本申請(qǐng)要求2015年5月4日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)62/156,441，2015年4月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)62/149,988以及2014年6月27日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)62/018,448的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容在此參考并入。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及羰基檢測(cè)和定量領(lǐng)域，具體地涉及生物樣品中的含羰基部分的濃度的檢測(cè)和定量。

背景技術(shù)：

含羰基部分的檢測(cè)是已知的，但是生物樣品中的特定低濃度的特定含羰基部分的精確檢測(cè)仍不清楚。已知羰基用于在高溫下引發(fā)鄰苯二胺和對(duì)苯二胺的聚合以產(chǎn)生隨后用于制備產(chǎn)品的固體聚合物的用途，但是苯二胺衍生物用于檢測(cè)在一些生物樣品中的含羰基部分的方法中的用途仍不清楚。此外，測(cè)量溶液中的熒光物質(zhì)的熒光以確定對(duì)應(yīng)于該物質(zhì)的分子的存在情況以及對(duì)給定樣品中此類分子的濃度進(jìn)行定量是已知的。對(duì)生物樣品中的羰基進(jìn)行進(jìn)一步分析是已知的，參見例如2003年11月6日公開的公開號(hào)US 2003/0208133和2011年1月6日公開的公開號(hào)US 2011/0003395，其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng)。

附圖簡(jiǎn)述

圖1A顯示了具有降低的表面活性劑依賴性的替代苯二胺衍生物。

圖1B顯示了替代苯二胺衍生物。

圖1C顯示了合成圖1B中所示的替代苯二胺衍生物的途徑。

圖1D顯示了圖1B中所示的替代苯二胺衍生物對(duì)醛引發(fā)的間苯二胺聚合的Fret應(yīng)答的圖示。

圖1E顯示了描繪在1μΜ己醛存在下圖1B中所示的替代苯二胺衍生物的熒光增加的圖表。

圖2顯示了描述mPDA與1-己醛的反應(yīng)的發(fā)射光譜作為時(shí)間的函數(shù)的圖表。

圖3顯示了描述隨著mPDA與作為含羰基部分的1-己醛的反應(yīng)時(shí)間而變化的熒光增加的圖表。

圖4A顯示了描述作為0.01至0.4％(w/v)的十二烷基硫酸鈉(“SDS”)濃度的函數(shù)，隨著與1-己醛反應(yīng)的時(shí)間而變化的熒光增加的圖表。

圖4B顯示了描述在SDS濃度為0.2％SDS時(shí)，與空白比較的隨著與1-己醛反應(yīng)的時(shí)間而變化的熒光增加的圖表。

圖4C顯示了描述在SDS濃度為0.4％SDS時(shí)，與空白比較的隨著與1-己醛反應(yīng)的時(shí)間而變化的熒光增加的圖表。

圖5顯示了展示作為1-己醛濃度的函數(shù)的熒光的圖表。

圖6顯示了描述作為醛鏈長(zhǎng)的函數(shù)的相對(duì)熒光的圖表。

圖7顯示了描述所選擇的小的芳族胺的相對(duì)熒光的圖表。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及一種檢測(cè)生物樣品中的含羰基部分的方法，所述方法包括將苯二胺衍生物添加至鹽水溶液中從而形成苯二胺溶液；將來自生物樣品的含羰基部分添加至所述苯二胺溶液中從而形成熒光溶液；和檢測(cè)來自所述熒光溶液的熒光。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式涉及一種含有醇、鹽、表面活性劑、苯二胺衍生物和含羰基部分的溶液。

本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式涉及一種含有間苯二胺衍生物與含羰基部分的產(chǎn)物的基本上無沉淀的溶液。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式涉及一種檢測(cè)和測(cè)量生物樣品中含羰基部分的濃度的方法，所述方法包括：

a)從所述生物樣品中分離含羰基部分；

b)將所述含羰基部分添加至含有苯二胺衍生物的水溶液中以形成熒光溶液；和

c)在預(yù)先確定的波長(zhǎng)下測(cè)量從所述熒光溶液發(fā)射的熒光。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式涉及一種檢測(cè)和測(cè)量人類呼吸樣品中的醛濃度的方法，所述方法包括：

a.將來自所述人類呼吸樣品的所述醛捕獲至二氧化硅上；

b.在微酸性條件下在醇中形成包含鹽、緩沖劑、表面活性劑的溶液；

c.將苯二胺衍生物添加至步驟b的溶液中；

d.將所捕獲的醛洗脫至步驟c的溶液中；

e.測(cè)定步驟c的溶液的熒光信號(hào)；

f.測(cè)定步驟d的溶液的熒光信號(hào)；

g.從來自步驟f的熒光信號(hào)中減去來自步驟e的熒光信號(hào)；和

h.將來自步驟g的所得熒光信號(hào)凈值與已知醛的標(biāo)準(zhǔn)熒光進(jìn)行比較，以確定在所

述熒光溶液中的醛濃度。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式涉及一種裝置，所述裝置包括：

a)具有基底的呼吸室，該基底承載來自動(dòng)物呼吸的含羰基部分；和

b)具有水溶液的流體室，所述水溶液含有醇、鹽、表面活性劑和緩沖劑。

本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式涉及一種用于檢測(cè)和定量生物樣品中含羰基部分的濃度的裝置，該裝置包括基底，所述基底具有加入其中的活性反應(yīng)性捕捉劑。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式涉及一種用于檢測(cè)生物樣品中含羰基部分的方法，所述方法包括下述步驟：提供具有加入其中的活性反應(yīng)性捕捉劑的基底，在所述基底上捕獲來自所述生物樣品的含羰基部分，和形成包含經(jīng)染色的含羰基部分的溶液。

本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式涉及一種用于檢測(cè)生物樣品中含羰基部分的方法，所述方法包括下述步驟：

a.提供基底；

b.將活性反應(yīng)性捕捉劑加入所述基底；

c.將含羰基部分捕獲于所述基底上；和

d.將所述活性反應(yīng)性捕捉劑和含羰基部分從所述基底洗脫至溶液中，從而形成經(jīng)染色的含羰基部分。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式涉及一種檢測(cè)生物樣品中含羰基部分的方法，所述方法包括將熒光發(fā)色團(tuán)添加至鹽水溶液從而形成熒光發(fā)色團(tuán)溶液；將來自所述生物樣品的含羰基部分添加至所述熒光發(fā)色團(tuán)溶液從而形成熒光溶液；和檢測(cè)來自所述熒光溶液的熒光。

具體實(shí)施方式

下述描述和附圖是說明性的，并且不被解釋為限制性的。描述了許多具體細(xì)節(jié)以提供對(duì)本公開的透徹理解。然而，在某些情況中，未描述熟知或常規(guī)細(xì)節(jié)以避免模糊該描述。本說明書中對(duì)“一個(gè)實(shí)施方式”或“實(shí)施方式”的指代意指與實(shí)施方式結(jié)合描述的特定特性、結(jié)構(gòu)或特征包括在本公開的至少一個(gè)實(shí)施方式中。本公開中對(duì)一個(gè)或另一個(gè)實(shí)施方式的指代可以是(但不一定是)對(duì)相同實(shí)施方式的指代；并且此類指代意指實(shí)施方式中的至少一個(gè)，而不是相互排除其他實(shí)施方式的獨(dú)立的或替代的實(shí)施方式。

在本申請(qǐng)的上下文中以及在各術(shù)語(yǔ)使用的特定上下文中，在本說明書中使用的術(shù)語(yǔ)一般具有其在本領(lǐng)域中的通常含義。在下文或本說明書的其他地方討論了用于描述本公開的某些術(shù)語(yǔ)，以便為從業(yè)人員提供關(guān)于本公開的描述的額外指導(dǎo)。為方便起見，可以突出顯示某些術(shù)語(yǔ)，例如使用斜體和/或引號(hào)標(biāo)記。使用突出顯示對(duì)術(shù)語(yǔ)的范圍和含義不具有影響；在相同上下文中無論術(shù)語(yǔ)是否被突出顯示，其范圍和含義是相同的。

因此，替代語(yǔ)言和同義詞可用于本申請(qǐng)討論的任何一個(gè)或多個(gè)術(shù)語(yǔ)。無論在本申請(qǐng)中是否對(duì)術(shù)語(yǔ)進(jìn)行詳細(xì)闡述或討論，均不會(huì)賦予其任何特殊意義。本申請(qǐng)?zhí)峁┝四承┬g(shù)語(yǔ)的同義詞。敘述一個(gè)或多個(gè)同義詞不排除使用其他同義詞。在包括任何本申請(qǐng)討論的術(shù)語(yǔ)示例的本說明書中的任何地方對(duì)實(shí)施例的使用僅是說明性的，并且不旨在進(jìn)一步限制本公開或任何示例性術(shù)語(yǔ)的范圍和含義。

本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)、定量和測(cè)定優(yōu)選地在生物樣品中，且優(yōu)選地在生物樣品中為低濃度的含羰基部分(“CCM”)(包括醛)的方法和裝置。就此而言，將CCM定義為包括一種或多種不同的含羰基部分。

如在本申請(qǐng)中使用的，“生物樣品”被以其最廣泛的含義進(jìn)行指代，并且包括固體和液體或從自然界(包括個(gè)體、體液、細(xì)胞系、組織培養(yǎng)物或任何其他來源)獲得的任何生物樣品。如所指出的，生物樣品包括體液或氣體，如呼吸、血液、精液、淋巴液、血清、血漿、尿液、滑液、脊髓液、痰、膿、汗，以及來自環(huán)境的液體樣品，如植物提取物、池塘水等。固體樣品可以包括動(dòng)物或植物體部分，包括但不限于毛發(fā)、指甲、葉子等。用于本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的優(yōu)選生物樣品是人類呼吸。

CCM是具有至少一個(gè)羰基的化合物。羰基是在大量化學(xué)化合物中出現(xiàn)的二價(jià)基團(tuán)>C＝0。該基團(tuán)由雙鍵連接至氧原子的碳原子組成。羰基官能團(tuán)最常見于三種主要類型的有機(jī)化合物中：醛、酮和羧酸。如在本申請(qǐng)中使用的，“醛”具有其常規(guī)化學(xué)含義，本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)生物樣品中的醛濃度。特別地，本發(fā)明可用于檢測(cè)醛的各種形式，包括但不限于：1-己醛、丙二醛，4-羥基壬烯醛、乙醛、1-丙醛、2-甲基丙醛、2,2-二甲基丙醛、1-丁醛和1-戊醛。

由基底捕捉的CCM的量可變化，但是通常對(duì)于由200mg的50-270目(300-50μm)粒子組成且床直徑為12.5mm的基底來說，一般而言，其等于在呼氣進(jìn)入如呼氣分析儀的管之后在人類呼吸中的量。優(yōu)選地，其為75至0.1ppb(400至4皮摩爾)，更優(yōu)選地為20ppb至0.01ppb(80至0.4皮摩爾)。

本發(fā)明適合于“混合&讀取”和“實(shí)時(shí)”測(cè)定形式以檢測(cè)CCM。本發(fā)明可以應(yīng)用于檢測(cè)溶液中的CCM。本發(fā)明可以通過添加初級(jí)捕獲(如下文所討論的在基底上)和釋放(如下文所討論的從負(fù)載基底洗脫)過程而應(yīng)用于檢測(cè)氣相中的痕量CCM。優(yōu)選地在該過程的一個(gè)步驟中，將氣相CCM(例如來自人類呼吸的醛)捕獲在基底上。

本發(fā)明的基底有利地由固體(但不必是剛性的)材料形成。該固體基底可由各種材料的任意一種形成，如膜、紙、非織造網(wǎng)、針織物、機(jī)織物、泡沫、玻璃等。例如，用于形成固體基底的材料可以包括但不限于天然的、合成的或經(jīng)合成改性的天然材料，如多糖(例如纖維素材料(如紙)和纖維素衍生物(如醋酸纖維素和硝化纖維素))；聚醚砜；聚乙烯；尼龍；聚偏二氟乙烯(PVDF)；聚酯；聚丙烯；二氧化硅；無機(jī)材料，如失活氧化鋁、硅藻土、MgSO₄、或在多孔基質(zhì)中均勻分散的其他無機(jī)細(xì)碎材料，與聚合物(如氯乙烯、氯乙烯丙烯共聚物和氯乙烯-乙酸乙烯酯共聚物)；布，天然的(例如棉)和合成的(例如尼龍或人造絲)；多孔凝膠，如硅膠、瓊脂糖、葡聚糖和明膠；聚合物膜，例如聚丙烯酰胺等等。優(yōu)選地，基底是任選地在玻璃料之間隔開的二氧化硅固相基質(zhì)。選擇基底的尺寸，使得由該基底捕捉可測(cè)量量的CCM。該尺寸可以改變，但一般而言其為約2mL，優(yōu)選地為約1mL，更優(yōu)選地為約0.25mL。

基底通常由具有50-60?？椎牧Ｗ拥拇步M成，所述床具有50至270目(300-50μm)和75至300mg的質(zhì)量，優(yōu)選60-120目(250-125μm)和100至200mg的質(zhì)量，更優(yōu)選50-120目(210-125μm)和125至175mg的質(zhì)量。

在該過程的另一步驟中，將諸如苯二胺衍生物的熒光發(fā)色團(tuán)添加至洗脫溶液，以形成苯二胺溶液?？捎糜诒景l(fā)明的苯二胺衍生物包括但不限于多種苯二胺衍生物(包括但不限于間苯二胺(“mPDA”)及其衍生物)和圖1A和圖1B中所示的那些，且mPDA優(yōu)選用于檢測(cè)醛(包括但不限于1-己醛)。盡管某些p-PDA或o-PDA衍生物可用于本發(fā)明的方法，但是它們不可用于檢測(cè)1-己醛，因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生不能用于下文所討論的基于光學(xué)的檢測(cè)的混濁膠體懸浮體。

其他苯二胺衍生物包括下述或其混合物：

其中R1、R2、R3、R4各自獨(dú)立地選自下組：H、烷基、取代的烷基、烷氧基、取代的烷氧基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨基羰基、氨基硫代羰基、氨基羰基胺、氨基硫代羰基氨基、氨基羰氧基、氨基磺?；被酋Ｑ趸?、氨基磺酰氨基，脒基、羧基、羧基酯、(羧基酯)氨基、(羧基酯)氧基、氰基、鹵代、羥基、SO3-、磺?；⑷〈幕酋；⒒酋Ｑ趸?、硫代?；?、硫醇基、烷硫基、取代的烷硫基、?；?、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)和取代的雜環(huán)。

參考圖1B，顯示了mPDA-橙(mPDA-Orange)，即4-[2-[4-(二乙胺基)苯基-乙烯基]-1-[1-(3,5-二亞胺基苯甲酰胺)-戊基氨基-5-氧基己基]吡啶鎓。該mPDA衍生物mPDA-橙利用a)對(duì)環(huán)境變化的敏感性和b)調(diào)節(jié)mPDA-醛引發(fā)的聚合對(duì)表面活性劑的依賴性的潛力。在圖2C中示出了用于合成mPDA-橙的方案?；痉桨笧橥ㄟ^烷基酰胺連接體將mPDA與苯乙烯基吡啶鎓部分偶聯(lián)。

隨著分子加入醛引發(fā)的mPDA聚合物中，mPDA-橙顯示出量子產(chǎn)率提高。此外，苯乙烯基吡啶鎓部分的激發(fā)和發(fā)射性質(zhì)提供來自mPDA聚合物的FRET(Forster能量轉(zhuǎn)移)產(chǎn)生的信號(hào)。苯乙烯基吡啶鎓部分顯示出最大值在470nm處的寬激發(fā)和在570nm處的發(fā)射最大值。激發(fā)圖與提供了與mPDA聚合物的發(fā)射圖的充分重疊，以提供基于FRET的信號(hào)產(chǎn)生?；贔ret的信號(hào)產(chǎn)生通過在mPDA聚合物處的激發(fā)(405nm)和在570nm處的苯乙烯基吡啶鎓部分的發(fā)射表現(xiàn)。圖1D中顯示了mPDA-橙對(duì)醛引發(fā)的mPDA聚合的FRET應(yīng)答的圖示。

由于引發(fā)聚合物所需的高濃度的苯乙烯基吡啶鎓的淬滅，因而單獨(dú)的mPDA-橙的直接醛引發(fā)聚合不會(huì)產(chǎn)生應(yīng)答信號(hào)。預(yù)期僅當(dāng)mPDA-橙包含在mPDA和mPDA-橙的混合物中時(shí)才會(huì)產(chǎn)生應(yīng)答。實(shí)際上，僅當(dāng)mPDA-橙以1,000:1至10,000:1的顯著稀釋的摩爾比mPDA/mPDA-橙摻雜入mPDA時(shí)才觀察到醛應(yīng)答。在圖1E中闡明了對(duì)醛的應(yīng)答。當(dāng)將1μΜ己醛添加至體系時(shí)，在405nm處激發(fā)時(shí)觀察到mPDA-橙在570nm的發(fā)射增加。當(dāng)在470-490nm處直接激發(fā)mPDA-橙苯乙烯基吡啶鎓部分時(shí)，未觀察到發(fā)射增加。該應(yīng)答在背景值上約3X，參見圖1E，此處條件為7mM mPDA、5μΜmPDA-橙(摩爾比15,000:1)、90mM NaCl、15％乙醇、0.1％SDS、50mM pH 2.5的檸檬酸鹽。該激發(fā)在405nm處，發(fā)射在575-585nm處。可以看出，在不存在醛時(shí)，該背景水平維持相當(dāng)穩(wěn)定，導(dǎo)致mPDA-橙加入的自引發(fā)似乎是最小的。盡管與單獨(dú)的mPDA的15X相比，mPDA-橙應(yīng)答為小得多的3X，該衍生物具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1)由在激發(fā)與發(fā)射之間的大Stokes位移提供的增加的波長(zhǎng)辨別度和2)增強(qiáng)的基線穩(wěn)定性。

一般而言，在苯二胺溶液中苯二胺衍生物濃度為0.5mM至25mM。對(duì)于mPDA而言，在苯二胺溶液中mPDA濃度一般為0.5至21mM，優(yōu)選為2至10mM，以及對(duì)于醛類(如1-己醛)而言最佳為5mM。盡管如上所述，對(duì)于mPDA-橙而言，必需將其稀釋為低摩爾比(優(yōu)選1000-10,000)mPDA。

一般而言，洗脫溶液包括鹽、緩沖劑、表面活性劑和有機(jī)溶劑。鹽濃度可為5mM至200mM，優(yōu)選20mM至80mM；緩沖劑濃度可為25mM至200mM，優(yōu)選40mM至60mM；以及表面活性劑濃度可為0.05％(1.7mM)至0.4％(13.9mM)，優(yōu)選0.15％(5.2mM)至0.25％(8.7mM)。最佳使用0.2％或6.96mM。鹽可以是任何對(duì)熒光溶液無負(fù)面影響且控制洗脫溶液中的鹽析效應(yīng)的鹽，并且可以包括NaCl、LiCl、KCl、硫酸鹽和磷酸鹽及其混合物，優(yōu)選為NaCl。

使用緩沖劑使洗脫溶液維持微酸性，優(yōu)選在pH 2和4.5之間，更優(yōu)選為pH 2.5。緩沖劑可以是硼酸鹽緩沖劑、磷酸鹽緩沖劑、檸檬酸鹽緩沖劑，有機(jī)緩沖劑(如HEPES(1-哌嗪乙烷磺酸)或TRIS(三(羥甲基)氨基乙烷)緩沖劑)，優(yōu)選使用檸檬酸鹽緩沖劑以檢測(cè)醛。

表面活性劑可以包括癸基硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉(“SDS”)、十四烷基硫酸鈉以及Standapol ES-1，優(yōu)選SDS包括SDS的C10、C12和C14形式的SDS。還可以使用Trition X-100、Ninate 11、Georpon 71、Tetraonic 1357、Cremapor-el、Chemal la-9、Silwet L7900、Surfynly468、表面活性劑10G和Tween 80，但是它們與優(yōu)選的洗脫溶液、CCM 1-己醛和mPDA未提供良好的結(jié)果。

在不存在SDS時(shí)，如下文所討論的聚合和醛應(yīng)答被嚴(yán)重抑制。mPDA是高度水溶性的，SDS的存在可以提供將mPDA組織和定位至基質(zhì)中的支架，以促進(jìn)聚合反應(yīng)。

溶劑可以包括EtOH、MeOH、丙醇和異丙醇的水溶液，優(yōu)選15％EtOH。

鹽濃度與苯二胺濃度的摩爾比是重要的。一般而言，該比例應(yīng)為0.03至0.5。對(duì)于CCM1-己醛而言，發(fā)現(xiàn)0.165的mPDA/NaCl的摩爾比提供最佳應(yīng)答。

實(shí)施本發(fā)明的方法的溫度范圍優(yōu)選為15至35℃，更優(yōu)選為25至30℃。

對(duì)于諸如1-己醛的醛而言，洗脫溶液的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式包括33mM NaCl、50mM檸檬酸鹽、pH 2.5、15％EtOH和0.2％SDS。其他優(yōu)選的洗脫溶液包括50mM檸檬酸鹽、pH2.5、15％丙醇和0.4％癸基硫酸鈉。

使用含有苯二胺衍生物的洗脫溶液時(shí)，將CCM洗脫至苯二胺溶液中以形成熒光溶液。CCM和mPDA反應(yīng)形成熒光物質(zhì)，通過測(cè)量熒光溶液中熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光而檢測(cè)熒光物質(zhì)在熒光溶液中的存在情況。

醛含量通過如下方式進(jìn)行定量：監(jiān)測(cè)信號(hào)上升(終點(diǎn))和/或信號(hào)變化速率(動(dòng)力學(xué))，和將此類數(shù)據(jù)與呼吸的羰基群樣品進(jìn)行比較，其中對(duì)于給定的mPDA濃度而言，所述信號(hào)變化速率作為醛濃度的函數(shù)而變化。實(shí)施中必需濾除所選擇羰基以外的羰基的影響。具有兩種一般測(cè)定形式或檢測(cè)模式。其通常描述為終點(diǎn)和動(dòng)力學(xué)。在終點(diǎn)測(cè)定中，將體系孵育設(shè)定時(shí)間并讀取信號(hào)。在該點(diǎn)的信號(hào)反映了體系中分析物的量。對(duì)于陽(yáng)性測(cè)定而言，分析物濃度越高，信號(hào)增加越大。在動(dòng)力學(xué)測(cè)定中，在設(shè)定的持續(xù)時(shí)間內(nèi)監(jiān)測(cè)變化速率。變化速率與分析物的量相關(guān)。優(yōu)選地，在本發(fā)明中使用終點(diǎn)測(cè)定。

測(cè)定測(cè)量可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定實(shí)踐在典型的熒光光譜儀上進(jìn)行，包括常規(guī)掃描光譜儀、酶標(biāo)儀或基于LED/二極管的光譜儀。出于說明的目的，圖2中所示的數(shù)據(jù)通過如下方式獲得：將總共2mL的反應(yīng)溶液和醛混合至標(biāo)準(zhǔn)熒光比色杯中，使用LED/二極管光譜儀在特定時(shí)間片時(shí)測(cè)量強(qiáng)度增加以模擬終點(diǎn)測(cè)定。所使用的LED/二極管光譜儀由具有LED源的Ocean Optics Jazz光譜儀和經(jīng)由光纖聯(lián)接至Qpod-e(Quantum Northwest)溫度控制熒光樣品架的二極管檢測(cè)組成。使用紫色LED(電壓：3.3V，I：0.03A)產(chǎn)生405nm激發(fā)。使用發(fā)射設(shè)置為495-505nm帶通和250毫秒積分的ILX-51 18二極管檢測(cè)檢測(cè)信號(hào)。與大多數(shù)基于熒光的測(cè)定一樣，最佳設(shè)置取決于所使用光譜儀的通量和雜散光排斥特性，并且必須針對(duì)每個(gè)儀器根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，苯二胺衍生物在溶液中與CCM反應(yīng)以產(chǎn)生熒光發(fā)射或熒光物質(zhì)。據(jù)信苯二胺衍生物氧化偶聯(lián)至CCM，苯二胺衍生物聚合為二聚體、三聚體、低聚物和/或聚合物。盡管聚合由CCM的存在調(diào)節(jié)且具有劑量應(yīng)答，但并不清楚CCM是否實(shí)際上成為增長(zhǎng)的聚合物的一部分。

可以將使用CCM聚合苯二胺衍生物的過程描述為分散聚合。聚苯二胺已經(jīng)用于構(gòu)造不同形狀、管、球等的納米結(jié)構(gòu)和膠體分散體。然而，如果聚合產(chǎn)生大的高分子量結(jié)構(gòu)，則在溶液中出現(xiàn)沉淀，這在本發(fā)明中可能妨礙光學(xué)檢測(cè)。因而必須選擇用于本發(fā)明的方法中的成分以避免在熒光溶液中具有抑制CCM檢測(cè)和定量的元素。

本發(fā)明利用CCM調(diào)節(jié)(引發(fā)、催化和加速)苯二胺衍生物的氧化偶聯(lián)和聚合的能力以檢測(cè)和定量生物樣品中痕量的醛、酮和含羰基的分析物。苯二胺的氧化偶聯(lián)和聚合產(chǎn)生發(fā)色和熒光物質(zhì)。在mPDA和醛的情況下，聚合物或多聚體的形成產(chǎn)生在405nm處的寬光吸收帶和在505nm處的相關(guān)發(fā)射帶。在<350nm的UV區(qū)域發(fā)現(xiàn)單體吸收。因此，可以方便地通過常規(guī)吸收或熒光光譜法跟蹤聚合物的產(chǎn)生。就此而言，應(yīng)意識(shí)到吸收和發(fā)射帶可取決于CCM和所選擇的苯二胺衍生物而不同，但是可用于實(shí)施本發(fā)明的所有此類條帶均為本發(fā)明的一部分。

例如，參考圖2，顯示了在1μΜ1-己醛存在下作為時(shí)間函數(shù)的mPDA反應(yīng)的發(fā)射光譜。熒光溶液的條件為：1μΜ1-己醛、5.4mM mPDA、33mM NaCl、50mM檸檬酸鹽(pH2.5)、15％EtOH和0.1％SDS。發(fā)射作為時(shí)間的函數(shù)顯著增加。

參考圖3，觀察了在具有和不具有醛(“空白”)的情況下的反應(yīng)和應(yīng)答。熒光溶液的條件為：1μΜ1-己醛、5.4mM mPDA、33mM NaCl、50mM檸檬酸鹽(pH 2.5)、15％EtOH和0.1％SDS。發(fā)射增加程度和增加速率取決于在苯二胺溶液中的醛濃度。醛濃度越高，觀察到越大和越迅速的信號(hào)增加。在不存在醛時(shí)，“空白”發(fā)生緩慢逐漸的小的信號(hào)上升，表明在檢測(cè)條件下mPDA的緩慢聚合。推測(cè)該聚合是由于存在諸如鐵的痕量氧化劑、活性氧物質(zhì)和其他引發(fā)劑。加入CCM后，觀察到相比于空白或背景的顯著信號(hào)增強(qiáng)。特別值得注意的是變化速率易于追蹤。因此，檢測(cè)系統(tǒng)適于動(dòng)力學(xué)和終點(diǎn)測(cè)定設(shè)計(jì)和檢測(cè)模式。可以在特定時(shí)間點(diǎn)(例如15分鐘(時(shí)間片))或通過監(jiān)測(cè)作為醛函數(shù)的斜率來對(duì)應(yīng)答進(jìn)行定量。動(dòng)力學(xué)速率足夠緩慢而不需要迅速和高精度的反應(yīng)物添加。聚合反應(yīng)通過CCM(如醛)進(jìn)行調(diào)節(jié)及其用作CCM定量傳感器是在本說明書中描述的另一個(gè)新發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。其他替代包括標(biāo)簽、染色或標(biāo)記CCM以供隨后分析。

參考圖4A、4B和4C，顯示了CCM引發(fā)的與苯二胺衍生物的聚合反應(yīng)對(duì)環(huán)境條件和反應(yīng)體系的組分(如SDS濃度)敏感。在這些圖中的熒光溶液的條件為：1μΜ1-己醛、5.4mM mPDA、33mM NaCl、50mM檸檬酸鹽(pH 2.5)和15％EtOH。例如，反應(yīng)和醛測(cè)定性能取決于鹽含量、mPDA含量、表面活性劑、pH和溫度。由于反應(yīng)涉及單體向聚合物的“準(zhǔn)相”轉(zhuǎn)變，不足的mPDA濃度產(chǎn)生具有有限信號(hào)變化的緩慢反應(yīng)。相比之下，大過量的mPDA導(dǎo)致非常迅速的反應(yīng)和限制光學(xué)檢測(cè)的不溶性沉淀物的形成。此外，大過量導(dǎo)致增加的背景或“空白”信號(hào)。

參考圖4A，信號(hào)作為SDS濃度的函數(shù)增加。在0.4％的SDS濃度時(shí)，信號(hào)增加為在0.2％時(shí)觀察到信號(hào)的幾乎3倍。

圖4B和圖4C分別顯示了在0.2％SDS和0.4％SDS時(shí)的醛應(yīng)答與空白的比較。SDS濃度的增加也會(huì)導(dǎo)致“空白”或背景信號(hào)的增加。信號(hào)和背景二者均由SDS濃度調(diào)節(jié)，且最佳SDS濃度不能僅通過監(jiān)測(cè)信號(hào)應(yīng)答來確定。因此，必須對(duì)SDS濃度進(jìn)行優(yōu)化以提供信號(hào)和背景信號(hào)產(chǎn)生之間的最大區(qū)分。對(duì)于特定實(shí)施方式而言，最佳SDS濃度落入窄的濃度帶內(nèi)，并且小的偏差可導(dǎo)致增加的可變性并限制測(cè)定靈敏度。

參考圖5，顯示了經(jīng)背景校正的作為1-己醛濃度函數(shù)的mPDA的熒光應(yīng)答。從0.1至1μΜ1-己醛觀察到線性應(yīng)答。數(shù)據(jù)點(diǎn)是三次重復(fù)樣品的平均值。在將醛加入苯二胺溶液后20分鐘時(shí)測(cè)量信號(hào)。在這些條件下(25℃下10.8mM mPDA、65.5NaCl、50mM檸檬酸鹽(pH 2.5)、0.2％SDS)，可獲得0.1μM的溶液檢測(cè)限(LOD)。

參考圖6中的圖表，對(duì)于脂族醛，mPDA顯示出作為鏈長(zhǎng)函數(shù)的不同應(yīng)答。圖表顯示了在醛加入后20分鐘時(shí)在下述條件下的熒光信號(hào)：5.4mM mPDA、33mM NaCl、50mM檸檬酸鹽(pH 2.5)、15％EtOH和0.1％SDS。在20分鐘時(shí)測(cè)量信號(hào)，并將該時(shí)間片用作假終點(diǎn)分析方法。對(duì)于脂族醛，相對(duì)應(yīng)答隨脂族鏈長(zhǎng)而增加。乙醛的應(yīng)答僅為對(duì)于1-己醛觀察到的應(yīng)答的12％。相比之下，癸(C₁₀)醛的應(yīng)答比1-己醛高出30％。

在使用本發(fā)明的方法時(shí)，芳族二胺的性質(zhì)也是考慮的重要因素。O-PDA是高反應(yīng)性的，并發(fā)生快速一般氧化。o-PDA的高反應(yīng)性阻礙了其用作本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中的醛傳感器。參考圖7，顯示了二胺子集的相對(duì)熒光應(yīng)答，并闡明了位置和電子效應(yīng)二者對(duì)醛熒光應(yīng)答的影響。傳統(tǒng)芳族供電子效應(yīng)和吸電子效應(yīng)應(yīng)該調(diào)節(jié)苯二胺衍生物對(duì)聚合的反應(yīng)性和敏感性。在優(yōu)選條件下，甚至當(dāng)暴露于過量的醛時(shí)，也沒有觀察到硝基苯二胺和萘二胺的醛應(yīng)答。已發(fā)現(xiàn)醛檢測(cè)是基于反應(yīng)聚合的調(diào)節(jié)。如果選擇的分子是高反應(yīng)性的和易于被引發(fā)而聚合的，則一般氧化劑能夠促進(jìn)反應(yīng)過程，并可能限制其用作傳感器。另一方面，如果分子“過于”穩(wěn)定，則聚合過程變得受到抑制且不能由醛充分促進(jìn)，并且需要更強(qiáng)的氧化劑以產(chǎn)生應(yīng)答。

本發(fā)明還包括一種用于使用本發(fā)明的方法的裝置。該裝置包括優(yōu)選由塑料制成的呼吸室，且在呼吸室中具有基底?；子缮衔乃懻摰牟牧锨覂?yōu)選二氧化硅制成?；壮休d來自動(dòng)物呼吸的含羰基部分，例如醛。該裝置還包括流體室。流體室包含水溶液，該水溶液含有醇(例如15％EtOH)、鹽(例如NaCl)、表面活性劑(例如SDS)和緩沖劑(例如檸檬酸鹽)。該溶液還可以包含苯二胺衍生物，如mPDA。

下述實(shí)施例顯示了一種使用本發(fā)明測(cè)定人類呼吸樣品中是否含有可測(cè)量的醛濃度和在呼吸中的醛濃度的方法。使用上文所討論的方法，進(jìn)行一系列熒光測(cè)量以提供已知包含在人類呼吸樣品(群體)中的各種特定醛及其混合物的標(biāo)準(zhǔn)，以及此類各種標(biāo)準(zhǔn)品及其混合物的濃度的標(biāo)準(zhǔn)。使用這些標(biāo)準(zhǔn)，能夠測(cè)定在人類呼吸樣品中特定醛或醛混合物的存在情況和此類特定醛或醛混合物的濃度。一般而言，在一個(gè)實(shí)施方式中，步驟如下：

a.將來自人類呼吸樣品的醛捕獲至二氧化硅上；

b.在微酸性條件下在醇中形成包含鹽、緩沖劑、表面活性劑的溶液；

c.將苯二胺衍生物添加至步驟b的溶液中；

d.將所捕獲的醛洗脫至步驟c的溶液中；

e.測(cè)定步驟c的溶液的熒光信號(hào)；

f.測(cè)定步驟d的溶液的熒光信號(hào)；

g.從來自步驟f的熒光信號(hào)中減去來自步驟e的熒光信號(hào)；和

h.將來自步驟g的所得熒光信號(hào)凈值與已知醛的標(biāo)準(zhǔn)熒光(校正曲線，即經(jīng)測(cè)定對(duì)已知濃度的應(yīng)答)進(jìn)行比較，以確定在熒光溶液中的醛濃度。簡(jiǎn)而言之，這是“y”軸值的比較以提供“x”軸值，或者已知y和校正函數(shù)y＝f(x)來解x。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，基底可預(yù)負(fù)載有共價(jià)附接至CCM的活性反應(yīng)性捕捉劑(“試劑”)，其包括但不限于熒光肼或氨氧基化合物。氨氧基化合物的一些實(shí)例如下：氨氧基5(6)四甲基羅丹明(氨氧基5(6)TAMRA)，優(yōu)選5或6的單一異構(gòu)體；和氨氧基5(6)羧基熒光素(氨氧基5(6)FAM)，優(yōu)選5或6的單一異構(gòu)體，例如氨氧基-C5-5-FAM。其它包括氨氧基-7-氨基-3-乙酰基-4-甲基香豆素-6-磺酸；5-氨氧基乙酸羅丹明B；和二硝基苯肼。在前述實(shí)例中，反應(yīng)性基團(tuán)被指定為不具有連接基團(tuán)，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。除前述以外，肼或酰肼形式包括在本發(fā)明內(nèi)。優(yōu)選地，試劑具有一定極性。

例如，對(duì)于由200mg 50至270目(300-50μm)的粒子組成且具有12.5mm的床直徑的基底而言，試劑的量可以為5.5mg至0.1mg，優(yōu)選地為2.5mg至0.4mg。

在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式中，使用雙溶液方法。在基底負(fù)載CCM后，將CCM洗脫至“沖洗”溶液中，所述沖洗溶液通常包含30％乙醇，優(yōu)選50mM檸檬酸鹽、30％乙醇且pH 2.5。將試劑加入沖洗溶液，從而產(chǎn)生經(jīng)染色的CCM。然后將該溶液通過另一基底(優(yōu)選二氧化硅玻璃料疊堆)，以捕獲經(jīng)染色的CCM。然后使用第二“沖洗”溶液從具有捕獲于其中的經(jīng)染色的CCM的基底上洗脫經(jīng)染色的CCM，所述第二沖洗溶液包含高于50％乙腈和優(yōu)選90％乙醇。該第二實(shí)施方式的益處之一是基線讀數(shù)不是去噪所必須的。

除非上下文另有明確要求，在整個(gè)說明書和權(quán)利要求書中，詞語(yǔ)“包括(comprise)”、“包括(comprising)”等應(yīng)以包括的意義解釋，而不是排他或窮舉的意義；即“包括，但不限于”的意義。此外，當(dāng)用于本申請(qǐng)中時(shí)，詞語(yǔ)“此處”、“上文”、“下文”和相似含義詞語(yǔ)應(yīng)指本申請(qǐng)整體而不是本申請(qǐng)的任何特定部分。在上下文允許的情況下，上述使用單數(shù)或復(fù)數(shù)的具體實(shí)施方式中的單詞也可以分別包括復(fù)數(shù)或單數(shù)。在兩個(gè)或更多個(gè)項(xiàng)目的列表的指代中的詞語(yǔ)“或”涵蓋該詞語(yǔ)的所有以下解釋：列表中的項(xiàng)目的任意一個(gè)，列表中的所有項(xiàng)目和列表中項(xiàng)目的任意組合。

本公開的實(shí)施方式的上述詳細(xì)描述并非旨在為窮舉的或?qū)⒔虒?dǎo)限于上文公開的精確形式。盡管上文出于說明的目的描述了本公開的具體實(shí)施方式和實(shí)施例，但是如相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的，在本公開范圍內(nèi)的各種等同修改是可能的。例如，當(dāng)方法以給定順序呈現(xiàn)時(shí)，替代實(shí)施方式可以不同順序進(jìn)行該方法，可以刪除、移動(dòng)、添加、細(xì)分、組合和/或修改一些方法步驟以提供替代或子組合。此外，本申請(qǐng)指出的任何特定數(shù)字均僅是實(shí)例：替代實(shí)施方式可以采用不同的值或范圍。

根據(jù)上述具體實(shí)施方式可以對(duì)本公開進(jìn)行這些和其他改變。盡管上述說明書描述了本公開的某些實(shí)施方式，并且描述了預(yù)期的最佳模式，但是無論上述內(nèi)容在文字上如何詳細(xì)，都可以以很多方式實(shí)施教導(dǎo)。體系的細(xì)節(jié)可以在其實(shí)施細(xì)節(jié)方面大幅變化，同時(shí)仍包含在本公開所公開的主題中。如上文所示，當(dāng)描述本公開的某些特征或方面時(shí)使用的特定術(shù)語(yǔ)不應(yīng)被認(rèn)為暗示該術(shù)語(yǔ)在本申請(qǐng)中被重新定義為限于與該術(shù)語(yǔ)相關(guān)的本公開的任何具體特征、特性或方面。一般而言，在下述權(quán)利要求中使用的術(shù)語(yǔ)不應(yīng)被解釋為將本公開限制在說明書中公開的具體實(shí)施方式，除非上述具體實(shí)施方式部分明確地定義了這些術(shù)語(yǔ)。因此，本公開的實(shí)際范圍不僅涵蓋所公開的實(shí)施方式，而且涵蓋根據(jù)權(quán)利要求實(shí)踐或?qū)嵤┍竟_的所有等同方式。

因此，盡管已經(jīng)示出并描述了本發(fā)明的示例性實(shí)施方式，但是應(yīng)當(dāng)理解，本申請(qǐng)使用的所有術(shù)語(yǔ)是描述性的而不是限制性的，并且本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可以進(jìn)行很多改變、修改和替換。