依從性和測試不準(zhǔn)確性。在加拿大的一項檢測24小時收集的完成度的研究發(fā)現(xiàn)，評估先兆子癇的女性標(biāo)本中有60％是體積不足的。由于所有上述原因，并且雖然已知不如24小時蛋白尿準(zhǔn)確，但尿液試紙仍然是用于先兆子癇篩選的常用方法。幾個研究已經(jīng)表明，尿液試紙與大量的假陽性和陰性相關(guān)，這使得它們在檢測或排除孕婦的蛋白尿中不可靠。對超過900名婦女的前瞻性研究表明，當(dāng)應(yīng)用于低風(fēng)險人群時，在沒有高血壓的情況下，該試紙對先兆子癇發(fā)展的預(yù)測不良(例如，高假陽性率)。該研究中大約40％的婦女在懷孕期間具有至少一個+1或更多的結(jié)果。然而，只有4％發(fā)生先兆子癇。尿道感染，陰道分泌物、血液或精液對尿液的污染是高假陽性讀數(shù)的最常見原因。與護(hù)士的讀數(shù)相比，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)患者對試紙讀數(shù)的自我評估高估了陽性。試紙還需要適當(dāng)?shù)拇鎯?、處理和主觀視覺讀取，即使在受過訓(xùn)練的人員中，這些都被認(rèn)為是重要的錯誤來源。此外，公認(rèn)的是，試紙所用的比色試劑(例如，四溴苯酚藍(lán))僅檢測在先兆子癇尿中排泄的蛋白質(zhì)的一部分。例如，兩類蛋白，BenceJones蛋白類似的IgG的輕鏈和片段化白蛋白，與先兆子癇病理性相關(guān)，并且沒有試紙反應(yīng)。這表明試紙可能低估總量，并且缺乏與篩選時存在于尿液中的蛋白質(zhì)類型相關(guān)的重要的定性數(shù)據(jù)。在一些實施方案中，本文提供了方法和組合物(例如試劑盒)：(1)適用于一級產(chǎn)前護(hù)理診所；(2)至少與試紙一樣容易使用，但對先兆子癇的蛋白尿更特異；(3)在定量規(guī)模上更具重現(xiàn)性；和(4)具有預(yù)測結(jié)果的潛力。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物與用于理想診斷的ASSURED標(biāo)準(zhǔn)一致(對于那些處于感染風(fēng)險的是可以負(fù)擔(dān)的，對于那些需要的是敏感的和特異性的、用戶友好的、快速和穩(wěn)健的、無設(shè)備的、和遞送的(delivered))。令人驚訝的是，患有先兆子癇的婦女在尿液中分泌高水平的錯誤折疊蛋白。這增加嚴(yán)重性并且早于臨床表現(xiàn)發(fā)病達(dá)10周。原則上，這種現(xiàn)象將先兆子癇分類為類似于阿爾茨海默病和朊病毒病的蛋白質(zhì)構(gòu)象障礙。此外，從患有先兆子癇的婦女獲得的尿中，在某些情況下，血液中，使用某些染料(例如，偶氮染料剛果紅)可檢測到錯誤折疊蛋白的存在。例如，剛果紅具有自組裝性質(zhì)，并且可以在與具有廣泛的β-折疊結(jié)構(gòu)的淀粉樣蛋白結(jié)合后引發(fā)大的不溶性寡聚體的形成。如果存在于樣品(例如，尿樣)的蛋白質(zhì)中，剛果紅可以插入β-折疊結(jié)構(gòu)。這里描述的是用于先兆子癇的簡單比色尿診斷測試，稱為剛果紅點測試。即使在隨機(jī)單一空隙的樣品中作評估，尿液中錯誤折疊蛋白的檢測具有先兆子癇的診斷和預(yù)后價值。這一點的理由如本文所示，與目前使用的方法(例如，在24小時尿收集物中的試紙和濁度法)相反，與非特異性蛋白尿的存在相比，錯誤折疊蛋白的存在與先兆子癇病理生理學(xué)連接更緊密。因此，在一些情況下，當(dāng)考慮診斷先兆子癇時，尿液中錯誤折疊蛋白的陽性結(jié)果表明負(fù)責(zé)臨床顯著蛋白尿的蛋白質(zhì)也被錯誤折疊。定性地發(fā)現(xiàn)這種錯誤折疊蛋白尿的存在是先兆子癇的獨特特征，其不伴隨在妊娠期間發(fā)生的其它高血壓病癥。部分地基于該評估，本文提供了用于，例如基于尿中的錯誤折疊蛋白以高度確定性建立先兆子癇診斷的方法和組合物(例如試劑盒)。所述方法和組合物為醫(yī)療保健提供者提供了顯著的臨床優(yōu)勢，因為它們使得快速診斷性篩選足夠可靠，以便能夠采用適當(dāng)?shù)母深A(yù)。本發(fā)明的一些方面涉及確定從受試者(例如，孕婦)獲得的尿樣含有或不含有錯誤折疊蛋白的方法。本發(fā)明的其它方面涉及檢測從受試者(例如，孕婦)獲得的樣品(例如，尿樣)中的錯誤折疊蛋白的方法。蛋白質(zhì)折疊是蛋白質(zhì)呈現(xiàn)其最小能量構(gòu)型的過程。當(dāng)從mRNA的序列翻譯成氨基酸的線形鏈時，每種蛋白質(zhì)作為未折疊的多肽或無規(guī)則卷曲存在。在蛋白質(zhì)折疊過程中，多肽從無規(guī)則卷曲折疊成其特征性的和功能性的三維結(jié)構(gòu)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遵循錯誤的折疊途徑或能量最小化漏斗(funnel)時，可能出現(xiàn)錯誤折疊蛋白，并且錯誤折疊可以自發(fā)發(fā)生。錯誤折疊蛋白也可能由異常的降解、清除機(jī)制或蛋白質(zhì)聚集(proteincrowding)引起。錯誤折疊蛋白通常但不總是不溶性的，并且傾向于形成稱為淀粉樣沉積物的長線性或纖維狀聚集體(DobsonC.M.Nature426,884-890,2003,通過引用并入本文)。可單獨檢測或作為異源共聚集體的錯誤折疊蛋白的實例包括但不限于Serpina-1、白蛋白、無IgGκ的輕鏈(κFLC)、血漿銅藍(lán)蛋白、干擾素誘導(dǎo)蛋白6-16(IFI6，也稱為G1P3)、淀粉樣前體蛋白(APP)。在一些實施方案中，錯誤折疊蛋白是嗜剛果紅蛋白或嗜剛果紅蛋白聚集體。在一些實施方案中，錯誤折疊蛋白可以是淀粉樣蛋白或β-折疊聚集體。在一些實施方案中，錯誤折疊蛋白是Serpina-1和白蛋白的非隨機(jī)切割片段的聚集體。在一些實施方案中，錯誤折疊蛋白是淀粉樣蛋白，并且可以展示表位，包括例如原纖維狀寡聚物和環(huán)狀原纖維。尿樣可以通過任何標(biāo)準(zhǔn)方法收集，例如但不限于，使用干凈捕獲方法，該方法利用具有蓋的杯(例如，無菌杯)。在一些實施方案中，當(dāng)尿已經(jīng)在受試者的膀胱中存在1至5小時(例如，1、2、3、4或5小時)時收集尿樣。在一些實施方案中，當(dāng)尿已經(jīng)在受試者的膀胱中存在少于1小時或多于5小時時收集尿樣。應(yīng)當(dāng)理解，從受試者收集的整個尿樣不一定在本發(fā)明的方法中使用。在一些實施方案中，用于本發(fā)明方法的“尿樣”(例如，與染料結(jié)合的樣品)為10μl至1ml，或更多。在一些實施方案中，尿樣為50μl至500μl。在一些實施方案中，尿樣為10μl、20μl、30μl、40μl、50μl、60μl、70μl、80μl、90μl、100μl、110μl、120μl、130μl、150μl、160μl、170μl、180μl、190μl或200μl。在一些實施方案中，尿樣為100μl、200μl、300μl、400μl或500μl。受試者可以是懷疑在他或她的尿中具有錯誤折疊蛋白的任何受試者。在一些實施方案中，受試者是女性，例如孕婦。在一些實施方案中，受試者是懷疑患有和/或有患先兆子癇風(fēng)險的孕婦。本發(fā)明的尿樣可以從懷孕1至20周、20至40周、或1至40周的婦女或更晚時期的婦女獲得。在一些實施方案中，尿樣從懷孕1至5周、1至10周、1至15周、5至10周、5至15周、5至20周、10至15周、10至20周或15至20周的孕婦獲得。在一些實施方案中，尿樣是從懷孕15至20周、15至25周、15至30周、15至35周、15至40周、20至30周、20至35周、20至40周、25至25周，5或25至40周的孕婦獲得。在一些實施方案中，尿樣可來自懷孕少于1周(例如，懷孕1、2、3、4、5或6天)的孕婦獲得。在一些實施方案中，尿樣從懷孕在第一個三個月，第二個三個月或第三個三個月的女性。在一些實施方案中，尿樣從未懷孕且正在考慮懷孕的婦女獲得(例如，以評估嗜剛果紅性的基線水平)。在一些實施方案中，尿樣從處于產(chǎn)后的婦女獲得。在一些實施方案中，尿樣由醫(yī)療保健提供者從任何或所有產(chǎn)前和產(chǎn)后檢查的孕婦獲得。例如，可以在第一次產(chǎn)前檢查(visit)，每4周直到懷孕的第28周；每2至3周至懷孕的第36周；在懷孕的最后一個月至少每周；分娩后；從醫(yī)療機(jī)構(gòu)出院和/或在任何產(chǎn)后檢查獲得尿樣。對于具有預(yù)先存在的醫(yī)療問題的女性、在懷孕期間發(fā)展并發(fā)癥的女性或懷孕的青少年，可以更頻繁地獲得尿液。各種神經(jīng)變性和非神經(jīng)疾病由錯誤折疊蛋白的存在引起或以錯誤折疊蛋白為特征。例如，由錯誤折疊蛋白的積累引起的最普遍神經(jīng)變性疾病是阿爾茨海默病、帕金森病和亨廷頓病，具有類似的淀粉樣蛋白源。另一個實例是肌萎縮性側(cè)索硬化。因此，在一些實施方案中，受試者不是孕婦。在一些實施方案中，受試者是懷疑患有神經(jīng)性(例如神經(jīng)變性)疾病和/或處于發(fā)展神經(jīng)性(例如神經(jīng)變性)疾病的風(fēng)險的受試者。在一些實施方案中，受試者是被懷疑患有非神經(jīng)疾病和/或處于發(fā)展非神經(jīng)疾病的風(fēng)險中的受試者。本發(fā)明的一些方面包括將來自受試者(例如，孕婦)的尿樣與結(jié)合錯誤折疊蛋白(例如，優(yōu)先結(jié)合)并且還結(jié)合纖維素或任何包含游離羥基的材料的染料混合，從而產(chǎn)生尿液和染料的溶液。如果尿樣和染料(或多于一種染料)在同一容器中(例如，如果將尿樣加入到含有染料的容器中，或者如果將染料加入容納尿樣的容器中，或者如果尿樣和染料同時合并，則認(rèn)為它們是“混合的”。因此，“尿液和染料的溶液”是指含有染料的尿液。應(yīng)當(dāng)理解，溶液可以含有或可以不含有額外的組分，例如水或緩沖液。在一些實施方案中，在將其與染料混合之前，將來自受試者的尿樣稀釋(例如，用水或緩沖液)。在一些實施方案中，尿樣保持未稀釋。結(jié)合錯誤折疊蛋白的染料是對錯誤折疊蛋白具有親和力(例如，插入錯誤折疊蛋白)的染料。結(jié)合錯誤折疊蛋白的染料的非限制性實例是剛果紅。剛果紅是3,3'-([1,1'-聯(lián)苯]-4,4'-二基)雙(4-氨基萘-1-磺酸)的鈉鹽。它是水溶性的，產(chǎn)生紅色膠體溶液的二級重氮染料。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明可以使用的結(jié)合錯誤折疊蛋白的其他染料，包括但不限于其它實染料(也稱為直接染料，因為它們通常不需要媒染劑和通過氫鍵作用)，例如，最初從植物提取的或被開發(fā)為染色棉花以及然后發(fā)現(xiàn)染色淀粉的那些。本文提供的所使用的這種實質(zhì)性染料的實例包括但不限于，天狼星紅(SiriusRed)F3B(CI35780)，苯并猩紅4BNS(CI29200)，天狼星猩紅(siriusscarlet)GG(CI40270)，橙色G和結(jié)晶紫。本文提供的所使用的其它染料的實例包括但不限于熒光染料，例如硫磺素T和硫磺素S。在一些實施方案中，本文提供的所使用的染料是伊文思藍(lán)(EvansBlue)，臺盼藍(lán)，氨基-8-萘磺酸鹽(ANS)或雙偶氮ANS。結(jié)合纖維素的染料是對纖維素纖維具有親和性(例如，插入有纖維素纖維)的染料。本發(fā)明可使用的結(jié)合纖維素纖維的染料的實例包括但不限于剛果紅、天狼星紅F3B(CI35780)、苯并猩紅4BNS(CI29200)、天狼星猩紅GG(CI40270)、橙色G、結(jié)晶紫、硫磺素S、硫磺素T、伊文思藍(lán)、臺盼藍(lán)、ANS和雙偶氮ANS。本發(fā)明的一些方面包括將尿液和染料的溶液施加到包含纖維素的表面，從而在表面上產(chǎn)生斑點。纖維素是具有式(C6H10O5)n的有機(jī)化合物，包含幾百至超過一萬個β(1→4)連接的D-葡萄糖單元的直鏈的多糖。術(shù)語“纖維素”不包括硝化纖維素。因此，包含纖維素的表面不包含硝化纖維素。也就是說，包含纖維素的表面不含(無)硝化纖維素。然而，在一些實施方案中，包含纖維素的表面可以進(jìn)一步包含硝化纖維素，這取決于所使用的表面和染料的類型。染料，例如剛果紅似乎對纖維素具有非共價親和力,并且，因此結(jié)合纖維素。關(guān)于纖維素，據(jù)認(rèn)為剛果紅是通過多糖鏈的羥基和染料的氨基之間的氫鍵被吸附。包含纖維素的表面的例子包括紙表面(如，普通紙、具有粘合底布的紙標(biāo)簽)，雖然所使用的包含纖維素的表面不限定于此。其他包含纖維素的表面包括棉花、亞麻、或包含彈性蛋白的表面。包含纖維素的表面，例如剛果紅結(jié)合的表面，可以稱為染料-相容表面或剛果紅-相容表面。如果沒有錯誤折疊蛋白存在下，所用的特定的染料可以結(jié)合到本文所用的表面，則認(rèn)為該表面與該染料是“相容”的。令人驚訝的是，本發(fā)明表明并不是所有含有纖維素的表面(稱為纖維素表面)都適用于本文所提供的方法和組合物。甚至在各類纖維素表面中，適用性也不同。例如，在50種不同類型的測試的紙中，結(jié)果表明只有精選類型的紙是合適的。纖維素表面(如紙)的適應(yīng)性基于幾個因素，包括，例如表面的接觸角、表面的孔隙度、表面的熒光度(其反映添加劑)和環(huán)境(如執(zhí)行本發(fā)明的方法的環(huán)境的溫度和濕度)。因此，染料結(jié)合錯誤折疊蛋白和纖維素以及隨后沿著包含纖維素的表面擴(kuò)散(或染料不擴(kuò)散)的條件取決于上述因素中的任何一個或多個。如果施加到表面時，(1)包含錯誤折疊蛋白和染料的尿液溶液從該溶液施加的點擴(kuò)散(如徑向擴(kuò)散)到纖維素表面(如圖1所示,案例1，“樣本”)；和(2)包含染料(以及無錯誤折疊蛋白)的尿液溶液，該染料不從施加該溶液的點徑向擴(kuò)散到纖維素表面(如圖1所示,案例1,“空白”)，或者，如果包含染料(以及無錯誤折疊蛋白)的尿液溶液，該染料擴(kuò)散(如徑向擴(kuò)散)的程度相對于包含錯誤折疊蛋白和染料的溶液更少，纖維素表面被認(rèn)為是適合用于本文的。在一些實施方案中，相關(guān)系數(shù)ρ用于區(qū)分合適和不合適的紙。合適的和不合適的紙之間的相關(guān)系數(shù)ρ的準(zhǔn)確截止值(cut-off)通過確定ρ與不同類型的“普通”紙上接觸角θ之間的關(guān)系限定。在一些實施方案中，相關(guān)系數(shù)ρ為0.5或更少(如0.1到0.5)表明是合適的紙。例如，ρ為0.1、0.2、0.3、0.4或0.5表明是合適的紙。“表面上的斑點”是指在施加溶液，例如尿液和染料的溶液(在尿液中具有或不具有錯誤折疊蛋白)之后在表面上形成的可檢測(例如，可觀察的，可見的)的斑點。不受理論的約束，表面中的纖維素纖維和尿液中的錯誤折疊蛋白與染料“競爭”結(jié)合。如果尿樣含有錯誤折疊蛋白，則染料(例如，剛果紅)與錯誤折疊蛋白結(jié)合，并且未結(jié)合的染料(例如，未與錯誤折疊蛋白結(jié)合的染料)的量成比例地減少。當(dāng)將包含錯誤折疊蛋白和染料的尿溶液施加到合適的纖維素表面(例如普通紙)上時，包含錯誤折疊蛋白和染料的尿溶液從可見的施加斑點(稱為表面上的斑點)擴(kuò)散(例如，徑向擴(kuò)散)，并且染料的擴(kuò)散是可檢測的。例如，當(dāng)將100μl包含錯誤折疊蛋白和染料的樣品(例如，尿液)溶液施加到合適的纖維素表面時，包含錯誤折疊蛋白和染料的樣品溶液，例如徑向擴(kuò)散至距離施加斑點5-7mm，并且染料的擴(kuò)散是可檢測的。染料的這種擴(kuò)散程度是“擴(kuò)散到可感知的程度”或“徑向擴(kuò)散到可感知的程度”的一個實例。因此，當(dāng)徑向擴(kuò)散時，通過包含錯誤折疊蛋白和染料的尿溶液擴(kuò)散而形成的特征性較大的均勻圓(如例如圖1，案例1，“樣品”所示)表明尿樣中存在錯誤折疊蛋白。也就是說，尿樣包含錯誤折疊蛋白。相反，如果樣品(例如尿樣)不含有錯誤折疊蛋白，則溶液中的染料(例如剛果紅)自由地與纖維素表面的纖維素纖維結(jié)合。當(dāng)包含例如尿液和染料，而不是錯誤折疊蛋白的溶液施用于合適的纖維素表面(例如普通紙)時，染料在施用斑點或其附近與表面的纖維素纖維結(jié)合，而溶液中的尿從施加斑點擴(kuò)散(例如徑向)時，染料不從施加斑點擴(kuò)散，或者染料擴(kuò)散到較小程度(相對于含有錯誤折疊蛋白的尿溶液中的染料)。例如，當(dāng)將100μl含有染料(而不是錯誤折疊蛋白)的尿溶液施加到合適的纖維素表面時，樣品可以擴(kuò)散(例如徑向)至距離施加斑點5-7mm，而染料可以擴(kuò)散(例如徑向)至距離施加斑點僅1-3mm。染料的這種擴(kuò)散程度是“不擴(kuò)散到可感知的程度”或“不徑向擴(kuò)散到可感知的程度”的一個實例。因此，因缺乏染料的合適擴(kuò)散而形成的特征性的更小的不均勻圓(如例如圖1，案例1，“空白”所示)表明樣品中不存在錯誤折疊蛋白。也就是說，樣品(例如，尿樣)中不含有錯誤折疊蛋白。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的檢測錯誤折疊蛋白的方法部分地依賴于色譜法的原理，并且在一些實施方案中，依賴于色譜結(jié)果的視覺評估。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解擴(kuò)散的“可感知的程度”是什么意思，特別是根據(jù)本文所述的蛋白質(zhì)和染料化學(xué)。如果可以確定染料已經(jīng)從中心點向外擴(kuò)散(例如徑向地)，則認(rèn)為染料從表面的中心點擴(kuò)散可感知的程度。這種擴(kuò)散結(jié)果是因為染料與錯誤折疊蛋白結(jié)合，因此不能結(jié)合到表面。通過比較，如果能夠確定染料沒有從中心點向外擴(kuò)散(例如，徑向地)，則染料被認(rèn)為不會擴(kuò)散至可感知的程度(盡管它可以從中心點擴(kuò)散到有限程度，例如1-3mm)。這種有限的擴(kuò)散是因為當(dāng)染料被施加到表面時，染料不與錯誤折疊蛋白結(jié)合并且可以結(jié)合到表面，并且是快速地結(jié)合。在一些實施方案中，樣品(例如尿液)可能對于錯誤折疊蛋白(例如，含有足夠的錯誤折疊蛋白以結(jié)合溶液中的全部或大部分染料)是“強(qiáng)陽性”的。在這樣的實施方案中，本發(fā)明的方法可以產(chǎn)生特征性的均勻圓，例如在圖1，案例1，“樣品”中所示。在其他實施方案中，樣品可能對錯誤折疊蛋白是“弱陽性”的(例如，含有錯誤折疊蛋白，但不足以結(jié)合溶液中的全部或大部分染料)。在這樣的實施例中，本發(fā)明的方法可以產(chǎn)生具有均勻“暈輪”的特征性中心斑點，例如，在圖1，案例2，“樣品”中所示。所述暈輪通常由與錯誤折疊蛋白結(jié)合并且因此不與中心斑點區(qū)域中的纖維素結(jié)合的染料部分?jǐn)U散產(chǎn)生。本發(fā)明的一些方面包括在包含錯誤折疊蛋白和染料的尿液(或其他樣品)的溶液發(fā)生擴(kuò)散的條件下在包含例如纖維素的表面上保持斑點。在一些實施例中，本發(fā)明的方法的一個優(yōu)點是獲得結(jié)果所需的時間短。在一些實施方案中，溶液或斑點在表面上保持1至5分鐘或更長時間。例如，斑點可以保持1至3分鐘，或1至2分鐘。在一些實施方案中，斑點保持2分鐘。在一些實施方案中，斑點保持在表面上小于1分鐘。應(yīng)當(dāng)理解，在一些實施方案中，保持還指在支持溶液擴(kuò)散的特定樣品的評估時間段(例如，1至5分鐘)內(nèi)保持環(huán)境(例如，溫度和濕度)。還應(yīng)當(dāng)理解，完成本發(fā)明的診斷測試的時間段可以根據(jù)環(huán)境和表面的類型(例如，纖維素表面)而變化。本發(fā)明的一些方面包括如果通過表面的溶液被著色則確定尿樣包含錯誤折疊蛋白，或者如果通過表面的溶液是無色的，則確定尿樣不包含錯誤折疊蛋白。例如，如果染料是剛果紅，如果尿樣中存在錯誤折疊蛋白，則通過表面的溶液將呈現(xiàn)紅色，粉紅色或紫色(因為溶液含有剛果紅)。不受理論的約束，這是因為與錯誤折疊蛋白結(jié)合并且不能結(jié)合到表面(例如，由于錯誤折疊蛋白的結(jié)合而飽和的結(jié)果)的剛果紅將穿過表面。相反，如果尿樣中不存在錯誤折疊蛋白，則通過表面的溶液將顯得無色(因為溶液不含有剛果紅)。不受理論的約束，這是因為游離的剛果紅已經(jīng)結(jié)合到表面，其充當(dāng)過濾器，僅使得沒有錯誤折疊蛋白的溶液通過，因此沒有剛果紅。在一些實施方案中，包含纖維素的表面是普通紙的表面。普通紙包括沒有涂層的紙。有涂層的紙可以分為亞光，半亞光或絲的，和有光澤的(例如，在一面或兩面涂覆一薄層碳酸鈣或瓷土)。因此，沒有亞光、半亞光或絲的、或光澤的涂層的紙在“普通紙”的定義內(nèi)。沒有涂層的打印紙是普通紙的一個非限制性實例?！捌胀垺钡亩x中還包括不含添加劑(例如，白堊或瓷土)的紙。在一些情況下，可以通過重量表征紙。分配給紙張的重量是一令紙張的重量(例如，500張，其中，1張等于17”×22”)。在一些實施例中，普通紙具有20lbs，24lbs或32lbs的重量。在一些情況下，可以通過密度表征紙。在一些實施例中，普通紙具有800kg/m3(50lb/ft3)的密度。在一些實施方案中，包含纖維素的表面還包含粘合劑背襯。在一些實施方案中，具有粘合劑背襯的包含纖維素的表面是標(biāo)簽(例如，市售的自粘標(biāo)簽)。本文提供的結(jié)果顯示，在一些實施方案中，粘合劑背襯防止紙張表面起皺，從而提供更準(zhǔn)確的結(jié)果。盡管如此，包含纖維素的表面不需要粘合劑背襯。在一些實施方案中，溶液(例如，包含尿和染料的溶液)中的染料濃度(或兩種或更多種染料的組合的濃度)為0.01％至1.0％或更高。例如，溶液中染料的濃度(或兩種或更多種染料的組合的濃度)可以為0.01％至0.1％，0.01％至0.2％，0.01％至0.3％，0.01％至0.4％，0.05％至0.1％，0.05％至0.2％，0.05％至0.3％，0.05％至0.4％，0.05％至0.5％，0.05％至0.6％，0.05％至0.7％，0.05％至0.8％，0.05％至0.9％。在一些實施方案中，溶液中染料的濃度(或兩種或更多種染料的組合的濃度)為0.01％，0.05％，0.1％，0.15％，0.2％，0.25％，0.3％，0.35％，0.4％，0.45％，0.5％，0.55％，0.6％，0.65％，0.7％，0.75％，0.8％，0.85％，0.9％，0.95％或1.0％。在一些實施方案中，溶液中染料的濃度(或兩種或更多種染料的組合的濃度)為0.1％。在一些實施方案中，在水溶液(例如水或包含染料的水性緩沖液)中的染料濃度(或兩種或更多種染料的組合的濃度)為0.2％至1.0％或更高。例如，溶液中染料的濃度(或兩種或更多種染料的組合的濃度)可以是0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％或1.0％。在一些實施方案中，水溶液(例如，水或包含染料的水性緩沖液)的體積為1μl至10μl或更多。例如，水溶液的體積可以是1μl，1.5μl，2μl，2.5μl，3μl，3.5μl，4μl，4.5μl，5μl，5.5μl，6μl，6.5μl，7μl，7.5μl，8μl，8.5μl，9μl，9.5μl或10μl。本發(fā)明的陽性對照由已知含有錯誤折疊蛋白的樣品(例如尿樣)產(chǎn)生。類似地，本發(fā)明的陰性對照從已知不含錯誤折疊蛋白的樣品(例如尿樣)或從水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或不含錯誤折疊蛋白的其它鹽溶液中獲得。產(chǎn)生陽性和/或陰性對照的條件類似于與所述陽性或陰性對照進(jìn)行比較的特定尿樣進(jìn)行本發(fā)明的方法的條件。例如，將來自孕婦的測試尿樣與來自孕婦的含有錯誤折疊蛋白(陽性對照)和/或不含錯誤折疊蛋白(陰性對照)的尿樣進(jìn)行比較。如果用測試樣品獲得的結(jié)果與用陽性對照獲得的結(jié)果相當(dāng)，則確定測試樣品含有錯誤折疊蛋白。如果用測試樣品獲得的結(jié)果與用陰性對照獲得的結(jié)果相當(dāng)，則確定測試樣品不含有錯誤折疊蛋白。此外，在制備陽性和/或陰性對照的方法中使用的包含纖維素的表面的類型(例如，普通紙)與在評價測試尿樣的方法中使用的包含纖維素的表面的類型相同。還應(yīng)當(dāng)理解，在產(chǎn)生陽性和/或陰性對照的方法中使用的溶液的體積以及染料(或多種染料)的類型(例如剛果紅)和在評價測試尿樣的方法中使用的溶液的體積以及染料(或多種染料)的類型和濃度相同。在一些實施方案中，用于與測試樣品結(jié)果比較的陽性和陰性結(jié)果在測試試劑盒中作為圖像提供。本發(fā)明的一些方法包括額外步驟，用于確認(rèn)來自受試者(例如，孕婦)的樣品(例如尿樣)是否含有錯誤折疊蛋白。例如，在來自受試者的尿樣被鑒定為含有錯誤折疊蛋白之后，可以類似地評估另外的稀釋的尿樣。這可以以至少兩種方式完成。在一種情況下，從受試者獲得第一尿樣(例如，使用清潔捕獲物)，并且評估第一尿樣的第一部分是否存在錯誤折疊蛋白。然后，類似地評估第一樣品的第二部分是否存在錯誤折疊蛋白。第二部分可以稀釋，然后類似地評估是否存在錯誤折疊蛋白。確定來自第一尿樣的第一和第二部分的尿液(稀釋的或未稀釋的)均具有錯誤折疊蛋白可以確認(rèn)受試者具有含錯誤折疊蛋白的尿液?；蛘?，獲得第一尿樣(例如，使用清潔捕獲物)，并且評估第一尿樣的一部分是否存在錯誤折疊蛋白。然后，在一段時間(例如，幾個小時)后，從同一受試者收集第二尿樣，并且類似地評估該第二尿樣的一部分是否存在錯誤折疊蛋白。第二部分可以稀釋，然后類似地評估是否存在錯誤折疊蛋白。確定來自同一受試者的第一和第二尿樣(稀釋或未稀釋的)均具有錯誤折疊蛋白可以確認(rèn)受試者具有含錯誤折疊蛋白的尿液。本發(fā)明的一些方面包括將來自孕婦的樣品(例如尿樣)與結(jié)合錯誤折疊蛋白和例如纖維素的第一染料和與第一染料顏色不同并且不結(jié)合錯誤折疊蛋白和纖維素的第二染料混合，從而產(chǎn)生尿液和兩種染料的溶液。通常，一種染料的顏色在視覺上不同于另一種染料的顏色。例如，第一染料可以是紅色，第二染料可以是藍(lán)色。在一些實施方案中，第一染料是剛果紅。在一些實施方案中，第二染料是水溶性染料，例如羊毛罌紅(也稱為FD&CBlueNo.1，食用色素)。其它水溶性染料(例如，其它FD&C顏料)可以用作不與錯誤折疊蛋白和纖維素結(jié)合的第二染料，包括但不限于FD&C紅色40號，F(xiàn)D&C黃色5號，F(xiàn)D&C黃色6號，F(xiàn)D&C藍(lán)色2號，F(xiàn)D&C紅色3號或FD&C綠色3號。在一些實施方案中，相關(guān)系數(shù)ρ用于區(qū)分非先兆子癇樣品(例如尿樣)和先兆子癇樣品(例如尿樣)。通過測試來自沒有先兆子癇的孕婦，患有先兆子癇的孕婦和具有其他孕期狀況的孕婦的大量尿樣來定義最佳區(qū)分非先兆子癇尿樣與先兆子癇尿樣的相關(guān)系數(shù)ρ的精確截止值。在一些實施方案中，0.5或更大(例如，0.5至1.0)的相關(guān)系數(shù)ρ指示先兆子癇。例如，0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0的ρ表示合適的紙張。在一些實施例中，使用算法計算相關(guān)系數(shù)。在一些實施例中，該算法被編程為移動電話或平板應(yīng)用程序。在一些實施例中，該算法補(bǔ)償照明，減去白色背景，然后計算擴(kuò)散斑點的彩色圖像的不同顏色通道(例如，紅色和藍(lán)色通道)之間的相關(guān)系數(shù)。通道之間的相關(guān)系數(shù)在非先兆子癇樣品(例如尿樣)和先兆子癇樣品(例如尿樣)之間顯著不同。該信息可以例如用于如下的校準(zhǔn)和篩選應(yīng)用程序(例如，軟件應(yīng)用程序)。校準(zhǔn)：校準(zhǔn)應(yīng)用程序的目的是幫助用戶選擇表面，例如纖維素表面(例如，紙)，并選擇染料(例如，剛果紅和藍(lán)色食用染料)的濃度以便穩(wěn)定地區(qū)分正常和先兆子癇樣品(例如尿樣)?？梢允褂脙蓚€標(biāo)準(zhǔn)：(1)在兩個顏色通道中有足夠的信號，使得照相機(jī)噪聲不影響相關(guān)(性)計算；和(2)表面(例如紙)的纖維結(jié)構(gòu)，其應(yīng)當(dāng)允許第二染料(例如，藍(lán)色食品染料)均勻地擴(kuò)散，同時在未結(jié)合錯誤折疊蛋白時允許第一染料(例如剛果紅染料)結(jié)合。因此，選擇合適的表面(例如紙)和染料濃度應(yīng)在兩個顏色通道(例如，紅色和藍(lán)色通道)中給出平衡信號以及非先兆子癇和先兆子癇樣品(例如尿樣)之間的相關(guān)系數(shù)中給出大差異。在一些實施方案中，校準(zhǔn)程序通過在非先兆子癇和先兆子癇樣品(例如，尿樣)中小心引入不同濃度的第一染料(例如剛果紅)和第二染料(例如藍(lán)色食品染料)，在不同表面(例如，紙)上施加混合物液滴，允許樣品擴(kuò)散，以及拍攝擴(kuò)散樣品的照片(參見圖27A和27B)。校準(zhǔn)軟件測量兩個通道(例如，紅色和藍(lán)色通道)的信號的百分比差和兩個通道之間的相關(guān)系數(shù)。相關(guān)系數(shù)和百分比信號差的曲線揭示了哪些濃度和表面(例如，紙)適合使用。在圖27A和27B中，例如，使用不同比例的剛果紅/藍(lán)染料來測試非先兆子癇尿液(a)和先兆子癇尿液(b)以及來自樣品2至樣品7的任何剛果紅/藍(lán)染料結(jié)果是可接受的，因為紅色和藍(lán)色通道之間的信號差異小于例如樣品8和9中的信號差異，并且紅色通道-藍(lán)色通道的相關(guān)系數(shù)對于非先兆子癇尿和先兆子癇尿是足夠不同的。篩選：一旦校準(zhǔn)了表面(例如紙)和染料濃度，試劑盒和任選地包括軟件應(yīng)用程序(“app”)可用于篩選錯誤折疊蛋白。在尿與第一和第二染料混合后，例如，混合物的一滴在纖維素表面上擴(kuò)散，擴(kuò)散的樣品(例如，液滴)的照片通過例如智能手機(jī)或平板相機(jī)捕捉。軟件應(yīng)用程序然后使用白色背景來估計和補(bǔ)償照明顏色。接下來，從圖像中減去背景，使得僅對應(yīng)于樣本的像素存在。然后計算兩個顏色通道(例如，紅色和藍(lán)色通道)之間的相關(guān)系數(shù)，并將其與閾值比較以指示是否存在錯誤折疊蛋白。在一些實施例中，0.5至1.0(例如，0.85)的相關(guān)系數(shù)閾值區(qū)分正常和先兆子癇尿，如圖27A和27B所示。本發(fā)明的一些方面提供了用于檢測樣品(例如尿樣)中的錯誤折疊蛋白的組合物和試劑盒。在一些實施方案中，此類組合物和試劑盒可用于診斷先兆子癇。本發(fā)明的試劑盒的非限制性實例顯示于圖25A和25B以及圖26A和26B中。圖25A和25A分別描繪了三折疊-構(gòu)造的剛果紅點簡易試劑盒和剛果紅點定量試劑盒的實例的內(nèi)部，其中頂板，中間板和底板由例如卡片紙制成。當(dāng)處于“折疊”構(gòu)造時，由頂板和底板覆蓋的中間板形成袋。底板中的彎曲狹縫(由曲線虛線表示)被定位和其尺寸為能接收關(guān)閉袋的折疊翼片。圖25A的頂板顯示了可以在試劑盒中提供的一次性移液管。移液管可以預(yù)先裝載染料(例如，5μl的0.5％剛果紅溶液或5μl的5％剛果紅+2.5μl的0.1％的羊毛罌紅溶液)并密封。移液管然后可以通過預(yù)成形的狹縫(由兩條直虛線表示)固定在中間板中。狹縫被定位成使得預(yù)加載染料(或兩種染料)的移液管的尖端保留在袋內(nèi)并避光。在一些情況下，試劑盒設(shè)置有用于修剪移液管的密封端的裝置(例如，指甲剪或小剪刀)。吸移管下面是提供用于樣品測試的包含纖維素的表面的區(qū)域。該表面通過被固定(例如，自粘紙標(biāo)簽)到試劑盒三折。在一些實施方案中，表面與試劑盒一起提供。在其他實施例中，表面是單獨提供的。對于每個臨床部位，表面可能需要單獨驗證適合性，例如考慮環(huán)境條件(例如濕度和溫度)的差異。底板包含強(qiáng)陽性樣品、弱陽性樣品和陰性樣品的對照的一系列圖像?？梢詫y試樣品與任何一個或多個對照進(jìn)行比較以確定樣品結(jié)果。圖26A中所示的試劑盒還包括顏色校準(zhǔn)刻度(由在測試表面的左側(cè)和右側(cè)側(cè)面的分級條表示)，設(shè)計用于圖片定向并校正任何光梯度。過量綠色(由在測試表面的頂部和底部側(cè)面的分級條表示)補(bǔ)償相機(jī)的任何傾向以調(diào)整顏色。在圖3C和圖4(1)中描述了陣列試劑盒的實例。在一些實施方案中，剛果紅點定量陣列試劑盒是剛果紅點定量試劑盒的擴(kuò)展，因為試劑盒基本上相同，除了它提供用于評估單個表面上的多個測試樣品(例如，纖維素表面)。因此，本發(fā)明的各個方面和實施方案提供了可用于有效和準(zhǔn)確地檢測尿液(或其他樣品)中的錯誤折疊蛋白的診斷方法和試劑盒，其在一些情況下指示某些疾病(例如先兆子癇，其中，測試樣品是從孕婦獲得的尿)。實施例實施例1本實施例呈現(xiàn)的實驗涉及開發(fā)用于快速和準(zhǔn)確鑒定例如尿中錯誤折疊蛋白的簡單診斷方法和組合物(例如，試劑盒)。在孕婦中，尿中錯誤折疊蛋白的存在可用于指示先兆子癇?，F(xiàn)有的剛果紅點實驗是一種有效實驗，能夠用作診斷和預(yù)后先兆子癇的工具。盡管如此，剛果紅點實驗，通常使用相對昂貴的試劑，例如硝化纖維素以及醇洗滌，需要約5小時完成。該研究的目的之一是生產(chǎn)簡化的、低成本和有效的診斷方法和組合物，其可以例如在護(hù)理點實施，例如在與醫(yī)療保健提供者的孕檢時實施，并且也適合于低資源配置的環(huán)境。為了這個目的，在一些實施方案中，本文提供了簡化的、基于紙張的方法和組合物，其提供了低成本的、例如在2分鐘內(nèi)完成的半定量結(jié)果或例如在7分鐘內(nèi)完成的定量結(jié)果。作為開發(fā)用于診斷先兆子癇的簡化紙張方法的初始步驟，分析了超過五十種不同類型的紙的“適合性”。令人驚奇的是，不是所有的紙都適合用作檢測由，例如剛果紅結(jié)合的錯誤折疊蛋白的表面。本文的分析顯示纖維素表面，例如普通紙，積極參與剛果紅點測試的化學(xué)反應(yīng)。在此紙色譜背后的化學(xué)反應(yīng)是復(fù)雜的。剛果紅通過與纖維素游離羥基的氫鍵與纖維素纖維結(jié)合。由于其平面分子構(gòu)型，剛果紅插入纖維素纖維之間。相同的原理適用于錯誤折疊蛋白，其由于β-折疊的豐富，具有與纖維素纖維相似的空間排列。相反，硝化纖維素具有的羥基已經(jīng)通過與硝酸反應(yīng)而酯化。由于已經(jīng)被占據(jù)，羥基不再結(jié)合剛果紅，因此，硝化纖維素不結(jié)合剛果紅-它主要是惰性的。不受理論的束縛，纖維素表面(例如普通紙)與用于剛果紅結(jié)合的尿樣的錯誤折疊蛋白競爭。在不含錯誤折疊蛋白的尿樣中，剛果紅在溶液中是游離的。當(dāng)在多孔的纖維素表面上點斑點時，該游離的剛果紅與纖維素形成氫鍵，從而減慢其通過表面的流動(本文稱為“剛果紅阻滯”)。紙適用性至少部分地基于紙張的接觸角，紙張的熒光度(其是添加劑的反映)和紙張的孔隙率、環(huán)境(例如，環(huán)境/區(qū)域的溫度和濕度)。由于液體在多孔表面(例如紙)上的流動是由物理定律(例如，菲克定律和斯托克斯-愛因斯坦關(guān)系)控制的復(fù)雜過程，因此基于合適的紙張和不合適的紙張之間的相關(guān)系數(shù)(Rho，ρ)設(shè)計軟件程序以確定用于剛果紅點測試的紙“適用性”。合適的紙張和不合適的紙張之間的相關(guān)系數(shù)定ρ的精確截止值由在不同類型的“普通”紙上的ρ與接觸角θ之間的關(guān)系來定義。電解質(zhì)和蛋白質(zhì)濃度在體外是不同的。接觸角θ可能是ρ的重要決定因素，并且較少受電解質(zhì)和蛋白質(zhì)濃度的影響。在一些實施方案中，0.5或更小(例如，0.1至0.5)的ρ表示合適的紙。例如，ρ為0.1、0.2、0.3、0.4或0.5表示合適的紙張。剛果紅點簡易方法和試劑盒在分析五十種不同類型的紙之后，選擇具有粘合劑背襯的特定類型，部分是因為使用特定紙獲得的結(jié)果相對于測試的其他類型的紙更一致，這可能是由于在濕潤時起皺不足。來自患有嚴(yán)重先兆子癇的孕婦(sPE)(圖1，“樣品”，案例1)、來自患有先兆子癇的孕婦(圖1，“樣品”，案例2)和沒有先兆子癇的孕婦(圖1，“樣品”，案例3，對照)的尿樣首先與剛果紅混合，然后施加于普通紙。將與剛果紅混合的水用作對照(圖1，“空白”，案例1-3)。在水樣品(圖1，“空白”，案例3)和非先兆子癇對照樣品(圖1，“樣品”，案例3)中，剛果紅保持緊密圍繞施用點，而清液慢慢散開。在來自患有先兆子癇的女性(圖1，“樣品”，案例2)的樣品中，剛果紅與清液一起擴(kuò)散，產(chǎn)生環(huán)繞中心可見施加點的粉紅色放大暈圈(圖1，“樣品”，案例2)。在來自患有嚴(yán)重先兆子癇的女性(例如，“高陽性”樣品)(圖1，“樣品”，案例1)，剛果紅和樣品形成延伸超出初始樣品施加點的均勻的強(qiáng)粉紅色放大斑點。在實驗(n＝78)中，觀察到剛果紅與3級視覺得分(P<0.001)之間的顯著相關(guān)性。該實施例的結(jié)果顯示，就與普通紙的相互作用方面，剛果紅處理的先兆子癇尿和剛果紅處理的非先兆子癇尿之間在化學(xué)特性上存在顯著差異。由于所有鍵是可飽和的，所形成的圓的尺寸取決于許多因素，包括例如紙潤濕性(例如，通過接觸角θ測量)和剛果紅濃度。不受理論的約束，如果紙具有低接觸角(例如，紙巾)，則沒有足夠的時間用于氫鍵合，因此樣品鋪展太快并且剛果紅延遲不明顯(數(shù)據(jù)未示出)。相反，如果紙具有高接觸角(例如，有光澤的有涂層的紙)，則樣品不會擴(kuò)散并在斑點中干燥(數(shù)據(jù)未示出)。如果樣品含有錯誤折疊蛋白(例如錯誤折疊蛋白的聚集體)，則剛果紅隨錯誤折疊蛋白的濃度成比例地插入。當(dāng)將這樣的樣品施加到纖維素表面時，幾乎沒有或沒有剛果紅可用于纖維素結(jié)合，因為大多數(shù)剛果紅與溶液中的錯誤折疊蛋白結(jié)合。結(jié)果形成特征性的寬粉紅色圓形，由錯誤折疊蛋白的擴(kuò)散產(chǎn)生(圖1，“樣品”，案例1)。如果所有剛果紅與錯誤折疊蛋白結(jié)合(圖1，“樣品”，案例1)，則出現(xiàn)均勻的特征性粉紅色圓圈，并且如果游離的剛果紅可用于與纖維素結(jié)合，則在均勻的粉紅色暈圈中出現(xiàn)緊密的中心圓(圖1，“樣品”，案例2)。基于本文提供的結(jié)果，設(shè)計了兩種用于先兆子癇的簡化診斷試劑盒。稱為剛果紅點簡易試劑盒(用于快速(例如，1至3分鐘))的第一試劑盒可以用于尿液嗜剛果紅的主觀評價。稱為剛果紅點定量試劑盒的第二試劑盒可用于結(jié)果的客觀定量，并通過測量“點同質(zhì)性”的軟件算法實現(xiàn)。剛果紅點定量方法和試劑盒的開發(fā)如下所述。剛果紅點定量方法和試劑盒來自沒有先兆子癇的孕婦的大多數(shù)尿樣在應(yīng)用于纖維素表面，例如普通紙時干燥清澈(或幾乎透明)，因此，沒有測量樣品在這樣的表面上會擴(kuò)散多遠(yuǎn)。為了解決這個問題，剛果紅點定量試劑盒設(shè)計有使用紅色和藍(lán)色染料的雙染料混合物。選擇藍(lán)色作為RGB(紅綠藍(lán))顏色空間中的剛果紅的顏色的補(bǔ)償。RGB顏色模型與人眼和大腦的生理學(xué)相關(guān)，而不與比色定義的顏色相關(guān)。它也是典型的移動電話(例如，智能電話)相機(jī)的輸出。在測試的幾種藍(lán)色染料中，選擇羊毛罌紅(FD&C藍(lán)色1號，無毒染料，McCormick&Co.)用于通過圖像分析定量測定剛果紅擴(kuò)散/延遲，并且因此將先兆子癇病例與非先兆子癇病例區(qū)分。藍(lán)色染料隨水相遷移，標(biāo)記最大擴(kuò)散面積(參見例如圖2，“正?！保斝?。雙重染料的最佳組成被確定為5％剛果紅：10％羊毛罌紅的2:1混合物，每100μl體積的尿中加入3μl雙染料混合物。接下來，創(chuàng)建圖像分析算法(例如，在MATLAB中)，其提取移動電話獲取圖像或平板獲取圖像的紅色和藍(lán)色通道中的信號之間的相關(guān)系數(shù)(Rho，ρ)(圖2)。在預(yù)處理以補(bǔ)償光源和紙張顏色之后計算相關(guān)系數(shù)。通過測試來自沒有先兆子癇的孕婦、患有先兆子癇的孕婦和具有其他孕期狀況的孕婦的大量尿樣來定義最佳區(qū)分非先兆子癇尿樣與先兆子癇尿樣的相關(guān)系數(shù)ρ的精確截止值。為此，使用從具有良好表征的診斷和妊娠結(jié)果的婦女中回收的存儲的尿樣(例如，獲得來自662名婦女的824個尿樣，儲存在-80℃)。相對于P/C比(獲得所有樣品的結(jié)果)和試紙測試，進(jìn)行比較精確性分析，使用SiemensClinitekStatus讀數(shù)器可視地和客觀地讀取。另外，使用諸如機(jī)器學(xué)習(xí)算法(例如，支持向量機(jī))，變分分析和/或非參數(shù)貝葉斯技術(shù)的算法來確定是否其它圖像分析參數(shù)(例如，除了擴(kuò)散空間中紅色和藍(lán)色像素的相關(guān)系數(shù))可以進(jìn)一步改善患者分類。此外，可以在遠(yuǎn)程服務(wù)器上而不是移動電話或平板電腦上執(zhí)行圖像處理，并且將結(jié)果報告回用戶。實施例2患有嚴(yán)重先兆子癇(sPE)的婦女顯示具有淀粉狀樣聚集物的光譜特征的尿嗜剛果紅性使用嚴(yán)格的研究設(shè)計，其涉及可行性和驗證階段(圖5)。作為原理(可行性)的初步證明，測試了來自懷孕婦女(n＝80)的具有精確臨床分類和已知結(jié)果的尿樣：需要因先兆子癇按醫(yī)學(xué)指示分娩的40名重度先兆子癇(sPE)婦女，以及妊娠期不復(fù)雜且足月分娩的40名健康的懷孕的對照的(P-CRL)婦女。她們的臨床特征包括在表1中。表1其尿樣用于可行性階段的婦女的人口統(tǒng)計學(xué)、臨床和結(jié)果特征(n＝80)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，并通過Student-t檢驗分析。數(shù)據(jù)表示為中位數(shù)[四分位數(shù)間距]，并通過Mann-Whitney檢驗分析。§數(shù)據(jù)表示為n(％)，并通過Fisher精確檢驗分析。將與剛果紅(CR)混合的尿點樣在未支持(unsupport)的硝化纖維素膜上，然后用濃度漸增的甲醇洗滌(圖6A)。該實驗的基本原理是基于CR的自組裝性質(zhì)及其在與具有廣泛的β-折疊結(jié)構(gòu)的淀粉樣蛋白結(jié)合后引發(fā)大的不溶性寡聚體形成的能力。如圖所示，在甲醇洗滌后，sPE而不是P-CRL婦女的斑點保持紅色，這表明患有PE的婦女顯示尿嗜剛果紅性。進(jìn)一步設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)化方案以客觀定量測定各尿樣對于保留CR的傾向性，同時改變程度降低由于蛋白尿和水合狀態(tài)的差異引起的變化(剛果紅點[CRD]測試)。通過圖像分析獲得兩個指數(shù)：CR保留(CRR，檢測嗜剛果紅性)和CR摻入(CRI，內(nèi)部參照)。與P-CRL相比，sPE尿中CRR顯著增加(P<0.001，圖6B)。在兩組之間未注意到CRI的差異(圖6C)。在受試者工作曲線特征(ROC)分析中，15％的CRR截止值具有100％[95％CI：92-100]靈敏度和100％[95％CI：92-100]特異性以區(qū)分sPE病例和P-CRL。在可行性群體中，所有sPE患者的CRR值>15％?；谠摻Y(jié)果，CRR≥15％被認(rèn)為是“不可靠”(NR-CRR)。當(dāng)用UV光照射時，CR-結(jié)合的淀粉樣蛋白顯示出明亮的紅色熒光，并且吸光度從約490偏移至540nm。在用長波長而不是短波長的UV照射硝化纖維素膜時，觀察到淀粉樣蛋白結(jié)合的CR的特征紅色熒光(圖6D)。在加入CR儲存液后，30％(12/40)的sPE尿樣(但不是P-CRLs)立即從橙紅色變化到品紅色(圖6E)，顏色明顯變化，這與體外β-淀粉樣蛋白低聚(聚集)所述的光譜紅移一致。在403nm(等滲點)和541nm(最大位移點)的吸光度的分光光度測定證實在sPE尿中存在淀粉狀蛋白樣聚集物(圖6F)。在sPE婦女中，光譜偏移程度與CRR指數(shù)相關(guān)(r＝0.664，P<0.001)。盡管作為一組，sPE婦女具有較高濃度的淀粉狀樣聚集物，但是20％(8/40)的sPE尿不顯示可檢測的(視覺的和/或分光光度的)光譜移位，盡管在CRD試驗中NR-CRR(圖6G)。僅在CRR>50％的樣品中發(fā)生分光光度法可檢測的移動，這意味著與CRD試驗(CRR截止值15％)相比，直接分光光度法在鑒定PE(P＝0.007，可行性群體)中具有較低的靈敏度(80％[95％CI：64-91])。此外，sPE婦女表現(xiàn)出尿硫黃素T-誘導(dǎo)(ThT)的熒光增加(圖6H)，P<0.001)。這是患有PE的婦女的尿液中存在淀粉狀蛋白樣結(jié)構(gòu)的另一個指標(biāo)。與直接分光光度法類似，只有sPE樣品的亞組(42％)在ThT結(jié)合后顯示485nm處熒光顯著增加(圖6I)。與CRD試驗相比，尿ThT結(jié)合在鑒定PE方面(P<0.001，可行性群體)具有較低的靈敏度(82％[95％CI：65-92])。尿嗜剛果紅性在高血壓妊娠疾病中不同并且隨PE嚴(yán)重程度增加而增加為了進(jìn)一步了解懷孕期間尿嗜剛果紅性的臨床意義，測試了來自另外582名婦女的尿樣，這次未就招募類別作選擇(圖5，驗證階段)。設(shè)計了橫向(n＝526)和縱向(n＝56)群體。橫向群體的婦女提供了單一尿樣。根據(jù)樣本收集和妊娠結(jié)果(MIDPE或其他)的臨床分類對結(jié)果進(jìn)行分組和分析。橫向群體中的婦女的臨床特征在表2中給出?？v向群體中的婦女在進(jìn)入研究時為無PE癥狀的，并且在整個妊娠期間縱向跟蹤。表2.尿樣在橫向驗證階段中使用的孕婦的人口統(tǒng)計學(xué)、臨床和結(jié)果特征(n＝516)數(shù)據(jù)表示為中值[四分位數(shù)范圍]，并通過Kruskal-WallisANOVA分析，然后使用Dunn's檢驗進(jìn)行事后比較§數(shù)據(jù)表示為n(％)，并通過ChiSquare測試精確測試進(jìn)行分析ap<0.05對P-CRL組；bp<0.05對sPE組縮寫：P-CRL，懷孕對照；gestHT，妊娠高血壓；crHTN，慢性高血壓；mPE，輕度先兆子癇；sPE，嚴(yán)重先兆子癇；spPE，疊加先兆子癇；IUGR，子宮內(nèi)生長受限；IUFD，子宮內(nèi)胎死亡；HELLP，溶血，肝酶升高，血小板低；當(dāng)在樣本收集時通過臨床診斷將橫向群體中的病例分組時，與所有其他組相比，sPE和疊加PE(spPE)婦女具有更高的CRR水平(圖7A，P<0.001)。接下來，我們分析了顯示尿液的NR-CRR值的婦女比例。我們發(fā)現(xiàn)，診斷為輕度PE(mPE)、sPE和spPE的婦女分別有75％(40/53)，89％(120/135)和91％(52/57)具有NR-CRR值(圖7B)。這部分顯著高于所有其他組(P<0.05)。在慢性高血壓(crHTN)婦女中，在招募時根據(jù)臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)排除了spPE，35％(22/63)的婦女顯示NR-CRR水平。與P-CRLs(6％，1/18，P＝0.017)或具有與PE無關(guān)的病理學(xué)的婦女(型-1：13％，16/125，P<0.001)相比，這顯著更高。與PE的進(jìn)展性質(zhì)一致，在招募時被分類為crHTN的27％(17/63)婦女的診斷被修改為spPE，并最終需要MIDPE(圖7C)。在這些中，53％(9/17)在初始評估時具有尿嗜剛果紅性，這意味著當(dāng)僅根據(jù)當(dāng)前臨床標(biāo)準(zhǔn)不能診斷該病癥時，CRD測試可用于快速預(yù)測spPE?；诜置鋾r的GA，縱向群體中的CRR指數(shù)和MIDPE之間的關(guān)系在圖7D中示出。需要MIDPE的婦女在所有GA期具有顯著較高的CRR(MIDPE：P<0.001，GA：P＝0.008)。早產(chǎn)PE中CRR水平與伴隨GA和MIDPE之間的顯著相互作用的足月PE相比明顯更高(2-因素ANOVA，P<0.018)。這一觀察結(jié)果可以解釋為，更高比例的足月mPE的婦女按照護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)由MIDPE不拖延地管理。此外，具有高CRR值(CRR≥60％)的患者，在足月MIDPE婦女中比在<34周時需要MIDPE的那些更少(29％對58％，P＝0.003)。在縱向群體(圖7E)中，發(fā)展為需要MIDPE(n＝9，全部來自高風(fēng)險組)的PE的婦女在疾病臨床表現(xiàn)之前具有顯著更高的CRR水平(對于MIDPE和分娩間隔，P＜0.001)。有趣的是，78％(7/9)的這些婦女在臨床明顯PE之前的10周時間進(jìn)入研究時具有NR-CRR值。這表明尿嗜剛果紅性的潛在機(jī)制可能發(fā)生在無癥狀階段的早期和逐漸惡化?？傮w而言，4名高危婦女在<20周GA時顯示尿嗜剛果紅性，均為MIDPE。所有低風(fēng)險婦女(n＝28)的妊娠過程未伴隨PE，正常分娩以及除了一個之外的所有在整個懷孕期間保持非嗜剛果紅性。這一個病例在第三個三月期變得嗜剛果紅性，并且在足月時因妊娠高血壓(gestHT)進(jìn)行指定分娩。在沒有發(fā)生PE的低風(fēng)險和高風(fēng)險婦女中，在研究進(jìn)入時CRR水平?jīng)]有統(tǒng)計學(xué)差異(低風(fēng)險：3.2±0.6％，高風(fēng)險：7.0±2.8％，P＝0.397)。剛果紅點(CRD)測試是診斷sPE和預(yù)測MIDPE的簡單模式來自包括在已知妊娠結(jié)果的驗證群體中的孕婦的招募尿樣(n＝563)的ROC分析(未失訪的橫向群體受試者：n＝508+未失訪的縱向群體受試者：n＝55)確定在預(yù)測需要MIDPE的PE中僅僅CRR具有85.9％的靈敏度[95％CI：81.1-89.9]，85.0％的特異性[95％CI：80.4-88.8]，5.7的陽性概率比(LR)[95％CI：4.4-7.5]，0.17的陰性LR[95％CI：0.1-0.2](表3)。表3.在具有已知妊娠結(jié)果的驗證階段的受試者(n＝563)中，對于因先兆子癇的醫(yī)學(xué)指示分娩(MIDPE)的預(yù)測的比較預(yù)后準(zhǔn)確度，用電子閱讀器獲得臨床試紙結(jié)果(Siemems8SGMultistix)縮寫：CRR：剛果紅保留，SBP：收縮壓，DBP：舒張壓*P<0.05對CRR≥15％美國婦產(chǎn)科學(xué)院(ACOG)推薦的先兆子癇診斷標(biāo)準(zhǔn)：高血壓定義為SBP≥140或DBP≥90。蛋白尿定義為≥300mg/24h或試紙≥+1(對于沒有進(jìn)行按指示的24小時蛋白尿測量或沒有完成24小時收集的病例)(3)?！焓澜缧l(wèi)生組織(WHO)推薦的先兆子癇診斷標(biāo)準(zhǔn)：高血壓定義為DBP≥90。蛋白尿定義為試紙≥+2(23)。與目前公認(rèn)的用于診斷PE的臨床篩選標(biāo)準(zhǔn)(CRR對血壓P<0.001；CRR對蛋白質(zhì)試紙P<0.001)相比，這明顯更好。CRR對收縮壓和舒張壓均具有加和值(P<0.001)。與基于ACOG(P＝0.004)(3)和WHO(P<0.001)(23)推薦的臨界值結(jié)合血壓和蛋白尿相比，單獨的CRR表現(xiàn)明顯更好。在多因素回歸(NRCRR優(yōu)勢比(oddratio)[95％CI]：30.6[18.9-49.6]；GA優(yōu)勢比：3.3[2.0-5.4])中控制GA和母體人口學(xué)特征后，CRR與MIDPE的關(guān)聯(lián)仍然顯著?；赑>0.1，從模型中排除了母體年齡，種族和胎次。接下來，分析完成24小時蛋白質(zhì)收集的女性組(認(rèn)為是目前的PE蛋白尿的金標(biāo)準(zhǔn)，n＝250)。CRR和24h蛋白尿之間存在顯著相關(guān)性(r＝0.788，P<0.001)。在需要MIDPE的24h蛋白尿≥300mg/24h的婦女中，94％(148/158)具有CRR≥15％，82％(129/158)具有CRR≥30％(圖13)。一些因沒有蛋白尿或高血壓而視作“非典型”PE病例顯示尿嗜剛果紅性。在非蛋白尿“非典型”病例中，58％(23/40)在第一次評估時是嗜剛果紅的，表明CRD試驗在這種臨床情況下的潛在臨床有用性。所有23名嗜剛果紅的患有“非典型PE”的婦女進(jìn)行醫(yī)學(xué)指示分娩。在21例中，分娩指征是具有非典型呈現(xiàn)的sPE。在剩余2例中，分娩指征是異常胎兒心率跟蹤。與尿可溶性fms樣酪氨酸激酶-1(sFlt-1)/胎盤生長因子(PlGF)比例[uFP，z-統(tǒng)計量＝4.5，P<0.001]，肌酐標(biāo)準(zhǔn)化尿sFlt-1濃度(z-統(tǒng)計量＝6.8，P<0.001)，肌酐標(biāo)準(zhǔn)化尿PlGF濃度(z-統(tǒng)計量＝9.2，P<0.001)和蛋白質(zhì)-比-肌酐(P:C)比例(z-統(tǒng)計量＝13.9，P<0.001)相比，CRR表現(xiàn)明顯更好(圖7F)。在用我們先前描述的尿蛋白質(zhì)組學(xué)評分(UPS，z-統(tǒng)計量＝0.4，P＝0.695)預(yù)測MIDPE方面CRR具有相似的性能。在需要MIDPE，獨立于GA或總蛋白尿或蛋白尿(P<0.001)的婦女中，UPS是尿嗜剛果紅性的最強(qiáng)預(yù)測因子。該發(fā)現(xiàn)與先前觀察結(jié)果一致，即UPS評分的幾個肽片段生物標(biāo)記物具有高錯誤折疊潛力。尿嗜剛果紅性與原型錯誤折疊蛋白的寡聚表位的免疫反應(yīng)性相關(guān)使用先前驗證的三種四級結(jié)構(gòu)抗體來鑒定已知淀粉樣蛋白形成蛋白的相互排斥的表位。A11多克隆抗體檢測細(xì)胞毒性前纖維寡聚體(PFOs)上的通用的、序列獨立的構(gòu)象表位，所述細(xì)胞毒性前纖維寡聚體似乎是反平行的β-折疊結(jié)構(gòu)，包括β-桶和β-圓柱體。αAPF多克隆抗體識別環(huán)狀原纖維(APFs)構(gòu)象上的通用的、序列獨立的表位，所述環(huán)狀原纖維看起來是β-桶，并且比通用PFO更成熟并因此具有更少的細(xì)胞毒性。OC抗體檢測成熟原纖維和可溶性纖維寡聚體的平行、互相對齊的原纖維構(gòu)象。在來自P-CRL(n＝57)，crHTN(n＝16)，mPE(n＝33)和sPE(n＝128)婦女的234個連續(xù)尿樣的子集上進(jìn)行蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化斑點印跡。與P-CRL和crHTN婦女相比，sPE具有更高的A11免疫反應(yīng)性(P<0.001，圖8A)。與P-CRL和crHTN相比，sPE和mPE婦女在招募時均具有顯著升高的αAPF尿免疫反應(yīng)性水平(圖8B)。如圖8C所示，A11和αAPF的免疫反應(yīng)性有顯著的異質(zhì)性，其中一些樣本對兩種抗體反應(yīng)相同(S3)，而其他主要與一種反應(yīng)(S2)。這些結(jié)果可以根據(jù)最近的結(jié)果解釋，表明PFO作為APF形成的前體的作用。用OC抗體沒有發(fā)現(xiàn)顯著的反應(yīng)性。總的來說，這些結(jié)果表明在患有PE的婦女的尿中存在PFO和APF，而不存在纖維狀寡聚物或成熟原纖維。然而，不是所有的有尿嗜剛果紅性的sPE婦女顯示可檢測的APF或PFO免疫反應(yīng)性。圖8D顯示了A11和αAPF免疫反應(yīng)性與包括在我們的分析中的每個尿樣的嗜剛果紅性水平的3D圖。雖然大多數(shù)非MIDPE樣品(n＝73，綠色圓圈)在靠近圖的原點聚集在一起，但是MIDPE樣品(n＝161，紅色方塊)基本上沿著三個軸分散，說明了尿液PFO，APFs和嗜剛果紅性中很大的不均勻性。在MIDPE組內(nèi)，CRR與PFO(r＝0.268，P<0.001)顯著相關(guān)，但不與APF免疫反應(yīng)性(r＝0.128，P＝0.106)顯著相關(guān)。明顯地，與缺乏尿PFO免疫反應(yīng)性的婦女相比，測試為陽性的患者具有顯著較高的收縮血壓(P＝0.002)和舒張血壓(P＝0.020)，以及更嚴(yán)重的高血壓綜合征的臨床表現(xiàn)(P<0.001)。所有分析在校正GA和總蛋白尿(尿P/C比)后仍然顯著。從PE尿分離的嗜剛果紅物質(zhì)包含具有淀粉狀樣微觀特征的圓形和纖維狀納米級結(jié)構(gòu)開發(fā)了用于CR-輔助的尿樣沉淀的方案以進(jìn)一步表征PE的嗜剛果紅性。當(dāng)通過偏振顯微鏡觀察sPE沉淀時(圖9A)，觀察到綠色雙折射圓形或細(xì)長顆粒(參見插圖)。在透射電子顯微鏡(TEM，圖9B，9C)下，圓形結(jié)構(gòu)的尺寸從30-300nm變化，而原纖維構(gòu)象更長，樹枝狀，并在較大的電致密新結(jié)構(gòu)中纏結(jié)在一起。在并行處理和成像的P-CRL樣品中不存在這些結(jié)構(gòu)(圖9D)。負(fù)染色TEM(圖9E，9F)顯示單纖維為具有光滑圓形末端(星號)的直徑為的細(xì)長絲。除了較厚的直徑，來自sPE尿的嗜剛果紅性沉淀物的整體微觀外觀與CR染色的從淀粉樣蛋白負(fù)載組織提取的原纖維的經(jīng)典報道非常相似。開采PE錯誤折疊組：PE尿液中嗜剛果紅性物質(zhì)的免疫學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示異質(zhì)蛋白質(zhì)組分術(shù)語“錯誤折疊組”描述錯誤折疊蛋白的任何集合。UPS評分的鑒別性生物標(biāo)記物代表SERPINA1和白蛋白的非隨機(jī)切割片段?；赟ERPINA’1在PE中聚集和蛋白錯誤折疊的傾向，下一步是在尿嗜剛果紅性物質(zhì)中搜索SERPINA1和白蛋白的足跡。圖9G(左圖)顯示了兩個sPE尿樣(泳道U1-U2)及其相應(yīng)的CR沉淀(泳道P1-P2)的代表性SERPINA1蛋白質(zhì)印跡。如圖所示，CR沉淀顯著富集在SERPINA1免疫反應(yīng)性(測定)中，其中分子量梯形圖顯示主要是SERPINA1片段而非完整的前體(黑色箭頭)。相同樣品的非特異性考馬斯染色(圖9G右圖)說明CR-輔助沉淀的過程導(dǎo)致條帶模式的改變，這意味著sPE尿中只有一些肽具有CR親和力，SERPINA1片段是這一家族的一部分。圖9H(左圖)是白蛋白的代表性蛋白質(zhì)印跡，顯示了在CR輔助沉淀之前(U1)和CR輔助沉淀之后(P1)的sPE尿樣。如圖所示，完整的白蛋白前體(黑色箭頭)和較高分子量的聚集體相對于白蛋白片段是主要的。在還原后在凝膠中自由遷移的CR染料的位置由紅色箭頭標(biāo)記。這些實驗證實來自sPE尿的CR沉淀物具有盡管不均勻但不隨機(jī)的蛋白質(zhì)組分。所述蛋白質(zhì)組分通過用抗白蛋白(圖9I)和抗SERPINA1(圖9J)抗體的TEM免疫標(biāo)記進(jìn)一步驗證。在雙免疫TEM觀察到的模式表明SERPINA1和白蛋白共存在CR沉淀中，這支持異源共聚集的想法。為了確定什么其他蛋白質(zhì)可能在CR沉淀中表現(xiàn)，將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于來自良好表征的sPE病例的樣本。除了通過串聯(lián)質(zhì)譜確認(rèn)的SERPINA1和白蛋白之外，其他代表的身份是IgGκ自由輕鏈(κFLC)、血漿銅藍(lán)蛋白和干擾素-誘導(dǎo)蛋白6-16(IFI6，也稱為G1P3)。有趣的是，許多通過質(zhì)譜法鑒定的肽被發(fā)現(xiàn)含有氧化的甲硫氨酸殘基，這結(jié)果與我們先前的發(fā)現(xiàn)(SERPINA1的Met365-氧化C末端片段作為sPE的尿生物標(biāo)記物)一致。通過從60個不同的尿樣中分離的CR沉淀物的蛋白來印跡驗證上述一致性。圖14顯示了來自4名早產(chǎn)sPE的婦女的尿液CR沉淀中κFLC、血漿銅藍(lán)蛋白、G1P3、SERPINA1和白蛋白的代表性蛋白印跡。總的來說，這些結(jié)果表明sPE婦女的嗜剛果紅材料包含源自多種蛋白質(zhì)的片段和/或聚集體的蛋白形式。此外，sPE患者在其是嗜剛果紅聚集體中共享來自至少5種不同蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)性蛋白形式的非隨機(jī)模式。因為κFLC、血漿銅藍(lán)蛋白和G1P33在完整蛋白質(zhì)的預(yù)期分子尺寸上具有其最主要的免疫反應(yīng)性條帶，這支持其固有的聚集傾向，即使在非片段化狀態(tài)下。不同于κFLC和血漿銅藍(lán)蛋白，它們先前已報道經(jīng)歷與幾種人構(gòu)象疾病相關(guān)的病理聚集，G1P3之前沒有被研究過在淀粉樣蛋白結(jié)構(gòu)中的參與情況。我們對由可變剪接產(chǎn)生的三種G1P3同種型的淀粉樣蛋白形成潛力進(jìn)行了計算機(jī)分析。在G1P3序列中，我們注意到異常高數(shù)量的易聚集片段(“熱點”)。AGGRESCAN算法預(yù)測G1P3應(yīng)當(dāng)具有聚集傾向，至少如果不超過Aβ42，其中最短同種型(G1P3a)最具淀粉樣變性(Na4vSS：G1P3a：13.6對Aβ42：6.4，圖15和表4)。PE尿液含有聚集的APP蛋白形式原纖維淀粉樣蛋白對胰蛋白酶的蛋白水解有抗性。這導(dǎo)致我們考慮這樣的可能性，即依賴于胰蛋白酶切割肽的指紋圖譜的蛋白質(zhì)組學(xué)方法可能已經(jīng)錯過了尿嗜剛果紅材料中的重要蛋白質(zhì)身份。一種候選是APP。APP的細(xì)胞加工是與阿爾茨海默氏病相關(guān)的公認(rèn)的病理生理現(xiàn)象。表4.干擾素-誘導(dǎo)蛋白6-16(G1P3)同種型和具有低和高聚集傾向的兩個原型序列的聚集參數(shù)*ΤTNNI3(肌鈣蛋白I型3)是天然未折疊的固有穩(wěn)定蛋白Aβ42(淀粉樣蛋白β42)是固有不穩(wěn)定的淀粉樣變性肽較高的AGGRESCAN參數(shù)值表示較高的聚集傾向，而負(fù)值表示非常低的聚集傾向。注意G1P3的聚集參數(shù)與Aβ42的相似以及與TNNI3的不同。此外，AGGRESCAN算法能夠確定較短的G1P3同種型具有更高的理論聚集傾向APP是一種普遍表達(dá)的蛋白，其中通過APP基因的選擇性剪接產(chǎn)生3種主要同種型(APP770，APP751，APP695)。在正常的代謝途徑中，APP首先被α-分泌酶(而不是β-分泌酶)裂解以釋放可溶性N-末端片段(sAPPα)。sAPPα是非淀粉樣變性的并且作為促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖和遷移的生長因子。然而，APP由β-分泌酶和隨后由λ-分泌酶的裂解(圖10A)釋放短的淀粉樣-β蛋白肽(Aβ)，其是嗜剛果紅性老年斑的主要成分。由于其低聚和自組裝的高傾向，Aβ在誘導(dǎo)與阿爾茨海默病相關(guān)的氧化應(yīng)激和神經(jīng)變性中具有直接的病理學(xué)作用?；谏鲜鲋R，分析從sPE婦女取回的尿樣的CR沉淀中APP片段的存在。使用識別APP特異性結(jié)構(gòu)域中殘基511-608的ALZ90單克隆抗體，通過蛋白質(zhì)印跡證實了這些樣品中APP片段的存在(圖10B，泳道P1-P3)。最顯著的條帶在60-90kDa之間遷移，在sPE案例中具有一致的條帶模式。該模式在spPE病例(P4-P7)中不存在或被修飾，觀察到支持這兩種與妊娠相關(guān)的臨床上重疊的綜合征之間的致病性差異。因為圖10B中所示的所有樣品具有NR-CRR水平，所以很可能尿嗜剛果紅性累計了也包括APP片段的錯誤折疊蛋白的集合。然后通過蛋白質(zhì)印跡使用針對APP序列上的表位陣列產(chǎn)生的良好表征的單克隆抗體來研究健康P-CRL(n＝8)和sPE(n＝16)婦女的粗尿樣中APP片段的存在：ALZ90，DE2B4(與Aβ區(qū)的殘基1-17內(nèi)的表位反應(yīng))，22C11(與APP、sAPP以及與結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白APLP-2的N-末端表位反應(yīng))(47)和MAB5354抗體(與Kunitz蛋白酶抑制劑[KPI]結(jié)構(gòu)域中的表位反應(yīng))(43-45)。圖10C顯示，與CR沉淀物相似，粗制sPE尿樣(U3-U8)顯示出強(qiáng)烈的ALZ90免疫反應(yīng)性。DE2B4檢測到與ALZ90類似的免疫反應(yīng)性模式，雖然具有較低的強(qiáng)度。因為排除了人白蛋白與兩種抗APP單克隆抗體的非特異性交叉反應(yīng)性(圖10D，顯示為DE2B4)，所以在sPE尿中由ALZ90和DE2B4顯示的條帶模式的唯一可能的解釋是APP片段化和/或APP片段與其它蛋白質(zhì)的共聚集。后一種可能性通過西布朗康藍(lán)(Cibacronblue)處理sPE尿時顯著的64kDa條帶的強(qiáng)度降低證實(圖16A，16B)。22C11抗體在成熟sAPP的預(yù)期分子量下檢測到P-CRL(U1-U2)和sPE(U3-U8)中的免疫反應(yīng)性尿蛋白(圖10E)。然而，sPE尿含有可能代表未成熟sAPP(泳道U4-U6)的額外條帶。值得注意的是，具有強(qiáng)ALZ90和DE2B4免疫反應(yīng)性的一些sPE婦女(泳道U3，U7，U8)具有較不顯著的22C11sAPP條帶。一起解釋，22C11與陽性ALZ90和DE2B4免疫反應(yīng)缺乏顯著染色表明sPE婦女分泌大量的APP片段，這些片段都是N-截斷和α-分泌酶切割的。使用檢測總sAPP(sAPPα和sAPPβ)的ELISA，確定sPE婦女(n＝66)具有比P-CRLs(n＝44)更高的sAPP分?jǐn)?shù)分泌(sPE：0.27％[0.05-0.90]對P-CRL：0.09％[0.01-0.42]，P＝0.032)。含有KPI結(jié)構(gòu)域(例如APP770和APP751)的sAPP同種型作為抗蛋白酶起作用并且通常稱為蛋白酶連接蛋白(nexin)-II(APP-KPI/PN2)。與SERPINA1類似，APP-KPI/PN2強(qiáng)效抑制包括胰蛋白酶和作為自殺底物的凝血因子的絲氨酸蛋白酶。包括KPI結(jié)構(gòu)域的APP-KPI/PN2的片段已知是高度淀粉樣變性的(50,51)。圖10F證明了sPE婦女的尿樣含有通過MAB5354(KPI結(jié)構(gòu)域)抗體特異性檢測的APP片段。然而，與DE2B4相比，MAB5354的免疫反應(yīng)性和APP751同種型的貢獻(xiàn)似乎很小(圖16C，16D)?？傊墒斓膕APP蛋白形式是健康妊娠中的正常尿液成分。相對低的血清sAPP，sAPP的高分?jǐn)?shù)分泌，特別是sPE尿液中高水平的片段化APP蛋白形式指示sPE中APP蛋白水解加工途徑的可能紊亂。人胎盤表達(dá)APP和原型α、β和γ-分泌酶的mRNA，其ADAM10和BACE2在PE中增加胎盤是PE的病理生理學(xué)的中心。因為APP的細(xì)胞處理是良好表征的酶裂解序列，我們研究了總APP和原型APP加工酶的胎盤mRNA表達(dá)：α-分泌酶(ADAM10，ADAM17)，β-分泌酶(BACE1，BACE2)和γ-分泌酶(PSEN1，PSEN2)。通過定量實時RT-PCR，我們確定人胎盤表達(dá)APP和α、β和γ-分泌酶的mRNA，其中對于APP、ADAM10、ADAM17、BACE2、PSEN1和PSEN2，早產(chǎn)表達(dá)高于足月的(圖11A，11B)。早產(chǎn)(P＝0.001)和足月(P＝0.009)中α-分泌酶ADAM10的相對豐度顯著高于ADAM17的相對豐度。在早產(chǎn)和足月胎盤中僅輕微檢測到β-分泌酶BACE1的擴(kuò)增信號。這與BACE2相反，BACE2以顯著更高的水平表達(dá)，特別是在早產(chǎn)胎盤中(P<0.001，相對于足月)。與α-和β-分泌酶相比，γ-分泌酶具有總體較低的mRNA水平。PSEN1的mRNA顯著高于早產(chǎn)兒的PSEN2的mRNA(P<0.001)，但不是在足月胎盤(P＝0.209)中，其中兩個γ-分泌酶均在低水平表達(dá)。與具有特發(fā)性早產(chǎn)(iPTB)的婦女的GA匹配胎盤組織相比，sPE中ADAM10(P<0.001)和BACE2(P<0.001)的絨毛滋養(yǎng)層mRNA水平顯著更高(圖11C)。相同組之間的比較顯示sPE中BACE1mRNA水平降低(P＝0.021，圖11C)。對于ADAM17，PSEN1，PSEN2或APP，沒有觀察到mRNA表達(dá)的明顯變化(全部P>0.05)。嚴(yán)重先兆子癇與類似淀粉樣斑塊的胎盤中的胞外ALZ90陽性聚集物沉積相關(guān)在iPTB胎盤的基底板和絨毛膜絨毛(villi)中鑒定到強(qiáng)的22C11(N-末端)APP免疫反應(yīng)性(圖12A)。蛻膜細(xì)胞(dec)比絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(evt)染色更強(qiáng)，而在胎盤絨毛中，內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)層與周圍基質(zhì)相比染色更顯著(圖12A，插入圖)。在sPE和iPTB胎盤之間，22C11染色模式中存在顯著差異。與iPTB相比，在sPE中，蛻膜細(xì)胞以幾乎相同的強(qiáng)度染色陽性，但是22C11蛻膜細(xì)胞的分布更加分散并且具有扭曲的形態(tài)(圖12B)。在母本的絨毛間隙中，觀察到非細(xì)胞絲狀聚集體的強(qiáng)染色，在sPE切片上的數(shù)目顯著增加(圖12B，插入圖，箭頭)。ALZ90抗體染色(對淀粉樣(amyloid)斑塊特異性)的模式與用22C11觀察到的模式不同。ALZ90陽性區(qū)域在早產(chǎn)iPTB組織中稀少，并且當(dāng)存在時，它們更經(jīng)常地定位于蛻膜(圖12C)而不是組織學(xué)免疫反應(yīng)性實際上不存在的胎盤絨毛(圖12C，插入物)。相反，在sPE胎盤中，ALZ90染色在基板(圖12D)和絨毛區(qū)域(圖12E)中更加突出，從而給出胎盤的整體片狀外觀。值得注意的是，ALZ90陽性局部化為點狀(圖12E，插入圖)或片狀非細(xì)胞材料聚集成斑塊(圖12F)。在受類纖維蛋白(fibrinoid)樣變性影響的區(qū)域中更頻繁地觀察到ALZ90陽性斑塊。然而，并非所有類纖維蛋白物質(zhì)都是ALZ90陽性的。在H&E染色時，ALZ90-陽性材料具有不同于周圍嗜酸性類纖維蛋白(fibrinoid)的特征性紫色蛋白質(zhì)外觀(圖12G)。與小鼠IgG孵育確認(rèn)了染色特異性(圖12H)。ALZ90-陽性血管內(nèi)物質(zhì)對G1P3是免疫反應(yīng)性的，并且經(jīng)常在形態(tài)學(xué)上被描述為胎盤鈣化的區(qū)域中注意到，我們通過茜素(Alizarin)S染色證實(圖17A-17D)。人胎盤表達(dá)對原型α、β和γ-分泌酶的免疫反應(yīng)性，其中ADAM10、BACE1、BACE2和PSEN1在PE胎盤中以細(xì)胞特異性方式增加與iPTB胎盤相比，sPE胎盤表達(dá)更多的ADAM10(P＝0.017，圖12I，12J)和BACE2(P＝0.007，圖12K，12L)。在sPE中，絨毛ADAM10免疫反應(yīng)性主要位于細(xì)胞滋養(yǎng)層(圖8J)，而β-分泌酶BACE2在包括絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層，合體滋養(yǎng)層和絨毛基質(zhì)細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群中更普遍地表達(dá)(圖8L)。發(fā)現(xiàn)人胎盤顯示BACE1的陽性免疫染色。在iPTB中，胎盤蛻膜細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)層表現(xiàn)出大多數(shù)陽性染色(圖8M)。在sPE絨毛中觀察到BACE1表達(dá)模式的變化，突出的BACE1存在于看起來包圍絨毛邊緣的合體滋養(yǎng)層中(圖8N)。制得重視的是，sPE胎盤顯示BACE1染色強(qiáng)度的區(qū)域差異(圖18A-18J)。觀察到胎盤梗死附近的區(qū)域具有最顯著的合體滋養(yǎng)層染色。關(guān)于γ-分泌酶PSEN1，iPTB胎盤在絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞或合體滋養(yǎng)層細(xì)胞中幾乎沒有染色(圖12O，插入圖)。相反，sPE合體滋養(yǎng)層顯示出顯著的PSEN1染色(P＝0.038，圖12P，插入圖)，其與BACE1一起代表通過淀粉樣蛋白形成途徑參與APP加工的兩種關(guān)鍵酶。研究設(shè)計孕婦從2004年3月至2010年12月在耶魯-紐黑文醫(yī)院(紐黑文，康涅狄格州)招募。非懷孕蛋白尿婦女在弗萊徹艾倫健康保健醫(yī)院(FletcherAllenHealthCareHospital)(伯靈頓，佛蒙特州)招募。研究方案由耶魯大學(xué)和佛蒙特大學(xué)人類研究保護(hù)計劃批準(zhǔn)。委員會。所有婦女提供書面知情同意書。研究來自662名婦女的824個尿樣(圖5)。為了調(diào)查尿嗜剛果紅性，在從40個sPE和MIDPE患者收集的80個尿樣中，以及在沒有任何并發(fā)癥的情況下足月分娩的40個健康無癥狀孕婦中進(jìn)行可行性階段?？尚行噪A段患者的臨床特征在補(bǔ)充材料中提供(表1)。在研究的第二階段，在一項前瞻性群體研究中進(jìn)行進(jìn)一步驗證尿嗜剛果紅性，其中包括基于她們在招募時的診斷而分層次的526名連續(xù)患者：(a)懷孕無癥狀對照(P-CRL，n＝18)；(b)妊娠高血壓(gHTN，n＝28)；(c)慢性高血壓(crHTN，n＝63)；(d)輕度PE(mPE，n＝53)；(e)sPE(n＝135)；(f)疊加PE(spPE，n＝57)；(g)沒有必要對PE進(jìn)行實驗室治療的懷孕相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況(其他1型，n＝125)，(h)進(jìn)行與PE和實驗室治療頻繁相關(guān)的懷孕相關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥或合并癥以確認(rèn)或排除PE(其他類型-2，n＝37)和(i)非懷孕蛋白尿婦女(n＝10)。驗證階段患者的臨床特征在補(bǔ)充材料中提供(表2)?？v向群體由在研究進(jìn)入時無癥狀并且在整個妊娠期間貢獻(xiàn)多個樣品的婦女組成(n＝56)。這些患者基于研究者可用性連續(xù)招募，并且被認(rèn)為是PE的高(n＝28)或低(n＝28)風(fēng)險。臨床和替代終點PE是一種綜合征，其特征在于具有不同發(fā)病機(jī)理和各種風(fēng)險因素的不同臨床表現(xiàn)。懷孕期間PE和高血壓疾病的定義通常是任意的。在缺乏支持各種定義的有效性的數(shù)據(jù)的情況下，診斷PE并不像人們可能相信的那么容易。在識別處于不良妊娠結(jié)局風(fēng)險中的患者時存在明顯的困難，特別是在患有PE或各種PE類似疾病的婦女中。因此，除了可以隨病程和醫(yī)生而變化的臨床診斷類別之外，選擇基于介入-的未遂事件(intervention-basednear-missevent)，即MIDPE，作為真實疾病的更好反映。這種方法成功應(yīng)用于我們以前的尿蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)研究。簡而言之，有理由認(rèn)為，MIDPE的指征屬于臨床團(tuán)隊，是所有其他治療策略失敗時的最后管理手段，其結(jié)果是最終結(jié)果，不能撤銷，因此較少受偏倚。因為PE患者(預(yù)期與立即分娩)的臨床管理可基于診斷時的胎齡(GA)而變化，根據(jù)分娩時的GA分析結(jié)果。使用<34、34-366/7和>37周的GA截止值。圖5和表1和2中給出了橫向和縱向群體中基于上述GA分布的因MIDPE或其他原因分娩的患者數(shù)量。生物樣品收集尿樣。簡言之，通過使用“直接捕獲物”或“清潔捕獲物”無菌技術(shù)通過無菌容器的標(biāo)準(zhǔn)使用收集隨機(jī)尿樣(5-10mL)。sPE婦女具有放置的Foley導(dǎo)管，以允許精確監(jiān)測尿輸出。百分之七十的早產(chǎn)PE婦女發(fā)作前登記預(yù)防(硫酸鎂)和類固醇。登記在縱向群體中的婦女以時間順序方式提供系列樣品。在收集尿液時，通過靜脈穿刺在來自橫向群體的女性子集(n＝141)中收集血液樣品。使血液凝塊。將血清和尿樣在3,000g，4℃下旋轉(zhuǎn)20分鐘，并分析或以等分試樣儲存在-80℃。在患有sPE的婦女(n＝8，GA：31±1周；生長百分位數(shù)：24±7％)分娩后立即收集胎盤組織。GA匹配的自發(fā)性先天早產(chǎn)(n＝8，基于通過羊膜穿刺確定無羊膜內(nèi)感染以及基于無組織學(xué)絨毛膜羊膜炎的診斷，GA：31±1周；生長百分位數(shù)：31％±7％)和無臨產(chǎn)情況下(intheabsenceoflabor)通過預(yù)定剖腹產(chǎn)足月分娩的健康婦女(n＝5，GA：39±1周，生長百分位數(shù)：36±10％)作為對照。組織在液氮中冷凍或在福爾馬林中固定。對硝化纖維素膜陣列上的尿嗜剛果紅性的評價和剛果紅點(CRD)試驗的原理尿嗜剛果紅性的評價是基于Halimi等人的方案實現(xiàn)的，他們調(diào)查了受Creutzfeldt-Jakob(朊病毒)疾病影響的患者的尿中的這種性質(zhì)。該方案以膜陣列形式對PE尿液進(jìn)行優(yōu)化，最終結(jié)果是CRD試驗。技術(shù)細(xì)節(jié)如下。簡言之，將100μl尿上清液與2μl的5mg/mLCR溶液混合。1小時后，將5μl上清液一式兩份點在硝化纖維素膜上，并置于空氣中干燥。依次在水中以及然后在濃度漸增的甲醇中洗滌膜。洗滌后，CR-染色的聚集體保留在膜中，而游離CR被除去。因為PE婦女的尿樣在蛋白質(zhì)濃度上具有廣泛的變化，所以在該研究的最初部分中進(jìn)行總蛋白/CR比的標(biāo)準(zhǔn)化。測試輸出表示為％CR保留[(CRR)，測量相對于染料添加量的洗滌后保留的染料]和％CR摻入[(CRI)，測量添加到每個樣品中并用作內(nèi)部對照的染料]。通過直接分光光度法評價尿嗜剛果紅性CR與淀粉樣蛋白的結(jié)合導(dǎo)致染料在可見光中的吸收光譜的變化(從橙紅色到玫瑰紅色)，并且這種紅移現(xiàn)已用于評估體外β-淀粉樣蛋白低聚(聚集)(22,100)。在可行性階段中使用的所有sPE和P-CRL尿樣如同CRD試驗一樣進(jìn)行處理。將尿-CR混合物稀釋10倍，并用分光光度法測定CR誘導(dǎo)的光譜漂移(見下文)。使用Klunk's公式，從403、504和541-nm處的吸光度值得到每個尿樣中淀粉狀蛋白樣蛋白質(zhì)的理論濃度。通過減去在沒有CR的樣品中獲得的值來實現(xiàn)固有吸光度和光散射的歸一化。淀粉狀蛋白樣蛋白的光譜漂移確定的濃度與受試者的CRR測試結(jié)果相關(guān)。評價尿中ThT-誘導(dǎo)的熒光在最初描述的用于血清的方案后測量ThT熒光。簡言之，將旋轉(zhuǎn)尿樣(30μl)與80mMThT在pH為7.4的100mM磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中混合。在分光熒光計(Clariostar，BMGLabtech，卡里，北卡羅來納州)中獲得熒光測量，激發(fā)/發(fā)射波長分別設(shè)定為444/485nm。固有尿液熒光的歸一化通過減去不存在ThT時的值來實現(xiàn)。寡聚狀態(tài)免疫反應(yīng)性的測試可溶性淀粉樣蛋白寡聚體是細(xì)胞死亡的細(xì)胞毒性和強(qiáng)效誘導(dǎo)劑。已經(jīng)描述了幾種免疫學(xué)上不同的結(jié)構(gòu)變體：前纖維寡聚物(PFO)，纖維寡聚物(FOs)和環(huán)狀原纖維(APF)。使用斑點印跡技術(shù)與以下第一抗體檢測四組婦女(P-CRL，n＝57；crHTN，n＝16；mPE，n＝33，sPE，n＝128)的尿中可溶性淀粉樣蛋白低聚物的存在情況：A11、OC和抗-APF，分別識別PFO，F(xiàn)O和APF(14-16)。技術(shù)細(xì)節(jié)在補(bǔ)充方法中提供。CR-輔助沉淀來自不同臨床類別(P-CRL，n＝13；crHTN，n＝5；mPE，n＝5；sPE，n＝51；spPE：n＝9；非PE蛋白尿癥，n＝8)的91個孕婦的尿樣如補(bǔ)充方法中所述進(jìn)行CR-輔助沉淀。在90％的PE樣品中在微量離心管的底部明顯鑒定到CR-沉淀物，但在任何P-CRL，crHTN或非-PE蛋白尿癥受試者中沒有(CR-沉淀物陰性)。偏振顯微鏡和透射電子顯微鏡(TEM)將來自sPE尿(n＝5)的CR沉淀物重懸浮于水中，在顯微鏡載玻片上干燥并通過偏振光顯微鏡觀察特征性綠色CR雙折射，如下所述?；蛘?，在用2％乙酸雙氧鈾進(jìn)行陽性或陰性染色后，將懸浮液置于200目聚醋酸甲基乙烯脂/碳涂覆的鎳網(wǎng)上。還試驗了P-CRL婦女的試管的樣品，以圖制備CR沉淀(n＝4)。尿液嗜剛果紅性物質(zhì)中蛋白質(zhì)的鑒定、驗證和聚集建模將從患有sPE的婦女(n＝4，GA：28±2周)中分離的CR沉淀重懸于還原Laemelli緩沖液(伯樂公司-BioRad)中并煮沸10分鐘。將樣品加載到用Coommassie藍(lán)染色的10％SDS-PAGE凝膠上。切除可見帶，并進(jìn)行胰蛋白酶消化和串聯(lián)質(zhì)譜分析(見下文)?；贛OWSE得分>53(matrixscience.com)建立蛋白質(zhì)同一性。發(fā)現(xiàn)SERPINA1、白蛋白、κFLC、血漿銅藍(lán)蛋白和干擾素-誘導(dǎo)蛋白6-16(G1P3)可以代表和選擇用于通過蛋白印跡在從其他60例分離的CR沉淀中驗證。使用在http://bioinf.uab.es/aggrescan/的基于網(wǎng)絡(luò)的服務(wù)器上運(yùn)行的AGGRESCAN算法確定G1P3的聚集傾向(細(xì)節(jié)如下)。測定尿、尿嗜剛果紅物質(zhì)和/或母體血清中的APP和ADAM-10免疫反應(yīng)性對sPE病例的代表性嗜剛果紅材料(n＝38)和尿(n＝16)進(jìn)行蛋白印跡。使用GA匹配病例的P-CRL尿液(n＝8)作為參考。通過ELISA研究了血清和尿液中可溶性APP(sAPP)和ADAM-10的免疫反應(yīng)性(以下描述的方案)。通過定量實時PCR和免疫組織化學(xué)研究α、β和γ-分泌酶使用TaqMan化學(xué)試劑(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司-AppliedBiosystems)和用于APP和以下APP-切割酶的經(jīng)驗證的引物/探針對胎盤和羊膜的mRNA進(jìn)行實時PCR：α-分泌酶(ADAM10，ADAM17)，β-分泌酶(BACE1，BACE2)和γ-分泌酶[早老素-1(PSEN1)，早老素-2(PSEN2)]。胎盤絨毛的染色強(qiáng)度以從0(不存在)到+5(強(qiáng))的量表半定量評估?？辜?xì)胞角蛋白-7和CD163的抗體分別用作滋養(yǎng)層和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)記物。技術(shù)細(xì)節(jié)如下。通過免疫組織化學(xué)定位胎盤中的淀粉樣蛋白斑塊淀粉樣蛋白的異常沉積是阿爾茨海默病的特征，阿爾茨海默病是原型蛋白錯誤折疊病癥。病理證據(jù)顯示肽Aβ的原纖維是淀粉樣蛋白的基本成分。處理石蠟包埋的載玻片以檢測已知存在于阿爾茨海默病患者腦中的斑塊中的Aβ表位。使用兩種良好表征的單克隆抗體(抗ALZ90和DE2B4)。通過茜素S染色鑒定共沉積的鈣。技術(shù)細(xì)節(jié)如下。其他生化、免疫學(xué)和分子估計的方法詳情分析所有尿樣的PE替代標(biāo)記物(使用或建議的)，例如蛋白質(zhì)與肌酐(P：C比)，可溶性fms樣酪氨酸激酶-1(sFlt-1)與胎盤生長因子(PlGF)(uFP)之比和尿蛋白質(zhì)組學(xué)評分(UPSb和UPSr)。技術(shù)細(xì)節(jié)如下。統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)報告為具有標(biāo)準(zhǔn)誤差平均值(SEM)(對于正態(tài)分布數(shù)據(jù))的平均值或作為具有四分位數(shù)范圍(對于非正態(tài)分布數(shù)據(jù))的中值。酌情將數(shù)據(jù)集與Student'st檢驗、Mann-Whitney檢驗、單向，雙向或KruskalWallisANOVA作比較。使用Pearson's或Spearman's秩序相關(guān)進(jìn)行相關(guān)分析。將比例與Fisher精確檢驗或卡方檢驗進(jìn)行比較。一起，在可行性和橫截群體中與縱向群體中的第一樣本一起登記的孕婦的尿液樣本代表了對登記無偏見的婦女的連續(xù)群體，因此適合于受試者工作曲線特征(ROC)。使用MedCalc(Broekstraat，比利時)統(tǒng)計軟件，在受試者工作曲線特征ROC圖上測量測試精度(正確分類的病例/病例總數(shù))、靈敏度、特異性、陽性和陰性預(yù)測值和似然比(LR)。使用自助法計算置信區(qū)間(CI)。使用DeLong方法進(jìn)行ROC曲線的比較，該方法使用非參數(shù)方法來確定依賴性ROC曲線下面積之間的差異的統(tǒng)計顯著性(來自相同病例)。臨床定義·在所有情況下，使用與最后月經(jīng)周期相關(guān)的完善的超聲診斷標(biāo)準(zhǔn)建立妊娠年齡(GA)?！?yán)重先兆子癇(sPE)被定義為在至少2次(相隔6小時)收縮壓>160mmHg或舒張壓>110mmHg，>5克蛋白質(zhì)分泌/24小時尿液收集和/或試紙測試上持續(xù)性+3蛋白尿。子宮內(nèi)胎生長受限(IUGR)<10百分位，持續(xù)性神經(jīng)系統(tǒng)癥狀(頭痛，視覺障礙)，上腹部疼痛，少尿(少于500mL/24小時)，血清肌酐>1.0mg/dL或HELLP綜合征的任何元素：溶血、升高的肝酶(>正常的2倍)、低血小板計數(shù)(<100,000細(xì)胞/μL)，用作美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(ACOG)的sPE定義的一部分?！ぽp度PE(mPE)定義為至少140/90mmHg的舒張壓和至少300mg/24小時尿液收集的尿蛋白分泌(或者在試紙測試中至少1+或更大)，兩次間隔4-6小時，沒有與ACOG診斷sPE或spPE相符的體征或癥狀?！な澜缧l(wèi)生組織(WHO)對PE舒張壓≥90mmHg和試紙蛋白尿2+或更高的定義用于指定的選擇統(tǒng)計分析?！と焉锔哐獕憾x為與PE相一致的升高的血壓，兩次間隔4小時至1周，在20周后沒有蛋白尿或sPE標(biāo)記物的情況下重新出現(xiàn)。·“非典型PE”被診斷為：○無蛋白尿的妊娠高血壓，加上一個或多個以下項目：先兆子癇癥狀(上腹痛，嚴(yán)重頭痛、少尿、肺水腫)，溶血，血小板減少癥(<100,000/mm3)，肝酶升高(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶或丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶的正常值的上限的2倍)。○沒有妊娠高血壓的妊娠蛋白尿，加上一個或多個以下項目：先兆子癇的癥狀，溶血，血小板減少，肝酶升高?！ぶ丿B先兆子癇(spPE)被定義為“新發(fā)病的蛋白尿”，在妊娠20周之前患有慢性高血壓的女性中，如果已經(jīng)存在于妊娠早期的蛋白尿突然增加，高血壓突然增加或HELLP的綜合征發(fā)展·慢性高血壓(crHTN)定義為懷孕前或孕齡20周之前血壓持續(xù)升高?！と绻?0周GA之前檢測到患者患有已知的孕前腎臟疾病或持續(xù)的蛋白尿(>0.5克/24小時，至少兩次)，則咨詢腎臟科醫(yī)生后診斷出慢性腎病。·非妊娠婦女的蛋白尿是根據(jù)150毫克/24小時尿液收集的臨界值來判斷的。·其他類型-1(不經(jīng)常與PE相關(guān)的條件，不需要PE處理)。我們進(jìn)一步測試了基于臨床表現(xiàn)不需要PE治療的一組懷孕患者中的尿嗜剛果紅性(n＝125)。他們在招募時的臨床診斷是：早產(chǎn)早破膜(PPROM，n＝25)，短宮頸和/或完整膜早產(chǎn)(n＝76)，前置胎盤(n＝6)，血壓正常的不明病因的子宮內(nèi)胎死亡(IUFD)，非蛋白尿婦女(n＝5)，血壓正常的早剝(n＝2)，血栓形成傾向(n＝3)和腎盂腎炎(n＝8)?！て渌愋?2(通常與PE高風(fēng)險相關(guān)的病癥，其需要實驗室后處理以確認(rèn)或排除PE)。為了臨床相關(guān)性并測試尿嗜剛果紅性的魯棒性以區(qū)分患有和不患有PE的患者，在分析中包括需要用于PE區(qū)別診斷的實驗室后處理的臨床異質(zhì)組患者(n＝37)。該組由表現(xiàn)為IUGR(n＝20)、預(yù)先存在的腎病(n＝9)、未知病因的肝和/或腎衰竭(n＝4)、抗磷脂綜合征(n＝4)的病例組成。剛果紅點(CRD)試驗方案和研究中CRR的計算·樣品制備：尿液在4℃以15,000g旋轉(zhuǎn)15分鐘。使用PierceBCA試劑盒(ThermoScientific，羅克福德，伊利諾斯州)以白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物測量總蛋白/濃度。所有尿樣用蒸餾水歸一化以測量BCA測試中的6.6-mg/mL總蛋白/濃度?；诔醪綄嶒炦x擇該值，該初步實驗研究BCA測試法的線性作為CR和蛋白質(zhì)/濃度的函數(shù)。為了實際相關(guān)性，在BCA測試中測量為>6.6-mg/mL的樣品用水稀釋，而測量<6.6-mg/mL的樣品在SpeedVac(ThermoScientific)中濃縮至干，并用水重懸至上述濃度?！RD硝化纖維素膜陣列的制備：將100-μl標(biāo)準(zhǔn)化的尿與2-μl剛果紅的儲備水溶液(5mg/mL，西格瑪目錄號C6277，圣路易斯，密蘇里州)混合。通過將2-μl的CR儲存液加入到100-μl磷酸緩沖鹽水(PBS)中來制備空白樣品(BLK)。在室溫下渦旋混合1小時后，將5-μl混合物一式兩份點樣在未支持的硝化纖維素膜(0.22μm，BioRad，拉荷亞，加利福尼亞州)上，并置于空氣中干燥(分鐘)。然后將膜用水沖洗3分鐘。然后使用數(shù)碼相機(jī)(CoolPix4500，尼康，東京，日本)拍照以獲取第一圖片(PIX1：洗滌前)。接下來，用濃度漸增的甲醇洗滌膜[50％甲醇：3分鐘，70％甲醇：1分鐘，90％甲醇直到BLK樣品中的紅色完全消失(分鐘)。在此期間，非PE樣品的紅色隨著游離CR染料洗掉而消失。如果尿液含有錯誤折疊蛋白，則CR被固定的錯誤折疊蛋白保留，并且斑點保持可見的紅色。此后拍攝第二張照片(PIX2：洗滌后)?！D像處理：PIX1和PIX2在AdobePhotoshop(Adobe，圣何塞，加利福尼亞州)中處理。具體來說，每個圖像被手動轉(zhuǎn)換為灰度級、裁剪、在信道中分割和調(diào)整，以使得PIX1中的相同斑點與PIX2中的那些水平排列。使用ImageJ軟件(http://imagej.nih.gov/ij/)確定每個斑點的光密度(OD)。手動扣除基線并提取剖面曲線下的面積。OD結(jié)果導(dǎo)出到Excel中，計算每個斑點的PIX2/PIX1之比×100，并在每個患者的兩個斑點之間求平均值。在整個現(xiàn)有研究中使用該測試結(jié)果(CR保留：CRR)作為尿嗜剛果紅的定量測量，并針對與PE的診斷和預(yù)后相關(guān)的臨床變量進(jìn)行分析。僅從PIX1計算的第二個變量CR摻入(CRI)作為平均樣品OD/平均BLKOD之比x100并用作內(nèi)部對照。通過直接分光光度法評價尿嗜剛果紅性如先前對Aβ結(jié)合所述進(jìn)行溶液中CR-誘導(dǎo)的光譜偏移的分光光度分析。如CRD試驗所述，將尿樣歸一化并與CR混合。將200μl的10倍稀釋的CR-尿混合物一式兩份施用在96孔板上，連同相同稀釋度的無CR的尿液?？瞻讟悠肥蔷哂泻筒痪哂蠧R的PBS。在配備有SOFTmaxPro4.0軟件的Spectramax平板讀數(shù)器(MolecularDevices，森尼韋爾，加利福尼亞州)中讀板。首先以波長掃描模式(300-700nm)中進(jìn)行測量，然后在403nm(等吸收點)、504nm(游離CR的最大吸收點)和541nm(游離CR和淀粉樣蛋白結(jié)合CR的最大差異點)作末端讀數(shù)。通過從沒有CR的相同尿樣中減去OD讀數(shù)來實現(xiàn)固有光散射的校正。使用Klunk's公式從吸光度值得出每個尿樣中淀粉樣蛋白樣蛋白質(zhì)的理論濃度，并且結(jié)果與受試者的CRD測試結(jié)果相關(guān)。其他生物化學(xué)、免疫學(xué)和分子估計·用針對白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的二喹啉甲酸/硫酸銅試劑(BCA試劑盒，Pierce，羅克福德，伊利諾斯州)測量尿蛋白/濃度。大多數(shù)尿樣使用12倍稀釋因子。對分別在標(biāo)準(zhǔn)曲線以下或以上測量的樣品進(jìn)行未稀釋或50倍稀釋的樣品的重復(fù)測量?！Ρ葟囊阎獫舛鹊玫降臉?biāo)準(zhǔn)曲線，比色測定尿肌酐(Stanbio實驗室，伯尼，德克薩斯州)?！と缦惹八?24)，根據(jù)制造商的說明書(R&DSystems，明尼阿波里斯，明尼蘇達(dá)州)通過ELISA測量尿未結(jié)合的可溶性fms樣酪氨酸激酶(sFlt-1)和胎盤生長因子(PlGF)。在用針對游離sFlt-1和PlGF的捕獲抗體預(yù)包被的96孔板中一式兩份測定尿樣。進(jìn)行孵育和洗滌方案，然后在450nm讀數(shù)。sFlt-1和PlGF在測定中的最小可檢測濃度分別為5和7pg/mL。數(shù)據(jù)報告并使用Softmax軟件Pro3.1.1(MolecularDevices，桑尼威爾，加利福尼亞州)繪圖。測定間和測定內(nèi)變異系數(shù)從3至10％變化。將sFlt-1PlGF和蛋白質(zhì)的尿液水平標(biāo)準(zhǔn)化為尿肌酐濃度。如先前報道的，計算uFP(log[sFlt/PlGFx100])作為比單獨的分析物更好的PE指示物?！つ蛞旱鞍踪|(zhì)組學(xué)分?jǐn)?shù)(UPS)源自之前發(fā)表的表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時間(SELDI-TOF)追蹤。我們使用反相疏水表面H4和H50芯片(BioRad，拉荷亞，加利福尼亞州)單獨測定每個尿樣。在2.3-17.5kDa質(zhì)量區(qū)域中的13個生物標(biāo)記物峰(P1-P13)構(gòu)成對PE的尿蛋白質(zhì)組學(xué)特征。對于指定為生物標(biāo)記物的每個峰，計算實驗質(zhì)量(同一性指示物)及其信噪比(相對豐度的指示劑)。計算兩個客觀的尿蛋白質(zhì)組學(xué)分?jǐn)?shù)：表示分配給每個生物標(biāo)記物的布爾指標(biāo)(1：存在；0：不存在)之和的UPSb(布爾分?jǐn)?shù))和具有合并的以UPSr＝Σx(S/N)/10+1(其中“x”包括布爾指標(biāo)為1的生物標(biāo)記物)計算的存在的生物標(biāo)記物的半定量信息的UPSr(排列分?jǐn)?shù))。寡聚狀態(tài)免疫反應(yīng)性的測試用于免疫檢測可溶性寡聚體的第一抗體已由我們團(tuán)隊成員在先前報道中開發(fā)和表征。使用以下第一多克隆抗體：A11、OC和抗APF，其識別由淀粉樣蛋白形成的特異性四級結(jié)構(gòu)表位。oA11識別前纖維寡聚體(PFO)oOC檢測成熟原纖維o抗APF與環(huán)原纖維(αAPF)反應(yīng)。使用斑點印跡技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化以使二級抗體與聚集體的FLC組分的非特異性結(jié)合最小化。將標(biāo)準(zhǔn)化為含有40μg蛋白質(zhì)/斑點的重復(fù)尿樣施加于硝化纖維素膜，使其在室溫下干燥，然后在室溫下用在Tris-緩沖鹽水(TBS)中的10％脫脂牛奶封閉2小時。將一抗在5％牛奶中以1：1,000(A11)或1：5,000(OC和αAPF)稀釋液稀釋。在4℃下孵育過夜后，將膜用TBS-T洗滌4次，然后在室溫下與在5％牛奶/TBS-T中1:5,000稀釋的生物素化的山羊抗兔IgG(H+L)(Fab'2)(JacksonImmunoresearch，西格羅夫，賓夕法尼亞州)孵化1小時。再次洗滌膜，然后與在無牛奶的TBS-T中的鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(HRP)(1：8,000，GEHealthcare，國王公園，紐約州)孵化。最后，用TBS-T洗滌膜三次，并用ECL化學(xué)發(fā)光(GEHealthcare)顯影。CR-輔助沉淀方案鑒于其自組裝性質(zhì)和對亞穩(wěn)定多肽締合的親和力，已知CR在水溶液中誘導(dǎo)淀粉樣蛋白低聚物生長和成核。當(dāng)CR結(jié)合的聚集體生長時，它們從溶液中沉淀出來并且可以通過離心分離?；谶@些原則，我們開發(fā)了CR-輔助沉淀尿樣的方案，以進(jìn)一步表征PE的嗜剛果紅和錯誤折疊組學(xué)。首先在4℃下以15,000g將10mL體積的尿液離心15分鐘。將上清液與200μlCR儲備溶液混合，如CRD試驗一樣渦旋1小時，然后再次離心以沉淀嗜剛果紅聚集蛋白。將沉淀重懸于水中并通過離心回收3次以除去所有未結(jié)合的CR。將最終的CR沉淀重懸于50μl水中，立即成像或冷凍保存于-80℃用于隨后的分析。如果沒有沉淀可見，則認(rèn)為樣品為CR沉淀-陰性，但是與CR沉淀-陽性樣品一樣進(jìn)行微量離心。偏振顯微術(shù)、透射電子顯微術(shù)(TEM)和cryo-TEM將CR-沉淀物重懸浮于水中，在顯微鏡載玻片上干燥，并使用配備有OlympusOLY-200數(shù)碼相機(jī)的OlympusU-STP顯微鏡(Olympus，梅爾維爾，NY)在偏振光下成像?；蛘?，在用2％乙酸雙氧鈾進(jìn)行陽性或陰性染色后，將懸浮液置于200目聚醋酸甲基乙烯脂/碳-涂覆的鎳網(wǎng)上。還試驗了P-CRL婦女的試管樣品，以圖制備CR沉淀。對于cryo-TEMCR，沉淀用在含0.9％氯化鈉的10mMHEPES(pH7.4)中的4％多聚甲醛/0.1％戊二醛固定30分鐘，然后沖洗，離心并重懸于10％明膠中。然后如前所述對樣品進(jìn)行超薄冷凍切片術(shù)處理。超薄冷凍切片用兔抗-山羊抗體(1:200，JacksonImmunoresearch)和偶聯(lián)至10nm金的蛋白A(CellMicroscopyCenter，烏特勒支，荷蘭)橋連的兔抗-SERPINA1(1:500，LabVision，弗里蒙特，加利福尼亞州)或山羊抗-人白蛋白(1:500，BethylLaboratories，蒙哥馬利，德克薩斯州)作單獨標(biāo)記。雙標(biāo)記的網(wǎng)格使用1：500的第一山羊抗-白蛋白和5nm的蛋白A-金，然后使用兔抗-SERPINA1和10nm的蛋白A-金。在裝備有Morada數(shù)碼相機(jī)和Olympus成像軟件的Tecnai12BioTWIN電子顯微鏡(FEI/Phillips，希爾斯伯勒，俄勒岡)中觀察所有樣品。FEITencaiBiotwinTEM在80Kv(下使用)。使用MoradaCCD和iTEM(Olympus)軟件拍攝圖像。蛋白質(zhì)印跡技術(shù)用于蛋白質(zhì)鑒定和驗證將CR沉淀重懸于還原Laemelli緩沖液(BioRad)中并煮沸10分鐘。將樣品加載到10％SDS-PAGE凝膠上并用Commassie藍(lán)染色。切下可見帶，并在EttanTADigester(GEHealthcare)上進(jìn)行胰蛋白酶消化。在4800TOF/TOF蛋白質(zhì)組學(xué)分析儀(AppliedBiosystems，福斯特城，加利福尼亞州)上獲得自動MALDI-MS/MS光譜。將所得肽序列上傳到可訪問的耶魯?shù)鞍踪|(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)庫(YPEDhttp://medicine.yale.edu/keck/proteomics/yped/index.aspx)中。概率Mowse分?jǐn)?shù)>53被認(rèn)為是指示廣泛同源性。發(fā)現(xiàn)以下代表蛋白質(zhì)：SERPINA1、白蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、IgGκFLC和干擾素-誘導(dǎo)蛋白6-16(IFI6-16，也稱為G1P3)。這些同一性在從其他60例的尿液中分離的沉淀中通過蛋白印跡得到驗證。沉淀用Laemelli緩沖液還原，并在轉(zhuǎn)移到PVDF膜上的4-20％SDS-PAGE凝膠上電泳。使用以下一抗：兔抗-SERPINA1(1:1,000，LabVision)，山羊抗-白蛋白(1:1000，Bethyl實驗室)，小鼠抗-血漿銅藍(lán)蛋白(克隆3B11,1:1,000ThermoScientific，羅克福德，伊利諾斯州)，小鼠抗-κFLC(克隆MEN09,1：1,000NovusBiologicals，立托頓，科羅拉多州)，兔抗-G1P3(1:300，Proteintech，芝加哥，伊利諾斯州)。用適當(dāng)?shù)纳锼鼗亩?1：5,000，JacksonImmunoresearch)，然后是鏈霉親和素-HRP(1：8,000，GEHealthcare)和ECL化學(xué)發(fā)光(GEHealthcare)檢測印跡。分析G1P3的聚集傾向使用AGGRESCAN(基于網(wǎng)絡(luò)的聚集傾向的計算和可視化算法)分析序列。該算法已經(jīng)顯示預(yù)期參與幾種構(gòu)象疾病的蛋白質(zhì)區(qū)段的聚集。還已經(jīng)顯示通過它們的聚集和溶解性質(zhì)來區(qū)分各種類型的蛋白質(zhì)。預(yù)測天然未折疊的蛋白具有最低的聚集傾向。在AGGRESCAN輸出中，具有最高預(yù)測聚集傾向的序列伸展作為輪廓圖中的峰出現(xiàn)。如果存在5個或更多個順序的連續(xù)殘基，每個氨基酸的平均聚集傾向值(a4v)大于熱點閾值(HST)，則多肽序列被認(rèn)為是“熱點”。AGGRESCAN參數(shù)列在表4中。APP和Aβ表位的蛋白印跡用Laemelli緩沖液還原尿或CR沉淀樣品，并在轉(zhuǎn)移至PVDF膜上的4-20％SDS-PAGE凝膠上電泳。使用以下一抗：小鼠單克隆抗-APP(1:1,000，MAB348，克隆22C11；針對APP的N-末端表位氨基酸66-81，密理博(Millipore))；小鼠單克隆抗-APP(1:259MAB5354，針對APP的KPI結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生，密理博)，小鼠單克隆抗-Alz90(1:250，MAB349，針對對應(yīng)于APP的氨基酸511-608的合成肽產(chǎn)生，密理博，比勒利卡，馬薩諸塞州)和小鼠單克隆DE2B4(1:1,000，針對人Aβ殘基1-17產(chǎn)生，諾偉思，立托頓，科羅拉多州)。每種抗體暴露不同的印跡(印跡未被剝離和重新探測)。使用人白蛋白(從血漿純化的)或在水稻中表達(dá)的重組體(西格瑪)來排除抗APP抗體的可能的非特異性交叉反應(yīng)性。使用阿爾茨海默氏腦組織裂解物(諾偉思，立托頓，科羅拉多州)作為陽性對照。用生物素化的山羊抗小鼠二抗(1：5,000，JacksonImmunoresearch)，然后是鏈霉親和素-HRP(1：8,000，GEHealthcare)和ECL化學(xué)發(fā)光(GEHealthcare)檢測印跡?？偪扇苄訟PP(sAPP)和ADAM10的免疫測定通過ELISA(sAPP：IBLInternational，漢堡，德國)測量尿液和配對血清樣品中的sAPP。將適當(dāng)稀釋的樣品(尿：2倍，血清：50倍)置于用針對sAPPα(α-分泌酶的裂解產(chǎn)物)和sAPPβ(β-分泌酶的裂解產(chǎn)物)共同表位的捕獲抗體預(yù)包被的96-孔板中。對于ADAM10ELISA(CosmoBioUSA，卡爾斯巴德，加利福尼亞州)，將母體血清稀釋3倍。根據(jù)制造商的指示進(jìn)行孵育和洗滌方案，隨后在波長校正下在450nm讀數(shù)。報告數(shù)據(jù)并使用Softmax軟件Pro3.1.1(MolecularDevices，森尼韋爾，加利福尼亞州)繪圖。定量實時RT-PCR提取RNA，并使用標(biāo)準(zhǔn)方法用隨機(jī)六聚體引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用TaqMan(AppliedBiosystems，卡爾斯巴德，加利福尼亞州)化學(xué)在由10μLmastermix(FastUniversalPCR2xMasterMix)、8μL水、1μL標(biāo)準(zhǔn)化的cDNA模板和1μLPCR探針(GeneExpressionAssaysonDemand)組成的20μL反應(yīng)物中進(jìn)行RT-PCR。用于分析的探針(AppliedBiosystems)如下：淀粉樣蛋白前體蛋白/蛋白酶nexin-II(APP，Hs01552282_m1)，A-解聚素和金屬蛋白酶-10(ADAM10、Hs00153853_m1)，ADAM17(Hs01041915_m1)，BACE-1(Hs00201573_m1)，BACE-2(Hs00273238_m1)，早老素-1(PSEN1，Hs00240518_m1)和早老素-2(PSEN2，Hs00240982_m1)。使用β-2微球蛋白(B2M；Hs99999907_m1)和核糖體蛋白L30(RPL30，Hs00265497_m1)作為內(nèi)源對照。在初步實驗中使用來自在人內(nèi)源性對照板(AppliedBiosystems)中擴(kuò)增的PE或CRL組織(胎盤或羊膜)的cDNA庫驗證了這兩種內(nèi)源性對照mRNA(B2M和RPL30)的組合。兩個參考基因的選擇基于在6個cDNA庫之間沒有不同的低循環(huán)閾值(Ct)值。對于每個靶標(biāo)，擴(kuò)增在一式兩份的反應(yīng)中以兩步循環(huán)(變性，95℃15秒，62℃下退火/延伸60秒)進(jìn)行40個循環(huán)。使用StepOne軟件(v2.1)進(jìn)行后處理計算。使用dCt的計算(ΔCt：靶標(biāo)的Ct-內(nèi)標(biāo)對照的Ct平均值)將獲得的值歸一化為內(nèi)源對照RNA的幾何平均值。0的dCt指示靶標(biāo)和持家基因之間的比率為1，并且可以用作不同靶標(biāo)和不同組織之間的相對豐度的指示。ddCt的計算(單個樣品的dCt-參考樣品中相同靶標(biāo)的dCt)增加了靶標(biāo)歸一化內(nèi)的附加視角，并且更好估計不同生物群之間的相對mRNA豐度。對于ddCt計算，我們使用來自所有樣品的RNA庫。免疫組織化學(xué)胎盤絨毛組織的5μm石蠟切片在二甲苯中脫蠟并用分級的乙醇再水化至磷酸鉀緩沖鹽水溶液(pH7.2)。用檸檬酸鹽緩沖液回收抗原后，用1％過氧化氫預(yù)處理切片15分鐘。封閉后，用以下一抗過夜溫育(在4℃)：小鼠單克隆抗-Alz90(1:250)，小鼠單克隆DE2B4(1:1,000)，山羊抗-ADAM10(1:200，R&DSystems，明尼阿波里斯，明尼蘇達(dá)州)，山羊抗-ADAM17(1:50R&DSystems)，小鼠單克隆抗-BACE1(1:150，MO2，克隆2C13，Abnova，臺北，臺灣)，兔抗BACE2(1:200，諾偉思，立托頓，科羅拉多州)和兔單克隆抗-PSEN1(1:100，Abcam，坎布里奇，馬薩諸塞州)和兔單克隆抗-PSEN2(1:100，Abcam)。如前所述，分別使用小鼠單克隆抗-細(xì)胞角蛋白-7(1：100，Zymed/英杰公司，卡爾斯巴德，加利福尼亞州)或小鼠單克隆抗-CD163(Neomarker，菲蒙，加利福尼亞州)抗體在選擇的切片上鑒定滋養(yǎng)細(xì)胞上皮細(xì)胞和胎盤巨噬細(xì)胞(110，111)。在室溫下用適當(dāng)?shù)纳锼鼗亩?1：600，JacksonImmunochemicals)溫育1小時后，以VectorNovaRed(VectorLaboratories)作為色原體和蘇木精作為復(fù)染劑，使用抗生物素蛋白-生物素染色(VectastainEliteABC，VectorLaboratories，伯林蓋姆，加利福尼亞州)進(jìn)行檢測。將組織切片在分級的乙醇中脫水，清除并固定。陰性對照載玻片與兔或小鼠同種型IgG酌情孵育。參考文獻(xiàn)(通過此處引用納入每一篇)1.K.S.Khan,D.Wojdyla,L.Say,A.M.Gulmezoglu,P.F.VanLook,世衛(wèi)組織對產(chǎn)婦死亡原因的分析：系統(tǒng)評價(WHOanalysisofcausesofmaternaldeath:asystematicreview).Lancet367,1066(4月1日,2006).2.A.H.Shennan,C.Redman,C.Cooper,F.Milne,大多數(shù)產(chǎn)婦死于先兆子癇是否可避免？(Aremostmaternaldeathsfrompre-eclampsiaavoidable？)Lancet379,1686(5月5日,2012).3.ACOG實踐公告。先兆子癇和子癇的診斷和治療(Diagnosisandmanagementofpreeclampsiaandeclampsia).第33號,1月2002.美國婦產(chǎn)科學(xué)院(2002).4.B.M.Sibai,C.L.Stella,非典型先兆子癇-子癇的診斷和治療(Diagnosisandmanagementofatypicalpreeclampsia-eclampsia).美國婦產(chǎn)科雜志，200,481e1(5月,2009).5.B.Sibai,G.Dekker,M.Kupferminc,先兆子癇(Pre-eclampsia).Lancet365,785(2月26日-3月4日,2005).6.A.A.Shamshirsaz,M.Paidas,G.Krikun,先兆子癇，缺氧，血栓形成和炎癥(Preeclampsia,hypoxia,thrombosis,andinflammation).Journalofpregnancy2012,374047(2012).7.B.M.Sibai,高血壓-先兆子癇的生物標(biāo)志物：我們接近嗎？(Biomarkerforhypertension-preeclampsia:arewecloseyet？)美國婦產(chǎn)科雜志197,1(7月,2007).8.W.Ramma等,循環(huán)抗血管生成因子的升高與先兆子癇中中性粒細(xì)胞活化的標(biāo)記物無關(guān)(Theelevationincirculatinganti-angiogenicfactorsisindependentofmarkersofneutrophilactivationinpreeclampsia).Angiogenesis15,333(9月,2012).9.R.Boij等,凝血，炎癥和血管生成的生物標(biāo)志物獨立地與先兆子癇相關(guān)(Biomarkersofcoagulation,inflammation,andangiogenesisareindependentlyassociatedwithpreeclampsia).美國生殖免疫學(xué)雜志，68,258(9月,2012).10.U.D.Anderson,M.G.Olsson,K.H.Kristensen,B.Akerstrom,S.R.Hansson,評論：生化標(biāo)記物預(yù)測先兆子癇(Review:Biochemicalmarkerstopredictpreeclampsia).Placenta33Suppl,S42(2月,2012).11.I.A.Buhimschi等,尿液的蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定了SERPINA1和白蛋白的特異性片段作為先兆子癇的生物標(biāo)志物(ProteomicprofilingofurineidentifiesspecificfragmentsofSERPINA1andalbuminasbiomarkersofpreeclampsia).美國婦產(chǎn)科雜志199,551e1(11月,2008).12.J.A.Huntington,絲氨酸蛋白酶抑制蛋白結(jié)構(gòu)，功能和功能障礙(Serpinstructure,functionanddysfunction).Journalofthrombosisandhaemostasis:JTH9Suppl1,26(7月,2011).13.P.Frid,S.V.Anisimov,N.Popovic,剛果紅和蛋白質(zhì)聚集在神經(jīng)退行性疾病中(Congoredandproteinaggregationinneurodegenerativediseases).Brainresearchreviews53,135(1月,2007).14.R.Kayed等,環(huán)狀原細(xì)纖維是結(jié)構(gòu)上和功能上不同類型的淀粉樣蛋白寡聚體(Annularprotofibrilsareastructurallyandfunctionallydistincttypeofamyloidoligomer).TheJournalofbiologicalchemistry284,4230(2月13日,2009).15.R.Kayed等,可溶性淀粉樣蛋白低聚物的常見結(jié)構(gòu)暗示著發(fā)病機(jī)理的共同機(jī)制(Commonstructureofsolubleamyloidoligomersimpliescommonmechanismofpathogenesis).Science300,486(4月18日,2003).16.R.Kayed等,原纖維特異性構(gòu)象依賴性抗體識別淀粉樣蛋白原纖維和原纖維寡聚體共有的通用表位，其在原纖維寡聚體中不存在(Fibrilspecific,conformationdependentantibodiesrecognizeagenericepitopecommontoamyloidfibrilsandfibrillaroligomersthatisabsentinprefibrillaroligomers).Molecularneurodegeneration2,18(2007).17.C.G.Glabe,退行性疾病中淀粉樣低聚體發(fā)病機(jī)制的常見機(jī)制(Commonmechanismsofamyloidoligomerpathogenesisindegenerativedisease).Neurobiologyofaging27,570(4月,2006).18.M.A.Smith,P.L.Richey,R.N.Kalaria,G.Perry,彈性蛋白酶與阿爾茨海默病的神經(jīng)原纖維病理學(xué)有關(guān)：蛋白水解失衡和氧化應(yīng)激之間的推定聯(lián)系(ElastaseisassociatedwiththeneurofibrillarypathologyofAlzheimerdisease:aputativelinkbetweenproteolyticimbalanceandoxidativestress).Restorativeneurologyandneuroscience9,213(1月1日,1996).19.M.A.Salameh等,淀粉樣蛋白前體蛋白/蛋白酶nexin2Kunitz抑制劑結(jié)構(gòu)域是胰蛋白酶的高度特異性底物(Theamyloidprecursorprotein/proteasenexin2Kunitzinhibitordomainisahighlyspecificsubstrateofmesotrypsin).TheJournalofbiologicalchemistry285,1939(1月15日,2010).20.M.Halimi等,朊病毒尿包含可被剛果紅染色的糖胺聚糖-輕鏈IgG復(fù)合物(Prionurinecomprisesaglycosaminoglycan-lightchainIgGcomplexthatcanbestainedbyCongored).Journalofvirologicalmethods133,205(5月,2006).21.R.P.Linke,使用剛果紅熒光的淀粉樣蛋白和各種淀粉樣蛋白綜合征的高靈敏度診斷(HighlysensitivediagnosisofamyloidandvariousamyloidsyndromesusingCongoredfluorescence).VirchowsArchiv:aninternationaljournalofpathology436,439(5月,2000).22.W.E.Klunk,R.F.Jacob,R.P.Mason,使用剛果紅Abeta(CR-abeta)分光光度測定法定量淀粉樣蛋白β肽(Abeta)聚集(Quantifyingamyloidbeta-peptide(Abeta)aggregationusingtheCongored-Abeta(CR-abeta)spectrophotometricassay).Analyticalbiochemistry266,66(1月1日,1999).23.R.J.Guidotti,D.(2005).24.C.S.Buhimschi等,尿血管生成因子聚集高血壓病癥并鑒定具有嚴(yán)重先兆子癇的女性(Urinaryangiogenicfactorsclusterhypertensivedisordersandidentifywomenwithseverepreeclampsia).美國婦產(chǎn)科雜志192,734(3月,2005).25.Y.Yoshiike,R.Kayed,S.C.Milton,A.Takashima,C.G.Glabe,成孔蛋白與淀粉樣蛋白低聚物共有結(jié)構(gòu)和功能同源性(Pore-formingproteinssharestructuralandfunctionalhomologywithamyloidoligomers).Neuromolecularmedicine9,270(2007).26.Y.Yoshiike等,在一組天然折疊蛋白質(zhì)中的淀粉樣低聚物構(gòu)象(Amyloidoligomerconformationinagroupofnativelyfoldedproteins).PloSone3,e3235(2008).27.E.Cerf等,反向平行β-折疊：低聚淀粉樣蛋白β肽的特征結(jié)構(gòu)(Antiparallelbeta-sheet:asignaturestructureoftheoligomericamyloidbeta-peptide).TheBiochemicaljournal421,415(Aug1,2009).28.A.Laganowsky等,有毒的淀粉樣蛋白小寡聚體的原子視圖(Atomicviewofatoxicamyloidsmalloligomer).Science335,1228(3月9日,2012).29.T.Shirahama,A.S.Cohen,高分辨電子顯微鏡分析的淀粉樣纖維(High-resolutionelectronmicroscopicanalysisoftheamyloidfibril).TheJournalofcellbiology33,679(6月,1967).30.J.D.Sipe,A.S.Cohen,評論：淀粉樣纖維的歷史(Review:historyoftheamyloidfibril).Journalofstructuralbiology130,88(6月,2000).31.H.Z.Malina,系統(tǒng)在生物學(xué)中導(dǎo)致細(xì)胞病理學(xué)：小分子或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞共價修飾后穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Systeminbiologyleadingtocellpathology:stableprotein-proteininteractionsaftercovalentmodificationsbysmallmoleculesorintransgeniccells).Journalofbiomedicalscience18,7(2011).32.N.E.Hellman,S.Kono,H.Miyajima,J.D.Gitlin,生物化學(xué)分析的錯義突變的血漿銅藍(lán)蛋白血癥(Biochemicalanalysisofamissensemutationinaceruloplasminemia).TheJournalofbiologicalchemistry277,1375(1月11日,2002).33.P.G.Winyard等,氧化應(yīng)激對血漿銅藍(lán)蛋白的一些物理化學(xué)性質(zhì)的影響(Effectsofoxidativestressonsomephysiochemicalpropertiesofcaeruloplasmin).TheBiochemicaljournal258,435(3月1日,1989).34.S.Kumar等,原發(fā)性淀粉樣變性中的血清免疫球蛋白游離輕鏈測量：預(yù)后價值和與臨床特征的相關(guān)性(Serumimmunoglobulinfreelight-chainmeasurementinprimaryamyloidosis:prognosticvalueandcorrelationswithclinicalfeatures).Blood116,5126(12月9日,2010).35.J.M.Kelly等,由α-和β-干擾素誘導(dǎo)的人基因的表征及其在小鼠細(xì)胞中的表達(dá)(Characterizationofahumangeneinduciblebyalpha-andbeta-interferonsanditsexpressioninmousecells).TheEMBOjournal5,1601(7月,1986).36.M.G.Turri,K.A.Cuin,A.C.Porter,在干擾素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物中提供多個剪接供體位點的新型小隨體的表征(Characterisationofanovelminisatellitethatprovidesmultiplesplicedonorsitesinaninterferon-inducedtranscript).Nucleicacidsresearch23,1854(6月11日,1995).37.F.Chiti,C.M.Dobson,蛋白錯誤折疊，功能性淀粉樣蛋白和人類疾病(Proteinmisfolding,functionalamyloid,andhumandisease).Annualreviewofbiochemistry75,333(2006).38.O.Conchillo-Sole等,AGGRESCAN：用于預(yù)測和評估多肽中聚集的“熱點”的服務(wù)器(AGGRESCAN:aserverforthepredictionandevaluationof"hotspots"ofaggregationinpolypeptides).BMCbioinformatics8,65(2007).39.M.F.Knauer,B.Soreghan,D.Burdick,J.Kosmoski,C.G.Glabe,細(xì)胞內(nèi)積累和抗阿爾茨海默病淀粉樣蛋白A4/β蛋白的降解(IntracellularaccumulationandresistancetodegradationoftheAlzheimeramyloidA4/betaprotein).美利堅合眾國國家科學(xué)院院報,89,7437(8月15日,1992).40.D.Goldgaber,M.I.Lerman,O.W.McBride,U.Saffiotti,D.C.Gajdusek,編碼阿爾茨海默病的腦淀粉樣蛋白的cDNA的表征和染色體定位(CharacterizationandchromosomallocalizationofacDNAencodingbrainamyloidofAlzheimer'sdisease).Science235,877(2月20日,1987).41.J.Kang,B.Muller-Hill,大鼠組織中阿爾茨海默病淀粉樣蛋白A4前體RNA的差異剪接：PreA4(695)mRNA主要在大鼠和人腦中產(chǎn)生(DifferentialsplicingofAlzheimer'sdiseaseamyloidA4precursorRNAinrattissues:PreA4(695)mRNAispredominantlyproducedinratandhumanbrain).Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications166,1192(2月14日,1990).42.B.DeStrooper,R.Vassar,T.Golde,分泌酶：在阿爾茨海默病中具有治療潛力的酶(Thesecretases:enzymeswiththerapeuticpotentialinAlzheimerdisease).Naturereviews.Neurology6,99(2月,2010).43.I.Caille等,可溶性形式的淀粉樣蛋白前體蛋白調(diào)節(jié)成人腦室下區(qū)祖細(xì)胞的增殖(Solubleformofamyloidprecursorproteinregulatesproliferationofprogenitorsintheadultsubventricularzone).Development131,2173(5月,2004).44.A.Schmitz,R.Tikkanen,G.Kirfel,V.Herzog,阿爾茨海默淀粉樣蛋白前體蛋白在上皮細(xì)胞中的生物學(xué)作用(ThebiologicalroleoftheAlzheimeramyloidprecursorproteininepithelialcells).Histochemistryandcellbiology117,171(2月,2002).45.J.Hoffmann,C.Twiesselmann,M.P.Kummer,P.Romagnoli,V.Herzog,阿爾茨海默病淀粉樣蛋白前體蛋白在調(diào)節(jié)表皮基底細(xì)胞增殖中的可能作用(ApossiblerolefortheAlzheimeramyloidprecursorproteinintheregulationofepidermalbasalcellproliferation).Europeanjournalofcellbiology79,905(12月,2000).46.C.Haass,D.J.Selkoe,β-淀粉樣蛋白前體蛋白的細(xì)胞加工和淀粉樣蛋白β肽的起源(Cellularprocessingofbeta-amyloidprecursorproteinandthegenesisofamyloidbeta-peptide).Cell75,1039(12月17日,1993).47.H.J.Clarris,B.Key,K.Beyreuther,C.L.Masters,D.H.Small,阿爾茨海默病的淀粉樣蛋白前體在發(fā)育中的大鼠嗅覺系統(tǒng)中的表達(dá)(ExpressionoftheamyloidproteinprecursorofAlzheimer'sdiseaseinthedevelopingratolfactorysystem.Brainresearch).Developmentalbrainresearch88,87(8月28日,1995).48.V.Muresan,N.H.Varvel,B.T.Lamb,Z.Muresan,淀粉樣蛋白-β前體蛋白的切割產(chǎn)物被分選到在神經(jīng)突內(nèi)獨立轉(zhuǎn)運(yùn)的不同載體囊泡(Thecleavageproductsofamyloid-betaprecursorproteinaresortedtodistinctcarriervesiclesthatareindependentlytransportedwithinneuritis).TheJournalofneuroscience:theofficialjournaloftheSocietyforNeuroscience29,3565(3月18日,2009).49.T.Oltersdorf等,具有Kunitz結(jié)構(gòu)域的阿爾茨海默氏病淀粉樣蛋白前體蛋白的分泌形式是蛋白酶nexin-II(ThesecretedformoftheAlzheimer'samyloidprecursorproteinwiththeKunitzdomainisproteasenexin-II).Nature341,144(9月14日,1989).50.L.Ho,K.Fukuchi,S.G.Younkin,可變剪接的Kunitz蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域改變培養(yǎng)細(xì)胞中的淀粉樣蛋白β蛋白前體加工和淀粉樣蛋白β蛋白的產(chǎn)生(ThealternativelysplicedKunitzproteaseinhibitordomainaltersamyloidbetaproteinprecursorprocessingandamyloidbetaproteinproductioninculturedcells).TheJournalofbiologicalchemistry271,30929(11月29日,1996).51.M.Barrachina等,在路易體癡呆的大腦皮質(zhì)中的淀粉樣蛋白β沉積伴隨著含有Kunitz蛋白酶抑制劑的AbetaPPmRNA同種型的相對增加(Amyloid-betadepositioninthecerebralcortexinDementiawithLewybodiesisaccompaniedbyarelativeincreaseinAbetaPPmRNAisoformscontainingtheKunitzproteaseinhibitor).Neurochemistryinternational46,253(2月,2005).52.罕見疾病法2002(見2013年1月10日的http://www.gpo.gov/fdsys/pkg/PLAW-107publ280/html/PLAW-107publ280.htm).53.E.F.Funai等,先兆子癇后長期死亡率(Long-termmortalityafterpreeclampsia).Epidemiology16,206(3月,2005).54.F.H.Harlow,M.A.Brown,先兆子癇診斷的多樣性(Thediversityofdiagnosesofpreeclampsia).妊娠高血壓：國際學(xué)會官方期刊對妊娠高血壓研究(Hypertensioninpregnancy:officialjournaloftheInternationalSocietyfortheStudyofHypertensioninPregnancy)20,57(2001).55.P.Zhang,M.Schmidt,L.Cook,母親血管病變和先兆子癇的組織學(xué)診斷：組織學(xué)變化與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性差(Maternalvasculopathyandhistologicdiagnosisofpreeclampsia:poorcorrelationofhistologicchangesandclinicalmanifestation).美國婦產(chǎn)科雜志194,1050(4月,2006).56.R.J.Perrin,A.M.Fagan,D.M.Holtzman,多模式技術(shù)的阿爾茨海默病的診斷和預(yù)后(MultimodaltechniquesfordiagnosisandprognosisofAlzheimer'sdisease).Nature461,916(10月15日,2009).57.J.C.Morris等,腦淀粉樣蛋白沉積和彌漫性斑塊在“正?！崩匣鹤C據(jù)為癥狀前和非常溫和的阿爾茨海默病(Cerebralamyloiddepositionanddiffuseplaquesin"normal"aging:EvidenceforpresymptomaticandverymildAlzheimer'sdisease).Neurology46,707(3月,1996).58.P.V.Arriagada,K.Marzloff,B.T.Hyman,無貧困老年人中阿爾茨海默型病理變化的分布與阿爾茨海默病的模式相符(DistributionofAlzheimer-typepathologicchangesinnondementedelderlyindividualsmatchesthepatterninAlzheimer'sdisease).Neurology42,1681(9月,1992).59.P.T.Nelson等,阿爾茨海默病神經(jīng)病理變化與認(rèn)知狀態(tài)的相關(guān)性：文獻(xiàn)綜述(CorrelationofAlzheimerdiseaseneuropathologicchangeswithcognitivestatus:areviewoftheliterature).Journalofneuropathologyandexperimentalneurology71,362(5月,2012).60.A.Serrano-Pozo等,在阿爾茨海默病過程中淀粉樣斑塊的穩(wěn)定尺寸分布(StablesizedistributionofamyloidplaquesoverthecourseofAlzheimerdisease).Journalofneuropathologyandexperimentalneurology71,694(8月,2012).61.E.A.Oliver等,激活的晚期糖基化終末產(chǎn)品系統(tǒng)的受體的婦女與嚴(yán)重先兆子癇(Activationofthereceptorforadvancedglycationendproductssysteminwomenwithseverepreeclampsia).TheJournalofclinicalendocrinologyandmetabolism96,689(3月,2011).62.X.Zhang,W.Le,缺氧在阿爾茨海默病中的病理作用(PathologicalroleofhypoxiainAlzheimer'sdisease).Experimentalneurology223,299(6月,2010).63.C.RuizdeAlmodovar,D.Lambrechts,M.Mazzone,P.Carmeliet,VEGF在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用和治療潛力(RoleandtherapeuticpotentialofVEGFinthenervoussystem).Physiologicalreviews89,607(4月,2009).64.G.Eskici,P.H.Axelsen,銅和氧化應(yīng)激在阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制中(CopperandoxidativestressinthepathogenesisofAlzheimer'sdisease).Biochemistry51,6289(8月14日,2012).65.P.Grammas,神經(jīng)血管功能障礙，炎癥和內(nèi)皮激活：對阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制的影響(Neurovasculardysfunction,inflammationandendothelialactivation:implicationsforthepathogenesisofAlzheimer'sdisease).Journalofneuroinflammation8,26(2011).66.E.Eiland,C.Nzerue,M.Faulkner,先兆子癇2012.Journalofpregnancy2012,586578(2012).67.R.Deane等,RAGE介導(dǎo)淀粉樣蛋白-β肽轉(zhuǎn)運(yùn)穿過血腦屏障和在腦中積累(RAGEmediatesamyloid-betapeptidetransportacrosstheblood-brainbarrierandaccumulationinbrain).Naturemedicine9,907(7月,2003).68.L.F.Lue,S.D.Yan,D.M.Stern,D.G.Walker,預(yù)防阿爾茨海默病晚期糖基化終末產(chǎn)物受體的激活(PreventingactivationofreceptorforadvancedglycationendproductsinAlzheimer'sdisease).Currentdrugtargets.CNSandneurologicaldisorders4,249(6月,2005).69.A.J.Howie,D.B.Brewer,剛果紅染色的淀粉樣蛋白的光學(xué)性質(zhì)：歷史和機(jī)制(OpticalpropertiesofamyloidstainedbyCongored:historyandmechanisms).Micron40,285(4月,2009).70.C.Wu,Z.Wang,H.Lei,W.Zhang,Y.Duan,在分子動力學(xué)模擬中觀察到剛果紅與淀粉樣原纖維表面的雙重結(jié)合模式(DualbindingmodesofCongoredtoamyloidprotofibrilsurfaceobservedinmoleculardynamicssimulations).JournaloftheAmericanChemicalSociety129,1225(2月7日,2007).71.UNICEF-WHO,發(fā)展中國家的產(chǎn)前護(hù)理：承諾，成就和失去的機(jī)會(AntenatalCareinDevelopingCountries:Promises,AchievementsandMissedOpportunities).世界衛(wèi)生組織,日內(nèi)瓦,瑞士,(2003).72.N.Murray等,常規(guī)尿分析在妊娠中的臨床應(yīng)用：前瞻性研究(Theclinicalutilityofroutineurinalysisinpregnancy:aprospectivestudy).TheMedicaljournalofAustralia177,477(11月4日,2002).73.S.Thangaratinam等,估計蛋白尿作為先兆子癇并發(fā)癥的預(yù)測因子：系統(tǒng)綜述(Estimationofproteinuriaasapredictorofcomplicationsofpre-eclampsia:asystematicreview).BMCmedicine7,10(2009).74.I.H.Hinberg,L.Katz,L.Waddell,體外診斷試紙測試對尿蛋白的敏感性(Sensitivityofinvitrodiagnosticdipstickteststourinaryprotein).Clinicalbiochemistry11,62(4月,1978).75.V.Maisnar等,尿中蛋白尿測量的問題，存在BenceJones蛋白(TheproblemsofproteinuriameasurementinurinewithpresenceofBenceJonesprotein).Clinicalbiochemistry44,403(4月,2011).76.N.Parker,A.C.Porter,鑒定包括干擾素誘導(dǎo)的人基因6-16和ISG12的新基因家族(Identificationofanovelgenefamilythatincludestheinterferon-induciblehumangenes6-16andISG12).BMCgenomics5,8(1月19日,2004).77.M.Rosenzweig,H.Landau,輕鏈(AL)淀粉樣變性：診斷和管理的更新(Lightchain(AL)amyloidosis:updateondiagnosisandmanagement).Journalofhematology&oncology4,47(2011).78.M.R.Hayden,S.C.Tyagi,M.M.Kerklo,M.R.Nicolls,2型糖尿病是一種構(gòu)象疾病(Type2diabetesmellitusasaconformationaldisease).JOP:Journalofthepancreas6,287(7月,2005).79.J.H.Kang,K.S.Kim,S.Y.Choi,H.Y.Kwon,M.H.Won,過氧化自由基對人血漿銅藍(lán)蛋白的氧化修飾(Oxidativemodificationofhumanceruloplasminbyperoxylradicals).Biochimicaetbiophysicaacta1568,30(11月7日,2001).80.S.W.Griffiths,C.L.Cooney,重組人α1-抗胰蛋白酶中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與甲硫氨酸氧化的關(guān)系(Relationshipbetweenproteinstructureandmethionineoxidationinrecombinanthumanalpha1-antitrypsin).Biochemistry41,6245(5月21日,2002).81.G.Joslin,R.J.Fallon,J.Bullock,S.P.Adams,D.H.Perlmutter,SEC受體識別α1-抗胰蛋白酶-蛋白酶復(fù)合物的五肽結(jié)構(gòu)域(TheSECreceptorrecognizesapentapeptideneodomainofalpha1-antitrypsin-proteasecomplexes).TheJournalofbiologicalchemistry266,11282(6月15日,1991).82.G.Joslin等,淀粉樣蛋白β肽，物質(zhì)P和鈴蟾肽與絲氨酸蛋白酶抑制劑復(fù)合體受體結(jié)合(Amyloid-betapeptide,substanceP,andbombesinbindtotheserpin-enzymecomplexreceptor).TheJournalofbiologicalchemistry266,21897(11月15日,1991).83.L.O.Tjernberg等,通過五肽配體捕獲β-淀粉樣蛋白原纖維形成(Arrestofbeta-amyloidfibrilformationbyapentapeptideligand).TheJournalofbiologicalchemistry271,8545(4月12日,1996).84.R.T.Turner,3rd等,memapsin2(β-分泌酶)的亞位點特異性：對抑制劑設(shè)計的影響(Subsitespecificityofmemapsin2(beta-secretase):implicationsforinhibitordesign).Biochemistry40,10001(8月28日,2001).85.M.T.Gersbacher,D.Y.Kim,R.Bhattacharyya,D.M.Kovacs,人類電壓門控鈉通道β2亞基中BACE1切割位點的鑒定(IdentificationofBACE1cleavagesitesinhumanvoltage-gatedsodiumchannelbeta2subunit).Molecularneurodegeneration5,61(2010).86.B.Bohrmann等,內(nèi)源性蛋白質(zhì)控制淀粉樣蛋白β肽聚合?？赡軐χ袠猩窠?jīng)系統(tǒng)和外周組織中β-淀粉樣蛋白形成的影響(Endogenousproteinscontrollingamyloidbeta-peptidepolymerization.Possibleimplicationsforbeta-amyloidformationinthecentralnervoussystemandinperipheraltissues).TheJournalofbiologicalchemistry274,15990(6月4日,1999).87.P.A.Gollin,R.N.Kalaria,P.Eikelenboom,A.Rozemuller,G.Perry,α1-抗胰蛋白酶和α1-抗胰凝乳蛋白酶在阿爾茨海默病的損害中(Alpha1-antitrypsinandalpha1-antichymotrypsinareinthelesionsofAlzheimer'sdisease).Neuroreport3,201(2月,1992).88.G.J.Howlett,K.J.Moore,解開淀粉樣蛋白在動脈粥樣硬化中的作用(Untanglingtheroleofamyloidinatherosclerosis).Currentopinioninlipidology17,541(10月,2006).89.R.E.Tanzi,R.D.Moir,S.L.Wagner,清除阿爾茨海默氏Abeta肽：許通向滅絕(ClearanceofAlzheimer'sAbetapeptide:themanyroadstoperdition).Neuron43,605(9月2日,2004).90.R.W.Carrell,D.A.Lomas,構(gòu)象疾病.Lancet350,134(7月12日,1997).91.S.L.Cole,R.Vassar,阿爾茨海默病β-分泌酶，BACE1(TheAlzheimer'sdiseasebeta-secretaseenzyme,BACE1).Molecularneurodegeneration2,22(2007).92.A.F.Haney,W.S.Trought,在高危產(chǎn)科的sonolucent胎盤(Thesonolucentplacentainhigh-riskobstetrics).Obstetricsandgynecology55,38(1月,1980).93.V.A.Varma,K.M.Kim,胎盤鈣化：超微結(jié)構(gòu)和X射線微量分析研究(Placentalcalcification:ultrastructuralandX-raymicroanalyticstudies).Scanningelectronmicroscopy,1567(1985).94.O.Yokota等,彌漫性神經(jīng)原纖維纏結(jié)與鈣化(DNTC)的NACP/α-突觸核蛋白免疫反應(yīng)性(NACP/alpha-synucleinimmunoreactivityindiffuseneurofibrillarytangleswithcalcification(DNTC)).Actaneuropathologica104,333(10月,2002).95.T.Cornelis,A.Odutayo,J.Keunen,M.Hladunewich,腎臟在正常妊娠和子癇前期(Thekidneyinnormalpregnancyandpreeclampsia).Seminarsinnephrology31,4(1月,2011).96.B.M.Sibai,重度先兆子癇的模仿者(Imitatorsofseverepre-eclampsia).Seminarsinperinatology33,196(6月,2009).97.S.Hirai,K.Okamoto,與阿爾茨海默病和腦淀粉樣血管病相關(guān)的淀粉樣蛋白β/A4肽(Amyloidbeta/A4peptideassociatedwithAlzheimer'sdiseaseandcerebralamyloidangiopathy).Internalmedicine32,923(12月,1993).98.R.C.Pattinson,M.Hall,遺漏：對產(chǎn)婦死亡查詢有用的輔助(Nearmisses:ausefuladjuncttomaternaldeathenquiries).Britishmedicalbulletin67,231(2003).99.S.f.M.-F.M.PublicationsCommittee,B.M.Sibai,評估和管理嚴(yán)重先兆子癇34周妊娠前(Evaluationandmanagementofseverepreeclampsiabefore34weeks'gestation).美國婦產(chǎn)科雜志205,191(9月,2011).100.S.Lee,K.Carson,A.Rice-Ficht,T.Good,Hsp20，一種新的α-晶狀體蛋白，防止Abeta原纖維形成和毒性(Hsp20,anovelalpha-crystallin,preventsAbetafibrilformationandtoxicity).Proteinscience:apublicationoftheProteinSociety14,593(3月,2005).101.M.D.Griffin等,人類血清中的硫磺素T熒光：與血管健康和心血管危險因素的相關(guān)性(ThioflavinTfluorescenceinhumanserum:correlationswithvascularhealthandcardiovascularriskfactors).Clinicalbiochemistry43,278(2月,2010).102.M.Sakono,T.Zako,淀粉樣低聚物：Abeta寡聚物的形成和毒性(Amyloidoligomers:formationandtoxicityofAbetaoligomers).TheFEBSjournal277,1348(3月,2010).103.C.P.Price,R.G.Newall,J.C.Boyd,使用蛋白質(zhì)：肌酐比率測量隨機(jī)尿樣品預(yù)測顯著蛋白尿：系統(tǒng)評價(Useofprotein:creatinineratiomeasurementsonrandomurinesamplesforpredictionofsignificantproteinuria:asystematicreview).Clinicalchemistry51,1577(9月,2005).104.F.Schoonjans,A.Zalata,C.E.Depuydt,F.H.Comhaire,MedCalc：用于醫(yī)療統(tǒng)計的新計算機(jī)程序(MedCalc:anewcomputerprogramformedicalstatistics).Computermethodsandprogramsinbiomedicine48,257(12月,1995).105.B.Efron,R.J.Tibshirani,引導(dǎo)的介紹(Anintroductiontothebootstrap).(CRC出版,波卡拉頓,佛羅里達(dá)州,1994).106.E.R.DeLong,D.M.DeLong,D.L.Clarke-Pearson,比較兩個或更多個相關(guān)的接收器操作特性曲線下的面積：非參數(shù)方法(Comparingtheareasundertwoormorecorrelatedreceiveroperatingcharacteristiccurves:anonparametricapproach).Biometrics44,837(9月,1988).107.J.D.Green,C.Goldsbury,J.Kistler,G.J.Cooper,U.Aebi,人胰島淀粉樣多肽寡聚物生長和原纖維延長定義了淀粉樣蛋白形成中的兩個不同階段(Humanamylinoligomergrowthandfibrilelongationdefinetwodistinctphasesinamyloidformation).TheJournalofbiologicalchemistry279,12206(3月26日,2004).108.J.Rybarska等,超分子剛果紅是該染料對于L鏈λ衍生的淀粉樣蛋白的唯一連接形式的證據(jù)。(EvidencethatsupramolecularCongoredisthesoleligationformofthisdyeforLchainlambdaderivedamyloidproteins).Folia組織化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)/波蘭科學(xué)院，波蘭組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)學(xué)會，39,307(2001).109.J.W.Slot,H.J.Geuze,冷凍切片和免疫標(biāo)記(Cryosectioningandimmunolabeling).Natureprotocols2,2480(2007).110.M.J.Wehrum等,Accreta完全胎盤previa綜合征的特點是減少血管內(nèi)皮生長因子的系統(tǒng)水平和侵襲性滋養(yǎng)層的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Accretacomplicatingcompleteplacentapreviaischaracterizedbyreducedsystemiclevelsofvascularendothelialgrowthfactorandbyepithelial-to-mesenchymaltransitionoftheinvasivetrophoblast).美國婦產(chǎn)科雜志204,411e1(5月,2011).111.Z.Tang等,來自具有嚴(yán)重先兆子癇懷孕的胎盤中葉酸受體-β水平降低和胎兒巨噬細(xì)胞(Hofbauer細(xì)胞)數(shù)量減少(Decreasedlevelsoffolatereceptor-betaandreducednumbersoffetalmacrophages(Hofbauercells)inplacentasfrompregnancieswithseverepre-eclampsia).Americanjournalofreproductiveimmunology70,104(8月,2013).實施例3研究設(shè)計和樣品CRD測試有兩個部分?！皾癫糠帧卑ㄖ苽淠?剛果紅混合物，將混合物成點在硝化纖維素紙張(CRD紙張陣列)上點樣，然后在智能手機(jī)上獲取和存儲兩張照片(Pix1：在洗滌紙張之前捕獲，以及Pix2：在疏水洗滌之后捕獲)?！案刹糠帧卑▋蓚€圖像的處理，隨后分別計算每個點和每個受試者的CRD測試結(jié)果[％剛果紅保留(CRR)]，在從空白樣品(BLK，使用磷酸鹽緩沖鹽水[PBS]代替人尿)中減去CRR結(jié)果后作為陣列上重復(fù)點的平均值。這個研究進(jìn)行了3個階段，每個階段尋求協(xié)同簡化、加速和改善兩者“濕部分”和“干部分”的CRD試驗?！ぴ陔A段1中，在使用ImageJ軟件(http：//imagej.nih.gov/ij/)準(zhǔn)備手動分析中，對先前在AdobePhotoshop(Adobe，圣何塞，加利福尼亞州)中處理的存儲圖像評估圖像處理軟件工具的初步版本。階段1的結(jié)果導(dǎo)致了用于在測試的“濕部分”期間采樣點的一致定位的標(biāo)準(zhǔn)化模板以及對“干部分”的優(yōu)化的移動電話可用的圖像處理工具部分的開發(fā)?！ぴ陔A段2中，這些改進(jìn)在新制備的標(biāo)準(zhǔn)化CRD陣列上實時測試，并且就針對手動方案的一致性和就針對疾病相關(guān)預(yù)后標(biāo)準(zhǔn)(醫(yī)學(xué)上指示的因先兆子癇的分娩：MIDPE)的測試準(zhǔn)確性進(jìn)行分析?！ぴ陔A段3中，測試結(jié)果分析了4個操作員，包括未經(jīng)培訓(xùn)的人員，沒有任何指導(dǎo)或我們系統(tǒng)的先前知識，以檢查魯棒性和改善系統(tǒng)的錯誤處理和反饋。此外，方案的“濕部分”被進(jìn)一步簡化來系統(tǒng)地修改和/或消除若干步驟，以實現(xiàn)最大可能的簡化而不損失技術(shù)性能。收集包括在本研究中的尿樣(實施例2)作為在CRD原理的分子基礎(chǔ)上報告的研究的一部分。在評估期間，由單個專家(IAB)手動計算的CRR作為技術(shù)黃金標(biāo)準(zhǔn)。選擇MIDPE(先兆子癇相關(guān)的未遂事件)作為比較精確度分析中感興趣的結(jié)果。統(tǒng)計方法總結(jié)如下。點量化算法的評價階段1數(shù)據(jù)集源自先前獲取的圖像(在洗滌之前和之后，尼康Coolpix4500)，這些圖像已經(jīng)手動量化作為初始研究的一部分。該數(shù)據(jù)集由來自總共218個受試者的18個陣列組成。每個陣列保持來自12-15個受試者的重復(fù)點(圖20A)?；趯t色點相對于背景紙張的突出性的興趣，測試了兩種可能的算法，這將理論上增強(qiáng)染料顏色：紅色通道像素值除以綠色通道(比率R/G，其中R和G范圍0-255)，通過減少背景顏色來增強(qiáng)紅色信息?；谙嗤耐评?，第二次計算使用減去綠色通道的紅色通道信息(差異R-G)。由于拜耳模式，選擇綠色通道而不是藍(lán)色通道，這使得數(shù)字相機(jī)傳感器對綠色比對藍(lán)色更敏感，以便匹配人類視覺系統(tǒng)對綠色的增強(qiáng)的靈敏度。最后，使用亮度轉(zhuǎn)換方程來保持顏色的強(qiáng)度，同時消除顏色信息本身(圖20B)。亮度(L)算法類似于手動處理程序采用的算法。使用我們的應(yīng)用的命令行界面(在具有LinuxUbuntu操作系統(tǒng)的ThinkPadT500上運(yùn)行的處理庫的命令行版本)執(zhí)行的模擬計算確定R/G(圖20C)和L(圖20D)計算返回的CRR值，與R-G(圖20E)相比明顯更好地與手動導(dǎo)出的CRR(兩個比較的z-檢驗P<0.001)相關(guān)。在比較精確度分析(圖20F)中，在手工衍生的CRR的接受者工作曲線下的面積(AUC)[AUC＝0.966；95％CI[0.932-0.985])和使用L轉(zhuǎn)換自動計算的CRR(0.962[0.927-0.983]，P＝0.579)無差異。與手動整合相比，當(dāng)CRR值計算為R/G(0.962[0.927-0.983]，P＝0.042)時，AUC有小但仍統(tǒng)計學(xué)上顯著差異的減少。我們將這種差異歸因于選擇的尿樣所顯示的微妙紅移(從紅色到紫色)，與L轉(zhuǎn)化相比，其更顯著地影響R/G比率。除了灰度圖像所需的通常較短的處理時間，這使我們選擇L-基的算法用于后續(xù)的過程開發(fā)。CRD陣列大小和布局的標(biāo)準(zhǔn)化對于完全自動化的程序，在階段1期間作為要求出現(xiàn)紙張的自動檢測以及所獲取圖像上的點的一致位置。此外，紙張的尺寸和取向需要是已知的。為了實現(xiàn)這一點，CRD陣列的布局被標(biāo)準(zhǔn)化和再訪問。獲得Pix1和Pix2的模式也被標(biāo)準(zhǔn)化并再訪問，如下：i)將硝化纖維素紙張切成4.5英寸寬，6英寸長的標(biāo)準(zhǔn)尺寸，其與iPhone屏幕尺寸成比例；ii)使用手持工藝紙沖壓機(jī)器沖壓紙張的四個角部正方形中的三個；iii)將樣品定位模板(圖21)印刷在普通紙上，然后將其放置在塑料紙張保護(hù)器內(nèi)并在硝化纖維素紙張下。包括真實尺寸的模板用于打印輸出，如圖24所示。模板標(biāo)記多達(dá)41個受試者的樣品位置(每個樣品在兩列相鄰單元格中一式兩份)。每個單元格的黑色中心點通過透明度可見，并用作樣品放置的指南，以確保紙張上有可預(yù)測的點。對應(yīng)于空白(BLK或PBS)的樣本點被放置在第一左角；iv)在陣列紙張放置在黑色表面上的情況下執(zhí)行對Pix1和Pix2圖像的采集，這導(dǎo)致沖壓孔作為位置標(biāo)記，而不需要使用在洗滌期間可能滲出的墨水或可能增加紙張成本的其他標(biāo)記物。CRD測試陣列的這種標(biāo)準(zhǔn)化格式從QUICK(QR)代碼中借用元素，即紙張具有已知的縱橫比并且突出顯示四個角中的三個。在左和上角的三個標(biāo)記物的檢測允許Pix1中的每個單獨點及其在Pix2中的相應(yīng)自身(或染料已被洗掉的位置)的旋轉(zhuǎn)、去偏斜和完美疊加。最后一個特征是通過一個圖像處理序列實現(xiàn)的，該序列定制為像app一樣在同一智能手機(jī)上運(yùn)行用于獲取Pix1和Pix2(在這種情況下為iPhone4)。CRD陣列圖像處理序列序列有如下七個成像處理步驟：i)采集CRD試驗的濕部分的圖像部分；ii)紙張檢測；iii)紙張?zhí)崛。籭v)單元格提??；v)點檢測；vi)點提取和vii)CRR計算。在圖21中示意性地表示過程工作流程。圖像采集。使用智能手機(jī)的內(nèi)置相機(jī)獲取圖像。iPhone4相機(jī)的分辨率足以捕獲每個直徑最大數(shù)量為約40個像素的樣本點。這導(dǎo)致每個樣本點大約1,200個像素。為了處理的速度和魯棒性，將每個圖像轉(zhuǎn)換成用于所有步驟的亮度灰度級。紙張檢測。由于照片角度的變化導(dǎo)致的紙張的確切位置和變形是未知的，首先需要透視投影的去偏斜。為了實現(xiàn)這一點，檢測四個角，然后在四個角之間應(yīng)用簡單的插值，以將紙張去偏斜成矩形圖像。為了找到這些角，紙張本身以及其邊緣必須被定位。紙張的兩個相對邊應(yīng)該具有相同的長度；這些角具有90度，并且相鄰邊的比率等于標(biāo)準(zhǔn)化模板的比率(0.75)。對于自動檢測，灰度輸入圖像使用Otsu方法二值化。因為圖像的背景是黑色的(由于通過穿孔可見的黑色攝影背景)，并且紙張是白色的，所以計算紙張的Otsu閾值以將前景(紙張)與背景分離。為了進(jìn)一步平滑所得到的二維圖像，應(yīng)用數(shù)學(xué)形態(tài)填充前景部分中的所有空洞。接下來，應(yīng)用梯度過濾器以暴露圖像上的紙張邊界。在具有過度表示的邊界的該梯度圖像上，使用霍夫線變換(Houghlinetransform)(查找圖像中線的方法)來檢測角。首先計算粗糙的霍夫線變換以寬松地找到四個最突出的邊(紙張的邊界)。接下來，提取這些線的4個交叉點。因為這些位置不完美地匹配角，所以圍繞先前找到的角在感興趣區(qū)域上分別執(zhí)行第二次精細(xì)的霍夫線變換。在該第二次運(yùn)行中，僅提取并交叉角附近的兩條主線，這改善了角點的定位，同時將存儲器使用量保持為最小。紙張?zhí)崛?。從四個角點，估計較長和較短邊的位置，并且使用雙線性插值將紙張透視變換為矩形幾何形狀。幾何校正還將每點的像素數(shù)量減少到約700個像素(縮小規(guī)模)。為了考慮可能的風(fēng)景與肖像獲取，通過計算每個角中的平均強(qiáng)度并選擇具有最高強(qiáng)度的角(其對應(yīng)于沒有穿孔標(biāo)記的角落)作為參考點來檢測紙張角中的三個位置標(biāo)記。紙張被相應(yīng)地?fù)Q位或旋轉(zhuǎn)，使得所有標(biāo)記被重新定位在上角和左角。標(biāo)準(zhǔn)化圖像現(xiàn)在包含跨越四個圖像角的紙張。該過程在Pix1和Pix2上單獨完成。單元格提取。由于基于標(biāo)準(zhǔn)化樣品應(yīng)用模板良好地定義了陣列的幾何形狀，因此無需進(jìn)一步的圖像處理地從標(biāo)準(zhǔn)化圖像中提取每個患者的單元格的位置。然而，每個單元格在一個未知的位置包含兩個點。該過程在Pix1和Pix2上單獨完成。點檢測。所有可能的樣品點存在于Pix1中，但一些可能在洗滌期間消失(陰性測試樣品)。因此，完全點檢測只能對Pix1執(zhí)行。為了確定點位置，對Pix1上的每個提取的單元格應(yīng)用梯度過濾器以檢測點邊緣。估計每個點的半徑。然后執(zhí)行霍夫圓變換，并且選擇每個單元中的兩個最突出的圓形形狀。因為點的相對位置在洗滌期間不改變，所以來自Pix1的相同位置信息用于Pix2的處理。點提取。利用已知的點的位置，提取并相加相應(yīng)像素的強(qiáng)度。為了考慮白平衡和溫和的照明變化，通過從表5的點內(nèi)的平均亮度中減去點外的單元格的平均亮度來進(jìn)行背景減除。表5.處理我方研究的階段3中的問題和方案*以觀察到的頻率遞減排列CRR計算。用手動公式模擬，測試結(jié)果(CRR)被計算為Pix1上的點的平均強(qiáng)度與Pix2中的點的平均強(qiáng)度的比率。從紙張上的所有其他計算的CRR值中減去空白樣品的值(左上方單元格位置中的點)。驗證和等價/非劣效性測試在階段2中，使用iPhone4和運(yùn)行上述序列的應(yīng)用程序來獲取和處理圖像。為了重復(fù)性，使用iPhone相機(jī)用于采集，但是圖像然后被傳送到在iPhone模擬器中執(zhí)行處理的計算機(jī)。分析包含328個不同的尿樣本的8個CRD陣列作為階段2的一部分。這些陣列是從保持冷凍在-80℃的等分試樣制備特異性地用于該研究。樣本來源于273個不同婦女(55個樣本后來在懷孕后期收集)。所有樣本在樣品收集和儲存方面是連續(xù)的。與在階段1部分分析的樣本沒有重疊。階段2數(shù)據(jù)集中感興趣的結(jié)果(MIDPE)的流行率在樣本(118/328)和受試者(108/273)中為40％。與階段1類似，手動和自動化CRR測量之間的一致性存在顯著水平?；赑earson’s精度系數(shù)ρ＝0.973和偏差校正因子Cb＝0.995(圖22A)，Lin’s一致性系數(shù)(ρc)為0.968,95％CI[0.961-0.974])有資格為“實質(zhì)性的(substantial)”。雙單側(cè)測試(TOST)過程確定智能手機(jī)可用的CRR計算等同于手動積分(圖22B)。這可以通過用手動與自動化程序計算的CRR的重疊的90％置信區(qū)間容易地看出，不管組是否通過結(jié)果組合地或各自地分析。獨特于TOST分析，90％置信區(qū)間對應(yīng)于P＝0.05顯著性水平。MIDPE組的等效余量為10％，無MIDPE組和整體數(shù)據(jù)集的等效余量為5％。使用來自每個受試者的第一樣本的ROC分析確定在CRR的手動定量(0.911[0.882-0.935])和智能手機(jī)計算(0.923[0.986-0.945]，P＝0.329)之間的AUC沒有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(圖22C)。處理時間圖23中包括說明處理時間的iPhone應(yīng)用程序的逐屏幕工作流程(在所示示例中，圖像Pix1和Pix2先前已經(jīng)被獲取并存儲在智能手機(jī)的圖片庫中)。利用我們的圖像處理工具，從CRD測試陣列“濕部分”的結(jié)論到結(jié)果的時間在智能手機(jī)上減少到大約2分鐘的處理時間。性能和工程公差分析為了驗證我們的算法和進(jìn)一步提高我們的成像方案在我們的研究的階段3的魯棒性，獲得6個標(biāo)準(zhǔn)化CRD陣列的附加數(shù)據(jù)集。實驗由未經(jīng)訓(xùn)練的人執(zhí)行，該人還沒有被給予關(guān)于如何定位智能手機(jī)以獲取圖像或避免不均勻的照明和陰影(照相機(jī)角度)的指令。這個數(shù)據(jù)集有助于評估操作員-引起的誤差的可能來源。在表5中總結(jié)了這些處理問題以及它們對成像處理鏈的影響和在更新版本中實施的補(bǔ)救措施。最常見的處理誤差是獲取Pix1和Pix2的過度透視。大多數(shù)問題通過向用戶反饋并用關(guān)于如何重新獲取圖像以避免該問題的指示來補(bǔ)救。我們的成像鏈的魯棒性通過設(shè)置Pix1和Pix2上容許的不均勻照明水平的限制進(jìn)一步改善。當(dāng)陰影超過變異的公差水平(變異系數(shù)>15％)時，通過界面提示用戶重新拍攝照片并遠(yuǎn)離光源。對CRD測試的濕部分的另外優(yōu)化作為階段3部分，在94個尿樣的連續(xù)集合上進(jìn)行另外的陣列，將先前驗證的CRD測試的“濕部分”與兩個縮寫版本進(jìn)行比較：一個省略了尿蛋白標(biāo)準(zhǔn)化，另一個省略了蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化和與剛果紅的1小時攪拌。省略了尿液標(biāo)準(zhǔn)化和攪拌(與剛果紅混合的樣品立即放置在紙張上)導(dǎo)致與原始方案的可接受的一致性(Lin'sρ＝0.914[0.873-0.942])。在多變量線性回歸中，偏倚程度僅由CRR水平?jīng)Q定，而不是由紙張上的位置、操作者熟練程度或尿蛋白濃度決定。準(zhǔn)確度(Cb＝0.997)超過精度(Pearson'sρ＝0.916)，表明盡管數(shù)字可能略有不同，省略標(biāo)準(zhǔn)化將不會顯著影響疾病分類。進(jìn)行其他實驗以用更容易獲得和處置的替代物替代甲醇洗滌。通過試驗和錯誤，我們確定醫(yī)藥級異丙醇(90％)被證明比甲醇更有效，并縮短了洗滌時間(測量直到完全空白脫色)至7分鐘。醫(yī)藥級乙醇(70％)不適合作為甲醇替代品。變性劑(即丙酮，在美國添加丙酮使其不可飲用)影響硝化纖維素紙張的孔徑，其導(dǎo)致陽性樣品上的信號的不可接受的損失。統(tǒng)計程序除非另有說明，MedCalc軟件(v12.5Ostend，比利時)用作統(tǒng)計輔助。使用Pearson’s乘積矩相關(guān)來測試相關(guān)性，而使用Lin’s一致性系數(shù)和McBride描述性一致性縮放來確定一致性。使用TOST/XLSTAT加載項程序在MicrosoftExcel中進(jìn)行等價/非劣效性測試。多變量逐步線性回歸用于確定多個變量對偏差水平的影響(使用手動方法獲得的結(jié)果與在濕方案中系統(tǒng)消除步驟后的結(jié)果之間的差異)。如果P<0.05，則在模型中輸入變量，并且如果P>0.1，則去除變量。對于所有程序，P<0.05用于表示統(tǒng)計學(xué)顯著性。方程L(x,y)＝0.3×R(x,y)+0.59×G(x,y)+0.11×B(x,y)(方程1)其中，L(x，y)是亮度，并且R(x，y)，G(x，y)和B(x，y)確定分別位于x，y處的像素的紅色、綠色和藍(lán)色值。r(di)作為點di的歸一化亮度(被認(rèn)為是“紅色”)，ci為包含di的單元格，以及ci或di中像素數(shù)N。參考文獻(xiàn)(此處通過引用納入每一篇)1.S.Lunde,inWipro.(Wipro有限公司),vol.2013.2.C.Free等,M衛(wèi)生技術(shù)在改善衛(wèi)生和衛(wèi)生服務(wù)方面的有效性：系統(tǒng)評價方案(TheeffectivenessofM-healthtechnologiesforimprovinghealthandhealthservices:asystematicreviewprotocol).BMCresearchnotes3,250(2010).3.M.Fiordelli,N.Diviani,P.J.Schulz,根據(jù)mHealth研究：進(jìn)化的十年(MappingmHealthresearch:adecadeofevolution).JournalofmedicalInternetresearch15,e95(2013).4.E.Ozdalga,A.Ozdalga,N.Ahuja,智能手機(jī)在醫(yī)學(xué)：審查當(dāng)前和潛在的使用醫(yī)生和學(xué)生(Thesmartphoneinmedicine:areviewofcurrentandpotentialuseamongphysiciansandstudents).JournalofmedicalInternetresearch14,e128(2012).5.A.Hart,K.Tallevi,D.Wickland,R.E.Kearney,J.A.Cafazzo,用于智能床和移動監(jiān)測應(yīng)用的無接觸呼吸監(jiān)測器。會議記錄：...I(Acontact-freerespirationmonitorforsmartbedandambulatorymonitoringapplications.Conferenceproceedings:...)EEE國際醫(yī)學(xué)和生物學(xué)工程學(xué)術(shù)年會。IEEE工程醫(yī)學(xué)和生物學(xué)學(xué)會。2010會議,927(2010).6.J.M.Ruano-Lopez等,智能生物手機(jī)，一個通過兩個歐洲項目開發(fā)的視點監(jiān)控點(TheSmartBioPhone,apointofcarevisionunderdevelopmentthroughtwoEuropeanprojects:OPTOLABCARDandLABONFOIL).Labonachip9,1495(6月7日,2009).7.J.J.Oresko,H.Duschl,A.C.Cheng,一種基于智能手機(jī)的可穿戴式平臺，通過心電圖處理進(jìn)行實時心血管疾病檢測(Awearablesmartphone-basedplatformforreal-timecardiovasculardiseasedetectionviaelectrocardiogramprocessing).IEEE生物醫(yī)學(xué)信息技術(shù)交易：IEEE工程醫(yī)學(xué)和生物學(xué)學(xué)會的出版物(IEEEtransactionsoninformationtechnologyinbiomedicine:apublicationoftheIEEEEngineeringinMedicineandBiologySociety)14,734(5月,2010).8.K.Boehret,所有參考(http://allthingsd.com/20130813/device-nags-you-to-sit-up-straight/,2013),vol.10月18日,2013可得.9.H.Engel等,通過智能手機(jī)攝影和3G無線互聯(lián)網(wǎng)遠(yuǎn)程實時監(jiān)測自由襟翼：一項前瞻性研究證明診斷的準(zhǔn)確性(Remotereal-timemonitoringoffreeflapsviasmartphonephotographyand3GwirelessInternet:aprospectivestudyevidencingdiagnosticaccuracy).Microsurgery31,589(11月,2011).10.E.Jonathan,M.Leahy,調(diào)查智能手機(jī)成像單元進(jìn)行光電容積描記(Investigatingasmartphoneimagingunitforphotoplethysmography).Physiologicalmeasurement31,N79(11月,2010).11.R.A.Joundi,J.S.Brittain,N.Jenkinson,A.L.Green,T.Aziz,使用iPhone加速度計快速震顫頻率評估(RapidtremorfrequencyassessmentwiththeiPhoneaccelerometer).Parkinsonism&relateddisorders17,288(5月,2011).12.R.Lemoyne,T.Mastroianni,M.Cozza,C.Coroian,W.Grundfest,實現(xiàn)iPhone作為無線加速度計用于量化步態(tài)特性。會議記錄：...(ImplementationofaniPhoneasawirelessaccelerometerforquantifyinggaitcharacteristics.Conferenceproceedings:...)IEEE國際醫(yī)學(xué)和生物學(xué)工程學(xué)術(shù)年會。IEEE工程醫(yī)學(xué)和生物學(xué)學(xué)會。2010會議,3847(2010).13.R.Lemoyne,T.Mastroianni,M.Cozza,C.Coroian,W.Grundfest,通過無線加速度計應(yīng)用程序?qū)崿F(xiàn)表征帕金森病震顫的iPhone。會議記錄：...(ImplementationofaniPhoneforcharacterizingParkinson'sdiseasetremorthroughawirelessaccelerometerapplication.Conferenceproceedings:...)IEEE國際醫(yī)學(xué)和生物學(xué)工程學(xué)術(shù)年會。IEEE工程醫(yī)學(xué)和生物學(xué)學(xué)會.2010大會,4954(2010).14.J.A.Wolf等,智能手機(jī)應(yīng)用程序診斷不準(zhǔn)確的黑色素瘤檢測(Diagnosticinaccuracyofsmartphoneapplicationsformelanomadetection).JAMAdermatology149,422(4月,2013).15.I.A.Buhimschi等,蛋白質(zhì)錯折疊，尿性嗜剛果紅，寡聚狀態(tài)免疫反應(yīng)性和先兆子癇中的缺陷淀粉樣蛋白前體蛋白加工(Proteinmisfolding,urinecongophilia,oligomericstateimmunoreactivityanddefectiveamyloidprecursorproteinprocessinginpreeclampsia).Manuscriptinreview.16.I.A.Buhimschi等,尿液的蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定了SERPINA1和白蛋白的特異性片段作為先兆子癇的生物標(biāo)志物(ProteomicprofilingofurineidentifiesspecificfragmentsofSERPINA1andalbuminasbiomarkersofpreeclampsia).美國婦產(chǎn)科雜志199,551e1(11月,2008).17.W.Gottesman,N.Baum,QR碼：下一個社交媒體(QRcodes:nextlevelofsocialmedia).TheJournalofmedicalpracticemanagement:MPM28,345(5月-6月,2013).18.N.Otsu,從灰度直方圖的閾值選擇方法(Athresholdselectionmethodfromgray-levelhistograms).IEEETransactionsonSystems,Man,andCybernetics9,62(1979).19.P.V.C.Hough,泡罩圖像的機(jī)器分析(MachineAnalysisofBubbleChamberPictures).Proc.Int.Conf.高能加速器和儀表(HighEnergyAcceleratorsandInstrumentation),(1959).20.T.M.Lehmann,C.,Spitzer,K.,醫(yī)學(xué)圖像處理中的插值方法(Interpolationmethodsinmedicalimageprocessing).IEEETransMedImaging18,1049(1999).21.R.O.Duda,P.E.Hart,使用霍夫變換來檢測圖片中的線條和曲線。計算機(jī)協(xié)會通訊(UseoftheHoughtransformationtodetectlinesandcurvesinpictures).計算機(jī)協(xié)會通訊，15,11(1972).22.L.I.Lin,用于評價再現(xiàn)性的一致性相關(guān)系數(shù)(Aconcordancecorrelationcoefficienttoevaluatereproducibility).Biometrics45,255(3月,1989).23.G.B.McBride,林的一致性相關(guān)系數(shù)的一致性標(biāo)準(zhǔn)提案(Aproposalforstrength-of-agreementcriteriaforLin'sConcordanceCorrelationCoefficient).NIWA客戶報告HAM2005-062,(2005).24.E.Walker,A.S.Nowacki,了解等效性和非劣效性測試(Understandingequivalenceandnoninferioritytesting).Journalofgeneralinternalmedicine26,192(2月,2011).25.A.A.Okunad,V.N.Murthy,技術(shù)作為醫(yī)療保健成本的“主要驅(qū)動力”：對紐豪斯猜想的協(xié)整分析(Technologyasa'majordriver'ofhealthcarecosts:acointegrationanalysisoftheNewhouseconjecture).Journalofhealtheconomics21,147(1月,2002).26.A.F.Coskun,R.Nagi,K.Sadeghi,S.Phillips,A.Ozcan,使用智能手機(jī)在尿液中進(jìn)行白蛋白檢測(Albumintestinginurineusingasmart-phone).Labonachip13,4231(11月7日,2013).27.S.Adibi,移動健康(mHealth)生物醫(yī)學(xué)成像范式。會議記錄：...(Mobilehealth(mHealth)biomedicalimagingparadigm.Conferenceproceedings:...)，IEEE國際醫(yī)學(xué)和生物學(xué)工程學(xué)術(shù)年會。IEEE工程醫(yī)學(xué)和生物學(xué)學(xué)會。2013大會,6453(7月,2013).28.A.Labrique,L.Vasudevan,L.W.Chang,G.Mehl,對mHealth的H_pe：更多“y”或“o”在地平線上？(H_peformHealth:more"y"or"o"onthehorizon？)Internationaljournalofmedicalinformatics82,467(5月,2013).29.ACOG實踐公告。先兆子癇和子癇的診斷和治療(Diagnosisandmanagementofpreeclampsiaandeclampsia).第33號，2002年1月。美國婦產(chǎn)科學(xué)院。(2002).30.K.S.Khan,D.Wojdyla,L.Say,A.M.Gulmezoglu,P.F.VanLook,世衛(wèi)組織對產(chǎn)婦死亡原因的分析：系統(tǒng)評價(WHOanalysisofcausesofmaternaldeath:asystematicreview).Lancet367,1066(4月1日,2006).31.R.J.Guidotti,D.(2005).32.F.Schoonjans,A.Zalata,C.E.Depuydt,F.H.Comhaire,MedCalc：用于醫(yī)療統(tǒng)計的新計算機(jī)程序。計算機(jī)方法和程序在生物醫(yī)學(xué)48,257(12月，1995)。(MedCalc:anewcomputerprogramformedicalstatistics).Computermethodsandprogramsinbiomedicine48,257(12月,1995).本文定義和使用的所有定義應(yīng)理解為包括字典定義、通過引用并入的文獻(xiàn)定義和/或所定義術(shù)語的普通含義。除非清楚地相反指示，否則本文在說明書和權(quán)利要求書中使用的不定冠詞“一”和“一個”應(yīng)當(dāng)被理解為是指“至少一個”。如本文在說明書和權(quán)利要求書中使用的短語“和/或”應(yīng)當(dāng)被理解為是指這樣連接的元素中的“任一個或兩個”，即在一些情況下連接存在并且在其它情況下各自存在的案例。用“和/或”列出的多個元素應(yīng)當(dāng)以相同的方式解釋，即，“一個或多個”的元素如此結(jié)合。除了由“和/或”子句具體標(biāo)識的元素之外，可以可選地存在其他元素，無論與具體標(biāo)識的那些元素相關(guān)還是不相關(guān)。因此，作為非限制性實例，當(dāng)結(jié)合開放式語言(例如“包括”)使用時，引用“A和/或B”,在一個實施例中可以僅指A(可選地包括除B之外的元素)；在另一個實施例中可以僅指B(可選地包括除A之外的元素)；在又一個實施例中，可以指A和B(可選地包括其他元素)。類似地，當(dāng)在開放式語言如“包括”中使用時，對“A，B和/或C”的引用，在一些實施例中可以僅指A(可選地包括除B和C之外的元素)；在另一個實施例中，可以僅指B(可選地包括除A和C之外的元素)；在另一個實施例中，可以僅指C(可選地包括除C和C之外的元素)；在另一個實施例中，可以指A和B(任選地包括其它元素)，指A和C(任選地包括其它元素)，指B和C(任選地包括其它元素)，或指A，B和C(任選地包括其他元素)。如本文在說明書和權(quán)利要求書中使用的，就一個或多個元素的列表，短語“至少一個”應(yīng)當(dāng)被理解為表示選自元素列表中的任何一個或多個元素的至少一個元素，但不一定包括在元素列表中具體列出的每樣一個元素或每一個元素，并且不排除元素列表中的元素的任何組合。該定義還允許元素可以可選地存在，而不是短語“至少一個”所指的元素列表中具體標(biāo)識的元素，無論這些元素與具體標(biāo)識的那些元素相關(guān)或不相關(guān)。因此，作為非限制性實例，“A和B中的至少一個”(或等效地為“A或B中的至少一個”或等效地為“A和/或B中的至少一個”)可以指代，在一些實施例中，至少一個，可選地包括多于一個A而不存在B(并且可選地包括除B之外的元素)；在另一個實施例中，指至少一個，任選包括多于一個B而不存在A(并且任選包括除A之外的元素)；在又一個實施例中，至少一個，可選地包括多于一個A，以及至少一個且可選地包括多于一個B(并且可選地包括其他元素)。還應(yīng)當(dāng)理解，除非清楚地指出相反的情況，在本文要求保護(hù)的包括多于一個步驟或動作的任何方法中，該方法的步驟或動作的順序不一定限于引用該方法的步驟或動作的順序。本文公開的所有參考文獻(xiàn)、專利和專利申請通過引用的方式并入本文中，其中每個被引用的主題在某些情況下可以包括文檔的全部。在權(quán)利要求中以及在上面的說明書中，諸如“包括”、“包括”、“攜帶”、“具有”、“含有”、“設(shè)計”、“持有”、“組分為(composedof)”等連接詞應(yīng)理解為開放式的，即，意味著包括但不限于。只有連接詞“由……組成(consistingof)”和“基本上由……組成”分別是封閉或半封閉的，如美國專利局專利審查程序手冊第2111.03節(jié)中所述。序列表<110>耶魯大學(xué)<120>檢測錯誤折疊蛋白的方法和組合物<130>Y0087.70084WO00<140>TBD<141>2015-04-10<150>US61/978,158<151>2014-04-10<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>130<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>1MetArgGlnLysAlaValSerLeuPheLeuCysTyrLeuLeuLeuPhe151015ThrCysSerGlyValGluAlaGlyLysLysLysCysSerGluSerSer202530AspSerGlySerGlyPheTrpLysAlaLeuThrPheMetAlaValGly354045GlyGlyLeuAlaValAlaGlyLeuProAlaLeuGlyPheThrGlyAla505560GlyIleAlaAlaAsnSerValAlaAlaSerLeuMetSerMetSerAla65707580IleLeuAsnGlyGlyGlyValProAlaGlyGlyLeuValAlaThrLeu859095GlnSerLeuGlyAlaGlyGlySerSerValValIleGlyAsnIleGly100105110AlaLeuMetGlyTyrAlaThrHisLysTyrLeuAspSerGluGluAsp115120125GluGlu130<210>2<211>134<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>2MetArgGlnLysAlaValSerLeuPheLeuCysTyrLeuLeuLeuPhe151015ThrCysSerGlyValGluAlaGlyGluAsnAlaGlyLysLysLysCys202530SerGluSerSerAspSerGlySerGlyPheTrpLysAlaLeuThrPhe354045MetAlaValGlyGlyGlyLeuAlaValAlaGlyLeuProAlaLeuGly505560PheThrGlyAlaGlyIleAlaAlaAsnSerValAlaAlaSerLeuMet65707580SerMetSerAlaIleLeuAsnGlyGlyGlyValProAlaGlyGlyLeu859095ValAlaThrLeuGlnSerLeuGlyAlaGlyGlySerSerValValIle100105110GlyAsnIleGlyAlaLeuMetGlyTyrAlaThrHisLysTyrLeuAsp115120125SerGluGluAspGluGlu130<210>3<211>138<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>3MetArgGlnLysAlaValSerLeuPheLeuCysTyrLeuLeuLeuPhe151015ThrCysSerGlyValGluAlaGlyGluAsnAlaGlyLysAspAlaGly202530LysLysLysCysSerGluSerSerAspSerGlySerGlyPheTrpLys354045AlaLeuThrPheMetAlaValGlyGlyGlyLeuAlaValAlaGlyLeu505560ProAlaLeuGlyPheThrGlyAlaGlyIleAlaAlaAsnSerValAla65707580AlaSerLeuMetSerMetSerAlaIleLeuAsnGlyGlyGlyValPro859095AlaGlyGlyLeuValAlaThrLeuGlnSerLeuGlyAlaGlyGlySer100105110SerValValIleGlyAsnIleGlyAlaLeuMetGlyTyrAlaThrHis115120125LysTyrLeuAspSerGluGluAspGluGlu130135<210>4<211>418<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>4MetProSerSerValSerTrpGlyIleLeuLeuLeuAlaGlyLeuCys151015CysLeuValProValSerLeuAlaGluAspProGlnGlyAspAlaAla202530GlnLysThrAspThrSerHisHisAspGlnAspHisProThrPheAsn354045LysIleThrProAsnLeuAlaGluPheAlaPheSerLeuTyrArgGln505560LeuAlaHisGlnSerAsnSerThrAsnIlePhePheSerProValSer65707580IleAlaThrAlaPheAlaMetLeuSerLeuGlyThrLysAlaAspThr859095HisAspGluIleLeuGluGlyLeuAsnPheAsnLeuThrGluIlePro100105110GluAlaGlnIleHisGluGlyPheGlnGluLeuLeuArgThrLeuAsn115120125GlnProAspSerGlnLeuGlnLeuThrThrGlyAsnGlyLeuPheLeu130135140SerGluGlyLeuLysLeuValAspLysPheLeuGluAspValLysLys145150155160LeuTyrHisSerGluAlaPheThrValAsnPheGlyAspThrGluGlu165170175AlaLysLysGlnIleAsnAspTyrValGluLysGlyThrGlnGlyLys180185190IleValAspLeuValLysGluLeuAspArgAspThrValPheAlaLeu195200205ValAsnTyrIlePhePheLysGlyLysTrpGluArgProPheGluVal210215220LysAspThrGluGluGluAspPheHisValAspGlnValThrThrVal225230235240LysValProMetMetLysArgLeuGlyMetPheAsnIleGlnHisCys245250255LysLysLeuSerSerTrpValLeuLeuMetLysTyrLeuGlyAsnAla260265270ThrAlaIlePhePheLeuProAspGluGlyLysLeuGlnHisLeuGlu275280285AsnGluLeuThrHisAspIleIleThrLysPheLeuGluAsnGluAsp290295300ArgArgSerAlaSerLeuHisLeuProLysLeuSerIleThrGlyThr305310315320TyrAspLeuLysSerValLeuGlyGlnLeuGlyIleThrLysValPhe325330335SerAsnGlyAlaAspLeuSerGlyValThrGluGluAlaProLeuLys340345350LeuSerLysAlaValHisLysAlaValLeuThrIleAspGluLysGly355360365ThrGluAlaAlaGlyAlaMetPheLeuGluAlaIleProMetSerIle370375380ProProGluValLysPheAsnLysProPheValPheLeuMetIleGlu385390395400GlnAsnThrLysSerProLeuPheMetGlyLysValValAsnProThr405410415GlnLys<210>5<211>21<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>5MetIleGluGlnAsnThrLysSerProLeuPheMetGlyLysValVal151015AsnProThrGlnLys20<210>6<211>22<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成多肽<400>6LeuMetIleGluGlnAsnThrLysSerProLeuPheMetGlyLysVal151015ValAsnProThrGlnLys20當(dāng)前第1頁1 2 3