本發(fā)明涉及一種分離靶生物實(shí)體(bioentity)如細(xì)胞或其它生物材料如細(xì)胞器或病毒的方法?？梢圆捎盟龇椒▉矶x色譜法，包括柱色譜法。本發(fā)明還涉及用于從樣品中分離靶細(xì)胞的新裝置以及相應(yīng)的設(shè)備。本發(fā)明還涉及其上具有配體的固定相在靶細(xì)胞的分離中的用途。

背景技術(shù)：

所需細(xì)胞類型的純的和功能性細(xì)胞群的分離是各種治療、診斷和生物技術(shù)應(yīng)用的前提。

色譜法是一種用于分離低分子量和高分子量分子包括蛋白質(zhì)的得到充分確認(rèn)的技術(shù)。這種技術(shù)也被應(yīng)用于細(xì)胞分離，特別是以親和色譜法的形式使用對所需細(xì)胞類型特異的固定化配體，如免疫配體。例如，不同的T細(xì)胞亞群如下分離：用單克隆免疫球蛋白標(biāo)記和負(fù)載到具有聚丙烯酰胺珠子的柱子上，兔抗-小鼠lgG共價(jià)結(jié)合到珠子上(Braun,R.,等,Journal of Immunological Methods(1982)54,251-258)。進(jìn)一步例如，使用共價(jià)綴合到雙花扁豆凝集素的Sepharose 6MB的凝集素-親和柱色譜法已被用于從健康白細(xì)胞中分離白血病細(xì)胞(Ohba,H.,等,Cancer Letters(2002)184,207-214)。

由于細(xì)胞尺寸通常大于蛋白質(zhì)，與蛋白質(zhì)相比，它們很難進(jìn)入常規(guī)色譜吸附劑的珠子的孔中。由于擴(kuò)散限制，使用大孔的吸附劑不能明顯克服這種分離現(xiàn)象。另一方面，只有蛋白質(zhì)可進(jìn)入的孔內(nèi)的表面積通常很大程度上超過蛋白質(zhì)和細(xì)胞都可進(jìn)入的表面積。因此，使用用于固定蛋白質(zhì)性或其他受體結(jié)合配體的常規(guī)色譜吸附劑來產(chǎn)生用于細(xì)胞的親和基質(zhì)通常需要使用大量過剩浪費(fèi)的受體結(jié)合配體，這是由于它們中的大部分都被固定在細(xì)胞不能進(jìn)入的孔或腔中。特異受體結(jié)合試劑通常是昂貴的且很難在所需規(guī)模產(chǎn)生，由此需要認(rèn)真考慮這方面。冷凍凝膠劑形式的整體吸附劑的使用因此被提出作為一種細(xì)胞親和色譜法的替代技術(shù)(參見例如Dainiak,M.B.,等,Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.(2007),106,101-127)。然而，整體吸附劑缺乏，以致所需的吸附劑可能無法在市場上以整體柱的形式獲得。此外，在親和色譜法的情況下，通常仍需要移除用于從這些細(xì)胞中洗脫所需細(xì)胞的競爭化合物。整體吸附劑在細(xì)胞生存力方面的潛在優(yōu)勢可能因此被移除用于從親和色譜柱中洗脫細(xì)胞的化合物所需的另外的程序逆轉(zhuǎn)。

目前使用的最重要的細(xì)胞分離方法是磁體-輔助細(xì)胞分選(MACS)和熒光-輔助細(xì)胞分選(FACS^TM)。通過流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞分選個(gè)別地分析細(xì)胞，在流式細(xì)胞術(shù)中通常熒光團(tuán)耦合到抗體，用于標(biāo)記細(xì)胞。細(xì)胞在極高壓下使用細(xì)胞分選器高速分離。FACS^TM技術(shù)能夠在一個(gè)步驟中通過應(yīng)用具有不同熒光團(tuán)的一組抗體分離由一組對應(yīng)標(biāo)記物定義的細(xì)胞。因此，此方法是可靠的，但是時(shí)間和成本強(qiáng)度大且費(fèi)勁。特別是對于非常大且多樣的細(xì)胞群的篩選，如含有1×10¹⁰個(gè)細(xì)胞的血漿分離置換法產(chǎn)物，流式細(xì)胞分析儀的極長分選時(shí)間對于一個(gè)適當(dāng)?shù)倪x擇過程是不可接受的。FACS^TM的另一個(gè)缺點(diǎn)在于，復(fù)雜且易于干擾的流式細(xì)胞分析儀很難適應(yīng)分離治療性細(xì)胞產(chǎn)品必需的GMP環(huán)境。此外，在細(xì)胞選擇程序中應(yīng)用的壓力可能會(huì)損害細(xì)胞效應(yīng)子功能。

磁體-輔助的細(xì)胞分離是一種廣泛使用的用于研究和治療應(yīng)用的系統(tǒng)。盡管與FACS^TM技術(shù)相比，所分離細(xì)胞的產(chǎn)量和純度是中等的，但選擇程序是穩(wěn)健的，不需要復(fù)雜的自動(dòng)化。磁體-輔助分離的主要缺點(diǎn)是所分離細(xì)胞上剩下的包括磁珠的染色試劑，其可能會(huì)損害所分離細(xì)胞群的效應(yīng)子功能。此外，非連續(xù)陽性選擇過程可能歸因于所分離細(xì)胞上的這些剩余磁性試劑。連續(xù)陽性選擇程序是選擇由一組標(biāo)記物定義的細(xì)胞群強(qiáng)制性的。

雖然仍然利用磁性或熒光標(biāo)記，分離細(xì)胞的一個(gè)顯著進(jìn)步是“技術(shù)”，其是例如國際專利申請WO 02/054065、美國專利7,776,562和美國專利8,299,782中所描述的，其中對位于細(xì)胞表面上的受體分子表現(xiàn)出低親和性結(jié)合的受體分子結(jié)合試劑用于可逆細(xì)胞染色和分離。與目前使用的單一陽性選擇結(jié)合磁性陰性選擇(目的是除了一個(gè)目標(biāo)，移除所有細(xì)胞群)相比，使用在每次選擇后移除低親和性受體結(jié)合試劑的技術(shù)的連續(xù)陽性選擇生成極高純度和產(chǎn)量的細(xì)胞群。

此外，國際專利申請WO 2013/124474描述了通過柱色譜法的靶細(xì)胞的色譜分離。在該方法中，通過如鏈霉親和素結(jié)合肽的親和標(biāo)簽，結(jié)合位于靶細(xì)胞表面上的受體分子的受體分子結(jié)合試劑(如Fab片段)被可逆地固定在固定色譜相上。對于這種固定，所述固定相包含與親和標(biāo)簽形成可逆鍵的親和試劑，例如，與作為受體分子結(jié)合試劑的一部分的鏈霉親和素結(jié)合肽可逆結(jié)合的鏈霉親和素突變蛋白。然后使含有靶細(xì)胞的樣品與固定相接觸，并通過結(jié)合到受體分子結(jié)合試劑將其可逆地固定于固定相上。然后通過加入競爭試劑從固定相中分離/洗脫靶細(xì)胞，所述競爭試劑也結(jié)合到親和試劑的結(jié)合位點(diǎn)，由此從固定相中替換受體分子結(jié)合試劑并因此也從固定相中釋放靶細(xì)胞。在美國專利6,022,951的實(shí)施例11中描述了使用單克隆完整抗體代替(單價(jià))抗體片段作為受體分子結(jié)合試劑的類似色譜純化。

然而，國際專利申請WO 2013/124474的方法可能具有若干限制。若將Fab片段固定在色譜柱(固定色譜相)上，然后將具有靶細(xì)胞的樣品施加至該色譜柱，則復(fù)合物形成的on-速率(Kon)，即Fab片段與受體分子的結(jié)合的on-速率(Kon)，會(huì)由于用于將樣品裝載至柱子上的流速而變?yōu)楣潭ò屑?xì)胞的限制。在這種情況下，并非所有靶細(xì)胞都能結(jié)合到色譜柱上。這將導(dǎo)致純化的靶細(xì)胞的低產(chǎn)量。另外，F(xiàn)ab片段在色譜柱上的固定的分布可能不均勻。當(dāng)將Fab片段裝載到柱子上時(shí)，F(xiàn)ab片段可主要結(jié)合在柱的頂部，導(dǎo)致在該柱的頂部上的密度過高，在柱的下部中的密度過低。這將導(dǎo)致復(fù)合物形成不足，并因此也影響分離的細(xì)胞的產(chǎn)量。此外，需要相對大量的Fab片段以便確保整個(gè)色譜樹脂均勻地覆蓋了Fab片段。為了避免Fab片段和靶細(xì)胞的受體分子之間的復(fù)合物形成的on-速率的速率限制問題，在國際專利申請WO 2013/124474的方法中可以首先將Fab片段與含有靶細(xì)胞的樣品一起溫育，并將該溫育混合物施加到色譜柱上。在這種情況下，F(xiàn)ab片段對受體分子的親和力將是限制性的；這種親和力可能不足夠高以在細(xì)胞表面上提供充足的Fab片段分子來確保靶細(xì)胞與固定相/色譜的有效結(jié)合。此外，由于流動(dòng)，靶細(xì)胞上的選擇的受體分子可能沒有機(jī)會(huì)形成親合結(jié)合到色譜樹脂上所必需的簇(可能不會(huì)達(dá)到Fab片段與受體分子的結(jié)合的平衡)。此外，對于每種類型的Fab片段和在靶細(xì)胞表面上的選擇的受體分子，在固定相上的固定程度可能不同。因此，純化效率將根據(jù)所考慮的靶細(xì)胞群而變化。

盡管-技術(shù)或國際專利申請WO 2013/124474中描述的方法通常工作良好，但是由于上文所討論的缺點(diǎn)，仍然需要一種方法，其例如允許對于所考慮的靶細(xì)胞的所有類型的純化方案標(biāo)準(zhǔn)化，即也不考慮由給定受體分子和其受體分子結(jié)合試劑組成的結(jié)合對所固有的結(jié)合特性的性質(zhì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本公開可以被認(rèn)為一般涉及用于細(xì)胞分離的固相技術(shù)或色譜技術(shù)。本文提供了用于分離在其表面上具有已知受體分子的所需生物實(shí)體如靶細(xì)胞的方法。本文公開的方法可包括將這樣的細(xì)胞與其表面上沒有這種受體的其他細(xì)胞分離。通常，相應(yīng)的方法提供了一種能夠分離復(fù)雜細(xì)胞群，例如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞或中央記憶性T細(xì)胞，從而用于研究、診斷和特別是治療目的的快速、有效和溫和的分離程序。當(dāng)要分離生物細(xì)胞或生物細(xì)胞群時(shí)，本文公開的方法允許獲得富集的、分離的和/或純化的靶細(xì)胞或靶細(xì)胞群，其基本上不含用于富集、分離和/或純化目的的試劑。

第一方面，本發(fā)明提供一種分離靶細(xì)胞的方法，其中所述靶細(xì)胞在所述靶細(xì)胞表面上具有受體分子，所述方法包括：

-使

i)受體分子結(jié)合試劑，所述受體分子結(jié)合試劑包含結(jié)合位點(diǎn)B和結(jié)合配偶體C，

其中包含在所述受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合位點(diǎn)B能夠特異性結(jié)合在所述靶細(xì)胞表面上的受體分子，且

其中包含在所述受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C能夠可逆地結(jié)合到在多聚化試劑上的結(jié)合位點(diǎn)Z，

ii)(可溶性)多聚化試劑，

其中所述多聚化試劑包含兩個(gè)或更多個(gè)能夠可逆地結(jié)合到包含在所述受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C的結(jié)合位點(diǎn)Z，

其中所述多聚化試劑進(jìn)一步包含配體結(jié)合配偶體LB，所述配體結(jié)合配偶體LB能夠特異性結(jié)合配體L，

和

iii)樣品，所述樣品包含所述靶細(xì)胞，

接觸，

由此允許所述受體分子結(jié)合試劑、所述多聚化試劑和所述靶細(xì)胞形成多價(jià)結(jié)合復(fù)合物，所述多價(jià)結(jié)合復(fù)合物包含結(jié)合到與所述多聚化試劑結(jié)合的兩個(gè)或更多個(gè)受體分子結(jié)合試劑的靶細(xì)胞，

-使所述靶細(xì)胞、受體分子結(jié)合試劑和多聚化試劑的多價(jià)結(jié)合復(fù)合物與固(solid)相接觸，所述固相包含配體L，

由此通過所述配體L與所述配體結(jié)合配偶體LB之間的結(jié)合允許所述靶細(xì)胞在所述固相上的可逆固定，其中經(jīng)至少包含在所述受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C與所述多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z之間的結(jié)合的破壞，所述靶細(xì)胞在所述固相上的固定是可逆的。

第二方面，本發(fā)明提供一種分離靶細(xì)胞的替代方法，其中所述靶細(xì)胞在所述靶細(xì)胞表面上具有受體分子，所述方法包括：

-使

i)受體分子結(jié)合試劑，

所述受體分子結(jié)合試劑包含結(jié)合位點(diǎn)B和結(jié)合配偶體C，

其中包含在所述受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合位點(diǎn)B能夠特異性結(jié)合在所述靶細(xì)胞表面上的受體分子，

其中包含在所述受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C能夠可逆地結(jié)合在多聚化試劑上的結(jié)合位點(diǎn)Z，且

其中所述受體分子結(jié)合試劑進(jìn)一步包含配體結(jié)合配偶體LB，所述配體結(jié)合配偶體LB能夠特異性結(jié)合配體L，

ii)(可溶性)多聚化試劑，

其中所述多聚化試劑包含兩個(gè)或更多個(gè)能夠可逆地結(jié)合包含在所述受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C的結(jié)合位點(diǎn)Z，

和

iii)樣品，所述樣品包含所述靶細(xì)胞，

接觸，

由此允許所述受體分子結(jié)合試劑、所述多聚化試劑和所述靶細(xì)胞形成多價(jià)結(jié)合復(fù)合物，所述多價(jià)結(jié)合復(fù)合物包含結(jié)合到與所述多聚化試劑結(jié)合的兩個(gè)或更多個(gè)受體分子結(jié)合試劑的靶細(xì)胞，

-使所述靶細(xì)胞、受體分子結(jié)合試劑和多聚化試劑的多價(jià)結(jié)合復(fù)合物與固相接觸，所述固相包含配體L，

由此通過所述配體L與所述配體結(jié)合配偶體LB之間的結(jié)合允許所述靶細(xì)胞在所述固相上的可逆固定，其中經(jīng)

a)包含在所述受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C與所述多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z之間的結(jié)合，和/或

b)所述固相的配體L與包含在所述受體分子結(jié)合試劑中的配體結(jié)合配偶體LB之間的結(jié)合，

的破壞，所述靶細(xì)胞在所述固相上的固定是可逆的。

如上所述，在第一或第二方面的方法的一些實(shí)施方案中，所述受體分子結(jié)合試劑、所述可溶性多聚化試劑和所述含有靶細(xì)胞的樣品在同一時(shí)間一起溫育。在其它實(shí)施方案中，所述受體分子結(jié)合試劑與所述多聚化試劑互相接觸以形成包含兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合到多聚化試劑的受體分子結(jié)合試劑的復(fù)合物，然后使該復(fù)合物與所述靶細(xì)胞接觸(一起溫育)。

在第一或第二方面的方法中，所述受體分子結(jié)合試劑與所述受體分子之間的結(jié)合的解離常數(shù)(K_d)可是低親和性的，其含義是所述受體分子結(jié)合試劑與所述受體分子之間的結(jié)合的解離常數(shù)(K_d)可在約10^-2至約10^-7M的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，所述受體分子結(jié)合試劑與所述受體分子之間的結(jié)合可是高親和性的，其含義是所述受體分子結(jié)合試劑與所述受體分子之間的結(jié)合的解離常數(shù)(K_d)可在約10^-7至約10^-10M的范圍內(nèi)。

在一些實(shí)施方案中，第一或第二方面的方法可進(jìn)一步包括使固定相與競爭試劑接觸。這種競爭試劑能夠破壞所述結(jié)合配偶體C與所述結(jié)合位點(diǎn)Z之間的結(jié)合。通過使所述固定相與這種競爭試劑接觸，靶細(xì)胞從所述固定相中洗脫。

第三方面，本發(fā)明提供一種將靶細(xì)胞固定在固相上的方法，其中所述靶細(xì)胞在所述靶細(xì)胞表面上具有受體分子。所述方法包括：

-使

(i)受體分子結(jié)合試劑，所述受體分子結(jié)合試劑包含結(jié)合位點(diǎn)B和結(jié)合配偶體C，

其中包含在所述受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合位點(diǎn)B能夠特異性結(jié)合在所述靶細(xì)胞表面上的受體分子，且

其中包含在所述受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C能夠可逆地結(jié)合在多聚化試劑上的結(jié)合位點(diǎn)Z，

ii)(可溶性)多聚化試劑，

其中所述多聚化試劑包含兩個(gè)或更多個(gè)能夠可逆地結(jié)合包含在所述受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C的結(jié)合位點(diǎn)Z，

其中所述多聚化試劑進(jìn)一步包含配體結(jié)合配偶體LB，所述配體結(jié)合配偶體LB能夠特異性結(jié)合配體L，

和

iii)樣品，所述樣品包含所述靶細(xì)胞，

接觸，

由此允許所述受體分子結(jié)合試劑、所述多聚化試劑和所述靶細(xì)胞形成多價(jià)結(jié)合復(fù)合物，所述多價(jià)結(jié)合復(fù)合物包含結(jié)合到與所述多聚化試劑結(jié)合的兩個(gè)或更多個(gè)受體分子結(jié)合試劑的靶細(xì)胞，

-使所述靶細(xì)胞、受體分子結(jié)合試劑和多聚化試劑的多價(jià)結(jié)合復(fù)合物與固相接觸，所述固相包含配體L，

由此通過所述配體L與所述配體結(jié)合配偶體LB的結(jié)合允許所述靶細(xì)胞在所述固相上的可逆固定，其中經(jīng)至少包含在所述受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C與所述多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z之間的結(jié)合的破壞，所述靶細(xì)胞在所述固相上的固定是可逆的。

第四方面，本發(fā)明提供一種將靶細(xì)胞固定在固相上的替代方法，其中所述靶細(xì)胞在所述靶細(xì)胞表面上具有受體分子。所述方法包括：

-使

i)受體分子結(jié)合試劑，所述受體分子結(jié)合試劑包含結(jié)合位點(diǎn)B和結(jié)合配偶體C，

其中包含在所述受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合位點(diǎn)B能夠特異性結(jié)合在所述靶細(xì)胞表面上的受體分子，

其中包含在所述受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C能夠可逆地結(jié)合在多聚化試劑上的結(jié)合位點(diǎn)Z，且

其中所述受體分子結(jié)合試劑進(jìn)一步包含配體結(jié)合配偶體LB，所述配體結(jié)合配偶體LB能夠特異性結(jié)合配體L，

ii)(可溶性)多聚化試劑，

其中所述多聚化試劑包含兩個(gè)或更多個(gè)能夠可逆地結(jié)合包含在所述受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C的結(jié)合位點(diǎn)Z，和

iii)樣品，所述樣品包含所述靶細(xì)胞，

接觸，

由此允許所述受體分子結(jié)合試劑、所述多聚化試劑和所述靶細(xì)胞形成多價(jià)結(jié)合復(fù)合物，所述多價(jià)結(jié)合復(fù)合物包含結(jié)合到與所述多聚化試劑結(jié)合的兩個(gè)或更多個(gè)受體分子結(jié)合試劑的靶細(xì)胞，

-使所述靶細(xì)胞、受體分子結(jié)合試劑和多聚化試劑的多價(jià)結(jié)合復(fù)合物與固相接觸，所述固相包含配體L，

由此通過所述配體L與所述配體結(jié)合配偶體LB的結(jié)合允許所述靶細(xì)胞在所述固相上的可逆固定，其中經(jīng)

a)包含在所述受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C與所述多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z之間的結(jié)合，和/或

b)所述固相的配體L與包含在所述受體分子結(jié)合試劑中的配體結(jié)合配偶體LB之間的結(jié)合，

的破壞，所述靶細(xì)胞在所述固相上的固定是可逆的。

第五方面，本發(fā)明提供一種用于從樣品中分離靶細(xì)胞的裝置。所述裝置包括：

-包含配體L的固相，其中所述配體L能夠特異性地結(jié)合配體結(jié)合配偶體LB，所述配體結(jié)合配偶體LB存在于用于分離靶細(xì)胞的受體分子結(jié)合試劑或(可溶性)多聚化試劑中，所述配體L由此允許所述靶細(xì)胞在所述固相上的可逆固定，

-以下中的至少一個(gè)

a)第一固定相，其中所述第一固定相適用于細(xì)胞分離，所述第一固定相是凝膠過濾基質(zhì)和/或親和色譜基質(zhì)，其中所述基質(zhì)包含親和試劑，所述親和試劑具有特異性結(jié)合包含在所述受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C的結(jié)合位點(diǎn)Z，由此允許所述受體分子結(jié)合試劑在所述第一固定相上的固定和所述受體分子結(jié)合試劑從包含所述靶細(xì)胞的洗脫液中的移除，

或

b)第二固定相，其中所述第二固定相包含配體L，其中所述配體L能夠特異性結(jié)合存在于用于分離靶細(xì)胞的受體分子結(jié)合試劑或多聚化試劑中的配體結(jié)合配偶體LB，所述配體L由此允許所述受體分子結(jié)合試劑或所述多聚化試劑在所述第二固定相上的固定和所述受體分子結(jié)合試劑或所述多聚化試劑從包含所述靶細(xì)胞的洗脫液中的移除。

第六方面，本發(fā)明提供一種用于從樣品中分離靶細(xì)胞的設(shè)備。這種設(shè)備包括根據(jù)第五方面的用于從樣品中分離靶細(xì)胞的裝置。

第七方面，本發(fā)明提供包含配體L的固相的用途，其中所述配體L能夠特異性結(jié)合配體結(jié)合配偶體LB，用于靶細(xì)胞的可逆固定或分離。所述配體可以是生物素或生物素衍生物。合適的生物素衍生物的實(shí)例包括、但不限于脫硫生物素、亞氨基生物素、2-(4'-羥基偶氮苯)苯甲酸(HABA)或鏈霉親和素結(jié)合肽。本第七方面包括包含配體L的固相在根據(jù)本發(fā)明的第一或第二方面用于分離靶細(xì)胞的方法或根據(jù)第三或第四方面用于固定靶細(xì)胞的方法中的用途，其中所述配體L能夠特異性結(jié)合配體結(jié)合配偶體LB。

附圖簡述

附圖示出了本文所示的細(xì)胞分離的實(shí)施方案。不受理論約束，附圖包括關(guān)于潛在的分離機(jī)制的結(jié)論。給出的結(jié)論僅為說明之用，僅僅服務(wù)于允許可實(shí)現(xiàn)的分離如何在分子水平上設(shè)想的可視化。

圖1描述一個(gè)分離靶細(xì)胞(3)的方法的實(shí)施方案，靶細(xì)胞(3)在靶細(xì)胞表面上具有受體分子(4)。靶細(xì)胞可以由存在至少一個(gè)特定特異性受體分子(4)定義。提供一種受體分子結(jié)合試劑(1)。所述受體分子結(jié)合試劑(1)具有結(jié)合位點(diǎn)(B)，其可特異性結(jié)合受體分子(4)。受體分子結(jié)合試劑(1)可以是如Fab片段的(單價(jià))抗體片段，其含義是所述結(jié)合位點(diǎn)(B)可以是抗原結(jié)合位點(diǎn)。如本文所定義的，受體分子結(jié)合試劑(的結(jié)合位點(diǎn)B)與受體分子之間的結(jié)合的解離常數(shù)(K_d)可以是低親和性的。受體分子結(jié)合試劑(1)還包含結(jié)合配偶體(C)，其能夠可逆地結(jié)合多聚化試劑(2)的結(jié)合位點(diǎn)(Z)。所述結(jié)合配偶體(C)可以是，例如親和標(biāo)簽或肽，如鏈霉親和素結(jié)合肽。更詳細(xì)地，所述結(jié)合配偶體(C)可以是，例如鏈霉親和素-結(jié)合肽，如例如美國專利5,506,121中描述的肽Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:3，也稱為)，或國際專利申請WO 02/077018或美國專利7,981,632中描述的具有順序設(shè)置的兩個(gè)或更多個(gè)單個(gè)結(jié)合模塊的鏈霉親和素結(jié)合肽。這種順序設(shè)置的說明性實(shí)例是序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₂-Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:13，也以其商標(biāo)名已知)。所述結(jié)合配偶體(C)可融合或綴合至受體分子結(jié)合試劑。若所述受體分子結(jié)合試劑(1)是Fab片段，所述結(jié)合配偶體C可融合至該抗體片段的重鏈或輕鏈的C-末端。

可溶性多聚化試劑(2)含有多個(gè)能夠可逆地結(jié)合結(jié)合配偶體(C)的結(jié)合位點(diǎn)Z。通過結(jié)合配偶體(C)，受體結(jié)合試劑(1)結(jié)合多聚化試劑(2)上的結(jié)合位點(diǎn)(Z)。當(dāng)多聚化試劑(2)與多個(gè)受體結(jié)合試劑(1)互相結(jié)合時(shí)，它們相對于受體分子結(jié)合試劑的結(jié)合位點(diǎn)(B)形成多價(jià)結(jié)合復(fù)合物。例如，如在國際專利申請WO 02/054065或美國專利7,776,562中所描述的，與單獨(dú)的(單價(jià))受體分子結(jié)合試劑的結(jié)合相比，這種多價(jià)結(jié)合復(fù)合物因此提供親合效果，由此允許使用如此低親和力的、不能以單一形式穩(wěn)定結(jié)合靶細(xì)胞但能從受體分子上快速解離的單價(jià)受體分子結(jié)合試劑。稍后(參見下文)，包含在這種多價(jià)復(fù)合物中的多聚化的受體分子結(jié)合試劑(1)可結(jié)合到靶細(xì)胞(3)。當(dāng)將鏈霉親和素結(jié)合肽用作結(jié)合配偶體(C)時(shí)，多聚化試劑(2)可以是鏈霉親和素肽(＝結(jié)合配偶體C1)通過在圖1中示意性示出的其(生物素)結(jié)合位點(diǎn)Z可逆地結(jié)合的任何鏈霉親和素突變蛋白。這種多聚化試劑可以是在野生型鏈霉親和素的序列位置44至47處包含氨基酸序列Va1⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷(SEQ ID NO:19)的鏈霉親和素突變蛋白(類似物)，或在野生型鏈霉親和素的序列位置44至47處包含氨基酸序列l(wèi)le⁴⁴-Gly⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷(SEQ ID NO:20)的鏈霉親和素突變蛋白(類似物)。這種突變蛋白描述在例如美國專利6,103,493中，并且以商標(biāo)以突變蛋白“m1”和突變蛋白“m2”的形式從IBA GmbH,哥廷根,德國商購獲得。

多聚化試劑(2)還包含能夠特異性結(jié)合配體(L)的配體結(jié)合配偶體(LB)。在圖1所示的實(shí)例中，所述配體結(jié)合配偶體(LB)可以是例如六-組氨酸標(biāo)簽或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶。在這種情況下，鏈霉親和素突變蛋白(單體)可以重組產(chǎn)生為具有六-組氨酸標(biāo)簽或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶作為融合配偶體的融合蛋白。

在圖1的方法中，之后，使包含靶細(xì)胞(3)的樣品與多價(jià)結(jié)合復(fù)合物接觸，從而靶細(xì)胞(3)結(jié)合到該多價(jià)結(jié)合復(fù)合物。提供色譜基質(zhì)(5)作為固相(固定相)。所述色譜基質(zhì)(5)含有配體結(jié)合配偶體(LB)所結(jié)合的配體(L)，由此將作為靶細(xì)胞/多價(jià)結(jié)合復(fù)合物一部分的靶細(xì)胞固定在固定相(5)上。在圖1的實(shí)例中，配體L可以是例如螯合基團(tuán)，所述螯合基團(tuán)其上復(fù)合有過渡金屬并且能夠結(jié)合如六-組氨酸標(biāo)簽的低聚組氨酸肽。固相或固定相(5)可以是如樹脂(Westburg,Leusden,The Netherlands)的固定金屬親和色譜(IMAC)樹脂?？蛇x地，若將谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶用作配體結(jié)合配偶體LB，則配體L可以是谷胱甘肽。在這種情況下，固相(5)可以是與谷胱甘肽偶聯(lián)的瓊脂糖凝膠(sepharose)基質(zhì)。

配體結(jié)合配偶體(LB)結(jié)合到配體L的結(jié)果是：靶細(xì)胞(3)被固定在固相上，且樣品正在消耗靶細(xì)胞(3)。因此，靶細(xì)胞(3)與樣品中的其它組分分離。如果需要，之后可以用合適的洗滌緩沖液(圖1未示出)洗滌固相。然后，使競爭試劑(6)與固定相(5)接觸。所述競爭試劑(6)可特異性結(jié)合配體(L)并破壞配體(L)與配體結(jié)合配偶體(LB)之間的結(jié)合。此外，破壞受體分子結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體(C)與多聚化試劑(2)的結(jié)合位點(diǎn)(Z)之間的結(jié)合。這可以例如通過結(jié)合多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)(Z)的競爭試劑(12)實(shí)現(xiàn)，由此從多聚化試劑(2)的結(jié)合位點(diǎn)(Z)替換受體分子結(jié)合試劑(2)的結(jié)合配偶體C。由于在該實(shí)例中采用了低親和性的受體分子結(jié)合試劑(1)，因此受體分子結(jié)合試劑(1)從受體分子(4)(圖1未示出)中解離。結(jié)果，靶細(xì)胞(3)從不含用于分離的任何試劑的固定相(5)中釋放。在配體L是其上復(fù)合有過渡金屬的螯合基團(tuán)且配體結(jié)合配偶體LB是低聚組氨酸標(biāo)簽的實(shí)例中，配體L與配體結(jié)合配偶體LB之間的結(jié)合可被如EDTA或EGTA的金屬螯合劑破壞。這一實(shí)例表明，競爭試劑本身無需是競爭劑，而可以是能夠破壞配體結(jié)合配偶體LB與配體L之間或結(jié)合配偶體C與多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z之間形成的鍵的任何化合物。在圖1的這一實(shí)例中，其中多聚化試劑(2)是鏈霉親和素突變蛋白，結(jié)合配偶體C是鏈霉親和素結(jié)合肽，相應(yīng)的競爭試劑(12)可以是與鏈霉親和素的生物素結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的任何化合物，例如，游離鏈霉親和素結(jié)合肽或生物素或生物素衍生物，如亞氨基生物素或脫硫生物素。同樣，競爭試劑還可以是pH變化，因?yàn)殒溍褂H和素結(jié)合肽與鏈霉親和素的結(jié)合可以被如pH 4的低pH破壞。此外，此處還注意到，對于如圖1所示的固定在固體支持物上的靶細(xì)胞(3)的洗脫/分離，無需破壞配體結(jié)合配偶體LB與配體L之間的鍵。相反，為了使靶細(xì)胞從固體支持物中釋放，破壞受體分子結(jié)合試劑(1)的結(jié)合配偶體C與多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z的結(jié)合即可。在此處上下文中注意到，由此配體結(jié)合配偶體LB與配體L之間形成的鍵甚至不必是可逆的，其也可以是不可逆的并且僅為與靶細(xì)胞(3)通過受體分子結(jié)合試劑(1)的結(jié)合配偶體C與多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z之間形成的可逆鍵結(jié)合的多聚化試劑(2)的固定服務(wù)。然而，如果在配體結(jié)合配偶體LB與配體L之間形成的鍵也是可逆的，則這可能是有利的，因?yàn)檫@允許固相的再生。在此處上下文中，還注意到配體結(jié)合配偶體LB還可包含在受體分子結(jié)合試劑(1)中，而不是包含在多聚化試劑(2)中。在圖1的這一說明性實(shí)例中，其中多聚化試劑是鏈霉親和素突變蛋白，配體L是螯合基團(tuán)，所述螯合基團(tuán)其上復(fù)合有過渡金屬并且能夠結(jié)合低聚組氨酸肽，受體分子結(jié)合試劑可以是抗體片段，如Fab片段，其在其兩條多肽鏈之一(例如，重鏈)的C-末端攜帶作為結(jié)合配偶體C的鏈霉親和素結(jié)合肽(參見上文)和在另一多肽鏈(例如，輕鏈)的C-末端攜帶作為配體結(jié)合LB的六組氨酸標(biāo)簽。為了確保六組氨酸標(biāo)簽是空間可接近的，F(xiàn)ab片段的輕鏈可以在恒定結(jié)構(gòu)域的C-末端與六組氨酸標(biāo)簽之間具有人工連接子作為“擴(kuò)鏈劑”。在此上下文中還注意到，可以通過加入含有生物素和EDTA作為競爭試劑的緩沖液，同時(shí)方便地實(shí)現(xiàn)兩種鍵，即多聚化試劑(2)與受體分子結(jié)合試劑(1)的結(jié)合配偶體C之間的鍵和固相的配體L與多聚化試劑的配體結(jié)合配偶體LB之間的鍵的破壞。生物素將從多聚化試劑中替換結(jié)合配偶體C(鏈霉親和素結(jié)合肽)，作為金屬螯合劑的EDTA將與介導(dǎo)六組氨酸標(biāo)簽與配體L結(jié)合的金屬離子復(fù)合，由此釋放六組氨酸標(biāo)簽并因此從固相中釋放受體分子結(jié)合試劑。

圖2描述一種分離靶細(xì)胞(3)的方法的另一實(shí)施方案，所述靶細(xì)胞(3)在靶細(xì)胞表面上具有受體分子(4)。提供一種受體分子結(jié)合試劑(1)，所述受體分子結(jié)合試劑(1)具有能夠特異性結(jié)合受體分子(4)的結(jié)合位點(diǎn)(B)。受體分子結(jié)合試劑(1)還包含結(jié)合配偶體(C)，其能夠可逆地結(jié)合可溶性多聚化試劑(2)的結(jié)合位點(diǎn)(Z)。多聚化試劑(2)具有多個(gè)特異性結(jié)合包含在受體結(jié)合試劑(1)中的結(jié)合配偶體(C)的結(jié)合位點(diǎn)Z。形成能夠結(jié)合靶細(xì)胞(3)的多價(jià)結(jié)合復(fù)合物。多聚化試劑(2)的結(jié)合位點(diǎn)(Z)還定義配體結(jié)合配偶體(LB)，其能夠結(jié)合包含在固相中的配體(L)。因此，在圖2的實(shí)例中，配體結(jié)合配偶體LB與結(jié)合位點(diǎn)Z相同。使具有靶細(xì)胞(3)的樣品與多價(jià)結(jié)合復(fù)合物接觸，從而靶細(xì)胞(3)結(jié)合至該結(jié)合復(fù)合物。提供一種固相(5)，如用于色譜法的固定相或珠子，其含有能夠結(jié)合結(jié)合位點(diǎn)(Z)的配體(L)，所述結(jié)合位點(diǎn)(Z)還定義配體結(jié)合配偶體(LB)。結(jié)果，多聚化試劑(2)上的游離結(jié)合位點(diǎn)(Z)結(jié)合到配體(L)，由此將作為靶細(xì)胞/多價(jià)結(jié)合復(fù)合物的一部分的靶細(xì)胞固定在固定相(5)上。由此樣品正在消耗靶細(xì)胞(3)且靶細(xì)胞(3)與樣品中的其它組分相分離。

在圖2所示的本發(fā)明的方法的實(shí)例中，受體分子結(jié)合試劑(1)可以再次是顯示其結(jié)合位點(diǎn)(B)與受體分子(4)的低親和力結(jié)合的抗體片段，如Fab片段。受體分子結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體C可以是鏈霉親和素結(jié)合肽。例如，結(jié)合配偶體C可以是由Junttila等，Proteomics 5(2005),1199-1203或美國專利7,981,632描述的序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:3，)、序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₃-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:11，也稱為“di-tag3”)或序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₂-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:12，也稱為“the di-tag2”)的鏈霉親和素結(jié)合肽。這種結(jié)合細(xì)胞表面受體如CD3、CD4、CD8(T細(xì)胞標(biāo)記物)、CD8、CD62L、CD45RA(記憶T細(xì)胞的標(biāo)記物)、CD4、CD25、CD45RA(調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的標(biāo)記物)、CD56(天然殺傷細(xì)胞的標(biāo)記物)、CD19(B細(xì)胞標(biāo)記物)和CD34(干細(xì)胞標(biāo)記物)的重組Fab片段，例如可作為試劑從IBA GmbH(哥廷根，德國)商購獲得，并因此可用作受體結(jié)合分子，用于采用本發(fā)明的方法分離相應(yīng)細(xì)胞。此處提及的所有鏈霉親和素結(jié)合肽都結(jié)合相同的結(jié)合位點(diǎn)，即鏈霉親和素的生物素結(jié)合位點(diǎn)。若采用一個(gè)或多個(gè)這種鏈霉親和素結(jié)合肽作為結(jié)合配偶體C，則多聚化試劑(2)是鏈霉親和素突變蛋白，如在野生型鏈霉親和素的序列位置44至47處包含氨基酸序列Va1⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷(SEQ ID NO:19)的鏈霉親和素突變蛋白“m1”，或在野生型鏈霉親和素的序列位置44至47處包含氨基酸序列l(wèi)le⁴⁴-Gly⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷(SEQ ID NO:20)的鏈霉親和素突變蛋白(類似物)“m2”。通常，使用可溶性多聚化試劑(2)。在鏈霉親和素突變蛋白的情況下，該可溶性多聚化試劑可以是，例如，鏈霉親和素或抗生物素蛋白或者鏈霉親和素或抗生物素蛋白的任何突變蛋白(類似物)的低聚體或聚合物。這種多聚化試劑，例如可從IBAGmbH,哥廷根,德國作為“Strep-Tactin PE for Fab Streptamers”(產(chǎn)品編號(hào)6-5001-010或6-5011-010)商購獲得。所述低聚體可包含鏈霉親和素、抗生物素蛋白或其突變蛋白的三個(gè)或更多個(gè)四聚體。所述低聚體或聚合物可通過多糖交聯(lián)。在第一步中，可基本上按照"Noguchi,A.,Takahashi,T.,Yamaguchi,T.,Kitamura,K.,Takakura,Y.,Hashida,M.&Sezaki,H.(1992)Preparation and properties of the immunoconjugate composed of anti-human colon cancer monoclonal antibody and mitomycin C dextran conjugate.Bioconjugate Chemistry 3,132-137"中描述的通過將羧基殘基引入多糖如葡萄糖，制備這種鏈霉親和素或抗生物素蛋白或者鏈霉親和素或抗生物素蛋白的突變蛋白的低聚體或聚合物。在第二步中，采用常規(guī)碳二亞胺化學(xué)，通過內(nèi)部賴氨酸殘基的伯氨基和/或游離N-末端至葡聚糖骨架中的羧基使鏈霉親和素或抗生物素蛋白或其突變蛋白偶聯(lián)?？蛇x地，還可通過雙功能連接子如戊二醛經(jīng)由交聯(lián)或通過文獻(xiàn)中描述的其它方法獲得合適的鏈霉親和素或抗生物素蛋白或者鏈霉親和素或抗生物素蛋白的任何突變蛋白的交聯(lián)低聚體或聚合物。還可以通過“點(diǎn)擊化學(xué)”，如通過疊氮化物與末端炔基之間的1,3-偶極環(huán)加成來獲得鏈霉親和素的低聚體或聚合物。基于這一目的，可以通過市售試劑，如疊氮化物琥珀酰亞胺酯(從Life Technologies獲得，產(chǎn)品編號(hào)A10280)和炔琥珀酰亞胺酯(從Life Technologies獲得，產(chǎn)品編號(hào)A10279)，分別將疊氮化物和炔基引入鏈霉親和素或鏈霉親和素突變蛋白。然后，將攜帶疊氮基的鏈霉親和素或鏈霉親和素突變蛋白與通常攜帶炔基的鏈霉親和素或鏈霉親和素突變蛋白的化學(xué)計(jì)量摩爾量反應(yīng)以產(chǎn)生低聚體(即具有3個(gè)或更多個(gè)單獨(dú)的鏈霉親和素四聚體)或聚合多聚化試劑。

在圖2的實(shí)例中，固相的配體L可以是例如共價(jià)連接到所述固相的生物素。固相的生物素結(jié)合多聚化試劑(2)的游離結(jié)合位點(diǎn)(Z)，由此將作為靶細(xì)胞/多價(jià)結(jié)合復(fù)合物一部分的靶細(xì)胞固定在固定相(5)上。這種固相可以是，例如，可從Affiland S.A.(Ans-Liege,Belgium)獲得的(d)-生物素瓊脂糖凝膠^TM、可從IBAGmbH,哥廷根,德國獲得的生物素-瓊脂糖，或使用本文在實(shí)驗(yàn)部分中描述的實(shí)驗(yàn)方案獲得的具有共價(jià)結(jié)合的生物素的瓊脂糖。在這一實(shí)例中，固相的配體L可選地可以是生物素衍生物，如脫硫生物素、亞氨基生物素、2-(4'-羥基偶氮苯)苯甲酸(HABA)或鏈霉親和素結(jié)合肽。

之后使固定相(5)與競爭試劑(7)接觸。競爭試劑(7)本身可以能夠(作為整體)結(jié)合到多聚化試劑(2)的結(jié)合位點(diǎn)(Z)。可選地，競爭試劑(7)可具有結(jié)合受體分子結(jié)合試劑(1)的結(jié)合位點(diǎn)(C)的結(jié)合位點(diǎn)(8)。通過競爭試劑(7)與多聚化試劑(2)的競爭結(jié)合，該競爭試劑，例如通過替換，破壞受體分子結(jié)合試劑(1)的結(jié)合位點(diǎn)C與多聚化試劑(2)的結(jié)合位點(diǎn)(Z)之間的結(jié)合。如上所述，固相的配體L還結(jié)合多聚化試劑(2)的結(jié)合位點(diǎn)(Z)。因此，競爭試劑還從多聚化試劑(2)中替換結(jié)合的配體L。通過這樣做，多聚化試劑(2)從固相(5)中釋放。由于靶細(xì)胞(3)與多聚化的受體分子結(jié)合試劑(1)結(jié)合，因此靶細(xì)胞(3)也從固相(固定相)(5)中釋放，并且真正例如從固定相(5)為色譜基質(zhì)的柱子中洗脫。在圖2的這一實(shí)例中，競爭試劑(7)可以是生物素，其“作為整體”結(jié)合多聚化試劑(2)的結(jié)合位點(diǎn)(Z)。因此，游離的生物素將在多聚化試劑(2)中(競爭地)替換共價(jià)偶聯(lián)至固相(5)并充當(dāng)配體L的生物素，以及充當(dāng)受體分子結(jié)合試劑且攜帶鏈霉親和素結(jié)合肽的Fab片段。因此，若固相(5)是色譜材料，在使固定的靶細(xì)胞(3)與游離生物素接觸之后，所得到的洗脫液包含分離的靶細(xì)胞(3)、游離受體分子結(jié)合試劑(1)、(可溶性)鏈霉親和素多聚化試劑(2)以及游離生物素。因此，分離混合物包含與國際專利申請WO 2013/124474中描述的“選擇濾筒(selectioncartridge)”的洗脫液相同的試劑。這就意味著，若固相(5)是用于色譜法的固定相(5)，則本發(fā)明的方法可以替代國際專利申請WO 2013/124474的“選擇濾筒”上所實(shí)施的分離靶細(xì)胞的方法。因此，本發(fā)明的方法，當(dāng)在柱色譜法中實(shí)施時(shí)，可以替代國際專利申請WO 2013/124474的“選擇濾筒”。此外，可以通過國際專利申請WO2013/124474中描述的“去除濾筒(removal cartridge)”來移除這種色譜柱的洗脫液的試劑。在此處上下文中，注意到如生物素-瓊脂糖凝膠^TM的固相可以無菌形式獲得。因此，采用含有濾筒的無菌生物素-瓊脂糖凝膠^TM，可在GMP條件下，用于細(xì)胞分離的自動(dòng)、封閉系統(tǒng)中簡單地實(shí)施本發(fā)明的方法。因此，本發(fā)明提供一種簡單且優(yōu)雅的手段來獲得目標(biāo)靶細(xì)胞，例如用于基于細(xì)胞的療法的T細(xì)胞或B細(xì)胞。在此上下文中，還注意到本發(fā)明提供另外的優(yōu)點(diǎn)，即可將相同的(標(biāo)準(zhǔn)化的)多聚化試劑用于任何所需細(xì)胞類型的分離。由于多聚化試劑可以與相同的固相(例如生物素-瓊脂糖凝膠^TM)一起使用，因此可以總是使用相同的多聚化試劑，如低聚鏈霉親和素突變蛋白，其提供a)足夠的游離結(jié)合位點(diǎn)Z用于固相上的固定，和b)相同的限定(過量)數(shù)目的游離結(jié)合位點(diǎn)Z，用于受體分子結(jié)合試劑的多價(jià)復(fù)合物的形成。因此，本發(fā)明允許確保：無論何種用于分離特定細(xì)胞類型的特異性受體分子結(jié)合試劑，都能提供足夠數(shù)量的結(jié)合位點(diǎn)Z用于多價(jià)結(jié)合復(fù)合物的形成。此外，本發(fā)明的方法的進(jìn)一步優(yōu)點(diǎn)是，在將細(xì)胞固定在固相上之前，將靶細(xì)胞與多聚化試劑和受體分子結(jié)合試劑一起溫育。這種用于形成含有結(jié)合細(xì)胞的多價(jià)復(fù)合物的溫育可以a)在限定的小體積中進(jìn)行，由此增加形成的復(fù)合物的濃度，和b)在限定的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，同樣與待分離的細(xì)胞類型無關(guān)。因此，本發(fā)明提供了標(biāo)準(zhǔn)化靶細(xì)胞分離的可能性，而與靶細(xì)胞的性質(zhì)無關(guān)。

圖3顯示一個(gè)分開/分離靶細(xì)胞的方法的實(shí)施方案，其中受體分子結(jié)合試劑(1)由兩種或更多種試劑或亞單位形成。銜接子試劑(9)與受體分子結(jié)合預(yù)試劑(100)互相接觸。該受體分子結(jié)合預(yù)試劑(100)具有針對包含在銜接子試劑(9)中的結(jié)合部分(10)的結(jié)合位點(diǎn)(11)。通過結(jié)合位點(diǎn)(11)和結(jié)合部分(10)，銜接子試劑(9)與受體結(jié)合預(yù)試劑(100)互相結(jié)合。由此形成的受體結(jié)合試劑(1)具有可已經(jīng)包含在受體結(jié)合預(yù)試劑(100)中的結(jié)合位點(diǎn)(B)。受體結(jié)合試劑(1)還包括可以特異性且可逆地結(jié)合多聚化試劑(2)的結(jié)合位點(diǎn)(Z)的結(jié)合配偶體(C)。所述結(jié)合配偶體(C)可已經(jīng)包含在銜接子試劑(9)中。然后如圖1所示實(shí)施該方法。可加入含有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(Z)的多聚化試劑(2)，其能夠結(jié)合結(jié)合配偶體(C)。該多聚化試劑(2)還包含能夠特異性結(jié)合配體(L)的配體結(jié)合配偶體(LB)。通過結(jié)合配偶體(C)，受體分子結(jié)合試劑(1)結(jié)合多聚化試劑(2)上的結(jié)合位點(diǎn)(Z)。形成能夠結(jié)合靶細(xì)胞(3)的多價(jià)結(jié)合復(fù)合物。若使含有靶細(xì)胞(3)的樣品與多價(jià)結(jié)合復(fù)合物接觸，則靶細(xì)胞(3)結(jié)合多價(jià)結(jié)合復(fù)合物。提供一種固定相(5)，其含有配體結(jié)合配偶體(LB)結(jié)合的配體(L)。結(jié)果，靶細(xì)胞/多價(jià)結(jié)合復(fù)合物被固定在所述固定相(5)上。加入一種特異性結(jié)合配體(L)的競爭試劑(6)。由此破壞配體(L)與配體結(jié)合配偶體(LB)之間的結(jié)合且靶細(xì)胞/多價(jià)結(jié)合復(fù)合物從固定相(5)中釋放。

圖4進(jìn)一步說明了分開/分離靶細(xì)胞的方法的實(shí)施方案，其中受體分子結(jié)合試劑是例如在圖2的實(shí)例中提到的攜帶鏈霉親和素結(jié)合肽的Fab片段(111)。Fab分子結(jié)合靶細(xì)胞表面上的受體分子，例如，如存在于T細(xì)胞上的CD3或CD8的細(xì)胞表面受體。多聚化試劑是多聚的鏈霉親和素突變蛋白(12)，如在野生型鏈霉親和素的序列位置44至47處包含氨基酸序列Va1⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷(SEQ ID NO:19)的鏈霉親和素突變蛋白“m1”的低聚體，或在野生型鏈霉親和素的序列位置44至47處包含氨基酸序列l(wèi)le⁴⁴-Gly⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷(SEQ ID NO:20)的鏈霉親和素突變蛋白“m2”的低聚體?？梢酝ㄟ^化學(xué)偶聯(lián)多個(gè)鏈霉親和素突變蛋白的分子來形成這種低聚體。這種多聚鏈霉親和素突變蛋白(12)包含多個(gè)針對Fab-片段(111)的鏈霉親和素結(jié)合肽的結(jié)合位點(diǎn)Z。所述多聚鏈霉親和素突變蛋白(12)還包含6x His-標(biāo)簽，其能結(jié)合金屬親和基質(zhì)，如Ni瓊脂糖凝膠^TM、NTA-瓊脂糖、His60Ni、HisPur樹脂或TALON樹脂，僅提及少數(shù)市售固相。若使攜帶鏈霉親和素結(jié)合肽的Fab片段(111)、多聚鏈霉親和素突變蛋白(12)與其靶細(xì)胞表面上具有受體分子的靶細(xì)胞接觸，則形成靶細(xì)胞/多價(jià)結(jié)合復(fù)合物。若該靶細(xì)胞/多價(jià)結(jié)合復(fù)合物與包含固定金屬離子的固定相接觸，則該復(fù)合物、并由此所述靶細(xì)胞被固定在固定相上。之后，可通過加入例如生物素和EDTA或咪唑來洗脫靶細(xì)胞。

圖5描述了允許能夠結(jié)合低聚組氨酸標(biāo)簽的多聚化試劑的裝配的合適部分。示于圖5A至圖5D的部分來自Schmidt,J.等，J.Biol.Chem.[2011]286,48,41723-41735)。這些化合物包含生物素和多個(gè)能夠結(jié)合低聚組氨酸標(biāo)簽的次氮基三乙酸(NTA)部分。通過使任意這些試劑與鏈霉親和素反應(yīng)來獲得多聚化劑。由于鏈霉親和素是同源四聚體，因此其提供四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)用于生物素，而生物素不可逆地結(jié)合于鏈霉親和素，這些生物素化的化合物的反應(yīng)產(chǎn)生攜帶多個(gè)(4至16個(gè))螯合基團(tuán)K的試劑，其中每個(gè)螯合基團(tuán)K能夠結(jié)合過渡金屬離子，如Ni²⁺或Co²⁺，由此使得多聚化試劑能夠結(jié)合低聚組氨酸肽。因此，當(dāng)圖5中所述部分的螯合基團(tuán)與這種過渡金屬復(fù)合時(shí)，多聚化試劑可與攜帶低聚組氨酸標(biāo)簽的受體分子結(jié)合試劑形成多價(jià)復(fù)合物。如Schmidt等(2011，上文)所述，受體分子結(jié)合試劑可以是例如可溶性主要組織相容性復(fù)合物(MHC)肽，在其N-末端具有融合的低聚組氨酸標(biāo)簽。作為純粹說明性的實(shí)例，這種MHC肽可以是如Schmidt等(2011，上文)所述的包含His-6標(biāo)簽、His-12標(biāo)簽或2_His-6標(biāo)簽的HLA-A 0201-肽。這種受體分子結(jié)合試劑也稱為“Histamer”，并且可以與本文描述的采用多聚次氮基三乙酸(NTA)部分作為結(jié)合位點(diǎn)Z的多聚化試劑一起從TC Metrix SA,Epalinges,Switzerland商購獲得。

圖6顯示了用于從外周血富集CD4+細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將多聚用作多聚化試劑，將攜帶鏈霉親和素-結(jié)合肽的抗CD4Fab片段用作受體分子結(jié)合試劑。將來自人血液的CD4+白細(xì)胞用作示例性靶細(xì)胞。固定相含有生物素作為配體L。通過使用熒光-激活細(xì)胞分選(FACS)的流式細(xì)胞術(shù)分析來表征細(xì)胞。圖6A描述了總細(xì)胞(無門控)的圖(Accuri C6流式細(xì)胞分析儀)。細(xì)胞針對CD3-PE和CD4-APC染色。圖6B描述了總細(xì)胞(門P1)的圖。細(xì)胞針對CD3-PE和CD4-APC染色。圖6C描述了總細(xì)胞(門P1)的圖。細(xì)胞未染色。圖6D描述了級分(fraction)D+W的細(xì)胞(門P1)的圖。細(xì)胞針對CD3-PE和CD4-APC染色。圖6E描述了級分E(門P1)的圖。細(xì)胞針對CD3-PE和CD4-APC染色。圖6F描述了級分R的細(xì)胞(門P1)的圖。細(xì)胞針對CD3-PE和CD4-APC染色。

圖7顯示了總結(jié)圖6中描述的FACS分析的結(jié)果的表。對總細(xì)胞的分析揭示了在門控的淋巴細(xì)胞群內(nèi)的39.56％CD4+細(xì)胞濃度。在流出物(flow through)和洗滌級分中的細(xì)胞消耗至4.01％CD4+細(xì)胞濃度。通過生物素洗脫顯示95.04％的CD4+細(xì)胞的純度。在移液管處理柱樹脂后，物理洗脫的細(xì)胞仍顯示出88.26％的純度。

圖8顯示了在工作實(shí)施例中進(jìn)行的細(xì)胞純化柱的說明性裝配。切割市售的旋轉(zhuǎn)柱以除去下端(圖8A)。然后將柱的上部插入含有膜的市售離心管的合適蓋子中(圖8B)。將具有上柱部分的蓋子放置在附屬管上(圖8C)。

圖9顯示了通過如國際專利申請WO 2013/124474(實(shí)施例10.1)中描述的采用移液器頭作為柱的色譜純化，或使用其中細(xì)胞與CD8結(jié)合Fab片段和生物素化固相預(yù)溫育(實(shí)施例10.2)的本發(fā)明方法的實(shí)施方案，從外周血單核細(xì)胞(PBMC)的制備物中分離CD8+細(xì)胞的比較實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖9A顯示了如國際專利申請WO 2013/124474中描述的，采用熒光-激活細(xì)胞分選(FACS)的選擇(分離)靶細(xì)胞前的初始PBMC制備物、洗滌(wash through)級分以及分離的洗脫級分(CD8+細(xì)胞陽性級分)的流式細(xì)胞術(shù)分析的Accuri C6圖，而圖9B顯示了采用本發(fā)明方法的實(shí)施方案，選擇(分離)靶細(xì)胞前的初始PBMC制備物、洗滌級分以及分離的洗脫級分(CD8+細(xì)胞陽性級分)的FACS分析的Accuri C6圖。圖9C顯示了柱狀圖，其中比較了兩種方法分離的CD8+細(xì)胞的產(chǎn)量和純度。在圖9C中，數(shù)字0015表示根據(jù)國際專利申請WO 2013/124474的方法的結(jié)果，而數(shù)字0016表示本發(fā)明方法的該實(shí)施方案的結(jié)果。圖9C中以％給出的產(chǎn)量和純度的數(shù)值是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。

圖10顯示了通過如國際專利申請WO 2013/124474中描述的采用移液器頭作為柱的色譜純化，或使用其中細(xì)胞與CD3結(jié)合Fab片段和生物素化固相預(yù)溫育的本發(fā)明方法的實(shí)施方案，從外周血單核細(xì)胞(PBMC)的制備物中分離CD3+細(xì)胞的比較實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖10A顯示了如國際專利申請WO 2013/124474中描述的，采用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)的選擇(分離)靶細(xì)胞前的初始PBMC制備物、洗滌級分以及分離的洗脫級分(CD3+細(xì)胞陽性級分)的流式細(xì)胞術(shù)分析的Accuri C6圖，而圖10B顯示了采用本發(fā)明方法的實(shí)施方案，選擇(分離)靶細(xì)胞前的初始PBMC制備物、洗滌級分以及分離的洗脫級分(CD8+細(xì)胞陽性級分)的FACS分析的Accuri C6圖。圖10C顯示了柱狀圖，其中比較了兩種方法分離的CD3+細(xì)胞的產(chǎn)量和純度。在圖10C中，數(shù)字0015表示根據(jù)國際專利申請WO 2013/124474的方法的結(jié)果，而數(shù)字0016表示本發(fā)明方法的該實(shí)施方案的結(jié)果。圖10C中以％給出的產(chǎn)量和純度的數(shù)值是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。

具體實(shí)施方式

本文提供通常通過流體色譜法(其可以以間歇模式或以連續(xù)模式進(jìn)行)分離或分開細(xì)胞和其它生物實(shí)體(例如，由表面上的共同特異性受體分子限定的細(xì)胞器、病毒、脂質(zhì)體或朊病毒)的方法。以下所用術(shù)語“靶細(xì)胞”通常是指所有這樣的生物實(shí)體(細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒、脂質(zhì)體或朊病毒)。

盡管在以下的公開中參照本發(fā)明的第一方面的方法一般地解釋了本發(fā)明，但是顯然，以下公開可以與本文所定義的本發(fā)明的第二、第三和第四方面的方法同樣地實(shí)施。

本發(fā)明基于這樣驚奇的發(fā)現(xiàn)：可溶性多聚化試劑與具有配體L的固定相的組合的應(yīng)用提供了優(yōu)于例如國際專利申請WO2013/124474中所述的已知方法的若干優(yōu)點(diǎn)，所述配體L與作為受體分子結(jié)合試劑或可溶性多聚化試劑的一部分的配體結(jié)合配體LB結(jié)合。

第一，本發(fā)明允許先溫育受體結(jié)合試劑、多聚化試劑和靶細(xì)胞樣品，然后使這一反應(yīng)混合物與固定相接觸。這樣做可以確保達(dá)到受體分子結(jié)合試劑與受體分子的結(jié)合，和因此與靶細(xì)胞的結(jié)合的平衡。由于這種溫育包括通過將單價(jià)受體分子結(jié)合試劑結(jié)合至多聚化試劑的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z，使單價(jià)受體分子結(jié)合試劑多聚化，這確保了當(dāng)將受體分子結(jié)合試劑與靶細(xì)胞一起溫育時(shí)確實(shí)可以達(dá)到親合效果。此外，由于可使用限定的多聚化試劑，且與受體分子結(jié)合試劑和/或所選擇的靶細(xì)胞的種類無關(guān)，因此，可使純化方案標(biāo)準(zhǔn)化而無需考慮所使用的受體分子結(jié)合試劑和靶細(xì)胞。

第二，認(rèn)為可溶性多聚化試劑改善了受體分子結(jié)合試劑至(多聚化的)受體分子結(jié)合試劑的可及性(accessibility)，這是由于多聚化試劑是可溶性的，其能夠例如，比固定在固體表面(如色譜基質(zhì))上的立體地和流動(dòng)限制的多聚化試劑更好地達(dá)到裂隙(crevice)或與靶細(xì)胞表面上的復(fù)合受體分子相互作用。

第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，與其中理想地應(yīng)采用具有低孔徑的色譜基質(zhì)以便防止受體分子結(jié)合試劑進(jìn)入孔并由此無法用于分離靶細(xì)胞的國際專利申請WO2013/124474的方法相比，可將任何固相用于本發(fā)明的方法，因?yàn)槲唇Y(jié)合的受體分子結(jié)合試劑不與固相接觸。

第四，由于使用總是相同限定的多聚化試劑的可能性，可以采用限定的和較小量的受體分子結(jié)合試劑來分離細(xì)胞。

第五，由于靶細(xì)胞(作為形成的多聚結(jié)合復(fù)合物的一部分)的固定是經(jīng)由受體分子結(jié)合試劑或多聚化試劑的配體結(jié)合配偶體LB介導(dǎo)的，則這種固定與所采用的受體分子結(jié)合試劑和靶細(xì)胞的類型無關(guān)。事實(shí)上，相同的反應(yīng)(LB與配體L的結(jié)合)可以用于任何給定細(xì)胞類型的固定。因此，這也允許分離/純化方案的標(biāo)準(zhǔn)化。

最后，如本文所述，可溶性多聚化試劑的使用允許通過色譜法將全部所使用的試劑(受體分子結(jié)合試劑、多聚化試劑和競爭試劑)移除。這允許將包含配體L的固相的裝置與如本文所述的第一固定相或第二固定相中的至少一個(gè)一起使用。這種裝置又允許本文所描述的分離方法簡單自動(dòng)化，并因此開發(fā)例如在GMP條件下的用于分離靶細(xì)胞的自動(dòng)且封閉的設(shè)備(此處應(yīng)注意，本文所述的所有試劑以及包含配體L的固相和第一固定相或第二固定相都可在GMP條件下制備)。

除非另有說明，本文(包括說明書和權(quán)利要求書)中使用的下列術(shù)語具有以下給出的定義。

本文所用術(shù)語“競爭試劑”是指能夠降低、干擾或消除一對結(jié)合劑或部分(如包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合位點(diǎn)B與靶細(xì)胞表面上的受體分子，包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C與包含在多聚化試劑中的結(jié)合位點(diǎn)Z，或配體L與配體結(jié)合配偶體LB)之間復(fù)合物的形成的任何試劑或條件。術(shù)語“競爭”是指任何對結(jié)合的干擾，而不考慮這種干擾的性質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，這種干擾也可以是對某一結(jié)合位點(diǎn)的非競爭性結(jié)合。當(dāng)可逆鍵由復(fù)合的金屬離子如Ca²⁺、Ni²⁺、Co²⁺或Zn²⁺介導(dǎo)時(shí)，這種競爭機(jī)制的一個(gè)實(shí)例是通過如EDTA或EGTA的螯合劑的金屬螯合。這一機(jī)制適應(yīng)用于在Ca²⁺存在下結(jié)合的結(jié)合對(如鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽)，或用于在固定金屬-螯合親和色譜(IMAC)中采用的結(jié)合對。在一些實(shí)施方案中，競爭試劑可具有一個(gè)能夠特異性結(jié)合包含在結(jié)合配偶體中的一個(gè)上的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合位點(diǎn)，所述結(jié)合配偶體如結(jié)合位點(diǎn)B、結(jié)合位點(diǎn)Z、結(jié)合配偶體C或配體結(jié)合配偶體LB。還可能是，整個(gè)競爭試劑能夠特異性結(jié)合包含在這些結(jié)合配偶體中的一個(gè)上的結(jié)合位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，通過pH或緩沖液的鹽強(qiáng)度的改變來提供競爭，且之后競爭試劑使pH或鹽強(qiáng)度增加或降低。pH的改變可以例如，用于替換/破壞鏈霉親和素與鏈霉親和素結(jié)合肽的結(jié)合，或用于替換/破壞蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G與抗體Fc結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)合。

術(shù)語“分離的”表示靶細(xì)胞已經(jīng)從其正常的生理環(huán)境如天然來源中移除。一種分離的細(xì)胞可例如包含在一個(gè)不同的培養(yǎng)基(如原始提供的水性溶液)中，或放置在不同的生理環(huán)境中。通常，分離的細(xì)胞構(gòu)成存在于其環(huán)境(如適用的溶液/懸浮液)中的總細(xì)胞的比例高于其被取出的環(huán)境中的總細(xì)胞比例。在一些實(shí)施方案中，除本文所述的方法之外，所需靶細(xì)胞的分離可包括一般細(xì)胞富集技術(shù)，如離心、過濾或細(xì)胞色譜。如B細(xì)胞或T細(xì)胞的淋巴細(xì)胞可以從例如外周血、從血液、腦脊液或其富集級分中獲得。B細(xì)胞或T細(xì)胞可以從外周血單核細(xì)胞(PBMC)，如人PBMC中獲得?？梢圆捎?，例如基于細(xì)胞密度和/或細(xì)胞尺寸的已知標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來富集這種PBMC。作為說明性實(shí)例，可以例如采用蔗糖、葡聚糖、或通過密度梯度離心來富集或分離PBMC。

“分離的”通常指獲得的樣品(如洗脫液或級分)含有作為基本上占優(yōu)勢細(xì)胞(細(xì)胞群)類型的靶細(xì)胞，例如，該靶細(xì)胞代表存在于樣品中的大于約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約85％或大于約90％的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，分離的靶細(xì)胞限定存在于樣品中的大于約95％或大于約97％的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，分離的靶細(xì)胞限定存在于樣品中的大于約99％的細(xì)胞?！胺蛛x的”還包括在經(jīng)過如本文所述的分離/純化方法之后，含有靶細(xì)胞的樣品中沒有反應(yīng)物，例如本文定義的受體結(jié)合試劑、多聚化試劑或競爭試劑。

本文使用的“分離”意味著，與用于靶細(xì)胞分離的樣品的含量(濃度)相比，靶細(xì)胞在實(shí)施本文所述方法獲得的樣品中富集。與上述一致，這意味著靶細(xì)胞可以在樣品中富集，例如，從樣品中細(xì)胞總量的約0.1％的含量富集至樣品(如從采用本文公開方法中獲得的洗脫液或級分)中約10％或更多、或20％或更多。在一些實(shí)施方案中，靶細(xì)胞可以從樣品中細(xì)胞總量的約0.1％的含量富集至從本文描述的方法中獲得的樣品中30％或更多、如40％或更多。術(shù)語“分離”還包括檢測樣品中靶細(xì)胞的存在或不存在。因此，靶細(xì)胞分離可用于分析或制備目的(例如，用于檢測靶細(xì)胞群的存在，也用于量化存在于樣品中的細(xì)胞，或用于大規(guī)模分離細(xì)胞以用于基于細(xì)胞的療法)。分析目的可包括診斷應(yīng)用以及基礎(chǔ)研究應(yīng)用，其中例如本文所述的分離方法用于篩選目的，例如一個(gè)特定受體分子例如G-蛋白耦合受體(GPCR)或任何其他生理相關(guān)受體(如胰島素受體)是否在選定的宿主細(xì)胞中重組表達(dá)(同樣見下文)。

在分離、純化或富集靶細(xì)胞的上下文中的“固定相”是與流動(dòng)相接觸的色譜系統(tǒng)的一部分。應(yīng)用于色譜系統(tǒng)的樣品的各個(gè)組分可以顯示在流動(dòng)相和固定相之間的單獨(dú)分配。在色譜期間，固定相保持在特定空間內(nèi)，并且在許多實(shí)施方案中具有至少基本固定的位置。術(shù)語“色譜基質(zhì)”和“固定相”在本文中可互換使用。在本發(fā)明中，固定相可以以間歇模式或流通模式(flow-through mode)使用。

本文所用術(shù)語“靶細(xì)胞”涵蓋所有生物實(shí)體/囊泡，其中膜(也可以是脂質(zhì)雙層)將內(nèi)部與外部環(huán)境(環(huán)境)分離，并且在生物實(shí)體/囊泡的表面上包含一種或多種類型的特異性受體分子。因此，靶細(xì)胞/生物實(shí)體/囊泡或靶細(xì)胞群被在其表面上存在至少一個(gè)常見特異性受體分子定義。

靶細(xì)胞或靶細(xì)胞群從樣品中分離，所述樣品例如可包含各種不同的細(xì)胞或細(xì)胞群。含有至少一個(gè)特定受體分子的幾乎任何靶細(xì)胞均可以與包含在樣品中的其他組分相分離。為了使本文描述的方法達(dá)到如下所述的親合效果，受體分子通常以兩個(gè)或更多個(gè)拷貝存在于靶細(xì)胞表面上。

在一些實(shí)施方案中，靶細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中細(xì)胞可以是古菌。在一些實(shí)施方案中細(xì)胞可以是病毒或細(xì)胞器，如線粒體、葉綠體、微粒體、溶酶體、高爾基體或細(xì)胞核。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、原生動(dòng)物或動(dòng)物細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中靶細(xì)胞包括細(xì)胞核。在一些實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括但不限于從人、小鼠、兔、豚鼠、松鼠、倉鼠、貓、狗、狐猴、山羊、豬、馬、恒河猴、獼猴或黑猩猩中獲得的細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的例子包括但不限于血液細(xì)胞或組織細(xì)胞，如肝細(xì)胞或干細(xì)胞，如源于合適來源的CD34-陽性外周干細(xì)胞或者胚胎干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白(Nanog)或Oct-4表達(dá)干細(xì)胞。血液細(xì)胞可以如是白細(xì)胞或紅細(xì)胞。白細(xì)胞可以是例如嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或樹突細(xì)胞。個(gè)別淋巴細(xì)胞可以是，例如T細(xì)胞—包括CMV-特異CD8+T-淋巴細(xì)胞、細(xì)胞毒性T-細(xì)胞、記憶T-細(xì)胞(記憶T細(xì)胞的示例性例子是CD62L⁺CD8⁺特異性中央記憶T-細(xì)胞)或調(diào)節(jié)性T-細(xì)胞(Treg的示例性例子是CD4⁺CD25⁺CD45RA+Treg細(xì)胞)、T-輔助細(xì)胞(例如CD4⁺T-輔助細(xì)胞)、B細(xì)胞或天然殺傷細(xì)胞，提到的只是一些示例性例子。

靶細(xì)胞通常是細(xì)胞，包括細(xì)胞群或如上提到的任何其他生物實(shí)體群，其膜(在一些實(shí)施方案中也可以是脂質(zhì)雙層)將內(nèi)部與外部環(huán)境(環(huán)境)分離。靶細(xì)胞的進(jìn)一步特點(diǎn)是其表面上具有特定特異性受體分子?？梢酝ㄟ^本文所述的方法在任何使用的純化試劑(如受體結(jié)合試劑；競爭試劑；和/或多聚化試劑)的順序移除下純化這種靶細(xì)胞。除了如果靶是細(xì)胞或細(xì)胞器則生理狀態(tài)并不改變的優(yōu)勢之外，相應(yīng)方法或用途提供了調(diào)節(jié)優(yōu)勢，即在使用這些純化的生物實(shí)體作為藥物時(shí)，純化試劑沒有施用給受試者(如患者)。

例如，靶細(xì)胞可以是組織如器官或其部分的細(xì)胞。各個(gè)器官的實(shí)例包括但不限于腎上腺組織、骨骼、血液、膀胱、腦、軟骨、結(jié)腸、眼、心、腎、肝、肺、肌肉、神經(jīng)、卵巢、胰腺、前列腺、皮膚、小腸、脾、胃、睪丸、胸腺、腫瘤、血管或子宮組織、或結(jié)締組織。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或癌細(xì)胞。

將要從中分離出靶細(xì)胞的樣品可以是任何來源。其例如但不限于可源自人、動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌或原生動(dòng)物。因此，任何以下樣品選自但不限于土壤樣品、空氣樣品、環(huán)境樣品、細(xì)胞培養(yǎng)樣品、骨髓樣品、食物樣品、血液樣品、血清樣品、血漿樣品、尿樣品、糞便樣品、精液樣品、淋巴液樣品、腦脊液樣品、洗鼻咽樣品、痰液樣品、口腔拭子樣品、咽喉拭子樣品、鼻拭子樣品、支氣管肺泡灌洗樣品、支氣管分泌物樣品、牛奶樣品、羊水樣品、活檢樣品、癌癥樣品、腫瘤樣品、組織樣品、細(xì)胞樣品、細(xì)胞培養(yǎng)樣品、細(xì)胞溶解產(chǎn)物樣品、病毒培養(yǎng)樣品、指甲樣品、頭發(fā)樣品、皮膚樣品、法醫(yī)樣品、感染樣品、院內(nèi)感染樣品、空間樣品或其任何組合。當(dāng)需要時(shí)，相應(yīng)的樣品可以已被預(yù)處理到任何程度。作為一個(gè)說明性實(shí)例，在用于本文所述的方法之前，組織樣品可能被消化、均質(zhì)或離心。在另一個(gè)說明性實(shí)例中，體液如血液的樣品可以通過血液細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)分離獲得。如果本文描述的分離方法用于基礎(chǔ)研究，樣品可以是體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞。樣品通常會(huì)準(zhǔn)備成液體的形式，如溶液或分散體。

位于靶細(xì)胞表面，包括位于生物實(shí)體的可及表面上的受體分子可以是在根據(jù)本發(fā)明的方法中的分離過程期間存在于細(xì)胞表面上的任何分子。受體分子是一種受體分子結(jié)合試劑所針對的分子。在一些實(shí)施方案中，受體是肽或蛋白，如膜受體蛋白。在一些實(shí)施方案中，受體是脂質(zhì)或多糖。作為蛋白質(zhì)的受體分子可以是外周膜蛋白或膜本體蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，它可以具有一個(gè)或多個(gè)跨膜的結(jié)構(gòu)域。作為一些說明性實(shí)例，膜蛋白可以是CD分子(分化簇)，如CD3、CD4、CD8、CD247(T細(xì)胞標(biāo)記物)、CD8、CD62L、CD45RA(記憶T細(xì)胞標(biāo)記物)、CD4、CD25、CD45RA(調(diào)節(jié)T細(xì)胞標(biāo)記物)、CD56(天然殺傷細(xì)胞標(biāo)記物)、CD19(B細(xì)胞標(biāo)記物)和CD34、Oct-4、胚胎干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白(Nanog)(干細(xì)胞標(biāo)記物)，僅列舉幾個(gè)說明性示例。因此，靶細(xì)胞可以是例如血細(xì)胞的群或亞群；如諸如T細(xì)胞、T-輔助細(xì)胞(例如CD4⁺T-輔助細(xì)胞)、B細(xì)胞或天然殺傷細(xì)胞的淋巴細(xì)胞；單核細(xì)胞；或干細(xì)胞，如CD34-陽性外周干細(xì)胞或者胚胎干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白(Nanog)或Oct-4表達(dá)干細(xì)胞。在其表面具有CD8的大多數(shù)T細(xì)胞是細(xì)胞毒性T細(xì)胞。因此，靶細(xì)胞可以是CD8⁺細(xì)胞毒性T-細(xì)胞。受體還可以是腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記物。膜蛋白還可以是G-蛋白偶聯(lián)受體，如嗅覺受體、視紫紅質(zhì)受體、視紫紅質(zhì)信息素受體、肽激素受體、味覺受體、GABA受體、阿片類受體、5-羥色胺受體、Ca²⁺受體、視黑素、神經(jīng)遞質(zhì)受體、受體激酶如絲氨酸/蘇氨酸激酶、酪氨酸激酶、孔/通道如氯通道、鉀通道，或細(xì)胞粘附受體如金屬蛋白酶、整合素或鈣粘蛋白。

本文所述的方法可以作為流體色譜法，通常為液相色譜法的一部分來實(shí)施。任何材料都可以作為本發(fā)明上下文中的色譜基質(zhì)采用，只要材料適用于色譜分離所選擇的生物實(shí)體如靶細(xì)胞即可。一個(gè)合適的色譜材料至少本質(zhì)上是無害的，即當(dāng)用于填充的色譜柱中在預(yù)期條件下進(jìn)行細(xì)胞分離(cell isolation)和/或細(xì)胞分開(cell separation)時(shí)不損害細(xì)胞生存力(或生物實(shí)體的生存力或穩(wěn)定性)。本文所述的方法中所使用的色譜基質(zhì)保留于預(yù)定位置，通常為在預(yù)定位點(diǎn)，而待分離的樣品及其內(nèi)包含的組分的位置是變化的。作為說明性實(shí)例，若使用填充床色譜柱，則通常將固定相限制在柱底部與流動(dòng)適配器之間。當(dāng)色譜作為膨脹床吸附實(shí)施時(shí)，樹脂在使用中變成流化的，并且所采用的珠子以濃度梯度的形式排列，單個(gè)珠子占有這樣一個(gè)位置：其沉降速度與向上的液體流速匹配。因此，色譜基質(zhì)是符合本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)理解的“固定相”，該固定相是色譜系統(tǒng)中的流動(dòng)相流動(dòng)通過的部分，且其中包含在液相中的組分在相之間擴(kuò)散。

若使用珠子，則柱色譜中的珠子的尺寸通常是相當(dāng)均勻的，而在膨脹床中的珠子的尺寸是可變的，通常為約50至約400mm的范圍。在這方面，注意加入到液體樣品中、與樣品混合、然后從樣品中移除(如通過棄除上清(液體)，同時(shí)將珠子暫時(shí)放在適當(dāng)位置(例如，通過外部磁場或通過離心))的顆粒如可自由活動(dòng)的磁珠在一個(gè)實(shí)施方案中并不是本文使用的固定相。然而，本發(fā)明的方法還可以在間歇模式中實(shí)施。在這樣一種方法中，可以將這些(磁)珠加入到含有靶細(xì)胞的樣品中以在這些珠子上固定靶細(xì)胞(經(jīng)由在靶細(xì)胞、受體結(jié)合試劑和親和/多聚化試劑之間形成復(fù)合物)，然后將珠子與樣品例如通過暫時(shí)將珠子放在適當(dāng)位置相分離，同時(shí)丟棄上清液。這樣一種間歇方法也是根據(jù)本發(fā)明的方法。

通常，各個(gè)色譜基質(zhì)具有固相或半固相的形式，而包含待分離(isolated/separated)的靶細(xì)胞的樣品是流體相(fluid phase)。用于實(shí)現(xiàn)分離的流動(dòng)相同樣是流體相(fluid phase)。色譜法基質(zhì)可以是顆粒物質(zhì)(具有任何合適的尺寸和形狀)或整體色譜材料，包括紙基材或膜。因此，色譜法可以是例如柱色譜法。在一些實(shí)施方案中，色譜法也可以是平面色譜法。在一些實(shí)施方案中，“色譜柱”可以是膨脹床色譜。如果將顆?；|(zhì)材料用于柱色譜法，則顆?；|(zhì)材料可以例如具有約5μm至約200μm、或從約5μm至400μm、或從約5μm至約600μm的平均粒徑。如下詳述，色譜基質(zhì)可以例如是或包含聚合物樹脂或金屬氧化物或類金屬氧化物。如果使用平面色譜，基質(zhì)材料可以是任何適合平面色譜的材料，如傳統(tǒng)的基于纖維素的或基于有機(jī)聚合物的膜(例如，紙膜、硝化纖維素膜或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜)或二氧化硅涂覆的玻璃板。在一個(gè)實(shí)施方案中，色譜基質(zhì)/固定相是一種非磁性材料或非可磁化材料。

用于現(xiàn)有技術(shù)且也適用于本文所述方法的非磁性材料或非可磁化色譜固定相，包括衍生化的二氧化硅或交聯(lián)凝膠。交聯(lián)凝膠(通常生產(chǎn)成珠子形式)可以基于天然聚合物，即在天然形成的聚合物類上。例如，色譜固定相基于其的天然聚合物是多糖。相應(yīng)的多糖通常是交聯(lián)的。多糖基質(zhì)的實(shí)例是瓊脂糖凝膠(例如，Superflow^TM瓊脂糖或材料，如商購可獲得的不同珠子和孔尺寸的Superflow^TM)或交聯(lián)葡聚糖凝膠。另一個(gè)說明性實(shí)例是葡聚糖共價(jià)結(jié)合的顆粒交聯(lián)瓊脂糖基質(zhì)，這是商購可獲得的(以各種珠子大小和不同孔尺寸)如或都可以從GE Healthcare獲得。這種色譜材料的另一個(gè)說明性實(shí)例是其也可以不同的珠子和孔尺寸從GE Healthcare獲得。

交聯(lián)凝膠也可以基于合成聚合物，即基于天然不存在的聚合物類。通常用于細(xì)胞分離的色譜固定相基于其的合成聚合物基于具有極性單體單元且因此本身具有極性的聚合物。這樣的極性聚合物是親水的。親水(“愛水的”)分子，也稱為疏脂的(“厭脂肪的”)，包含可以與水分子形成偶極-偶極相互作用的部分。疏水(“厭水的”)分子，也稱為親脂的，具有與水分離的傾向。

合適的合成聚合物的說明性實(shí)例是聚丙烯酰胺、苯乙烯-二乙烯基苯凝膠以及丙烯酸酯和二醇或丙烯酰胺和二醇的共聚物。一個(gè)說明性實(shí)例是聚甲基丙烯酸酯凝膠，可以以商購獲得。另一個(gè)實(shí)例是乙二醇和甲基丙烯酸酯的共聚物，可以以商購獲得。在一些實(shí)施方案中，色譜固定相可以也包括天然和合成的聚合物組分，如復(fù)合基質(zhì)或復(fù)合物或多糖和瓊脂糖的共聚物，如聚丙烯酰胺/瓊脂糖復(fù)合物，或多糖和N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺的復(fù)合物。葡聚糖和N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺的共聚物的一個(gè)說明性實(shí)例是上述系列材料。衍生化二氧化硅可以包括耦合到合成或天然聚合物的二氧化硅顆粒。這種實(shí)施方案的實(shí)例包括、但不限于多糖接枝二氧化硅、聚乙烯吡咯烷酮接枝二氧化硅、聚氧化乙烯接枝二氧化硅、聚(2-羥基乙基天冬酰胺)二氧化硅和聚(N-異丙基丙烯酰胺)接枝二氧化硅。

如用于本文所述方法中的色譜基質(zhì)的固相還可以包括可被磁吸引的顆粒。此外，這種可被磁吸引的顆?？砂軌蚪Y(jié)合多聚化試劑的配體結(jié)合配偶體LB的配體L?？杀淮盼念w?？梢院锌勾判浴㈣F磁性、順磁性或超順磁材料。超順磁材料響應(yīng)磁場，這個(gè)磁場具有不產(chǎn)生永久磁化的感應(yīng)磁場。基于氧化鐵的磁性顆粒是，例如可從Dynal Biotech商購購得的從Miltenyi Biotec商購購得的磁性MicroBeads，從CPG Inc.商購購得的磁性多孔玻璃珠，以及從各自其他來源的，如Roche Applied Science、BIOCLON、BioSource International Inc.、micromod、AMBION、Merck、Bangs Laboratories、Polysciences或Novagen Inc.，這里只列出一些。例如，Hutten,A.等人(J.Biotech.(2004),112,47-63)已經(jīng)描述了基于超順磁Co和FeCo的磁性納米顆粒，以及鐵磁Co納米晶體。在一些實(shí)施方案中，本文公開方法中所用色譜基質(zhì)沒有任何可被磁吸引的材料。

在分離靶細(xì)胞的方法中，可采用色譜基質(zhì)作為親和色譜基質(zhì)。親和色譜基質(zhì)本身可包括永久結(jié)合(通常是共價(jià)結(jié)合)的部分，其能夠特異性結(jié)合選定的靶。例如，常規(guī)親和色譜基質(zhì)可以包括結(jié)合特定給定靶的抗體?？蛇x地，用于固定金屬-螯合親和色譜(IMAC)的色譜基質(zhì)用例如三齒亞氨基二乙酸的螯合配體劑或低聚組氨酸標(biāo)簽修飾，所述三齒亞氨基二乙酸能夠在金屬離子和蛋白質(zhì)的某些裸露側(cè)鏈之間形成配位鍵。因此，在本領(lǐng)域，親和色譜基質(zhì)通常設(shè)計(jì)成使得其本身能夠特異性結(jié)合待分離的靶。在本文公開方法的一些實(shí)施方案中，固定相用作國際專利申請WO 2013/124474中描述的“選擇濾筒”的替代物。

多聚化試劑包含兩個(gè)或更多個(gè)針對包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C的結(jié)合位點(diǎn)Z。在之后形成的非共價(jià)結(jié)合復(fù)合物中，兩個(gè)或更多個(gè)受體結(jié)合試劑結(jié)合到多聚化試劑。結(jié)合的受體結(jié)合試劑彼此緊密排布，使得如果具有(至少兩個(gè)拷貝的)受體分子的靶細(xì)胞存在于樣品中，并與具有一個(gè)或多個(gè)能夠結(jié)合特定受體分子的結(jié)合位點(diǎn)B的受體結(jié)合試劑接觸，可以發(fā)生親合效應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，受體結(jié)合試劑包括多個(gè)如兩個(gè)或更多個(gè)針對靶細(xì)胞上受體的結(jié)合位點(diǎn)B。

因此，在本文所述的多個(gè)受體結(jié)合試劑結(jié)合至多聚化試劑的方法中，如美國專利7,776,562或國際專利申請WO02/054065中描述的親合(多聚化)效應(yīng)可以發(fā)生，從而允許靶細(xì)胞/多價(jià)結(jié)合復(fù)合物的形成。這種靶細(xì)胞/多價(jià)結(jié)合復(fù)合物可被可逆地固定在固定相上，由此使靶細(xì)胞固定在固定相上。由于可以通過加入競爭試劑來破壞多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z與受體分子結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體C之間的鍵，隨后可以在溫和條件下洗脫靶細(xì)胞，在這種條件下受體分子結(jié)合試劑完全從靶細(xì)胞中解離，由此避免受體分子結(jié)合試劑影響靶細(xì)胞的功能狀態(tài)。因此，這種經(jīng)由此親和色譜法分離靶細(xì)胞不僅具有允許靶細(xì)胞群(或本文描述的任何其他生物實(shí)體)的分離/純化，且不改變由常見特異性受體分子定義的靶細(xì)胞群的功能狀態(tài)的優(yōu)點(diǎn)。而且，這種方法還有額外的好處，它完全廢除使用磁珠純化細(xì)胞的需要，由此簡化了對細(xì)胞的任何進(jìn)一步處理并進(jìn)一步打開了本文還描述的分離靶細(xì)胞的自動(dòng)化的途徑。

在一些實(shí)施方案中，色譜基質(zhì)，如第一或第二(如果使用)固定相包含在色譜柱中，例如填充在色譜柱中。在一些實(shí)施方案中，使用第一和第二固定相。所述第一固定相對應(yīng)于上文描述的固定相，其包含例如配體L。第二固定相可用于從使用的試劑，例如受體結(jié)合試劑、競爭試劑和/或多聚化試劑中消耗第一固定相的洗脫液。由此，這種第二固定相可以是如國際專利申請WO 2013/124474中描述的“移除濾筒”。在一些實(shí)施方案中，第二固定相包括通常與其共價(jià)連接的親和試劑。親和試劑能夠結(jié)合包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C。親和試劑還可能夠結(jié)合競爭試劑。這樣的色譜基質(zhì)可以是親和色譜基質(zhì)。其也可以是凝膠過濾基質(zhì)，親和試劑耦合于其上。通過固定的親和試劑，色譜基質(zhì)可以消耗受體分子結(jié)合試劑的流動(dòng)相。接觸色譜基質(zhì)的樣品，例如負(fù)載到與其填充的柱子上，同樣可以耗盡其中的受體結(jié)合試劑。作為一個(gè)說明性實(shí)例，若采用鏈霉親和素結(jié)合肽作為結(jié)合配偶體C，且采用生物素作為競爭試劑，則親和試劑可以是與色譜基質(zhì)(如sephararose^TM)偶聯(lián)的鏈霉親和素(參見國際專利申請WO 2013/124474以獲得這種“移除濾筒”的詳細(xì)描述)。此外，若將鏈霉親和素或鏈霉親和素突變蛋白的可溶性低聚體用作可溶性多聚化試劑，可以通過其上固定或共價(jià)耦合了生物素的另一(第三)固定相將這種多聚化試劑從洗脫液中移除(參見從Affiland S.A.(Ans-Liege,Belgium商購獲得的生物素-瓊脂糖凝膠，或在本文實(shí)驗(yàn)部分制備的具有共價(jià)結(jié)合的生物素的瓊脂糖)?；诳扇苄枣溍褂H和素的多聚化試劑將通過與其生物素基團(tuán)結(jié)合而固定在固相上。因此，本發(fā)明提供了在移除本發(fā)明方法中使用的所有試劑的情況下自動(dòng)分離靶細(xì)胞的可能性。

應(yīng)用含有靶細(xì)胞的樣品之后，可以隨后用流動(dòng)相(如水性介質(zhì)，如緩沖液)洗滌本文所用的色譜基質(zhì)，以便移除沒有固定在色譜基質(zhì)上的任何物質(zhì)。這種洗滌可以在本文所述的方法或用途的上下文中使用的任何固定相上進(jìn)行。相應(yīng)的色譜基質(zhì)可以用作第一固定相或用作第二固定相。

然后，例如通過條件改變可以誘導(dǎo)上文描述的非共價(jià)多價(jià)復(fù)合物的解離，該復(fù)合物的形成使靶細(xì)胞固定在親和色譜基質(zhì)上。這種條件改變例如可以是pH或水性流動(dòng)相離子強(qiáng)度的改變。在一些實(shí)施方案中，采用競爭試劑以便誘導(dǎo)受體分子結(jié)合試劑與多聚化試劑之間的可逆非共價(jià)復(fù)合物的解離。通過占有或阻塞多聚化試劑對于包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體的結(jié)合位點(diǎn)，競爭試劑能夠結(jié)合多聚化試劑。通過使用與多聚化試劑具有特別高親和力的競爭試劑，或通過使用相對于受體分子結(jié)合試劑的濃度過量的競爭試劑(在這種情況下，相比于受體結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體C，競爭試劑也可能對多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z具有較低親和力)，受體結(jié)合試劑和多聚化試劑之間的非共價(jià)鍵合可以被破壞。允許靶細(xì)胞從色譜基質(zhì)中洗脫，如從色譜基質(zhì)填充于其中的柱子洗脫。收集洗脫液，由此收集靶細(xì)胞。

用作色譜中流動(dòng)相的流體相可以是適用于保存靶細(xì)胞的生物活性的任何流體。通常，流體是液體。在一些實(shí)施方案中，相應(yīng)的液體是或包括水，例如以水性溶液的形式。其他組分可以包含在相應(yīng)的水性溶液中，例如溶解或懸浮于其中。作為說明性實(shí)例，水性溶液可以包含一種或多種緩沖化合物。多種緩沖化合物用于本領(lǐng)域，且可以用來實(shí)施本文描述的各種方法。緩沖液的實(shí)例包括、但不限于磷酸鹽溶液如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、碳酸鹽、琥珀酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、甲酸鹽、硼酸鹽、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基-乙磺酸酯(也稱為ACES)、N-(2-羥乙基)-哌嗪-N’-2-乙磺酸(也稱為HEPES)、4-(2-羥乙基)-1-哌嗪-丙磺酸(也稱為HEPPS)、哌嗪-1,4-二(2-乙磺酸酸)(也稱為PIPES)、(2-[三(羥甲基)-甲氨基]-1-乙磺酸(也稱為TES)、2-環(huán)己胺-乙磺酸(也稱為CHES)和N-(2-乙酰胺基)-亞氨基二乙酸鹽(也稱為ADA)?？捎糜谶@些鹽的任何抗衡離子；銨、鈉和鉀可以作為說明性實(shí)例。緩沖劑的更多例子包括但不限于，三-乙醇胺、二乙醇胺、兩性離子緩沖劑如甜菜堿、乙胺、三乙胺、甘氨酸、雙甘氨肽、組氨酸、三(羥甲基)-氨基甲烷(也稱為TRIS)、二-(2-羥乙基)-亞氨基-三(羥甲基)-甲烷(也稱為BIS-TRIS)和N-[三(羥甲基)-甲基]-甘氨酸(也稱為TRICINE)，這里只舉幾個(gè)例子。緩沖液可以進(jìn)一步包括穩(wěn)定待分離的靶細(xì)胞的組分，例如蛋白質(zhì)如(血清)白蛋白、生長因子、微量元素等。選擇合適的流動(dòng)相在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)，且可以經(jīng)驗(yàn)性進(jìn)行。

與國際專利申請WO2013/011011一致，受體分子結(jié)合試劑與靶細(xì)胞上的受體分子之間的結(jié)合強(qiáng)度對靶細(xì)胞與多聚化試劑經(jīng)由受體結(jié)合試劑的結(jié)合可逆性可能不是必不可少的。相反，不考慮結(jié)合強(qiáng)度，意味著不論經(jīng)由結(jié)合位點(diǎn)B的受體結(jié)合試劑與受體分子之間的結(jié)合的解離常數(shù)(K_d)具有低親和性，例如，K_d的范圍是約10^-3至約10^-7M，或具有高親和性，例如，K_d的范圍是約10^-7至約1×10^-10M，靶細(xì)胞均可以可逆地結(jié)合，只要經(jīng)由結(jié)合位點(diǎn)B的受體結(jié)合試劑與靶細(xì)胞表面上的受體分子之間的結(jié)合的解離發(fā)生得足夠快。在這方面，經(jīng)由結(jié)合位點(diǎn)B的受體結(jié)合試劑與受體分子之間的結(jié)合的解離速率常數(shù)(k_off)可以具有約3×10^-5sec^-1或更高的值。這個(gè)解離速率常數(shù)是表征受體結(jié)合試劑的結(jié)合位點(diǎn)B與靶細(xì)胞表面上的受體分子之間形成的復(fù)合物的解離反應(yīng)的常數(shù)。受體結(jié)合試劑的結(jié)合位點(diǎn)B與靶細(xì)胞表面上的受體分子之間的結(jié)合反應(yīng)的結(jié)合速率常數(shù)(k_on)可以具有任何值。為了確保受體分子與受體結(jié)合試劑之間的充分可逆結(jié)合，將結(jié)合平衡的k_off值選擇為具有下述值是有益的：約3×10^-5sec^-1或更大，約5×10^-5sec^-1或更大，如約1×10^-4sec^-1或更大、約1.5×10^-4sec^-1或更大、約2.0×10^-4sec^-1或更大、約2.5×10^-4sec^-1或更大、約3×10^-4sec^-1或更大、約3.5×10^-4sec^-1或更大、約4×10^-4sec^-1或更大、約5×10^-4sec^-1或更大、約7.5×10^-4sec^-1或更大、約1×10^-3sec^-1或更大、約1.5×10^-3sec^-1或更大、約2×10^-3sec^-1或更大、約2.5×10^-3sec^-1或更大、約3×10^-3sec^-1或更大、約4×10^-3sec^-1、約5×10^-3sec^-1或更大、約7.5×10^-3sec^-1或更大、約1×10^-2sec^-1或更大、約5×10^-2sec^-1或更大、約1×10^-1sec^-1或更大或者約5×10^-1sec^-1或更大。本文使用的關(guān)于k_off速率、k_on速率或K_D(參見下述)的術(shù)語“約”的含義是包含±20.0％的誤差范圍，包括±15.0％、±10.0％、±8.0％、±9.0％、±7.0％、±6.0％、±5.0％、±4.5％、±4.0.％、±3.5％、±3.0％、±2.8％、±2.6％、±2.4％、±2.2％、±2.0％、±1.8％、±1.6％、±1.4％、±1.2％、±1.0％、±0.9％、±0.8％、±0.7％、±0.6％、±0.5％、±0.4％、±0.3％、±0.2％、±0.1％或±0.01％。應(yīng)注意，本文使用的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)常數(shù)的值指大氣壓力條件，即1.013巴和室內(nèi)溫度，即25℃。

在一些實(shí)施方案中，受體分子結(jié)合試劑具有能夠特異性結(jié)合到受體分子的單一(單價(jià))結(jié)合位點(diǎn)B。這種單價(jià)受體分子結(jié)合試劑的實(shí)例是可溶性MHC I肽(其與細(xì)胞特異性抗原呈遞肽復(fù)合，這種MHC分子在例如國際專利申請WO 02/054065中或在Schmidt,J.等，J.Biol.Chem.[2011]286,48,41723-41735中描述，并且可從例如IBA GmbH或TC Metrix S.A.商購獲得)、單價(jià)抗體片段(如例如，F(xiàn)ab片段、Fv片段或單鏈Fv片段(scFv))或單價(jià)人工結(jié)合分子(蛋白質(zhì)性的或其他)，如基于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族多肽的突變蛋白(也稱為)?？蛇x地，受體分子結(jié)合試劑還可以具有兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)B。這種受體分子結(jié)合試劑的實(shí)例是完整(二價(jià))抗體分子或保留兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段，如F(ab')₂片段。受體分子結(jié)合試劑可以是多價(jià)分子，如五聚體IgE分子。

在一些實(shí)施方案中，是在分子水平上，而不是經(jīng)由至少結(jié)合位點(diǎn)B的受體分子結(jié)合試劑與靶細(xì)胞上的受體分子的結(jié)合的k_off速率(3×10^-5sec^-1或更大)，允許將本文所述可逆試劑與本文所述靶細(xì)胞的分離組合。而是并例如如美國專利7,776,562或國際專利申請WO02/054065所描述，受體分子與受體分子結(jié)合試劑的結(jié)合位點(diǎn)B之間的低親和力與經(jīng)由固定化多聚化試劑介導(dǎo)的親合效應(yīng)一起允許靶細(xì)胞的可逆分離。在這些實(shí)施方案中，可以在多聚化試劑的兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z和至少兩個(gè)受體結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體C之間形成復(fù)合物，從而允許靶細(xì)胞的可逆固定化和隨后的從固相中洗脫靶細(xì)胞(經(jīng)由加入競爭試劑，其將破壞形成于結(jié)合配偶體C與結(jié)合位點(diǎn)Z之間的結(jié)合(復(fù)合)，進(jìn)而導(dǎo)致受體結(jié)合試劑從靶細(xì)胞中解離)。這種低結(jié)合親和力可以由解離常數(shù)(K_D)表征，所述K_D在約10^-2M或10^-3M至約10^-7M，或約10^-3M至約10^-6M，或約10^-4M至約10^-7M的范圍內(nèi)。

如上所示，受體分子結(jié)合試劑除了具有能夠結(jié)合受體分子的結(jié)合位點(diǎn)B之外，還具有結(jié)合配偶體C。這個(gè)結(jié)合配偶體C能夠可逆地結(jié)合多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z，其中多聚化試劑具有一個(gè)或多個(gè)用于結(jié)合配偶體C的結(jié)合位點(diǎn)。包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C與多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z之間形成的非共價(jià)的鍵可以具有任何所需的強(qiáng)度和親和力，只要其在實(shí)施本發(fā)明方法的條件下是可破壞的或可逆的即可。包含在受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C與多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z之間的結(jié)合的解離常數(shù)(K_D)可以具有在約10^-2M至約10^-13M范圍內(nèi)的值。因此，這種可逆的鍵可以例如具有從約10^-2M至約10^-13M、或從約10^-3M至約10^-12M或從約10^-4M至約10^-11M、或從約10^-5M至約10^-10M的K_D值。這種鍵的K_D以及在受體分子結(jié)合試劑的結(jié)合位點(diǎn)B與受體分子之間形成的鍵的K_D、k_off和k_on速率可以由任何合適的手段測定，例如，通過熒光滴定法、平衡透析或表面等離子體共振。受體分子結(jié)合試劑可包括至少一個(gè)、包括兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)第二結(jié)合配偶體C，且多聚化試劑可包括至少兩個(gè)、如三、四、五、六、七、八個(gè)或更多個(gè)用于包含在受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體的結(jié)合位點(diǎn)。如美國專利7,776,562或國際專利申請WO 2002/054065所述，可以選擇結(jié)合配偶體C和具有一個(gè)或多個(gè)對應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)Z的多聚化試劑的任意組合，只要結(jié)合配偶體C和多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z能夠在(多價(jià))復(fù)合物中可逆地結(jié)合或多聚化以產(chǎn)生親合效應(yīng)即可。

包含在受體分子結(jié)合中的結(jié)合配偶體C可以是寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖、低聚糖或多聚糖。這種結(jié)合配偶體相比于其他物質(zhì)對多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)具有更高的親和力。相應(yīng)結(jié)合配偶體的實(shí)例包括、但不限于免疫球蛋白分子、其片段和具有抗體樣功能的蛋白質(zhì)性結(jié)合分子。

在一些實(shí)施方案中，包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C包含生物素，多聚化試劑包含與生物素可逆結(jié)合的鏈霉親和素類似物或抗生物素蛋白類似物。在一些實(shí)施方案中，包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C包含與鏈霉親和素或抗生物素蛋白可逆結(jié)合的生物素類似物，多聚化試劑包含與相應(yīng)生物素類似物可逆結(jié)合的鏈霉親和素、抗生物素蛋白、鏈霉親和素類似物或抗生物素蛋白類似物。在一些實(shí)施方案中，包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C包含鏈霉親和素或抗生物素蛋白結(jié)合肽，多聚化試劑包含與相應(yīng)鏈霉親和素或抗生物素蛋白結(jié)合肽可逆結(jié)合的鏈霉親和素、抗生物素蛋白、鏈霉親和素類似物或抗生物素蛋白類似物。

在一些實(shí)施方案中，包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C可以包含鏈霉親和素-結(jié)合肽，所述鏈霉親和素-結(jié)合肽包含以下序列之一或由以下序列之一組成：

a)-Trp-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa-(SEQ ID NO:1)，其中Xaa是任何氨基酸，和Yaa及Zaa都是Gly，或Yaa是Glu和Zaa是Lys或Arg，

b)-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly-(SEQ ID NO:2)，

c)-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(SEQ ID NO:3)，

d)順序設(shè)置的至少兩個(gè)鏈霉親和素結(jié)合肽，其中每個(gè)肽結(jié)合鏈霉親和素，其中兩個(gè)肽之間的距離為至少0個(gè)且不大于50個(gè)氨基酸，和其中所述至少兩個(gè)肽中的每個(gè)都包含氨基酸序列–His–Pro–Baa–，其中Baa選自谷氨酰胺、天冬酰胺和甲硫氨酸，

e)如d)中所述的順序設(shè)置，其中所述至少兩個(gè)肽中的一個(gè)包含序列–His–Pro–Gln–，

f)如d)中所述的順序設(shè)置，其中所述肽中的一個(gè)包含氨基酸序列–His–Pro–Gln–Phe–(SEQ ID NO:4)，

g)如d)中所述的順序設(shè)置，其中至少一個(gè)肽至少包含氨基酸序列–Oaa–Xaa–His–Pro–Gln–Phe–Yaa–Zaa–(SEQ ID NO:5)，其中Oaa是Trp、Lys或Arg，Xaa是任何氨基酸，和其中Yaa和Zaa都是Gly，或Yaa是Glu和Zaa是Lys或Arg，

h)如d)中所述的順序設(shè)置，其中至少一個(gè)肽至少包含氨基酸序列–Trp–Xaa–His–Pro–Gln–Phe–Yaa–Zaa–(SEQ ID NO:6)，其中Xaa是任何氨基酸，和其中Yaa和Zaa都是Gly，或Yaa是Glu和Zaa是Lys或Arg，

i)如d)中所述的順序設(shè)置，其中至少一個(gè)肽至少包含氨基酸序列–Trp–Ser–His–Pro–Gln–Phe–Glu–Lys–(SEQ ID NO:7)，

j)氨基酸序列–Trp–Ser–His–Pro–Gln–Phe–Glu–Lys–(Xaa)n–Trp–Ser–His–Pro–Gln–Phe–Glu–Lys–(SEQ ID NO:8)，其中Xaa是任何氨基酸，和n是從0至12的整數(shù)，

k)選自以下的氨基酸序列：Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(SEQ ID NO:9)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:10)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₃-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:11)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₂-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:12)或Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₂-Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:13)。

在這些例子中，多聚化試劑可以包含鏈霉親和素突變蛋白(類似物)Va1⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷或鏈霉親和素突變蛋白(類似物)Ile⁴⁴-Gly⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷，這兩個(gè)都描述在例如美國專利6,103,493中，且可以以商標(biāo)商購獲得。這種多聚鏈霉親和素突變蛋白也可以稱為多聚化的Strep-Tactin。

在一些實(shí)施方案中，受體分子結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體C包含本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的部分作為親和標(biāo)簽。在這樣的實(shí)施方案中，多聚化試劑包含相應(yīng)的結(jié)合配偶體，例如已知結(jié)合到親和標(biāo)簽的抗體或抗體片段。作為已知親和標(biāo)簽的一些說明性實(shí)例，包含在受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C可以包含低聚組氨酸、麥芽糖-結(jié)合蛋白、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(CBP)或硫氧還蛋白、鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽(CBP)、FLAG’-肽、HA-標(biāo)簽(序列：Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala，SEQ ID NO:15)、VSV-G-標(biāo)簽(序列：Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys，SEQ ID NO:16)、HSV-標(biāo)簽或單純皰疹病毒糖蛋白D的HSV表位(序列：Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp，SEQ ID NO:17)、T7表位(Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly，SEQ ID NO:21)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu的轉(zhuǎn)錄因子c-myc的“myc”表位(SEQ ID NO:14)、V5-標(biāo)簽(序列：Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr，SEQ ID NO:18)、或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。在這樣的實(shí)施方案中，多聚化試劑(在這種情況下為抗體或抗體片段)的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與抗原之間形成的復(fù)合物可以通過加入游離抗原而被競爭性地破壞，所述游離抗原即游離肽(表位標(biāo)簽)或游離蛋白質(zhì)(如MBP或CBP)。親和標(biāo)簽也可以是寡核苷酸標(biāo)簽。這樣的寡核苷酸標(biāo)簽可以例如用于與具有互補(bǔ)序列的寡核苷酸雜交，所述寡核苷酸連接到或包含在多聚化試劑中。

合適的結(jié)合對的其它實(shí)例包括將免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域如抗體Fc結(jié)構(gòu)域用作受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C，和將蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G或蛋白質(zhì)L用作多聚化試劑。蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G和蛋白質(zhì)L都能夠可逆地結(jié)合抗體Fc結(jié)構(gòu)域。這種結(jié)合可被緩沖液條件的改變例如通過增加緩沖液的鹽強(qiáng)度或通過降低pH(例如，從約7.0的中性pH降至約3.0至約2.5的pH)而破壞。

在一些實(shí)施方案中，包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C與多聚化試劑的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z之間的結(jié)合在二價(jià)、三價(jià)或四價(jià)陽離子存在下產(chǎn)生。在這方面，在一些實(shí)施方案中，親和/多聚化試劑包括二價(jià)、三價(jià)或四價(jià)陽離子，通常通過合適的螯合劑保持，例如復(fù)合。在這樣的實(shí)施方案中，包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體可以包括包含(例如復(fù)合)二價(jià)、三價(jià)或四價(jià)陽離子的部分。相應(yīng)的金屬螯合劑的實(shí)例包括、但不限于乙二胺、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、N,N-二(羧甲基)甘氨酸(也稱為次氮基三乙酸，NTA)、1,2-二(鄰氨基苯氧基)-乙烷-N,N,N',N'–三乙酸(BAPTA)、2,3-二巰基-1-丙醇(二巰基丙醇)、卟啉和血紅素。作為一個(gè)實(shí)例，EDTA與大多數(shù)二價(jià)、三價(jià)和四價(jià)金屬離子形成復(fù)合物，所述離子如鈣(Ca²⁺)、錳(Mn²⁺)、銅(Cu²⁺)、鐵(Fe²⁺)、鈷(Co³⁺)和鋯(Zr⁴⁺)，而BAPTA對于Ca²⁺是特異性的。作為說明性實(shí)例，本領(lǐng)域使用的標(biāo)準(zhǔn)方法是在低聚組氨酸標(biāo)簽與銅(Cu²⁺)、鎳(Ni²⁺)、鈷(Co²⁺)或鋅(Zn²⁺)離子之間形成復(fù)合物，其通過螯合劑次氮基三乙酸(NTA)的方式呈現(xiàn)。

在一些實(shí)施方案中，包含在受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C包含鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽，多聚化試劑包含如在美國專利5,985,658中所描述的多聚體鈣調(diào)蛋白。在一些實(shí)施方案中，包含在受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C包含F(xiàn)LAG肽，多聚化試劑包含與FLAG肽結(jié)合的抗體，如與美國專利4,851,341所描述的單克隆抗體4E11結(jié)合的FLAG肽。在一些實(shí)施方案中，與FLAG肽結(jié)合的抗體可以是商購可獲得的單克隆抗體M1。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含在受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C包含低聚組氨酸標(biāo)簽，多聚化試劑包含結(jié)合過渡金屬離子并由此還能結(jié)合低聚組氨酸標(biāo)簽的螯合基團(tuán)K。所有這些結(jié)合復(fù)合物的破壞都可以通過金屬離子螯合如鈣螯合，例如通過加入EDTA或EGTA(上述)完成。鈣調(diào)蛋白，抗體如4E11或螯合金屬離子或游離螯合劑可以通過常規(guī)方法多聚化，如通過與鏈霉親和素或抗生物素蛋白或其多聚體的生物素化和絡(luò)合，或在第一步中通過引入羧基殘基到如葡聚糖的多糖，基本上如Noguchi,A等人Bioconjugate Chemistry(1992)3,132-137中所述，且在第二步中，使用常規(guī)碳二亞胺化學(xué)經(jīng)由伯胺基團(tuán)連接鈣調(diào)蛋白或抗體或螯合金屬離子或游離螯合劑到多糖如葡聚糖骨架中的羧基。在這樣的實(shí)施方案中，包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C與多聚化試劑的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z之間的結(jié)合可以被金屬離子螯合破壞。例如，金屬螯合可以通過加入EGTA或EDTA完成。

在一些實(shí)施方案中，可溶性多聚化試劑是鏈霉親和素或抗生物素蛋白或者鏈霉親和素或抗生物素蛋白的任何類似物的低聚體或聚合物。結(jié)合位點(diǎn)Z是抗生物素蛋白或鏈霉親和素的天然的生物素結(jié)合。相應(yīng)的低聚體或聚合物可以從對應(yīng)的單體鏈霉親和素或抗生物素蛋白或其類似物獲得。例如，這種多聚化試劑可以以“PE for Fab Streptamers”(產(chǎn)品編號(hào)6-5001-010或6-5011-010，偶聯(lián)到熒光標(biāo)記-該標(biāo)記不干擾本發(fā)明的方法，因此無需移除)從IBA GmbH,哥廷根,德國商購獲得。此外，用于形成低聚體或聚合物的各種技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。相應(yīng)的低聚體或聚合物可以例如通過多糖交聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一步中，鏈霉親和素或抗生物素蛋白或者鏈霉親和素或抗生物素蛋白的類似物的低聚體或聚合物，通過將羧基殘基引入到多糖如葡聚糖中來制備，基本上如Noguchi,A等人Bioconjugate Chemistry(1992)3,132-137中所述。然后在第二步中，使用常規(guī)碳二亞胺化學(xué)，鏈霉親和素或抗生物素蛋白或其類似物可以經(jīng)由內(nèi)部賴氨酸殘基的伯胺基團(tuán)和/或游離N-端連接到葡聚糖骨架中的羧基。鏈霉親和素或抗生物素蛋白或者鏈霉親和素或抗生物素蛋白的任何類似物的交聯(lián)低聚體或聚合物也可以通過經(jīng)由用作連接子的雙功能分子(如戊二醛)交聯(lián)或通過本領(lǐng)域描述的其他方法獲得。亞氨基硫醇/SMCC、NHS活化羧基葡聚糖或樹枝狀分子的應(yīng)用是本領(lǐng)域建立的交聯(lián)技術(shù)的進(jìn)一步實(shí)例。

作為說明性實(shí)例，在第一步中，鏈霉親和素或抗生物素蛋白或者鏈霉親和素或抗生物素蛋白的類似物的低聚體或聚合物，可以通過將羧基殘基引入到多糖如葡聚糖中來制備，基本上如Noguchi,A等人(Bioconjugate Chemistry[1992]3,132-137)中所述。然后在第二步中，使用常規(guī)碳二亞胺化學(xué)，鏈霉親和素或抗生物素蛋白或其類似物可以經(jīng)由內(nèi)部賴氨酸殘基的伯胺基團(tuán)和/或游離N-末端連接到葡聚糖骨架中的羧基。在一個(gè)實(shí)施方案中，以每摩爾葡聚糖約60摩爾鏈霉親和素或鏈霉親和素突變蛋白的摩爾比實(shí)施偶聯(lián)反應(yīng)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本文所述的靶細(xì)胞分離的鏈霉親和素突變蛋白是在美國專利6,103,493中和在DE 196 41 876.3中描述的那些鏈霉親和素突變蛋白?；谝吧玩溍褂H和素的氨基酸序列，這些鏈霉親和素突變蛋白在氨基酸位置44至53的區(qū)域內(nèi)具有至少1個(gè)突變。在一些實(shí)施方案中，采用最小鏈霉親和素突變蛋白。最小鏈霉親和素突變蛋白N-末端開始于野生型鏈霉親和素的氨基酸10至16區(qū)域，并C-末端結(jié)束于野生型鏈霉親和素的氨基酸133至142區(qū)域。這種鏈霉親和素突變蛋白的實(shí)例在位置44處具有疏水性脂肪族氨基酸而不是Glu，在位置45處具有任何氨基酸，在位置46處具有疏水性脂肪族氨基酸或/和在位置47處具有堿性氨基酸而不是Val。所述鏈霉親和素突變蛋白可以是突變蛋白Va1⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷或鏈霉親和素突變蛋白(類似物)Ile⁴⁴-Gly⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷，兩者都描述在例如美國專利6,103,493中，且都以商標(biāo)商購獲得。

野生型鏈霉親和素(wt-鏈霉親和素)是指Argarana等人，Nucleic AcidsRes.14(1986)1871-1882公開的氨基酸序列。鏈霉親和素突變蛋白是與野生型鏈霉親和素的序列以一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、缺失或添加相區(qū)分的多肽，并且所述多肽保留野生型鏈霉親和素的結(jié)合特性。鏈霉親和素-樣多肽和鏈霉親和素突變蛋白是在免疫學(xué)上與野生型鏈霉親和素基本上相同的多肽，并且尤其能夠以與野生型鏈霉親和素相同或不同的親和力結(jié)合生物素、生物素衍生物或生物素類似物。鏈霉親和素-樣多肽或鏈霉親和素突變蛋白可以含有不是野生型鏈霉親和素的部分的氨基酸，或者它們可以僅包含野生型鏈霉親和素的一部分。鏈霉親和素-樣多肽也是不同于野生型鏈霉親和素的多肽，因?yàn)樗拗鳑]有將宿主產(chǎn)生的多肽轉(zhuǎn)換為野生型鏈霉親和素的結(jié)構(gòu)所需的酶。術(shù)語“鏈霉親和素”還包括鏈霉親和素四聚體和鏈霉親和素二聚體，尤其是鏈霉親和素同源四聚體、鏈霉親和素同源二聚體、鏈霉親和素異源四聚體和鏈霉親和素異源二聚體。每個(gè)亞基通常都具有用于生物素或生物素類似物的結(jié)合位點(diǎn)或用于鏈霉親和素-結(jié)合肽的結(jié)合位點(diǎn)。鏈霉親和素或鏈霉親和素突變蛋白的實(shí)例在例如WO 86/02077、DE 19641876A1、US 6,022,951、WO 98/40396或WO 96/24606中提到。

如上所述，用于本發(fā)明的固相包括能夠(特異性)結(jié)合包含在多聚化試劑中的配體結(jié)合配偶體LB的配體L。配體L與配體結(jié)合配偶體LB之間形成的鍵提供了靶細(xì)胞(作為多價(jià)結(jié)合復(fù)合物的一部分)在固相上的(可逆)固定。因此，LB與L之間形成的鍵本身無需一定是可逆的，也可以是不可逆的。在這種情況下，L與LB之間可形成共價(jià)鍵。可選地，L可以是生物素和LB可以是抗生物素蛋白或鏈霉親和素的生物素結(jié)合位點(diǎn)。盡管基于非共價(jià)相互作用，這種結(jié)合具有約1×10^-15M的解離常數(shù)(K_d)，并且被認(rèn)為是不可逆的。

然而，L與LB之間的結(jié)合是可逆的也是可能的。在這種情況下，配體L與配體結(jié)合配偶體LB的鍵的解離常數(shù)K_d可以比結(jié)合配偶體C與結(jié)合位點(diǎn)Z的可逆鍵的解離常數(shù)K_d小。換言之，L和LB之間的結(jié)合比結(jié)合配偶體C與結(jié)合位點(diǎn)Z的結(jié)合更強(qiáng)。在此處上下文中，注意到可以選擇本文涉及的兩個(gè)結(jié)合對(第一結(jié)合對：受體分子結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體C與多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z；第二結(jié)合對：固相的配體L與包含在多聚化試劑中的配體結(jié)合配偶體LB)，使得所述結(jié)合對既可以被相同也可以被不同的競爭試劑破壞(替換)。

作為兩個(gè)不同的競爭試劑的實(shí)例，受體分子結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體C可以是鏈霉親和素結(jié)合肽，和多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z可以是鏈霉親和素突變蛋白的生物素結(jié)合位點(diǎn)?？梢酝ㄟ^加入生物素或其類似物來破壞這種結(jié)合。固相的配體L可以是能夠與六組氨酸標(biāo)簽結(jié)合的螯合基團(tuán)，和包含在多聚化試劑中的配體結(jié)合配偶體LB可以是六組氨酸標(biāo)簽?？梢酝ㄟ^加入如EDTA的螯合劑或如咪唑的競爭劑來破壞這種結(jié)合。

然而，將相同的競爭試劑用于破壞結(jié)合配偶體C與結(jié)合位點(diǎn)Z之間形成的可逆鍵，和用于破壞配體結(jié)合配偶體LB與配體L之間形成的鍵是有利的。作為這種實(shí)施方案的實(shí)例，受體分子結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體C可以是鏈霉親和素結(jié)合肽，和多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z可以是鏈霉親和素突變蛋白的生物素結(jié)合位點(diǎn)。固相的配體L也可以是生物素，和包含在多聚化試劑的配體結(jié)合配偶體LB也是鏈霉親和素突變蛋白的生物素結(jié)合位點(diǎn)。在這兩種情況下，都可以通過加入生物素或其類似物來破壞所述結(jié)合。因此，在這樣的實(shí)施方案中，多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z和配體結(jié)合配偶體LB可以是相同的。在這樣的實(shí)施方案中注意到，多聚化試劑，其在使受體分子結(jié)合試劑多聚化(通過形成多價(jià)復(fù)合物，該多價(jià)復(fù)合物中兩個(gè)或更多個(gè)受體分子結(jié)合試劑結(jié)合至多聚化試劑)后仍具有游離的結(jié)合位點(diǎn)Z(其隨后與配體結(jié)合配偶體LB相同)用于隨后的配體L的結(jié)合。相應(yīng)的條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員憑經(jīng)驗(yàn)確定，例如，通過改變多聚化試劑與受體分子結(jié)合試劑的摩爾比，和測定這些多價(jià)結(jié)合復(fù)合物隨后與攜帶配體L的固相的結(jié)合速率。

根據(jù)上文，相同結(jié)合對可以用作結(jié)合配偶體C和結(jié)合位點(diǎn)Z也可用作配體L和配體結(jié)合配偶體LB。在說明性實(shí)例中，配體L和配體結(jié)合配偶體LB形成的結(jié)合對選自：

-作為配體結(jié)合配偶體LB的鏈霉親和素或鏈霉親和素類似物，和結(jié)合鏈霉親和素的配體L(分子)，

-在二價(jià)陽離子存在下結(jié)合的結(jié)合對，

-作為配體L的低聚組氨酸肽，和作為配體結(jié)合配偶體LB的包含至少兩個(gè)螯合基團(tuán)K的結(jié)合部分A，其中每個(gè)螯合基團(tuán)能夠結(jié)合過渡金屬離子，由此使結(jié)合部分A能夠結(jié)合所述低聚組氨酸肽，

-抗原和針對所述抗原的抗體，其中所述配體L包含所述抗原，和所述配體結(jié)合配偶體LB包含針對所述抗原的所述抗體，

-作為配體結(jié)合配偶體LB的選自谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，和分別作為配體L的谷胱甘肽、麥芽糖、幾丁質(zhì)或纖維素，

-作為配體結(jié)合配偶體LB的抗體Fc結(jié)構(gòu)域，和作為配體L的如蛋白A、蛋白G或蛋白L的免疫球蛋白結(jié)合蛋白。

本文公開的方法可以在任何溫度下實(shí)施，在所述溫度下至少基本上不損害靶細(xì)胞的生存力。當(dāng)本文中提及至少基本上不是有害的、不是不利的或者至少基本上不影響生存力的條件時(shí)，是指在這種條件下可以回收的具有全部生存力的靶細(xì)胞的百分比是至少70％，包含至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法在約20℃或以下，例如約14℃或以下、約9℃或以下或者約6℃或以下的溫度下實(shí)施。如果水性基質(zhì)用來包含靶細(xì)胞的話，根據(jù)待分離的靶細(xì)胞，合適的溫度范圍可以是例如約2℃至約45℃，包含約2℃至約40℃、約3℃至約35℃，或約4℃至約30℃。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法在恒溫值下實(shí)施，或者在選擇的溫度值±約5℃、±約4℃、±約3℃、±約2℃、±約1℃或±約0.5℃下實(shí)施。溫度可以例如選擇為具有約5℃、約10℃、約15℃、約20℃或約25℃的值。在一些實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的方法過程中改變溫度，即增加、減少或通過其組合改變。例如溫度可以在以上定義的范圍內(nèi)改變，如在約2℃至約40℃范圍內(nèi)或約3℃至約35℃范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠憑借經(jīng)驗(yàn)確定合適的溫度，綜合考慮細(xì)胞的性質(zhì)和分離條件。例如，溫度不敏感細(xì)胞如癌細(xì)胞可在室溫或甚至升高的溫度如37℃下進(jìn)行分離。

在本發(fā)明的方法中，特異性結(jié)合受體分子的受體分子結(jié)合試劑的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)B可以例如是抗體、其片段和具有抗體樣功能的蛋白質(zhì)性結(jié)合分子。(重組)抗體片段的實(shí)例是Fab片段、Fv片段、單鏈Fv片段(scFv)、二價(jià)抗體片段如(Fab)2’-片段、雙體、三體(Iliades,P.,等,FEBS Lett(1997)409,437-441)、十體(Stone,E.,等,Journal of Immunological Methods(2007)318,88–94)和其他結(jié)構(gòu)域抗體(Holt,L.J.,等,Trends Biotechnol.(2003),21,11,484-490)。在一些實(shí)施方案中，受體分子結(jié)合試劑的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)可以是二價(jià)蛋白質(zhì)性人工結(jié)合分子如二聚體脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白，其也被稱為“duocalin”。在一些實(shí)施方案中，受體結(jié)合試劑可以具有單一第二結(jié)合位點(diǎn)，即它可以是單價(jià)的。單價(jià)受體結(jié)合試劑的實(shí)例包括、但不限于單價(jià)抗體片段、具有抗體樣結(jié)合特性的蛋白質(zhì)性結(jié)合分子或MHC分子。單價(jià)抗體片段的實(shí)例包括、但不限于Fab片段、Fv片段、和單鏈Fv片段(scFv)，包括二價(jià)單鏈Fv片段。

如上所述，具有抗體樣功能的蛋白質(zhì)性結(jié)合分子的實(shí)例是基于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族多肽的突變蛋白(參見例如，WO 03/029462，Beste等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)96,1898-1903)。脂質(zhì)運(yùn)載蛋白，例如膽汁三烯結(jié)合蛋白、人嗜中性粒細(xì)胞明膠酶-相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、人載脂蛋白D或人淚脂質(zhì)運(yùn)載蛋白，擁有可以被修飾的天然配體-結(jié)合位點(diǎn)，使得它們結(jié)合給定的靶。具有抗體樣結(jié)合性質(zhì)的蛋白質(zhì)性結(jié)合分子的其他實(shí)例可以用作特異性結(jié)合受體分子的受體結(jié)合試劑，所述實(shí)例包括、但不限于所謂的glubody(參見如國際專利申請WO 96/23879)，基于錨蛋白支架(Mosavi,L.K.,等人,Protein Science(2004)13,6,1435-1448)或晶體支架(如國際專利申請WO 01/04144)的蛋白，Skerra,J.Mol.Recognit.(2000)13,167-187中所描述的蛋白質(zhì)，AdNectin、tetranectin和avimer。avimer包括通過人受體結(jié)構(gòu)域家族的外顯子改組進(jìn)化的多價(jià)avimer蛋白質(zhì)，其含有作為多個(gè)結(jié)構(gòu)域串在若干細(xì)胞表面受體中出現(xiàn)的所謂的A-結(jié)構(gòu)域(Silverman,J.,等,Nature Biotechnology(2005)23,1556-1561)。源自人纖連蛋白的結(jié)構(gòu)域的adnectin包含三個(gè)可以針對與靶的免疫球蛋白樣結(jié)合進(jìn)行工程化的環(huán)(Gill,D.S.&Damle,N.K.,Current Opinion in Biotechnology(2006)17,653-658)。源于相應(yīng)人同源三聚體蛋白質(zhì)的tetranectin，同樣在可以針對所需結(jié)合進(jìn)行改造的C-型凝集素結(jié)構(gòu)域中包含環(huán)區(qū)(出處同上)。

合適的蛋白質(zhì)性結(jié)合分子的其他實(shí)例是EGF-樣結(jié)構(gòu)域、Kringle-結(jié)構(gòu)域、纖連蛋白I型結(jié)構(gòu)域、纖連蛋白II型結(jié)構(gòu)域、纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域、PAN結(jié)構(gòu)域、G1a結(jié)構(gòu)域、SRCR結(jié)構(gòu)域、Kunitz/Bovine胰腺胰蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域、淀粉酶抑制劑(tendamistat)、Kazal-型絲氨酸蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域、Trefoil(P-型)結(jié)構(gòu)域、血管性血友病因子C型結(jié)構(gòu)域、過敏毒素樣結(jié)構(gòu)域、CUB結(jié)構(gòu)域、甲狀腺球蛋白I型重復(fù)、LDL-受體A類結(jié)構(gòu)域、Sushi結(jié)構(gòu)域、連接(Link)結(jié)構(gòu)域、血小板反應(yīng)蛋白I型結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(例如，結(jié)構(gòu)域抗體或駱駝重鏈抗體)、C-型凝集素結(jié)構(gòu)域、MAM結(jié)構(gòu)域、血管性血友病因子A型結(jié)構(gòu)域、生長調(diào)節(jié)素B結(jié)構(gòu)域、WAP-型四二硫化物核心結(jié)構(gòu)域、F5/8C型結(jié)構(gòu)域、血液結(jié)合素結(jié)構(gòu)域、SH2結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域、層粘連蛋白-型EGF-樣結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域、“Kappabody”(參見Ill.等，Protein Eng(1997)10,949-57)、所謂的“小體(minibody)”(Martin等,EMBO J(1994)13,5303-5309)、雙體(參見Holliger等，PNAS USA(1993)90,6444-6448)、所謂的“Janusis”(參見Traunecker等，EMBO J(1991)10,3655-3659或Traunecker等，Int J Cancer(1992)增刊7,51-52)、納米抗體、微體、affilin、affibody、knottin、泛素、鋅指蛋白、自體熒光蛋白或富含亮氨酸的重復(fù)蛋白。具有抗體樣功能的核酸分子的實(shí)例是適體。適體折疊成限定的三維基序并且顯示對于給定靶結(jié)構(gòu)的高親和性。

本文公開的方法也可以使用部件試劑盒實(shí)施，例如，所述試劑盒設(shè)計(jì)為進(jìn)行如上詳述的方法。所述試劑盒可以包括如上定義的受體分子結(jié)合試劑。所述試劑盒例如可以包括填充如在溶液中的受體結(jié)合試劑的容器。所述試劑盒可進(jìn)一步包括如上定義的多聚化試劑。例如，所述試劑盒可以包括填充如在溶液中的多聚化試劑的容器。所述試劑盒還可以包括如上定義的色譜基質(zhì)，其可以(預(yù))裝填到柱子如濾筒中。在一些實(shí)施方案中，與這種色譜基質(zhì)和/或容器相關(guān)的，提供以如何使用該試劑盒來實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的方法的說明書形式的通知。

本文所述方法還可包括多個(gè)固定相如若干彼此獨(dú)立使用的色譜柱的應(yīng)用。所述方法還包括多個(gè)彼此獨(dú)立使用的受體分子結(jié)合試劑和多聚化試劑的應(yīng)用。在一些實(shí)施方案中，使用第一組匹配的受體分子結(jié)合試劑、多聚化試劑和固定相，和第二組及任何其它組匹配的受體結(jié)合試劑、多聚化試劑和固定相。這樣的組合可用于多次實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶細(xì)胞在其表面上具有多個(gè)不同的受體分子。對于每個(gè)受體，可以獨(dú)立實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法。當(dāng)在本發(fā)明方法的第二次運(yùn)行中將靶細(xì)胞固定在固定相時(shí)，來自第一次運(yùn)行的任何剩余試劑，即不同的受體結(jié)合試劑和多聚化試劑，通常不結(jié)合固定相，并由此將它們從靶細(xì)胞移除。然而，本文所述方法的任何重復(fù)還可以包括作為“移除濾筒”的固定相(除了提供合適的配體用于形成相應(yīng)的多價(jià)結(jié)合復(fù)合物來固定靶細(xì)胞外)在移除前一次運(yùn)行所剩余的任何試劑中的用途。因此，為靶細(xì)胞上第一受體分子設(shè)計(jì)的第一次運(yùn)行可涉及采用第一受體分子結(jié)合試劑和第一多聚化試劑。為第二受體分子設(shè)計(jì)的第二次運(yùn)行可涉及采用第二受體分子結(jié)合試劑和第二多聚化試劑。

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于自樣品中分離靶細(xì)胞的裝置，所述裝置包括

-包含配體L的固相，其中所述配體L能夠特異性地結(jié)合配體結(jié)合配偶體LB，所述配體結(jié)合配偶體LB存在于用于分離靶細(xì)胞的受體分子結(jié)合試劑或多聚化試劑中，所述配體L由此允許所述靶細(xì)胞在所述固相上的可逆固定，

-以下中的至少一個(gè)

a)第一固定相，其中所述第一固定相適用于細(xì)胞分離，所述第一固定相是凝膠過濾基質(zhì)和/或親和色譜基質(zhì)，其中所述基質(zhì)包含親和試劑，所述親和試劑具有特異性結(jié)合包含在所述受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體C的結(jié)合位點(diǎn)Z，由此允許所述受體分子結(jié)合試劑在所述第一固定相上的固定和所述受體分子結(jié)合試劑從包含所述靶細(xì)胞的洗脫液中的移除，

或

b)第二固定相，其中所述第二固定相包含配體L，其中所述配體L能夠特異性結(jié)合存在于用于分離靶細(xì)胞的受體分子結(jié)合試劑或多聚化試劑中的配體結(jié)合配偶體LB，所述配體L由此允許所述受體分子結(jié)合試劑或所述多聚化試劑在所述第二固定相上的固定和所述受體分子結(jié)合試劑或所述多聚化試劑從包含所述靶細(xì)胞的洗脫液中的移除。

在這種裝置中，所述固相和所述第一或第二固定相中的至少一個(gè)可以是流體連接的。在一個(gè)實(shí)施方案中，裝置的所述第一固定相和/或所述第二固定相包含在色譜柱中或是平面固定相。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述固相包含在用于分離靶細(xì)胞的間歇反應(yīng)器中。所述間歇反應(yīng)器可以是包含其上固定有配體L的固相的容器?？蛇x地，所述間歇反應(yīng)器包含其上固定有配體L的珠子。在不同的實(shí)施方案中，所述固相是適于色譜法的固定相。

若間歇反應(yīng)器包含珠子，則本發(fā)明的裝置可進(jìn)一步包括將所述珠子保持在所述間歇反應(yīng)器中的保持裝置。若所述珠子是磁珠，則所述保持裝置可以是磁體。

在所述裝置的一個(gè)實(shí)施方案中，所述固相流體連接到所述第一固定相，且所述第一固定相流體連接到所述第二固定相。可選地，裝置中固定相的順序可以顛倒使得所述固相流體連接到所述第二固定相，且所述第二固定相流體連接到所述第一固定相。

在所述裝置的一個(gè)實(shí)施方案中，包含在固相和/或第二固定相中的配體L是生物素或生物素衍生物。這種生物素衍生物的實(shí)例包括、但不限于脫硫生物素、亞氨基生物素、2-(4'-羥基偶氮苯)苯甲酸(HABA)或鏈霉親和素結(jié)合肽。

在本發(fā)明裝置的另一個(gè)實(shí)施方案中，包含在第一固定相中的親和試劑可以是鏈霉親和素、鏈霉親和素突變蛋白、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突變蛋白。

本發(fā)明還涉及一種用于從樣品中分離靶細(xì)胞的設(shè)備，其中所述設(shè)備包括本文公開的用于分離靶細(xì)胞的裝置。

根據(jù)上述內(nèi)容，本發(fā)明還涉及包含配體L的固相的用途，其中所述配體L能夠特異性結(jié)合配體結(jié)合配偶體LB，用于可逆地固定或分離靶細(xì)胞。在示例性用途中，所述配體可以是生物素或如脫硫生物素、亞氨基生物素、2-(4'-羥基偶氮苯)苯甲酸(HABA)或鏈霉親和素結(jié)合肽的生物素衍生物。本文特別考慮包含配體L的固相在如本文所定義的分離靶細(xì)胞或用于固定靶細(xì)胞的方法中的用途，其中配體L能夠特異性結(jié)合配體結(jié)合配偶體LB。

由于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠很容易理解本發(fā)明的公開內(nèi)容，根據(jù)本發(fā)明可以同樣采用目前存在的或以后將被開發(fā)的物質(zhì)、手段、用途、方法或步驟的其他組合，所述組合執(zhí)行與本文描述的相應(yīng)的示例性實(shí)施方案基本上相同的功能或獲得基本上相同的結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)例

實(shí)施例1：“細(xì)胞純化柱”的構(gòu)建

從柱(BioRad；產(chǎn)品編號(hào)732-6008)的上端約45mm處切下該柱的下部出口(圖8A)。將剩余的上端柱體夾入“離心和試管”(Becton-Dickinson；產(chǎn)品號(hào)352235；參見圖8B)的過濾管蓋子中。該蓋子含有能夠保持Superflow^TM樹脂的35μm尼龍網(wǎng)。將具有柱的蓋子放回12x75mm、5mL的聚苯乙烯圓底試管上(圖8A)。所述柱子準(zhǔn)備用Superflow樹脂填充。

實(shí)施例2：生物素-Superflow(0,38mg/mL生物胞素)的制備

根據(jù)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)⑸锇?Sigma-Aldrich，產(chǎn)品編號(hào)B4261)偶聯(lián)至6(Sterogene，產(chǎn)品編號(hào)806)。簡言之，在1MNaCO₃中洗滌并重懸浮Superflow樹脂。采用Acetonitril(10ml/ml)；Bromcyan(0.2g/ml)實(shí)施活化。用pH 9.5的1M NaCO₃和1M HCl洗滌所述樹脂。在0.1M硼酸；0.5M NaSO₄中使生物胞素偶聯(lián)至Superflow樹脂(0.38mg/mL)以得到生物素-Superflow。用pH 8.0的50mM Tris洗滌得到的生物素-Superflow。

在本發(fā)明的分離方法中，所述樹脂作為固相，生物素作為配體L，以經(jīng)由作為配體L的生物素和作為配體結(jié)合配偶體LB的鏈霉親和素突變蛋白“”之間的結(jié)合，允許靶細(xì)胞/多價(jià)結(jié)合復(fù)合物在固定相上的可逆固定。

實(shí)施例3：使用Ficoll梯度離心從血液中分離淋巴細(xì)胞

在該實(shí)施例中，根據(jù)制造商的方案采用Amersham-BiosciencesPlus(6x500ml#17-1440-03)。簡言之，使用注射器無菌地取出所需體積的Ficoll(3ml用于4ml稀釋的抗凝血液樣品)。將Ficoll-Paque Plus(3ml)加入離心管中。小心地將稀釋的血液樣品(4ml)鋪在Plus上。在室溫(20℃)下，以400xg離心20分鐘。使用干凈的巴斯德吸管取出上層，使淋巴細(xì)胞層在界面處未被擾動(dòng)。采用干凈的巴斯德吸管將淋巴細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中。向試管中的淋巴細(xì)胞中加入3倍體積或以上的平衡鹽溶液。通過輕輕地將淋巴細(xì)胞吸入和取出巴斯德吸管來使它們懸浮。在10-100×g和18-20℃下離心10分鐘，隨后移除上清液。

實(shí)施例4：包含可溶性多聚Strep-Tactin、攜帶鏈霉親和素結(jié)合標(biāo)簽的抗CD4Fab片段、和T細(xì)胞的多價(jià)結(jié)合復(fù)合物的制備

根據(jù)本領(lǐng)域所用的標(biāo)準(zhǔn)方案制備人血沉棕黃層(buffy coat)細(xì)胞。將100μl多聚化的可溶性Strep-Tactin(濃度1.7mg/ml，可作為“PE forFab streptamer”獲得，產(chǎn)品編號(hào)6-5001-010，IBA GmbH哥廷根,德國–此處注意到鏈霉親和素突變蛋白的藻紅蛋白(PE)熒光標(biāo)記未在這些實(shí)驗(yàn)中使用，因?yàn)樵诒景l(fā)明的方法中其不產(chǎn)生干擾而保持在試劑中)與900μl緩沖液IS(在pH 7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的0.5％BSA(w/v)，其中PBS＝8.06mM Na₂HPO₄ 1.47mM KH₂PO₄、137mM NaCl)混合，以獲得170μg/ml的1:10稀釋液。6μg稀釋的多聚化Strep-Tactin(35.3μl)與4μg在其重鏈攜帶鏈霉親和素結(jié)合肽(SAWSHPQFEK(GGGS)₂GGSAWSHPQFEK，SEQ ID NO：13，也稱為)的CD4結(jié)合Fab-片段(250μg/ml的16μl，例如可作為CD4Fab Streptamer分離試劑盒產(chǎn)品編號(hào)6-8000-206的一部分獲得，IBA GmbH，哥廷根，德國)和74μl緩沖液IS混合至終體積為125μl，并在4℃下，在15ml管中溫育45分鐘。在該溫育過程中，所述Fab片段將通過其鏈霉親和素結(jié)合肽與多聚化Strep-tactin(用作多聚化試劑)結(jié)合。

以100μl的體積加入1×10⁷個(gè)細(xì)胞的量并在冰上與抗CD4Fab-片段/Strep-Tactin溫育20分鐘。將細(xì)胞重懸浮(用于洗滌)在10ml緩沖液IS中，以400×g離心，移除上清液并將細(xì)胞重懸浮在3ml緩沖液IS中。通過這樣操作，形成了靶T細(xì)胞結(jié)合的多價(jià)結(jié)合復(fù)合物。

實(shí)施例5：CD4+T細(xì)胞的色譜分離

根據(jù)實(shí)施例1的描述組裝“細(xì)胞純化柱”。用1ml床體積的生物素-Superflow(0.38mg/ml生物胞素)(參見實(shí)施例2)填充柱子。按照實(shí)施例3的描述從血沉棕黃層(buffy coat)分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。

將100μl多聚化Strep-Tactin(1.7mg/ml)與900μl的緩沖液IS混合來得到170μg/ml的1:10稀釋液。將6μg稀釋的多聚化Strep-Tactin(35.3μl)與用于實(shí)施例4的4μg抗CD4Fab片段(250μg/ml的16μl)和74μl的緩沖液IS混合至終體積為125μl，并在4℃下，在15ml管中溫育45分鐘。根據(jù)實(shí)施例4，以100μl的體積加入1×10⁷個(gè)細(xì)胞并與抗CD4Fab片段/Strep-Tactin在4℃下溫育20分鐘。將細(xì)胞重懸浮在10ml緩沖液IS中，以400×g離心，移除上清液并將細(xì)胞重懸浮在3ml緩沖液IS中。用1ml冷凍的緩沖液IS平衡該柱兩次。

將實(shí)施例4中獲得的細(xì)胞懸浮液(1×10⁷個(gè)細(xì)胞)以每份1ml的3份施加到柱上，以便通過Strep-Tactin的游離結(jié)合位點(diǎn)與固相的生物素的結(jié)合將靶細(xì)胞固定在柱上。3ml的總體積在約15分鐘內(nèi)通過柱子。收集流出物。用1ml緩沖液IS洗滌柱子5次?？偣?ml在約25分鐘內(nèi)通過柱子。收集并合并流出物以及洗滌體積(級分D+W)。通過5次加入具有1mM生物素的1ml緩沖液IS來洗脫細(xì)胞，并收集(級分E)。總共5ml在約20分鐘內(nèi)通過柱子。為了移除那些由于在柱樹脂內(nèi)的非特異性結(jié)合或某種類型的堆積而不能被洗脫的細(xì)胞，在下部出口處蓋上柱子，將樹脂用1ml緩沖液IS重懸浮，并用1ml移液器頭通過上下吹吸來大力混合。然后取下蓋子并收集流出物(flow out)。將這一程序重復(fù)一次并與第一次級分合并以得到級分R。通過在緩沖液IS中離心(400×g)洗滌所有收集的細(xì)胞懸浮液，并用門控抗體染色。在50μl具有2μl門控抗體(在這種情況下為CD3-PE和CD4-APC)的緩沖液IS中進(jìn)行染色。將細(xì)胞在4℃下在黑暗中溫育20分鐘，并通過在200μl緩沖液IS中離心(400×g)來洗滌用于FACS分析。在Accuri C6流式細(xì)胞術(shù)中進(jìn)行FACS分析。圖6A至6F描繪了在FACS分析中測量的級分的Accuri C6圖。

結(jié)果

圖7提供了結(jié)果的概述。

·總細(xì)胞的FACS分析表明在門控淋巴細(xì)胞中39.56％CD4⁺細(xì)胞的濃度。

·流出物和洗滌級分中的細(xì)胞被消耗至4.01％CD4⁺細(xì)胞的濃度。

·通過生物素洗脫表明CD4⁺細(xì)胞的純度為95.04％。

·在移液管處理柱樹脂后，物理洗脫的細(xì)胞仍顯示出88.26％的純度。

實(shí)施例6：采用包含GST-標(biāo)記的Strep-Tactin和Fab-片段的多價(jià)結(jié)合復(fù)合物分離T細(xì)胞

根據(jù)公認(rèn)的程序制備人血沉棕黃層(buffy coat)細(xì)胞。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序來產(chǎn)生Strep-Tactin和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。采用GST Spin Trap柱(GE Healthcare Biosciences,Uppsala,Sweden)，根據(jù)制造商的說明對所述融合蛋白進(jìn)行親和純化。采用“控制蛋白交聯(lián)試劑盒”(Thermo Fisher Scientific Inc,Waltham,MA,U.S.A.,產(chǎn)品23456)，根據(jù)制造商的說明使所述GST-標(biāo)記的Strep-Tactin多聚化。125μl多聚化GST-標(biāo)記的Strep-Tactin(2.0mg/ml)與875μl pH 7.3的磷酸鹽緩沖鹽水混合以得到250μg/ml的1:8的稀釋液。將6μg稀釋的多聚化GST-Strep-Tactin(35.3μl)與4μg攜帶鏈霉親和素結(jié)合肽的Fab片段溫育，并隨后加入到實(shí)施例4中描述的細(xì)胞中，其中采用pH 7.3的磷酸鹽緩沖鹽水重懸浮所述細(xì)胞。

根據(jù)實(shí)施例1組裝“細(xì)胞純化柱”。用1ml床體積的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathione Sepharose 4 Fast Flow,GE Healthcare Biosciences,Uppsala,瑞典)填充柱子。用1ml pH 7.3的冷磷酸鹽緩沖鹽水平衡該柱兩次。將細(xì)胞懸浮液以小部分施加至該柱上。收集流出物并用1ml pH 7.3的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌該柱5次。收集洗滌級分。通過加入1ml具有10mM谷胱甘肽和1mM生物素的pH 8.0的50mM Tris/HCl將細(xì)胞洗脫。收集洗脫液。進(jìn)一步用1ml含有10mM谷胱甘肽的pH 8.0的50mM Tris/HCl洗滌該柱5次。未洗脫的細(xì)胞可以按照實(shí)施例5所述移除。

實(shí)施例7：采用包含生物素-NTA、Fab-His的多價(jià)結(jié)合復(fù)合物分離T細(xì)胞

根據(jù)公認(rèn)的程序制備人血沉棕黃層(buffy coat)細(xì)胞。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序來產(chǎn)生6×His標(biāo)記的CD4結(jié)合Fab片段。采用Ni-NTA spin柱(Qiagen,Valencia,CA,U.S.A.)，根據(jù)制造商的說明對融合蛋白進(jìn)行親和純化。按照Schmidt等(上文，2011)所述合成生物素與多個(gè)次氮基三乙酸(NTA)部分的綴合物。將所述生物素/NTA綴合物以約0.1μg/ml的濃度溶解在含有1mg/ml NiCl₂的pH 7.3的磷酸鹽緩沖鹽水中，并在保留鏈霉親和素的游離生物素位點(diǎn)(可作為配體結(jié)合配偶體LB)的情況下，將所述生物素/NTA綴合物與鏈霉親和素接觸以形成多聚化NTA部分。將88μl多聚化生物素/Ni-NTA鏈霉親和素綴合物與4μg 6×His標(biāo)記的CD4-Fab(16μl，250μg/ml)和21μl緩沖液IS混合至終體積為125μl，并在4℃下，在15ml管中溫育1小時(shí)。如實(shí)施例4所述，以100μl的體積加入1×10⁷個(gè)細(xì)胞并在冰上與多聚化的CD4-Fab/生物素/Ni-NTA溫育20分鐘，采用pH 7.3的磷酸鹽緩沖鹽水來重懸浮所述細(xì)胞。

根據(jù)實(shí)施例1組裝“細(xì)胞純化柱”。用1ml床體積的實(shí)施例2中制備的生物素-Superflow(0.38mg/ml生物胞素)填充柱子。用1ml pH 7.3的冷磷酸鹽緩沖鹽水平衡該柱兩次。將細(xì)胞懸浮液以小部分施加至該柱上。收集流出物并用1ml pH 7.3的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌該柱5次。收集洗滌級分。通過5次加入1ml含有1mM EDTA的pH 7.3的磷酸鹽緩沖鹽水將細(xì)胞洗脫。雖然EDTA的加入使攜帶六組氨酸標(biāo)簽(受體分子結(jié)合試劑)的CD4Fab片段從多聚化試劑中釋放，由此也使細(xì)胞從固相中釋放，但多聚化試劑將(經(jīng)由鏈霉親和素與作為固相的配體L的生物素的結(jié)合)保留固定在固相上。收集洗脫液。進(jìn)一步用1ml pH 7.3的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌該柱5次。未洗脫的細(xì)胞可以按照實(shí)施例5所述移除。

實(shí)施例8：采用包含F(xiàn)LAG-Strep-Tactin、Fab-Strep的多價(jià)結(jié)合復(fù)合物分離T細(xì)胞

根據(jù)公認(rèn)的程序制備人血沉棕黃層(buffy coat)細(xì)胞。按照實(shí)施例4和5使用攜帶鏈霉親和素結(jié)合肽的CD4結(jié)合Fab片段。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序來產(chǎn)生具有FLAG-標(biāo)簽(DYKDDDDK)的Strep-Tactin。采用M2磁珠(Sigma-Aldrich)，根據(jù)制造商的說明對融合蛋白進(jìn)行親和純化。采用“控制蛋白交聯(lián)試劑盒”(Thermo Fisher Scientific Inc,Waltham,MA,U.S.A.,產(chǎn)品23456)，根據(jù)制造商的說明使所述FLAG-標(biāo)記的Strep-Tactin多聚化。按照實(shí)施例4和6中所述將多聚化FLAG-標(biāo)記的Strep-Tactin、Fab-Strep和細(xì)胞組合。

根據(jù)實(shí)施例1組裝“細(xì)胞純化柱”。用1ml床體積的M1瓊脂糖親和凝膠(Sigma-Aldrich)填充柱子。用1ml pH 7.3的冷磷酸鹽緩沖鹽水平衡該柱兩次。將細(xì)胞懸浮液以小部分施加至該柱上。收集流出物并用1ml pH 7.3的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌該柱5次。收集洗滌級分。通過5次加入1ml也含有1mM生物素的FLAG肽溶液(Sigma，產(chǎn)品號(hào)F3290)將細(xì)胞洗脫。收集洗脫液。進(jìn)一步用1ml FLAG肽/生物素溶液洗滌該柱2次。未洗脫的細(xì)胞可以按照實(shí)施例5所述移除。

實(shí)施例9：采用包含多聚化鈣調(diào)蛋白和攜帶鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽的Fab-片段的多價(jià)結(jié)合復(fù)合物分離T細(xì)胞

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序來產(chǎn)生CD4結(jié)合Fab片段和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽(CBP)的融合蛋白。采用鈣調(diào)蛋白親和樹脂(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,U.S.A.)，根據(jù)制造商的說明采用間歇結(jié)合方法對該Fab片段-CBP融合蛋白進(jìn)行親和純化。多聚化試劑是低聚Strep-Tactin，向其中加入生物素化的鈣調(diào)蛋白以得到化學(xué)計(jì)量的多聚化鈣調(diào)蛋白，其保留了可以作為配體結(jié)合配偶體LB的生物素結(jié)合位點(diǎn)。將抗CD4Fab片段-CBP融合蛋白與低聚Strep-Tactin在4℃下，于緩沖液IS中溫育1小時(shí)，所述低聚Strep-Tactin具有已經(jīng)固定于其上的生物素化的鈣調(diào)蛋白。

根據(jù)實(shí)施例1組裝“細(xì)胞純化柱”。用1ml床體積的實(shí)施例2中制備的生物素-Superflow(0,38mg/ml生物胞素)填充柱子。用1ml pH 7.3的冷磷酸鹽緩沖鹽水平衡該柱兩次。將細(xì)胞懸浮液以小部分施加至該柱上。收集流出物并用1ml pH 7.3的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌該柱5次。收集洗滌級分。通過5次加入1ml含有1mM EDTA的pH 7.3的磷酸鹽緩沖鹽水將細(xì)胞洗脫。與實(shí)施例7類似，在本實(shí)施例中EDTA使攜帶鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽(受體分子結(jié)合試劑)的CD4Fab片段從多聚化試劑中釋放，由此也使細(xì)胞從固相中釋放，但多聚化試劑將(經(jīng)由鏈霉親和素與作為固相的配體L的生物素的結(jié)合)保留固定在固相上。收集洗脫液。進(jìn)一步用1ml含有1mM EDTA的pH 7.3的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌該柱5次。未洗脫的細(xì)胞可以按照實(shí)施例5所述移除。

實(shí)施例10：采用未標(biāo)記的細(xì)胞和Fab片段功能化的樹脂(現(xiàn)有技術(shù))相對于采用Fab片段預(yù)溫育的細(xì)胞和本發(fā)明的生物素樹脂，基于移液器頭單步驟純化源自PBMC的人CD8+細(xì)胞

對于這一實(shí)驗(yàn)，采用源自全血單位的血沉棕黃層，使用標(biāo)準(zhǔn)Ficoll-Hypaque密度離心在室溫下制備外周血單核細(xì)胞(參見實(shí)施例3)。

實(shí)施例10.1：采用Fab功能化樹脂，根據(jù)本領(lǐng)域方法分離未標(biāo)記的細(xì)胞(對比例)

基本如國際專利申請WO 2013/124474中所述，采用移液器頭作為柱子，通過色譜純化從PBMC制備物中分離CD8+細(xì)胞。

簡言之，用1.5μg抗-CD8 Fab-片段裝載填充100μl-瓊脂糖(產(chǎn)品編號(hào)：6-0425-000，IBA GmbH,哥廷根)的移液器頭，所述抗-CD8 Fab-片段在重鏈的C-末端攜帶順序設(shè)置的兩個(gè)Strep-tagII鏈霉親和素結(jié)合分子(下劃線)，即SAWSHPQFEK(GGGS)₂GGSAWSHPQFEK((SEQ ID NO:13)，該序列也以其商標(biāo)名“”而已知)，(隨后命名為抗-CD8 Fab-TST和對應(yīng)商購可獲得的產(chǎn)品具有產(chǎn)品編號(hào)：6-8003,IBA GmbH,哥廷根)。為此，在細(xì)胞分離之前，將在300μl緩沖液IS中的1.5μg抗-CD8 Fab-TST以200μl/min的速度施加至含有-瓊脂糖的移液器頭。對于靶細(xì)胞分離，將1×10⁷個(gè)重懸浮在1ml緩沖液IS中的新鮮制備的PBMC以300μl/min的速度通過樣品的兩個(gè)上下循環(huán)施加至存在于移液器頭中的-瓊脂糖基質(zhì)上。隨后，通過用1ml緩沖液IS，以2ml/min的速度洗滌三次(上下吹打緩沖液)來將未結(jié)合的(CD8-陰性)細(xì)胞從移液器頭中移除。最終，通過用1ml 100μM D-生物素溶液以600μl/min的流速漂洗，從親和基質(zhì)上卸除結(jié)合的細(xì)胞，隨后通過用2 x ml緩沖液IS以2ml/min的流速?zèng)_洗，從移液器頭中洗脫CD8+靶細(xì)胞，。獨(dú)立地(在單獨(dú)的容器中)合并洗脫的CD8-陽性級分和之前移除的CD8-陰性級分，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析以確定產(chǎn)量和純度。為此，將細(xì)胞重懸浮在100μl緩沖液IS中并在4℃下用抗-人CD8-PE(OKT8)(來自BioLegend，產(chǎn)品編號(hào)300908)和抗-人CD3-APC(OKT3)(來自BioLegend，產(chǎn)品編號(hào)317318)抗體于黑暗中染色20分鐘。之后，在緩沖液IS中洗滌并重懸浮細(xì)胞。加入碘化丙啶(PI)以區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞。用流式細(xì)胞分析儀(Accuri C6，BD)獲得數(shù)據(jù)并用C Flow Plus分析軟件(BD)分析。

實(shí)施例10.2：根據(jù)本發(fā)明的方法，采用生物素化樹脂分離用Fab片段預(yù)溫育的細(xì)胞

在4℃下，黑暗中，用1.5μg抗-CD8 Fab-TST(其作為含有針對多聚化試劑的結(jié)合配偶體C的受體分子結(jié)合試劑)溫育1μg多聚化可溶性Strep-Tactin(產(chǎn)品編號(hào)：6-0911-000,IBA GmbH，哥廷根，其用作多聚化試劑)45分鐘。將新鮮制備的PBMC(30μl緩沖液IS中1×10⁷個(gè)細(xì)胞)轉(zhuǎn)移至Fab片段/多聚化Strep-Tactin制備物中。在4℃下，黑暗中，將含有PBMC和加載Fab片段的多聚化Strep-Tactin的反應(yīng)混合物溫育20分鐘，并用1ml緩沖液IS洗滌一次。

移液器頭中填充100μl作為包含配體L的固相的生物素-瓊脂糖(產(chǎn)品編號(hào)：6-0446-000，IBA GmbH，哥廷根)。將用抗-CD8 Fab-TST/多聚化Strep-Tactin預(yù)溫育的細(xì)胞以300μl/min的速度通過采用樣品的兩個(gè)上下循環(huán)施加至存在于移液器頭中的-瓊脂糖基質(zhì)上。隨后，通過用1ml緩沖液IS，以2ml/min的速度洗滌三次(上下吹打緩沖液)來將未結(jié)合的(CD8-陰性)細(xì)胞從移液器頭中移除。最終，通過用1ml 100μM D-生物素溶液以600μl/min的流速漂洗，從親和基質(zhì)上卸除結(jié)合的細(xì)胞，隨后通過用2 x ml緩沖液IS以2ml/min的流速?zèng)_洗，從移液器頭中洗脫CD8+靶細(xì)胞。獨(dú)立地(在單獨(dú)的容器中)合并洗脫的CD8-陽性級分和之前移除的CD8-陰性級分，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析以確定產(chǎn)量和純度。為此，將細(xì)胞重懸浮在100μl緩沖液IS中并在4℃下用抗-人CD8-PE(OKT8)(來自BioLegend，產(chǎn)品編號(hào)300908)和抗-人CD3-APC(OKT3)(來自BioLegend，產(chǎn)品編號(hào)317318)抗體于黑暗中染色20分鐘。之后，在緩沖液IS中洗滌并重懸浮細(xì)胞。加入碘化丙啶(PI)以區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞。用流式細(xì)胞分析儀(Accuri C6，BD)獲得數(shù)據(jù)并用C Flow Plus分析軟件(BD)分析。

實(shí)施例10.1和10.2的結(jié)果比較

從使用國際專利申請WO 2013/124474中描述的方法(圖9A)和本發(fā)明的方法(圖9B)的代表性分離實(shí)驗(yàn)的Accuri C6圖可以看出，兩種方法都能夠分離CD8+靶細(xì)胞。圖9C中描述的兩種方法的結(jié)果的比較(圖9C中，數(shù)字0015表示國際專利申請WO 2013/124474的方法的結(jié)果，而數(shù)字0016表示本發(fā)明的方法的結(jié)果；以％表示的數(shù)字是指三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值)表明，在將等量的抗-CD8 Fab-TST用作受體分子結(jié)合試劑時(shí)，使用本發(fā)明的方法以89％的產(chǎn)量和70％的純度獲得CD8+細(xì)胞，而國際專利申請WO 2013/124474的方法以63％的純度提供產(chǎn)量為72％的CD8+細(xì)胞。這表明本發(fā)明的方法提高了待分離的靶細(xì)胞的產(chǎn)量和純度。

實(shí)施例11：使用降低量的Fab-片段的，采用未標(biāo)記的細(xì)胞和Fab片段功能化的樹脂相對于Fab片段預(yù)溫育的細(xì)胞和生物素樹脂，基于移液器單步驟純化源自PBMC的人CD3+細(xì)胞

同樣在本實(shí)施例中，將本發(fā)明的分離靶細(xì)胞的方法的性能與使用如國際專利申請WO 2013/124474中描述的移液器頭的色譜純化進(jìn)行比較。

在這一實(shí)驗(yàn)中，通過實(shí)施例10中所述移液器頭的使用，采用未標(biāo)記的細(xì)胞和如國際專利申請WO 2013/124474所述用Fab片段功能化的Strep-tactin樹脂將CD3+細(xì)胞從PBMC制備物中分離。作為比較，采用根據(jù)本發(fā)明的方法用Fab片段預(yù)-溫育的細(xì)胞和生物素樹脂來分離CD3+細(xì)胞。所采用的抗-CD3Fab-片段(產(chǎn)品編號(hào)：6-8001,IBA GmbH，哥廷根)在其重鏈C-末端攜帶(SAWSHPQFEK(GGGS)₂GGSAWSHPQFEK；(SEQ ID NO:13))。與實(shí)施例10相比，將Fab片段的量從1.5μg降低至0.75μg，而樹脂體積、多聚化可溶性Strep-Tactin的量和細(xì)胞數(shù)量分別保持不變。采用抗-人CD3-APC(OKT3)(來自BioLegend，產(chǎn)品編號(hào)317318)和抗-人CD4-PE(OKT4)(來自BioLegend，產(chǎn)品編號(hào)317410)抗體，通過流式細(xì)胞術(shù)分析獲得的CD3-陽性級分和CD3-陰性級分。

從使用國際專利申請WO 2013/124474中描述的方法(圖10A)和本發(fā)明的方法(圖10B)的代表性分離實(shí)驗(yàn)的Accuri C6圖可以看出，在這些條件下，兩種方法都再次能夠分離CD8+靶細(xì)胞。圖10C中描述的兩種方法的結(jié)果的比較(圖10C中，數(shù)字0015表示國際專利申請WO 2013/124474的方法的結(jié)果，而數(shù)字0016表示本發(fā)明的方法的結(jié)果；以％表示的數(shù)字是指三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值)表明，在將等量的0.75抗-CD8 Fab-TST用作受體分子結(jié)合試劑時(shí)，使用本發(fā)明的方法以72％的產(chǎn)量和90％的純度獲得CD8+細(xì)胞，而國際專利申請WO 2013/124474的方法以77％的純度提供產(chǎn)量僅為9％的CD8+細(xì)胞。因此，當(dāng)將受體分子結(jié)合試劑的量降低50％(與實(shí)施例10中所用的量相比)時(shí)，采用本發(fā)明的方法的靶細(xì)胞產(chǎn)量和純度均保持恒定，而國際專利申請WO 2013/124474的方法的產(chǎn)量顯著下降。

總結(jié)實(shí)施例5、10和11的結(jié)果，本發(fā)明的方法能夠從PBMC制備物中分離CD4+、CD8+和CD3+細(xì)胞。實(shí)施例10和11的比較表明，與國際專利申請WO 2013/124474中描述的方法相比，受體分子結(jié)合試劑(如攜帶鏈霉親和素結(jié)合肽作為結(jié)合配偶體C的Fab片段)的量可以降低而不引起產(chǎn)量和純度的顯著損失，由此節(jié)省成本和資源。這一比較還表明，本發(fā)明的方法比國際專利申請WO 2013/124474中描述的方法更穩(wěn)健。

實(shí)施例12：采用本發(fā)明的生物素化樹脂、Strep-Tactin和Fab-片段分離B細(xì)胞

在4℃下，黑暗中，用以產(chǎn)品編號(hào)6-8013-100從IBA GmbH商購獲得的1.5μg抗-CD19 Fab片段溫育1μg多聚化可溶性Strep-Tactin(產(chǎn)品編號(hào)：6-0911-000,IBA GmbH，哥廷根，用作多聚化試劑)45分鐘，所述Fab片段(“抗-CD19 Fab-TST”)在重鏈C-末端攜帶，由此作為包含針對多聚化試劑的結(jié)合配偶體C的受體分子結(jié)合試劑。將新鮮制備的PBMC(30μl緩沖液IS中1×10⁷個(gè)細(xì)胞)轉(zhuǎn)移至Fab片段/多聚化Strep-Tactin制備物中。在4℃下，黑暗中，將含有PBMC和加載Fab片段的多聚化Strep-Tactin的反應(yīng)混合物溫育20分鐘，并用1ml緩沖液IS洗滌一次。

移液器頭中填充100μl作為包含配體L的固相的生物素-瓊脂糖(產(chǎn)品編號(hào)：6-0446-000，IBA GmbH，哥廷根)。將用抗-CD19 Fab-TST/多聚化Strep-Tactin預(yù)溫育的細(xì)胞以300μl/min的速度通過采用樣品的兩個(gè)上下循環(huán)施加至存在于移液器頭中的-瓊脂糖基質(zhì)上。隨后，通過用1ml緩沖液IS，以2ml/min的速度洗滌三次(上下吹打緩沖液)來將未結(jié)合的(CD19-陰性)細(xì)胞從移液器頭中移除。最終，通過用1ml 100μM D-生物素溶液以600μl/min的流速漂洗，從親和基質(zhì)上卸除結(jié)合的細(xì)胞，隨后通過用2xml緩沖液IS以2ml/min的流速?zèng)_洗，從移液器頭中洗脫CD19+靶細(xì)胞。獨(dú)立地(在單獨(dú)的容器中)合并洗脫的CD19-陽性級分和之前移除的CD19-陰性級分，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析以確定產(chǎn)量和純度。為此，將細(xì)胞重懸浮在100μl緩沖液IS中并在4℃下用抗-人CD19-APC抗體(來自eBioscience,clon:SJ25C1,產(chǎn)品編號(hào)：17-0198-42)于黑暗中染色20分鐘。之后，在緩沖液IS中洗滌并重懸浮細(xì)胞。加入碘化丙啶(PI)以區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞。用流式細(xì)胞分析儀(Accuri C6，BD)獲得數(shù)據(jù)并用C Flow Plus分析軟件(BD)分析。

本說明書中之前發(fā)表的文件的列表或討論不一定看做是承認(rèn)該文件是現(xiàn)有技術(shù)的一部分或公知常識(shí)。

在缺乏未在本文具體公開的任何一個(gè)或多個(gè)元素、一個(gè)或多個(gè)限制的情況下，可以適當(dāng)?shù)貙?shí)施本文示例性描述的本發(fā)明。因此，例如，術(shù)語“包括”、“包括”、“含有”等應(yīng)該在廣義上理解且沒有限制。此外，本文使用的術(shù)語和表述被用作描述性術(shù)語且沒有限制，在使用這些術(shù)語和表述時(shí)，沒有排除顯示和描述的特征或其部分的等同物的意思，而是應(yīng)認(rèn)識(shí)到各種修改均可在發(fā)明要求保護(hù)的范圍內(nèi)。因此，應(yīng)理解的是，盡管本發(fā)明已經(jīng)通過示例性實(shí)施方案和可選特征進(jìn)行了具體公開，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以尋求對本文公開的其中體現(xiàn)的發(fā)明做出修改和變化，這樣的修改和變化被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。.

本文已經(jīng)全面且一般地描述了本發(fā)明。落入一般公開內(nèi)容內(nèi)的每個(gè)較窄種類和亞屬分組也形成本發(fā)明的部分。這包括本發(fā)明的一般描述，其具有從屬中移除任何主題的條件或否定限制，無論離體材料是否在本文專門敘述。

其他實(shí)施方案在以下權(quán)利要求范圍內(nèi)。此外，在本發(fā)明的特征或方面以馬庫什組的方式描述時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本發(fā)明也由此以馬庫什組的任何個(gè)體成員或成員亞組的形式描述。

序列表

<110> IBA股份有限公司

<120> 分離靶細(xì)胞的方法

<130> LC16310019P

<150> EP14166718.8

<151> 2014-04-30

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鏈霉親和素-結(jié)合肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是Gly或Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是Gly、Lys或Arg

<400> 1

Trp Xaa His Pro Gln Phe Xaa Xaa

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鏈霉親和素-結(jié)合肽

<400> 2

Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鏈霉親和素-結(jié)合肽

<400> 3

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 4

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成肽

<400> 4

His Pro Gln Phe

1

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鏈霉親和素-結(jié)合肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是Trp、Lys或Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是Gly或Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是Gly、Lys或Arg

<400> 5

Xaa Xaa His Pro Gln Phe Xaa Xaa

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鏈霉親和素-結(jié)合肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是Gly或Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是Gly、Lys或Arg

<400> 6

Trp Xaa His Pro Gln Phe Xaa Xaa

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鏈霉親和素-結(jié)合肽

<400> 7

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 8

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鏈霉親和素結(jié)合肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(20)

<223> Xaa是任何氨基酸并且其中多達(dá)12個(gè)可以缺失

<400> 8

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鏈霉親和素-結(jié)合肽

<400> 9

Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鏈霉親和素-結(jié)合肽

<400> 10

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 11

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鏈霉親和素-結(jié)合肽

<400> 11

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25

<210> 12

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鏈霉親和素-結(jié)合肽

<400> 12

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20

<210> 13

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鏈霉親和素-結(jié)合肽

<400> 13

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> Myc-標(biāo)簽

<400> 14

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> HA-標(biāo)簽

<400> 15

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> VSV-G-標(biāo)簽

<400> 16

Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys

1 5 10

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> HSV-標(biāo)簽

<400> 17

Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp

1 5 10

<210> 18

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> V5-標(biāo)簽

<400> 18

Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr

1 5 10

<210> 19

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鏈霉親和素類似物序列位置44至47

<400> 19

Val Thr Ala Arg

1

<210> 20

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鏈霉親和素類似物序列位置44至47

<400> 20

Ile Gly Ala Arg

1

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> T7 表位

<400> 21

Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly

1 5 10