相關(guān)申請(qǐng)

本申請(qǐng)要求2014年9月15日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)62/050,585的權(quán)益，該臨時(shí)專利申請(qǐng)?jiān)诓慌c本文所示公開內(nèi)容沖突的范圍內(nèi)全文通過引用結(jié)合到本文中。

本公開總體上尤其涉及用薄膜體聲波諧振器(tfbar)檢測(cè)分析物。

發(fā)明背景

壓電裝置(例如薄膜體聲波諧振器(tfbar))和如石英晶體微量天平(qcm)的技術(shù)用作質(zhì)量檢測(cè)器已有一段時(shí)間。壓電諧振器的一個(gè)應(yīng)用是檢測(cè)很少量物質(zhì)。在此類應(yīng)用中用作傳感器的壓電諧振器有時(shí)被稱為“微量天平”。壓電諧振器一般構(gòu)造成夾在兩個(gè)電極層之間的結(jié)晶或多晶壓電材料的薄平面層。在用作傳感器時(shí)，使諧振器暴露于正被檢測(cè)的物質(zhì)，以允許物質(zhì)結(jié)合到傳感器的表面上。

檢測(cè)結(jié)合到傳感諧振器表面上物質(zhì)的量的一種常規(guī)方式是操作諧振器作為在其諧振頻率的振蕩器。由于被檢測(cè)的物質(zhì)結(jié)合到傳感器表面上，諧振器的振蕩頻率減小。檢測(cè)可能由物質(zhì)結(jié)合到諧振器表面上引起的諧振器振蕩頻率變化，并用其計(jì)算結(jié)合到諧振器上的物質(zhì)的量或物質(zhì)在諧振器表面上積累的速率。也可用相變測(cè)定物質(zhì)已結(jié)合或正在結(jié)合到諧振器表面上的量或速率。

在免疫分析中使用壓電諧振器傳感器已有描述。在此免疫分析中，測(cè)定可歸于抗原和抗體之間免疫反應(yīng)的質(zhì)量變化，其中之一在分析前結(jié)合到諧振器表面上。

然而，在某些情況下，可合乎需要檢測(cè)樣品中分析物的存在，而不使分析物結(jié)合到諧振器表面，例如，通過結(jié)合到諧振器表面的抗體。

發(fā)明概述

本公開尤其描述用在高頻率操作的tfbar檢測(cè)分析物，而不用使分析物直接結(jié)合到tbar表面上。分析物檢測(cè)是間接的，用沉淀分子作為分析物的替代。分析物能夠被氧化或還原，并將電子供給可溶沉淀前體或從可溶沉淀前體提取電子，或?qū)㈦娮庸┙o中間電子轉(zhuǎn)移劑或從中間電子轉(zhuǎn)移劑提取電子，中間電子轉(zhuǎn)移劑可將電子供給可溶沉淀前體或另一種中間電子轉(zhuǎn)移劑，或從可溶沉淀前體或另一種中間電子轉(zhuǎn)移劑提取電子。前體氧化或還原得到沉淀分子。

因此，沉淀分子為氧化還原反應(yīng)產(chǎn)物，在此，反應(yīng)產(chǎn)物從可溶前體氧化或還原成不可溶或沉淀反應(yīng)產(chǎn)物。在tfbar表面上沉淀氧化還原反應(yīng)產(chǎn)物改變表面上的質(zhì)量，從而改變tfbar的諧振特性。改變的動(dòng)力學(xué)或改變的幅度可與樣品中分析物的量相關(guān)。

本公開還尤其描述用tfbar檢測(cè)氧化還原酶的活性。tfbar可在高頻率操作。檢測(cè)氧化還原酶活性可以類似于檢測(cè)上述分析物的方式完成。推斷包括氧化還原酶的試樣可與能夠被該酶氧化或還原的底物結(jié)合。底物的氧化或還原可通過氧化還原級(jí)聯(lián)與可溶前體的氧化或還原耦合，導(dǎo)致分子在tfbar的表面上沉淀。tfbar表面上質(zhì)量的改變可與試樣中酶的活性相關(guān)。

本文所述裝置、系統(tǒng)或方法的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案提供與檢測(cè)分析物的現(xiàn)有傳感器、裝置、系統(tǒng)或方法相比的一個(gè)或多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。本文所公開的方法、傳感器、裝置和系統(tǒng)的實(shí)施方案允許檢測(cè)可能不特別適合由免疫分析或結(jié)合事件檢測(cè)的分子。本文所公開的方法、傳感器、裝置和系統(tǒng)的實(shí)施方案產(chǎn)生可利用多種特異氧化還原酶的通用傳感器。通過以下詳述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將很容易理解這些和其它優(yōu)點(diǎn)。

附圖簡(jiǎn)述

圖1a-1c為圖示說明薄膜體聲波諧振器(tfbar)傳感裝置的操作原理的示意圖。

圖2為顯示檢測(cè)分析物的tfbar系統(tǒng)的實(shí)施方案的組件的示意圖。

圖3a-b為圖示說明引起在薄膜諧振器(tfr)表面上沉淀的分析物耦合氧化還原的實(shí)施方案的示意圖。

圖4-6為圖示說明引起在tfr表面上沉淀的分析物耦合氧化還原的一些實(shí)施方案的示意圖。

圖7a-c為圖示說明引起從tfr表面接枝聚合的分析物耦合氧化還原的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖。

圖8為顯示利用總體上如圖6中所繪的分析的諧振器在特定相的頻率變化的曲線圖。

示意圖不一定按比例繪制。圖中所用相似的數(shù)字指相似的組件、步驟等。然而，應(yīng)了解，涉及所給圖中組件數(shù)字的使用不意圖限制標(biāo)有相同數(shù)字的另一個(gè)圖中的組件。另外，涉及組件的不同數(shù)字的使用不意圖表明不同編號(hào)的組件不能相同或相似。

發(fā)明詳述

在以下詳述中公開化合物、組合物、傳感器、裝置、系統(tǒng)和方法的數(shù)個(gè)具體實(shí)施方案。應(yīng)了解，其它實(shí)施方案也可涵蓋，并且可在不脫離本公開的范圍或精神下產(chǎn)生。因此，以下詳述不以限制意義理解。

本公開尤其描述用在高頻率操作的tfbar檢測(cè)分析物，而不用使分析物直接結(jié)合到tfbar表面上。分析物檢測(cè)是間接的，用沉淀分子作為分析物的替代。分析物能夠被氧化或還原，并將電子供給可溶沉淀前體或從可溶沉淀前體提取電子，或?qū)㈦娮庸┙o中間電子轉(zhuǎn)移劑或從中間電子轉(zhuǎn)移劑提取電子，中間電子轉(zhuǎn)移劑可將電子供給可溶沉淀前體或另一種中間電子轉(zhuǎn)移劑，或從可溶沉淀前體或另一種中間電子轉(zhuǎn)移劑提取電子。根據(jù)前體，前體氧化或還原得到沉淀分子。

可使一種或多種中間電子轉(zhuǎn)移劑或氧化還原劑結(jié)合到tfbar表面。固定的中間電子轉(zhuǎn)移劑可氧化或還原在檢測(cè)分析中利用的一種或多種可溶沉淀前體、靶分析物、輔因子或任何其它氧化還原分子。在一些實(shí)施方案中，由于在tfbar表面上沉淀分子的沉淀仍可能發(fā)生，沒有中間電子轉(zhuǎn)移劑或其它分析劑耦合到tfbar表面。然而，優(yōu)選在tfbar表面上固定至少一種中間電子轉(zhuǎn)移劑或其它氧化還原劑，以便在tfbar表面附近發(fā)生至少部分級(jí)聯(lián)氧化還原反應(yīng)，以增加在tfbar表面附近生成沉淀分子的可能性。另外，在試驗(yàn)諧振器而非參比諧振器表面上固定氧化還原劑允許該劑從通過試驗(yàn)和參比諧振器引入的溶液或懸浮體省略，因此，可減少或除去由于不存在氧化還原劑在參比傳感器上沉淀的量。

在移動(dòng)跨過諧振器之前，或者當(dāng)它們正在移動(dòng)跨過傳感器時(shí)，可混合分析物和可溶沉淀前體。優(yōu)選在分析混合物與tfbar接觸之前，分析物的氧化還原不能與可溶沉淀前體的氧化還原耦合。因此，直至混合物與tfbar接觸，才在分析混合物中存在分析物氧化還原與可溶沉淀前體氧化還原耦合所需的至少一種氧化還原劑。這可通過氧化還原劑(例如，中間電子轉(zhuǎn)移劑)固定到tfbar表面，通過分析物樣品與其它劑在跨tfbar引入時(shí)混合等來(lái)完成。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用各劑的氧化還原態(tài)基于分析物的希望氧化還原態(tài)選擇，以避免在分析混合物與tfbar接觸前引發(fā)氧化還原級(jí)聯(lián)和產(chǎn)生沉淀分子，并避免存在的分析物的假陽(yáng)性結(jié)果或量的過高估計(jì)。

傳感器、裝置和系統(tǒng)

本文所公開的傳感器包括至少一個(gè)薄膜諧振器傳感器，例如，薄膜體聲波諧振器(tfbar)傳感器。tfbar傳感器包括壓電層或壓電基體，和輸入和輸出轉(zhuǎn)換器。tfbar傳感器為小傳感器，使這項(xiàng)技術(shù)適用于手持裝置。因此，本發(fā)明也涵蓋用于檢測(cè)靶分析物的包括本文所述傳感器的手持裝置。

現(xiàn)在轉(zhuǎn)向附圖，參考圖1a和1b，附圖顯示用作傳感器檢測(cè)分析物的體聲波壓電諧振器20的實(shí)施方案的一般操作原理。諧振器20一般包括通過形成諧振器電極的兩個(gè)相應(yīng)金屬層結(jié)合到相反側(cè)上的壓電材料平面層。在諧振器由諧振器諧振帶內(nèi)的信號(hào)驅(qū)動(dòng)時(shí)，諧振器的兩個(gè)表面自由地經(jīng)歷振動(dòng)。在諧振器用作傳感器時(shí)，其至少一個(gè)表面適應(yīng)包括至少一種中間電子轉(zhuǎn)移劑，用于分析物的氧化還原反應(yīng)與使可溶沉淀前體轉(zhuǎn)化成沉淀分子的氧化還原反應(yīng)耦合。在諧振器表面上沉淀分子的沉淀改變諧振器的諧振特性，檢測(cè)和解釋諧振特性變化，以提供關(guān)于正被檢測(cè)物質(zhì)(分析物)的定量信息。

例如，通過檢測(cè)由諧振器表面上沉淀分子的沉淀引起的諧振器的插入或反射系數(shù)相移變化，可得到此類定量信息。此類傳感器與作為振蕩器操作諧振器并監(jiān)測(cè)振蕩頻率變化的那些不同。相反，此類傳感器在預(yù)選頻率的信號(hào)通道中插入諧振器，并監(jiān)測(cè)由諧振器表面上正被檢測(cè)物質(zhì)結(jié)合引起的插入或反射系數(shù)相移變化。當(dāng)然，也可利用監(jiān)測(cè)振蕩頻率變化的傳感器。

圖1a更詳細(xì)顯示沉淀分子在其表面26上已沉淀之前的諧振器20。所繪諧振器20電耦合到信號(hào)源22，信號(hào)源22提供具有在諧振器諧振帶內(nèi)頻率f的輸入電信號(hào)21。輸入電信號(hào)耦合到諧振器20，并通過諧振器傳輸，以提供輸出電信號(hào)23。在所繪實(shí)施方案中，輸出電信號(hào)23在與輸入電信號(hào)21相同的頻率，并且相位與輸入信號(hào)相差相移δφ1，這取決于振蕩器的壓電性質(zhì)和物理尺寸。輸出信號(hào)23耦合到相位檢測(cè)器24，相位檢測(cè)器24提供與插入相移相關(guān)的相位信號(hào)。

圖1b顯示傳感諧振器20，沉淀分子其表面26上沉淀。相同的輸入信號(hào)耦合到諧振器20。由于由物質(zhì)結(jié)合作為微擾改變諧振器的諧振特性，輸出信號(hào)25的插入相移變化到δφ2。由物質(zhì)結(jié)合引起的插入相移變化由相位檢測(cè)器24檢測(cè)。檢測(cè)的相移變化與諧振器表面上結(jié)合的物質(zhì)量相關(guān)。

圖1c顯示檢測(cè)諧振器插入相位的替代。在信號(hào)源22和諧振器20之間加入定向耦合器27，并有相反電極接地。相位檢測(cè)器28構(gòu)造成檢測(cè)由于物質(zhì)結(jié)合到諧振器表面的反射系數(shù)相移。當(dāng)然，可利用反射相移或傳感器諧振特性的任何其它適合變化。

可在本文所述信號(hào)放大方面利用的其它tfbar相移傳感器包括例如標(biāo)題為“resonatoropertingfrequencyoptimizationforphase-shiftdetectionsensors”(相移檢測(cè)傳感器的諧振器操作頻率優(yōu)化)的美國(guó)專利8,409,875中所述的那些傳感器，所述專利在不與本文所示公開內(nèi)容沖突的范圍內(nèi)全文通過引用結(jié)合到本文中。例如，傳感器裝置可包括(i)傳感諧振器，包含一種或多種結(jié)合的電子轉(zhuǎn)移劑；(ii)驅(qū)動(dòng)電路，構(gòu)造成驅(qū)動(dòng)傳感諧振器進(jìn)行振蕩運(yùn)動(dòng)；(iii)檢測(cè)電路，布置成耦合到傳感諧振器，并構(gòu)造成檢測(cè)代表傳感諧振器振蕩運(yùn)動(dòng)諧振特性的一個(gè)或多個(gè)諧振器輸出信號(hào)；和(iv)與驅(qū)動(dòng)和檢測(cè)電路操作性耦合的控制器?？刂破骺膳c包含指令的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)器接口連接，在執(zhí)行時(shí)，這些指令使控制器調(diào)節(jié)驅(qū)動(dòng)電路驅(qū)動(dòng)傳感諧振器的頻率，以保持傳感諧振器的諧振點(diǎn)。因此，可如下實(shí)現(xiàn)傳感：驅(qū)動(dòng)tfbar進(jìn)行振蕩運(yùn)動(dòng)，檢測(cè)代表tfbar振蕩運(yùn)動(dòng)諧振特性的一個(gè)或多個(gè)諧振器輸出信號(hào)，并調(diào)節(jié)傳感諧振器的驅(qū)動(dòng)頻率，以保持tfbar的諧振點(diǎn)。在實(shí)施方案中，驅(qū)動(dòng)電路驅(qū)動(dòng)傳感諧振器的頻率為最大群延遲的頻率。

這種相位檢測(cè)方法可有利使用不同諧振頻率的壓電諧振器。

在不同實(shí)施方案中，用于本文所述方法、裝置和系統(tǒng)的tfbar具有約500mhz或更大諧振頻率，例如約700mhz或更大，約900mhz或更大，約1mhz或更大，約1.2mhz或更大，約1.5ghz或更大，約1.8gh或更大，約2ghz或更大，2.2ghz或更大，2.5ghz或更大，約3ghz或更大，或約5ghz或更大，在利用放大元件介導(dǎo)質(zhì)量負(fù)荷時(shí)，如下更詳細(xì)描述，可提供增強(qiáng)的靈敏性。在實(shí)施方案中，tfbar具有約500mhz至約5ghz諧振頻率，例如約900mhz至約3ghz，或約1.2ghz至約2.5ghz。一些這些頻率基本高于前述壓電諧振器的頻率。

本文所述傳感諧振器為薄膜諧振器。薄膜諧振器包括在基體上沉積的壓電材料薄層，而非使用例如at-切割石英。壓電膜一般具有小于約5微米厚度，例如小于約2微米，并且可具有小于約100納米厚度。由于其高諧振頻率和理論上較高靈敏度，一般優(yōu)選膜諧振器。根據(jù)應(yīng)用，可形成用作傳感元件的薄膜諧振器，以支持縱向或剪切體聲波諧振模式。優(yōu)選形成傳感元件支持剪切體聲波諧振模式，因?yàn)樗鼈兏m用于液體樣品。

關(guān)于可利用薄膜諧振器(tfr)的傳感器裝置和系統(tǒng)的另外細(xì)節(jié)描述于例如1999年8月3日頒予drees等的美國(guó)專利5,932,953，所述專利在不與本文所示公開內(nèi)容沖突的范圍內(nèi)全文通過引用結(jié)合到本文中。

tfr傳感器可以任何適合方式并由任何適合材料制成。例如，諧振器可包括基體，例如硅晶片或藍(lán)寶石、布拉格鏡層或其它適合的聲學(xué)隔離裝置、底電極、壓電材料和頂電極。

可在tfr中使用任何適合壓電材料。適合壓電基體的實(shí)例包括鉭酸鋰(litao3)、鈮酸鋰(linbo3)、氧化鋅(zno)、氮化鋁(aln)、鋯鈦酸鉛(pzt)等。

電極可由任何適合材料形成，例如鋁、鎢、金、鈦、鉬或類似材料。電極可通過氣相沉積形成，或者可通過任何其它適合方法形成。

任何適合裝置或系統(tǒng)可利用本文所述薄膜諧振器和放大。作為實(shí)例并參考圖2，檢測(cè)分析物的系統(tǒng)可包括容器10(或多于一個(gè)容器)、薄膜諧振器20、驅(qū)動(dòng)電路22、檢測(cè)電路29和控制電子器件30。流體通道使一個(gè)或多個(gè)容器10耦合到諧振器20?？刂齐娮悠骷?0可操作連接到驅(qū)動(dòng)電路和檢測(cè)電路。在實(shí)施方案中，控制電子器件30構(gòu)造成基于來(lái)自檢測(cè)電路29的輸入改變驅(qū)動(dòng)電路22使諧振器20振蕩的頻率。

仍參考圖2，容器10(或多于一個(gè)容器)可容納中間電子轉(zhuǎn)移劑、可溶沉淀前體和任選的分析物分子。以下更詳細(xì)描述各這些劑。控制電子器件30可控制這些劑從容器10流到諧振器20，例如，通過泵、真空等。

可利用任何適合控制電子器件30。例如，控制電子器件可包括處理器、控制器、存儲(chǔ)器等。存儲(chǔ)器可包括計(jì)算機(jī)可讀指令，在通過處理器或控制器執(zhí)行時(shí)，指令使裝置和控制電子器件執(zhí)行歸于本文所述裝置和控制電子器件的各種功能。存儲(chǔ)器可包括任何易失性、非易失性、磁性、光學(xué)或電介質(zhì)，例如隨機(jī)存取存儲(chǔ)器(ram)、只讀存儲(chǔ)器(rom)、非易失性ram(nvram)、電可擦除可編程rom(eeprom)、閃存儲(chǔ)器或任何其它數(shù)字介質(zhì)?？刂齐娮悠骷?0可包括任何一種或多種微處理器、控制器、數(shù)字信號(hào)處理器(dsp)、專用集成電路(asic)、現(xiàn)場(chǎng)可編程門陣列(fpga)或等同的分立或集成邏輯電路。在一些實(shí)例中，控制電子器件30可包括多個(gè)組件，例如一個(gè)或多個(gè)微處理器、一個(gè)或多個(gè)控制器、一個(gè)或多個(gè)dsp、一個(gè)或多個(gè)asic、一個(gè)或多個(gè)fpga和其它分立或集成邏輯電路的任何組合。歸于本文所述控制電子器件的功能可體現(xiàn)為軟件、固件、硬件或其任何組合。

分析物耦合氧化還原級(jí)聯(lián)

在本文所述方法、裝置和系統(tǒng)中，分子識(shí)別包含能夠經(jīng)歷氧化還原反應(yīng)的分析物的樣品可允許檢測(cè)樣品中的分析物。分析物的氧化還原通過一種或多種中間電子轉(zhuǎn)移劑和輔因子(如果需要或希望)耦合到可溶沉淀前體的氧化還原。氧化還原級(jí)聯(lián)使可溶沉淀前體轉(zhuǎn)化成沉淀分子，沉淀分子可沉淀在tfbar表面上。由于沉淀分子沉淀，tfbar傳感器，在本文所述較高頻率范圍，很有效地響應(yīng)在傳感器表面的質(zhì)量增加。

現(xiàn)在參考圖3a-b，顯示圖示說明可溶沉淀前體的分析物耦合氧化還原，以使前體轉(zhuǎn)化成沉淀分子，并且沉淀分子在tfbar表面上沉淀的示意圖。如圖3a中所繪，中間電子轉(zhuǎn)移劑100固定在諧振器20的表面26上。優(yōu)選中間電子轉(zhuǎn)移劑100構(gòu)造成與分析物110或可溶沉淀前體120之一或二者選擇性相互作用(見圖3b)。在一些實(shí)施方案中，中間電子轉(zhuǎn)移劑100構(gòu)造成與可溶沉淀前體120選擇性相互作用，以氧化或還原在傳感器20的表面26附近的前體。因此，所得沉淀分子125在傳感器20的表面26附近產(chǎn)生。在圖3b所繪的實(shí)施方案中，中間電子轉(zhuǎn)移劑100氧化或還原分析物110，以產(chǎn)生氧化還原分析物產(chǎn)物115，并還原或氧化可溶沉淀前體120，以產(chǎn)生沉淀分子125，沉淀分子125可沉淀在傳感器20的表面26上。分析物110和可溶沉淀前體120可加到溶液、懸浮體等中，并移動(dòng)跨過諧振器20。

可用任何適合數(shù)量的中間電子轉(zhuǎn)移劑使分析物的氧化還原與可溶沉淀分子的氧化還原有效耦合?，F(xiàn)在參考圖4-5，描繪利用多種中間電子轉(zhuǎn)移劑和相關(guān)氧化還原輔因子的實(shí)施方案。

在圖4所繪的實(shí)施方案中，利用第一100和第二140中間電子轉(zhuǎn)移劑。在所繪實(shí)施方案中，第二中間電子轉(zhuǎn)移成分140使分析物110氧化或還原成氧化還原分析物產(chǎn)物115。第二中間電子轉(zhuǎn)移成分140也使氧化還原輔因子150還原或氧化成輔因子氧化還原產(chǎn)物155。第一中間電子轉(zhuǎn)移劑100使輔因子氧化還原產(chǎn)物155氧化或還原成氧化還原輔因子150，并使可溶沉淀前體120還原或氧化，以產(chǎn)生沉淀分子125，沉淀分子125可沉淀在諧振器20的表面26上。在所繪實(shí)施方案中，第一中間電子轉(zhuǎn)移成分100結(jié)合到傳感器20的表面26。然而，應(yīng)了解，可使第一100和第二140中間電子轉(zhuǎn)移劑100之一或二者結(jié)合到諧振器的表面。輔因子150、可溶沉淀底物120、分析物110和任選第一100或第二140電子轉(zhuǎn)移劑之一(如果不結(jié)合到諧振器的表面或如果需要添加劑)可跨諧振器引入溶液中。

在圖5所繪的實(shí)施方案中，利用第一100、第二140和第三160中間電子轉(zhuǎn)移劑。在所繪實(shí)施方案中，第二中間電子轉(zhuǎn)移成分140使分析物110氧化或還原成氧化還原分析物產(chǎn)物115。第二中間電子轉(zhuǎn)移成分140也使第一氧化還原輔因子150還原或氧化成第一輔因子氧化還原產(chǎn)物155。第三中間電子轉(zhuǎn)移成分160使第一輔因子氧化還原產(chǎn)物155氧化或還原成第一氧化還原輔因子150。第三中間電子轉(zhuǎn)移成分160也使第二氧化還原輔因子170還原或氧化成第二輔因子氧化還原產(chǎn)物175。第一和第二氧化還原輔因子可相同。第一中間電子轉(zhuǎn)移劑100使第二輔因子氧化還原產(chǎn)物175氧化或還原成第二氧化還原輔因子170，并使可溶沉淀前體120還原或氧化，以產(chǎn)生沉淀分子125，沉淀分子125可沉淀在諧振器20的表面26上。在所繪實(shí)施方案中，第一中間電子轉(zhuǎn)移成分100結(jié)合到傳感器20的表面26。然而，應(yīng)了解，可使第一100、第二140和第三160中間電子轉(zhuǎn)移成分中的兩種或更多種結(jié)合到諧振器的表面。第一150和第二170輔因子(如果不同)、可溶沉淀底物120、分析物110和任選第一100、第二140或第三160電子轉(zhuǎn)移劑之一(如果不結(jié)合到諧振器的表面或如果需要添加劑)可跨諧振器引入溶液、懸浮體等中。

如上所示，可用任何適合數(shù)量的中間電子轉(zhuǎn)移劑和輔因子(如果需要)使分析物的氧化還原與可溶沉淀前體的氧化還原耦合。可使任何一種或多種中間電子轉(zhuǎn)移劑固定到諧振器的表面上。在一些實(shí)施方案中，不使中間電子轉(zhuǎn)移劑結(jié)合到諧振器的表面。在一些實(shí)施方案中，使一種或多種氧化還原劑例如輔因子固定到諧振器的表面。在一些實(shí)施方案中，使一種或多種中間電子轉(zhuǎn)移劑和一種或多種其它氧化還原劑固定到諧振器的表面。

對(duì)于生物分析物，優(yōu)選第一中間電子轉(zhuǎn)移劑為對(duì)分析物具有高親和性且能夠催化分析物氧化或還原的分析物選擇性酶。此類酶的實(shí)例包括脫氫酶或還原酶、血紅素代謝酶、氧化應(yīng)激相關(guān)酶、加氧酶或羥化酶等。脫氫酶或還原酶的實(shí)例包括羥基類固醇脫氫酶、醇脫氫酶、醛脫氫酶、醛-酮還原酶、膽綠素還原酶、2,4-二烯酰coa還原酶、二氫葉酸還原酶、甘油醛磷酸脫氫酶、γ-干擾素可誘導(dǎo)溶酶體硫醇還原酶、谷氨酸脫氫酶、谷胱甘肽還原酶、異檸檬酸脫氫酶、乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、細(xì)胞色素p450還原酶、醌型二氫蝶啶還原酶、硫氧還蛋白還原酶、含ww域的氧化還原酶等。血紅素代謝酶的實(shí)例包括膽綠素還原酶、血紅素氧化酶等。氧化應(yīng)激相關(guān)酶的實(shí)例包括醛氧化酶、過氧化氫酶、環(huán)氧合酶、erp57/pdia、谷氧還蛋白、谷胱甘肽過氧化物酶、髓過氧化物酶、氧化氮合成酶、過氧化物氧還蛋白、超氧化物歧化酶、硫氧還蛋白、硫氧還蛋白還原酶等。加氧酶或羥化酶的實(shí)例包括醛氧化酶、環(huán)氧合酶、多巴胺β羥化酶、脯氨酰羥化酶、鳥苷三磷酸(gtp)環(huán)化水解酶、羥酸氧化酶、吲哚胺雙加氧酶、犬尿氨酸3-單加氧酶、脂加氧酶、賴氨酰氧化酶、單胺氧化酶、肽基甘氨肽α酰胺化單加氧酶、蛋白二硫鍵異構(gòu)酶、色氨酸羥化酶、葡糖氧化酶等。

一些氧化還原酶更有效地與氧化還原輔因子作用，或者需要氧化還原輔因子。因此，可期望在包含酶和任何其它中間電子轉(zhuǎn)移劑、一種或多種可溶沉淀前體和分析物(如果存在)的液體混合物或溶液中包括一種或多種適合輔因子。氧化還原輔因子可以為有機(jī)或無(wú)機(jī)氧化還原輔因子。無(wú)機(jī)輔因子的實(shí)例包括銅離子、三價(jià)鐵或亞鐵離子、鎂離子、錳離子、鉬離子、鎳離子、鋅離子、鐵-硫簇等。有機(jī)輔因子的實(shí)例包括煙堿腺嘌呤二核苷酸(nad+)、黃素腺嘌呤二核苷酸(fad)、硫辛酰胺、抗壞血酸、黃素單核苷酸(fmn)、輔酶f420、輔酶b、輔酶q、谷胱甘肽、血紅素、吡咯并喹啉醌、四氫生物蝶呤等。

在一些實(shí)施方案中，中間電子轉(zhuǎn)移劑為能夠使可溶于分析環(huán)境的可溶沉淀前體轉(zhuǎn)化成在諧振器表面上沉淀的不可溶沉淀分子的酶。能夠產(chǎn)生能夠在tfbar表面上積累的不可溶沉淀分子的酶/沉淀前體系統(tǒng)的實(shí)例包括過氧化物酶，例如辣根過氧化物酶(hrp)或髓過氧化物酶，和以下之一：聯(lián)苯胺(benzidene)、二鹽酸聯(lián)苯胺、二氨基聯(lián)苯胺、o-聯(lián)甲苯胺、o-聯(lián)二茴香胺和四甲基聯(lián)苯胺、咔唑(特別是3-氨基-9-乙基咔唑)和各種酚化合物，所有這些已報(bào)告在與過氧化物酶反應(yīng)時(shí)生成沉淀。在一些實(shí)施方案中，過氧化物酶通過氧化酶與特定分析物氧化耦合，其中最終產(chǎn)物之一為過氧化物(例如，葡糖氧化酶氧化葡萄糖)，它與在氧化時(shí)沉淀的可溶沉淀前體耦合。通過分析物特異氧化由脫氫酶產(chǎn)生的還原輔因子可通過作為中間電子轉(zhuǎn)移劑的黃遞酶耦合到還原，隨后沉淀例如作為不可溶甲臜(formazan)的四唑鎓鹽，例如氯化硝基藍(lán)四唑鎓(nbt)、氯化2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2h-四唑鎓(int)或溴化3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2h-四唑鎓(mtt)。

在一些實(shí)施方案中，中間電子轉(zhuǎn)移劑可以為例如吩嗪硫酸二甲酯的化學(xué)物質(zhì)，這種化學(xué)物質(zhì)通過在分析物特異氧化期間由脫氫酶產(chǎn)生的還原輔因子(例如，nadh或nadph)促進(jìn)還原，和隨后沉淀例如甲臜，例如氯化硝基藍(lán)四唑鎓(nbt)、氯化2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2h-四唑鎓(int)或溴化3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2h-四唑鎓(mtt)。

現(xiàn)在參考圖6，示意描繪分析檢測(cè)系統(tǒng)的實(shí)施方案。在所繪實(shí)施方案中，黃遞酶(中間電子轉(zhuǎn)移劑)固定在傳感器的表面上。黃遞酶通過還原輔因子(例如nadh或nadph)催化四唑鎓(例如，nbt)還原成不可溶甲臜。在通過酶(在所繪實(shí)施方案中，3-α-羥基類固醇脫氫酶或3-hsd)特異氧化分析物(在所繪實(shí)施方案中，膽汁酸)期間，nadh或nadph作為酶使用的電子載體輔因子產(chǎn)生。在表面上沉淀的甲臜的量或甲臜沉淀速率可與分析混合物中膽汁酸的量相關(guān)。

應(yīng)了解，圖6只提供可用于通過引起在傳感器(例如，tfbar)表面上沉淀的分析物耦合氧化還原檢測(cè)樣品中分析物存在或量的具體分析的一個(gè)實(shí)施方案。例如，可用任何適合中間電子轉(zhuǎn)移受體(例如，酶(例如上述那些酶))使可溶沉淀前體(在所繪實(shí)施方案中，nbt)轉(zhuǎn)化成可用的不可溶沉淀分子(在所繪實(shí)施方案中，甲臜)。酶不必結(jié)合到受體的表面。作為另一個(gè)實(shí)例，可利用任何一種或多種另外的中間電子受體，例如分析物-選擇性酶(在所繪實(shí)施方案中，3-hsd)?？墒怪虚g電子轉(zhuǎn)移劑結(jié)合到傳感器表面，或者可在分析混合物中游離?？衫萌魏芜m合輔因子或分析物。

可利用的適合分析物(即，其存在或量可用本文所述系統(tǒng)分析)的實(shí)例包括任何能夠經(jīng)歷氧化還原反應(yīng)的分析物。根據(jù)具體情況，優(yōu)選分析物與能夠催化或另外促進(jìn)分析物氧化或還原的分析物-選擇性中間電子轉(zhuǎn)移劑一起使用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，分析物-選擇性中間電子轉(zhuǎn)移劑為酶。具有分析物-選擇性氧化還原酶的氧化還原分析物的實(shí)例包括膽汁酸(酶可以為3-hsd等)、葡萄糖(酶可以為葡糖氧化酶或葡糖脫氫酶)等。應(yīng)了解，“分析物”可以為一類化合物，例如膽汁酸；具體化合物，例如葡萄糖；或一類化合物和具體化合物二者。在一些實(shí)施方案中，關(guān)注的分析物可以為能夠進(jìn)行氧化或還原反應(yīng)的任何酶。

在一些實(shí)施方案中，聚合物從溶液沉淀到諧振器的表面上。聚合物可從作為可溶沉淀前體的單體生成?？捎醚趸€原聚合引發(fā)劑引發(fā)此聚合和分析物耦合氧化還原到聚合物沉淀。氧化還原引發(fā)劑的實(shí)例包括過二硫酸銨-二硫化鈉、硝酸鈰銨、過氧化物(例如，過氧化氫)、烷基氫過氧化物、過二硫酸鹽、過二磷酸鹽等。在一些實(shí)施方案中，使聚合引發(fā)劑固定到諧振器表面，例如通過經(jīng)由另一個(gè)分子耦合。在此實(shí)施方案中，生成聚合物從表面接枝。按照本公開意圖，將接枝到諧振器表面的聚合物認(rèn)作為不可溶沉淀分子，即使聚合物可溶于溶劑或液體介質(zhì)，只要聚合物不接枝到諧振器表面。

現(xiàn)在參考圖7a-c，顯示圖示說明氧化還原聚合引發(fā)劑100接枝到諧振器20的表面26的實(shí)施方案的示意圖。在此實(shí)施方案中，氧化還原聚合引發(fā)劑100作為中間電子轉(zhuǎn)移劑。在加試劑之前(圖7a)，聚合引發(fā)劑不活化，且不設(shè)置成引發(fā)聚合。然而，在加試劑后，如果分析物110存在，則聚合引發(fā)劑100活化，并用于引發(fā)單體120聚合。所加試劑包括分析物100或懷疑包含分析物的樣品、中間電子轉(zhuǎn)移劑140、氧化還原輔因子150和單體120。優(yōu)選中間電子轉(zhuǎn)移劑140與分析物110選擇性相互作用，并促進(jìn)分析物110氧化或還原成分析物氧化還原產(chǎn)物115。中間電子轉(zhuǎn)移劑140也促進(jìn)輔因子150還原或氧化成輔因子氧化還原產(chǎn)物155。輔因子氧化還原產(chǎn)物155與聚合引發(fā)劑(中間電子轉(zhuǎn)移劑)100相互作用，以活化聚合引發(fā)劑，并且單體120可從接枝引發(fā)劑100聚合形成聚合物(沉淀分子)125。

應(yīng)了解，圖7a-c代表可如何用氧化還原聚合引發(fā)劑作為中間電子轉(zhuǎn)移劑使分析物氧化還原與傳感器表面上聚合物沉淀耦合的一個(gè)實(shí)施方案。例如，聚合引發(fā)劑不必固定到傳感器的表面。作為另一個(gè)實(shí)例，對(duì)于分析物有選擇性的中間電子轉(zhuǎn)移劑和聚合引發(fā)劑二者均可結(jié)合到諧振器的表面。作為另一個(gè)實(shí)例，可利用一種或多種另外的中間電子轉(zhuǎn)移劑或輔因子。

可使用在tfbar表面上固定中間電子轉(zhuǎn)移劑的任何適合方法。作為實(shí)例，可用氣相沉積法在傳感器表面上沉積均勻環(huán)氧硅烷涂層。然后，可使用例如基于壓電的納米分配技術(shù)，在試驗(yàn)和參比諧振器上沉積試驗(yàn)和參比中間電子轉(zhuǎn)移劑(例如，聚合引發(fā)劑(可綴合到具有用于耦合到諧振器表面的適合官能性的分子))、酶等。中間電子轉(zhuǎn)移劑上的伯胺與環(huán)氧化物基團(tuán)反應(yīng)，使電子轉(zhuǎn)移劑共價(jià)結(jié)合到傳感器表面。作為另一個(gè)實(shí)例，如果存在，電子轉(zhuǎn)移劑的硫醇基可結(jié)合到tfbar表面上的硫或硫氫基或涂覆到tfbar表面。適當(dāng)或必要時(shí)，可使tfbar的表面改性，以允許結(jié)合中間電子轉(zhuǎn)移劑。

在不同實(shí)施方案中，可用關(guān)于檢測(cè)分析物的類似于上述的原理檢測(cè)氧化還原酶的存在或活性?？煽紤]分析物為酶，一般可如上所述檢測(cè)酶的量、活性或量和活性。應(yīng)了解，較少量酶較大活性可產(chǎn)生比較多酶較小活性更大的信號(hào)。因此，在實(shí)施方案中，可檢測(cè)樣品中氧化還原酶的活性和量的組合。推斷包括氧化還原酶的試樣可與能夠被該酶氧化或還原的已知量底物結(jié)合。底物的氧化或還原可通過氧化還原級(jí)聯(lián)與可溶前體的氧化或還原耦合，使沉淀分子在tfbar的表面上沉淀。tfbar表面上質(zhì)量的改變可與試樣中酶的活性相關(guān)。

可使一種或多種中間電子轉(zhuǎn)移成分或其它氧化還原試劑(例如，輔因子)耦合到tfbar表面，如上所述。在此情況下，待檢測(cè)酶加到樣品中，并且不會(huì)作為tfbar結(jié)合中間電子轉(zhuǎn)移成分。

作為說明并參考圖4，可將待檢測(cè)氧化還原酶認(rèn)為是成分140。在含酶140的樣品移動(dòng)跨過傳感器20的表面26時(shí)或之前，可將用于酶的已知量底物110與酶140混合。如果酶140存在并且具有活性，酶140可使底物110氧化或還原成氧化還原底物產(chǎn)物115。在所繪實(shí)施方案中，酶140也使氧化還原輔因子150還原或氧化成輔因子氧化還原產(chǎn)物155。中間電子轉(zhuǎn)移劑100使輔因子氧化還原產(chǎn)物155氧化或還原成氧化還原輔因子150，并使可溶沉淀前體120還原或氧化，以產(chǎn)生沉淀分子125，沉淀分子125可沉淀在諧振器20的表面26上。輔因子150、可溶沉淀底物120、底物110和酶140可跨結(jié)合有中間電子轉(zhuǎn)移成分100的諧振器引入溶液中。

雖然關(guān)于圖4描述，但應(yīng)了解，可通過關(guān)于檢測(cè)分析物的任何上述適合實(shí)施方案的適合改進(jìn)完成酶的存在或活性的檢測(cè)。例如，可用酶代替圖6中的中間電子轉(zhuǎn)移成分140或160，并且可用底物代替成分150或170。

用途

本文所述傳感器、裝置和系統(tǒng)可用于檢測(cè)樣品中的分析物。傳感器可用于多種化學(xué)、環(huán)境、食品安全或醫(yī)學(xué)應(yīng)用。例如，待檢測(cè)樣品可以為血液、血清、血漿、腦脊液、唾液、尿等或由其得到。不是流體組合物的其它試驗(yàn)組合物可溶于或懸浮于分析用的適合溶液或溶劑。

定義

除非另外說明，本文所用所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有在本領(lǐng)域常用的意義。本文提供的定義是為了幫助理解本文中常用的某些術(shù)語(yǔ)，而不是要限制本公開的范圍。

如本說明書和附加權(quán)利要求中所用，除非上下文另外清楚地指明，否則單數(shù)形式“一個(gè)”和“該”包括具有復(fù)數(shù)對(duì)象的實(shí)施方案。

如本說明書和附加權(quán)利要求中所用，除非上下文另外清楚地指明，否則詞語(yǔ)“或”一般以其包括“和/或”的意義使用。詞語(yǔ)“和/或”意味著一個(gè)或所有所列元素或任何兩個(gè)或更多個(gè)所列元素的組合。

本文所用“具有”、“包括”和“包含”等以開放式意義使用，一般意指“包括但不限于”。應(yīng)了解，“基本由…組成”、“由…組成”等歸入“包含”等中。本文所用“基本由…組成”，在其涉及組合物、產(chǎn)物、方法等時(shí)，意味著組合物、產(chǎn)物、方法等的組分限于所列舉組分和不實(shí)質(zhì)影響組合物、產(chǎn)物、方法等的基本和新的特征的任何其它組分。

詞語(yǔ)“優(yōu)選的”或“優(yōu)選地”指在某些情況下可給予某些益處的本發(fā)明的實(shí)施方案。然而，在相同或其它情況下，其它實(shí)施方案也可能是優(yōu)選的。另外，對(duì)一個(gè)或多個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的敘述不意味著其它實(shí)施方案不可用，也不是要從包括權(quán)利要求的本公開的范圍排除其它實(shí)施方案。

而且，在本文中由端點(diǎn)描述的數(shù)字范圍包括在此范圍內(nèi)包含的所有數(shù)字(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等，或者10或更小包括10、9.4、7.6、5、4.3、2.9、1.62、0.3等)。在一個(gè)數(shù)值范圍為“高達(dá)”具體值時(shí)，那個(gè)值也包括在范圍內(nèi)。

在本文中涉及的任何方向，例如“頂”、“底”、“左”、“右”、“上”、“下”和其它方向及取向在本文中為了參照附圖清楚而描述，而不是要限制實(shí)際裝置或系統(tǒng)或裝置或系統(tǒng)的用途。本文所述裝置或系統(tǒng)可以多個(gè)方向和取向使用。

本文所用“氧化還原分析物”為能夠被氧化或還原的分析物。優(yōu)選氧化還原分析物能夠與可催化分析物氧化或還原的氧化還原酶相互作用。

本文所用對(duì)于分子有“選擇性”的中間電子轉(zhuǎn)移劑或酶為與分子(例如分析物或沉淀前體)選擇性相互作用的轉(zhuǎn)移劑或酶。“選擇性相互作用”意為以顯著高于其它分子的專一性與關(guān)注的分子相互作用。例如，比起分析混合物中存在的其它試劑，選擇性轉(zhuǎn)移劑或酶可與關(guān)注的分子以5倍或更高(例如，10倍或更高、50倍或更高或100倍或更高)的專一性相互作用。在一些情況下，電子轉(zhuǎn)移劑或酶可對(duì)多于一種分子有選擇性(例如分析物和輔因子或沉淀前體和輔因子)。

實(shí)施例

以下非限制實(shí)施例用于更充分描述使用上述傳感器、方法、裝置和系統(tǒng)的方式。應(yīng)了解，這些實(shí)施例決不用于限制本公開或以下權(quán)利要求的范圍，只為了說明目的而提供。

實(shí)施例1：沉淀分子的分析物-耦合氧化還原-概念證明

以下實(shí)施例利用圖6中概要描繪的分析系統(tǒng)。結(jié)果顯示于圖8中。圖8顯示在臨床可用范圍內(nèi)牛磺膽酸注入正常人血清的劑量響應(yīng)。反應(yīng)混合物包括1.75mmnad+、0.4mg/mlnbt、0.1u/ml3-hsd，在trisph7.5中。傳感器為環(huán)氧硅烷涂覆的rev3傳感器，涂有0.2mg/ml黃遞酶(試驗(yàn)通道)和0.2mg/mlbsa(參比通道)。分析合并60ul反應(yīng)混合物、10ul樣品、38ultrisph7.5，在傳感器上通過2分鐘。圖8中分析和顯示的數(shù)據(jù)為前15秒響應(yīng)數(shù)據(jù)的線性擬合。

因此，本文公開通過氧化還原耦合的質(zhì)量檢測(cè)的實(shí)施方案。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，本文所述方法、裝置和系統(tǒng)可用公開以外的實(shí)施方案實(shí)施。公開的實(shí)施方案為了說明目的而提供，而非限制。還應(yīng)了解，在本文中關(guān)于附圖和實(shí)施方案描繪和描述的方法、裝置和系統(tǒng)的組分可以互換。