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本申請(qǐng)涉及2014年9月29日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/056830，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。

本發(fā)明一般涉及熒光成像，且特別是涉及在自體熒光的存在下，生物材料中目標(biāo)熒光團(tuán)的成像。

背景

在生命科學(xué)中，熒光通常用作鑒定和分析生物材料的非侵入性方法。生物材料例如蛋白、核酸、脂質(zhì)、細(xì)胞和細(xì)胞組分、干細(xì)胞或小分子中的特定目標(biāo)可用外在或外生熒光團(tuán)標(biāo)記，因而隨后成像。生物材料也自然會(huì)發(fā)熒光，其被稱為內(nèi)在熒光或“自體熒光”，因?yàn)樗诓淮嬖谕馍o予的熒光團(tuán)的情況下出現(xiàn)。自體熒光被認(rèn)為源自生物材料中的各種內(nèi)生熒光團(tuán)，包括例如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)、彈性蛋白、膠原蛋白、黃素、氨基酸和卟啉。

當(dāng)用適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)的光照射生物材料時(shí)，自體熒光和熒光發(fā)射可以生成并記錄為圖像。然而，自體熒光，其是熒光團(tuán)的組合的結(jié)果且以幾百納米擴(kuò)展的寬發(fā)射光譜為特征，當(dāng)熒光團(tuán)和自體熒光的發(fā)射光譜重疊時(shí)，可能干擾檢測(cè)特定的熒光團(tuán)發(fā)射的能力。在這樣的情況下，除了通過屏蔽感興趣的熒光團(tuán)的熒光減少信號(hào)檢測(cè)靈敏性外，自體熒光也可通過提供假陽性結(jié)果減少檢測(cè)的特異性。

解決這個(gè)問題的一個(gè)途徑是利用減少或最大限度地降低由生物材料的自體熒光所致的檢測(cè)發(fā)射信號(hào)的裝置。現(xiàn)有技術(shù)描述了通過在圖像采集前使用生物材料的各種預(yù)處理來減少自體熒光的方法。然而，這樣的技術(shù)也可降低生物材料自身的品質(zhì)，且通常不適合于體內(nèi)應(yīng)用。或者，如果自體熒光發(fā)射自身不能減輕，則有可能通過任何獲得的熒光圖像的數(shù)字處理，最大限度地減少?gòu)淖泽w熒光至圖像數(shù)據(jù)的信號(hào)貢獻(xiàn)。例如在含有來自感興趣的熒光團(tuán)和自體熒光二者的合并信號(hào)的圖像中，這些方法中的一些依靠獲得“純”自體熒光信號(hào)的估計(jì)值并使用這樣的估計(jì)值通過加權(quán)減法除去自體熒光。其它方法使用統(tǒng)計(jì)相關(guān)性技術(shù)以改正額外的自體熒光信號(hào)。這些圖像數(shù)據(jù)處理技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)參考文獻(xiàn)中描述且通常通過差的準(zhǔn)確度，通過需要小(即，低分辨率)數(shù)據(jù)集，或通過需要重要的后處理限制。因此，理想的是建立一種高分辨率的圖像處理技術(shù)，以快速和準(zhǔn)確地分辨生物材料中感興趣的熒光團(tuán)發(fā)射的熒光與相同生物材料中的自體熒光發(fā)射。

概述

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種提取生物材料中的目標(biāo)熒光團(tuán)的圖像的方法，其中生物材料中目標(biāo)熒光團(tuán)發(fā)射的波段重疊自體熒光發(fā)射的波段。該方法包括用第一激發(fā)光照射生物材料，以誘導(dǎo)由生物材料的自體熒光和目標(biāo)熒光團(tuán)的熒光二者產(chǎn)生的第一熒光發(fā)射，并用第二激發(fā)光照射生物材料以誘導(dǎo)由生物材料的自體熒光產(chǎn)生的第二熒光發(fā)射，從第一熒光發(fā)射獲得第一熒光圖像和從第二熒光發(fā)射獲得第二熒光圖像，并處理第一和第二熒光圖像以提取代表目標(biāo)熒光團(tuán)的第三熒光圖像，其中在獲得第一和第二熒光圖像之前，調(diào)制第一和第二激發(fā)光的相對(duì)強(qiáng)度。所述處理可例如包括從第一熒光圖像減去第二熒光圖像。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，相對(duì)強(qiáng)度的調(diào)制包括鑒定第一和第二熒光發(fā)射中的波長(zhǎng)區(qū)，其中波長(zhǎng)區(qū)是由熒光團(tuán)引起的發(fā)射存在于第一熒光發(fā)射中，而不存在于第二熒光發(fā)射中的區(qū)域,選擇波長(zhǎng)區(qū)以外的波段,計(jì)算選擇的波段下的第一和第二熒光發(fā)射的相對(duì)強(qiáng)度的比率，并調(diào)節(jié)第一和第二激發(fā)光的相對(duì)強(qiáng)度，以調(diào)節(jié)對(duì)應(yīng)的第一熒光發(fā)射、第二熒光發(fā)射或二者，直至達(dá)到一個(gè)合適的計(jì)算比率。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，第一和第二熒光發(fā)射的相對(duì)強(qiáng)度的比率可通過將對(duì)應(yīng)于第一熒光發(fā)射的曲線下面積值除以對(duì)應(yīng)于第二熒光發(fā)射的曲線下面積值來計(jì)算。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種提取生物材料中的目標(biāo)熒光團(tuán)的圖像的系統(tǒng)，其中生物材料中目標(biāo)熒光團(tuán)發(fā)射的波段重疊自體熒光發(fā)射的波段。系統(tǒng)包括用于用第一激發(fā)光照射生物材料，以誘導(dǎo)由生物材料的自體熒光和目標(biāo)熒光團(tuán)的熒光二者產(chǎn)生的第一熒光發(fā)射，并用第二激發(fā)光照射生物材料以誘導(dǎo)由生物材料的自體熒光產(chǎn)生的第二熒光發(fā)射的裝置，用于從第一熒光發(fā)射獲得第一熒光圖像和從第二熒光發(fā)射獲得第二熒光圖像的裝置，用于在采集第一和第二熒光圖像之前調(diào)制第一和第二激發(fā)光的相對(duì)強(qiáng)度的裝置，和用于處理第一和第二熒光圖像以提取代表目標(biāo)熒光團(tuán)的第三熒光圖像的裝置。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，用于照射的裝置包括照射模塊，用于獲得的裝置包括熒光發(fā)射采集模塊，和用于處理的裝置包括處理器模塊。

在其中目標(biāo)熒光團(tuán)是卟啉的實(shí)施方案中，例如，第一激發(fā)光具有約405nm的波長(zhǎng)，第二激發(fā)光具有約450nm的波長(zhǎng)，選擇的波段是約600nm，和計(jì)算的比率是約1。

附圖簡(jiǎn)述

在說明本發(fā)明的實(shí)施方案的附圖中，

圖1圖示地說明根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的示例性方法；

圖2說明從尿中的自體熒光和卟啉(圖2a)，尿中的自體熒光(圖2b)產(chǎn)生的熒光光譜，和對(duì)應(yīng)于根據(jù)各個(gè)實(shí)施方案獲得的單獨(dú)卟啉的差示光譜(圖2c)；

圖3說明根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的新鮮獲得的尿(3a)和光漂白的尿(3b)在405nm和450nm的熒光光譜；

圖4說明對(duì)應(yīng)于圖3中的熒光光譜的圖像，其中左欄(a、c、e)涉及新鮮收集的尿，而右欄(b、d、f)涉及光漂白的尿，上排(a、b)涉及從約405nm激發(fā)的熒光圖像，中排(c、d)涉及從約450nm激發(fā)的熒光圖像，和下排(e、f)說明根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案獲得的對(duì)應(yīng)于目標(biāo)熒光團(tuán)(卟啉)的差示圖像；

圖5a說明當(dāng)用405nm光激發(fā)時(shí)，受試者前臂的示例體內(nèi)熒光圖像，顯示來自前臂的自體熒光和卟啉熒光；圖5b說明如在圖5a的前臂的相同區(qū)域，在用450nm光激發(fā)時(shí)的熒光圖像，顯示自體熒光減少至與圖5a中的自體熒光水平類似的水平，其中卟啉熒光在450nm激發(fā)下不存在；圖5c說明根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案除去自體熒光的卟啉的熒光圖像；

圖6a說明在激發(fā)強(qiáng)度被調(diào)節(jié)在600nm后，在405nm和450nm的背景強(qiáng)度值，并在激發(fā)之間觀察到背景值之間的低于約2%的差異；圖6b說明來自在405nm下激發(fā)的熒光圖像和根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案除去背景后的信噪比的比較；

圖7說明根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的提取生物材料中的目標(biāo)熒光團(tuán)的圖像的系統(tǒng)；

圖8說明根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的照射模塊；和

圖9說明根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的熒光發(fā)射采集模塊。

詳述

現(xiàn)在對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面和變化的實(shí)施方式和實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，其實(shí)施例在附圖中說明。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種提取生物材料中的目標(biāo)熒光團(tuán)的圖像的方法，其中生物材料中目標(biāo)熒光團(tuán)發(fā)射的波段重疊自體熒光發(fā)射的波段。圖1圖示地說明本發(fā)明根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的方法。參考圖1，該方法包括用第一激發(fā)光照射生物材料，以誘導(dǎo)由生物材料的自體熒光和目標(biāo)熒光團(tuán)的熒光二者產(chǎn)生的第一熒光發(fā)射，并用第二激發(fā)光照射生物材料，以誘導(dǎo)由生物材料的自體熒光產(chǎn)生的第二熒光發(fā)射，從第一熒光發(fā)射獲得第一熒光圖像和從第二熒光發(fā)射獲得第二熒光圖像，并處理第一和第二熒光圖像，以獲得代表目標(biāo)熒光團(tuán)的第三熒光圖像，其中第一和第二激發(fā)光的相對(duì)強(qiáng)度在獲得第一和第二熒光圖像之前被調(diào)制。

在各個(gè)實(shí)施方案中，生物材料包括源自、得自，或位于生物受試者(例如，哺乳動(dòng)物)中的材料，并且還包括體外、原位或體內(nèi)材料。生物材料的例子包括源自或位于哺乳動(dòng)物(包括人)的生物組織或流體或其部分、器官、細(xì)胞、細(xì)胞系、細(xì)胞成分。生物材料包括得自、源自或在受試者的組織中的細(xì)胞的收集，例如，來自受試者發(fā)育的任何時(shí)間的上皮組織、結(jié)締組織、血管、肌肉、神經(jīng)組織、骨。在各個(gè)實(shí)施方案中，生物材料包括包含目標(biāo)熒光團(tuán)(例如，卟啉)的健康的、病變的或惡性組織(例如，癌或腫瘤組織)。生物材料的例子還包括細(xì)菌，包括存在于受試者(人、動(dòng)物)中的細(xì)菌。為流體的生物材料的例子包括尿、血清、血漿，或血。在各個(gè)實(shí)施方案中，生物材料可以是用于組織化學(xué)、免疫組織化學(xué),細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光、免疫印跡或其它熒光相關(guān)的成像應(yīng)用的組織切片。

在各個(gè)實(shí)施方案中，生物材料中的目標(biāo)熒光團(tuán)是當(dāng)用特定波長(zhǎng)的光激發(fā)時(shí)，以不同的(通常較長(zhǎng))的波長(zhǎng)發(fā)射光的熒光團(tuán)。目標(biāo)熒光團(tuán)包括具有分析、預(yù)后、診斷、生理、病理意義或其組合的熒光團(tuán)。在各個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)熒光團(tuán)可天然存在于生物材料中(即，內(nèi)生熒光團(tuán))，以前體或最終形式，或其組合外部給予生物材料內(nèi)(即，外生熒光團(tuán))。天然存在的或內(nèi)生熒光團(tuán)的例子包括卟啉、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)、彈性蛋白、膠原蛋白、黃素，和氨基酸。在其中卟啉是目標(biāo)熒光團(tuán)的實(shí)施方案中，卟啉包括一類有機(jī)化合物，其與生物系統(tǒng)相關(guān)并形成為血紅素生物合成中的前體中間體。例如，在人和其它哺乳動(dòng)物中，具有8-、7-、6-、5-和4-羧基的卟啉通常為血紅素合成而過量形成，并因而在尿中排泄。在各個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語“卟啉”包括，例如卟啉衍生物、糞卟啉、尿卟啉、原卟啉、卟啉綴合物、脂質(zhì)體，和納米囊泡。

外生熒光團(tuán)的例子包括各種熒光探針或熒光誘導(dǎo)劑，其可被用來增強(qiáng)(例如，提高)至生物材料的組分的熒光特性或給生物材料的組分提供熒光特性。例如，熒光探針可與生物材料的組分締合或附接于其上，以例如增強(qiáng)組分中內(nèi)生熒光團(tuán)的熒光。外生熒光探針的例子包括異硫氰酸熒光素(fitc)、熒光素、熒光染料、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)，和曙紅。熒光誘導(dǎo)劑的例子包括可插入細(xì)胞染色體以誘導(dǎo)熒光蛋白(例如，綠色熒光蛋白)產(chǎn)生的基因。熒光誘導(dǎo)劑可以是可增強(qiáng)目標(biāo)熒光團(tuán)的熒光反應(yīng)的輔助劑。例如在其中目標(biāo)熒光團(tuán)是卟啉的實(shí)施方案中，輔助劑可以是選擇的食物來源(例如，生卟啉食物或化學(xué)物質(zhì))、氨基乙酰丙酸或heme路徑中的某些酶的抑制劑(例如，亞鐵螯合酶(ferrochelatease)抑制劑)，其當(dāng)消費(fèi)或給予受試者時(shí)，增加卟啉的熒光反應(yīng)。

生物材料在外生給予的熒光團(tuán)的不存在下，由于在生物材料中存在各種內(nèi)生熒光團(tuán)，會(huì)天然發(fā)熒光或“自發(fā)熒光(autofluoresces)”。自體熒光由生物材料中的各種熒光團(tuán)引起，包括例如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)、彈性蛋白、膠原蛋白、黃素、氨基酸、脂褐質(zhì)、晚期糖基化終產(chǎn)物，和卟啉。生物材料包括在用于本發(fā)明的方法和系統(tǒng)的各個(gè)實(shí)施方案之前已被加工或被另外處理的材料。例如，在某些實(shí)施方案中，預(yù)處理可包括生物材料的光漂白，以推測(cè)通過滅活某些自體熒光內(nèi)生熒光團(tuán)減少生物材料的自體熒光，并因此在其中目標(biāo)熒光團(tuán)比較不容易受到光漂白或以比生物材料中自體熒光熒光團(tuán)更慢的速率被光漂白的情況下，促進(jìn)目標(biāo)熒光團(tuán)的更清晰的后續(xù)解析。

根據(jù)各個(gè)實(shí)施方案，所述方法包括用第一激發(fā)光照射生物材料，以誘導(dǎo)由生物材料的自體熒光和目標(biāo)熒光團(tuán)的熒光二者產(chǎn)生的第一熒光發(fā)射，并用第二激發(fā)光照射生物材料，以誘導(dǎo)由生物材料的自體熒光產(chǎn)生的第二熒光發(fā)射。在各個(gè)實(shí)施方案中，選擇第一激發(fā)光的波長(zhǎng)，以便當(dāng)?shù)谝患ぐl(fā)光照射生物材料時(shí)，引起自體熒光的生物材料中的熒光團(tuán)和目標(biāo)熒光團(tuán)二者被激發(fā)并發(fā)射第一熒光發(fā)射。在各個(gè)實(shí)施方案中，選擇第二激發(fā)光的波長(zhǎng)，以僅僅使生物材料中產(chǎn)生自體熒光的熒光團(tuán)被激發(fā)并發(fā)射第二熒光發(fā)射。在各個(gè)實(shí)施方案中，例如，第一激發(fā)光可具有范圍從約350nm至約450nm的波長(zhǎng)，而第二激發(fā)光可具有范圍從約450nm至約700nm的波長(zhǎng)。具有第一激發(fā)光和第二激發(fā)光的生物材料的照射包括間歇性照射、連續(xù)照射或其組合。

在其中目標(biāo)熒光團(tuán)是卟啉的實(shí)施方案中，第一激發(fā)光具有約405nm的波長(zhǎng)，而第二激發(fā)光具有約450nm的波長(zhǎng)。圖2(陰影區(qū)域)說明得自尿中卟啉的數(shù)據(jù)。特別是，圖2a是從尿中自體熒光和卟啉二者引起的第一熒光發(fā)射光譜，和圖2b是從僅僅自體熒光引起的第二熒光發(fā)射光譜。圖2c是對(duì)應(yīng)于僅僅卟啉的差示光譜。在圖2說明的實(shí)施例中，用光漂白預(yù)處理尿以促進(jìn)更好地區(qū)分卟啉與自體熒光。特別是，通過用波長(zhǎng)約450nm的第二激發(fā)光照射尿約3分鐘進(jìn)行光漂白預(yù)處理，這導(dǎo)致與未處理的尿比較的改進(jìn)的區(qū)分尿的卟啉與自體熒光(圖3)。圖3顯示來自新鮮獲得的尿的熒光光譜(圖3a)和尿的大約3-分鐘光漂白暴露于約450nm的光后獲得的光譜(圖3b)。

根據(jù)各個(gè)實(shí)施方案，所述方法包括從第一熒光發(fā)射獲得第一熒光圖像和從第二熒光發(fā)射獲得第二熒光圖像，和處理第一和第二熒光圖像以提取代表目標(biāo)熒光團(tuán)的第三熒光圖像，其中第一和第二激發(fā)光的相對(duì)強(qiáng)度在獲得第一和第二熒光圖像之前被調(diào)制。圖4a-4d是對(duì)應(yīng)于當(dāng)尿是新鮮獲得時(shí)和當(dāng)尿已暴露于約450nm的光約3分鐘時(shí)獲得的圖3光譜的圖像。圖4e和4f是對(duì)應(yīng)于從如結(jié)合各個(gè)實(shí)施方案描述的處理產(chǎn)生的僅僅卟啉的差示圖像。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，在圖像采集前調(diào)制相對(duì)強(qiáng)度包括鑒定第一和第二熒光發(fā)射中的波長(zhǎng)區(qū)，其中波長(zhǎng)區(qū)是由熒光團(tuán)引起的發(fā)射存在于第一熒光發(fā)射中而不存在于第二熒光發(fā)射中的區(qū)域，選擇波長(zhǎng)區(qū)以外的波段，計(jì)算選擇波段下的第一和第二熒光發(fā)射的相對(duì)強(qiáng)度的比率，和調(diào)節(jié)第一和第二激發(fā)光的相對(duì)強(qiáng)度，以調(diào)節(jié)對(duì)應(yīng)的第一熒光發(fā)射、第二熒光發(fā)射或二者，直至達(dá)到一個(gè)合適的計(jì)算比率。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方案，波段包括波長(zhǎng)。例如，在其中目標(biāo)熒光團(tuán)是卟啉的實(shí)施方案中，如在圖2c或圖3b中所示，其中由卟啉引起的發(fā)射的波長(zhǎng)區(qū)存在于第一熒光發(fā)射中，而不存在于范圍例如從約615nm至約625nm和從約660nm至約700nm的第二熒光發(fā)射中。因此，600nm被選擇作為波長(zhǎng)區(qū)外的波段并用作計(jì)算在405nm和450nm的相對(duì)強(qiáng)度的比率，以確定是否需要調(diào)節(jié)相對(duì)強(qiáng)度的波段。在這個(gè)實(shí)施例中，調(diào)節(jié)相對(duì)強(qiáng)度直至達(dá)到在約1+/-2%范圍內(nèi)的計(jì)算比率。在這個(gè)實(shí)施例中，通過將對(duì)應(yīng)于第一熒光發(fā)射的曲線下面積值(即，由約405nm激發(fā)產(chǎn)生的發(fā)射)除以對(duì)應(yīng)于第二熒光發(fā)射的曲線下面積值(即，由在約450nm激發(fā)產(chǎn)生的發(fā)射)，計(jì)算在600nm波段的比率。在各個(gè)實(shí)施方案中，可通過將在第一熒光發(fā)射的選擇波段(例如，選擇的波長(zhǎng))的強(qiáng)度除以在第二熒光發(fā)射的選擇波段(例如，選擇的波長(zhǎng))的強(qiáng)度計(jì)算比率。在各個(gè)實(shí)施方案中,其它方法可用來計(jì)算比率。例如，在選擇波段(例如，600nm)下由在405nm和450nm的各自發(fā)射產(chǎn)生的光譜中的一個(gè)或多個(gè)強(qiáng)度點(diǎn)(并非面積)可被用于這樣一種計(jì)算。

在各個(gè)實(shí)施方案中，處理包括從第一熒光圖像減去第二熒光圖像，以產(chǎn)生目標(biāo)熒光團(tuán)的無自體熒光的圖像(例如，圖4e和4f)。

根據(jù)各個(gè)實(shí)施方案的方法和系統(tǒng)可被用來原位檢測(cè)熒光。圖5和6中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說明實(shí)施例結(jié)果，其中卟啉被局部應(yīng)用于受試者的皮膚。在這個(gè)實(shí)施例中，卟啉溶液通過將約0.1mg糞卟啉酯(sigma-aldrich)溶于約10ml二甲亞砜(dmso,sigmaaldrich)中來制備。使用棉簽(q-tip)將卟啉溶液施用于受試者前臂的小面積上。熒光成像系統(tǒng)用來獲得特征為在約405?nm和約450?nm的卟啉吸收最大值的雙重激發(fā)能力的數(shù)據(jù)。后者被選擇作為主要卟啉吸收帶外的最短的波長(zhǎng)，且由于其誘導(dǎo)高水平的組織自體熒光的特性。為確保反射的激發(fā)光不干擾熒光圖像，600nm的帶通濾波器(600nm±5nm)被放置在成像系統(tǒng)中的檢測(cè)器前面，并調(diào)制在405nm和450nm的激發(fā)強(qiáng)度直至在450nm的自體熒光與在405nm的自體熒光的比率達(dá)到約1。圖5a是當(dāng)用405nm光激發(fā)時(shí)，受試者前臂的體內(nèi)熒光圖像，顯示來自前臂的自體熒光和卟啉熒光。圖5b是在用450nm光激發(fā)時(shí)，在如圖5a的前臂相同區(qū)域的熒光圖像。由于由450nm激發(fā)誘導(dǎo)的自體熒光大于由405nm激發(fā)誘導(dǎo)的自體熒光，調(diào)制在450nm的激發(fā)光，產(chǎn)生與圖5a的自體熒光水平類似水平的自體熒光。圖5c說明根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案除去自體熒光的卟啉的熒光圖像。

圖5a說明使用在405nm的單一激發(fā)產(chǎn)生由卟啉熒光引起的局域優(yōu)化(well-localized)熒光區(qū)。周圍區(qū)域的高水平的背景由皮膚中存在幾個(gè)內(nèi)生熒光團(tuán)引起(例如，黃素腺嘌呤二核苷酸(fad)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)和脂質(zhì))。當(dāng)用遠(yuǎn)離卟啉的吸收光譜的不同的激發(fā)波長(zhǎng)(450nm)激發(fā)相同區(qū)域時(shí)，也可觀察到類似的自體熒光圖案(圖5b)。圖5c顯示根據(jù)本發(fā)明的方法處理后生成的圖像，其中使用該方法成功地減弱了自體熒光。

圖6a說明在600nm調(diào)節(jié)激發(fā)強(qiáng)度后，在405nm和450nm的背景強(qiáng)度值，和在激發(fā)之間觀察到背景值之間的低于約2%的差異。圖6b說明從405nm激發(fā)的熒光圖像和根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案除去背景后的信噪比(s/n比率)的比較。如與使用在405nm的單一激發(fā)所比較的，s/n比率的增加可使用該方法實(shí)現(xiàn)(見圖6b，其中示出了分別約28.5和約1.9的s/n比率)。

各種常規(guī)方法包括同時(shí)采集熒光圖像，其中所有熒光種類被照射，且它們的熒光發(fā)射在相同的時(shí)間收集。然后獲得的圖像使用一個(gè)或多個(gè)包括光譜分解或背景減法的自體熒光去除模型處理。雖然各種常規(guī)方法已經(jīng)提出用于除去自體熒光，例如光譜分解(線性分解)和數(shù)字背景減法以揭示差異，這樣的方法依賴于處理采集后圖像和對(duì)自體熒光的預(yù)表征光譜，需要校準(zhǔn)，且易受基于目標(biāo)熒光團(tuán)的濃度的靈敏性變化的影響。雖然這些方法可能是成本有效的且適用于體外和體內(nèi)成像二者，它們不能從熒光圖像完全除去自體熒光組分，并進(jìn)一步對(duì)儀器背景信號(hào)作出解釋。在圖像采集前的第一和第二激發(fā)光的相對(duì)強(qiáng)度的調(diào)制，如結(jié)合各個(gè)實(shí)施方案所述的，由于例如在引起自體熒光的生物材料中目標(biāo)熒光團(tuán)(例如，卟啉)和熒光團(tuán)之間光漂白的不同速率，補(bǔ)償發(fā)射隨時(shí)間的相對(duì)變化。如果強(qiáng)度的調(diào)制在圖像采集后數(shù)字化進(jìn)行，如在現(xiàn)有技術(shù)中描述的，會(huì)降低處理兩幅圖像以推導(dǎo)目標(biāo)熒光團(tuán)的圖像的準(zhǔn)確性(例如，減法)，特別是如果第一和第二熒光信號(hào)的幅度明顯不同?，F(xiàn)有技術(shù)光譜分解方法常常需要樣品中自體熒光的量的現(xiàn)有知識(shí)，其可能不是常數(shù)。此外，生物材料的圖像也可包括一定量的由采集系統(tǒng)本身貢獻(xiàn)的噪音或背景。因此，與本發(fā)明形成對(duì)照，圖像采集后的強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)化，如在現(xiàn)有技術(shù)中教導(dǎo)的，是較嘈雜的和信號(hào)品質(zhì)有限的，特別是當(dāng)目標(biāo)熒光團(tuán)具有與自體熒光信號(hào)(例如，在生物材料的低濃度組分中的內(nèi)生熒光團(tuán)或熒光團(tuán))比較的低水平信號(hào)時(shí)。而且，圖像采集后目標(biāo)熒光團(tuán)的低水平信號(hào)的放大，如在現(xiàn)有技術(shù)中教導(dǎo)的，也放大儀器背景信號(hào)，其進(jìn)一步負(fù)面影響信號(hào)品質(zhì)。與現(xiàn)有技術(shù)方法不同，本發(fā)明促進(jìn)對(duì)生物材料中熒光的變化的動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)校正，因此能夠?qū)崟r(shí)表示生物材料的性質(zhì)。

根據(jù)各個(gè)實(shí)施方案生成的數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的雙重激發(fā)方法，如結(jié)合各個(gè)實(shí)施方案描述的，通過在采集熒光圖像前以選擇的波長(zhǎng)調(diào)制自體熒光強(qiáng)度，促進(jìn)在生物組織的熒光成像期間熒光背景信號(hào)的減少或減輕熒光背景信號(hào)。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方案，光譜圖像的采集通過定時(shí)激發(fā)和在一定時(shí)間從僅僅感興趣的目標(biāo)熒光團(tuán)或背景收集光進(jìn)行。這種激發(fā)和熒光收集的暫時(shí)分離使串話(cross-talk)減至最小。代替在相同激發(fā)源下收集發(fā)射信號(hào)，根據(jù)各個(gè)實(shí)施方案的本發(fā)明方法，通過第二激發(fā)波長(zhǎng)(其不誘導(dǎo)來自感興趣的目標(biāo)熒光團(tuán)的熒光)，誘發(fā)等價(jià)背景水平，然后可以隨后被減去，而不減少來自感興趣的目標(biāo)熒光團(tuán)的熒光信號(hào)。

本發(fā)明方法可有利于熒光成像應(yīng)用，其中組織自體熒光影響熒光成像。來自不同激發(fā)源的等價(jià)自體熒光信號(hào)的檢測(cè)促進(jìn)比單一熒光激發(fā)更準(zhǔn)確的分子診斷。而且，根據(jù)各個(gè)實(shí)施方案的雙重?zé)晒獬上穹椒ū绕渌筇幚矸治黾夹g(shù)更可靠和準(zhǔn)確，因?yàn)楦信d趣的熒光團(tuán)的熒光強(qiáng)度不受數(shù)字除去背景或調(diào)制背景水平的影響。如根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案收集的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所說明的，該方法可用來通過利用熒光團(tuán)例如卟啉的優(yōu)先累積來鑒定體內(nèi)的惡性組織。

根據(jù)本發(fā)明一個(gè)方面，提供提取生物材料中的目標(biāo)熒光團(tuán)的圖像的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包含用于用第一激發(fā)光照射生物材料，以誘導(dǎo)由生物材料的自體熒光和目標(biāo)熒光團(tuán)的熒光二者產(chǎn)生的第一熒光發(fā)射，并用第二激發(fā)光照射生物材料，以誘導(dǎo)由生物材料的自體熒光產(chǎn)生的第二熒光發(fā)射的裝置，用于從第一熒光發(fā)射獲得第一熒光圖像和從第二熒光發(fā)射獲得第二熒光圖像的裝置，用于在獲得第一和第二熒光圖像之前調(diào)制第一和第二激發(fā)光的相對(duì)強(qiáng)度的裝置，和用于處理第一和第二熒光圖像以提取代表目標(biāo)熒光團(tuán)的第三熒光圖像的裝置。

選擇的涉及系統(tǒng)的方面已在上文結(jié)合本發(fā)明方法的各個(gè)實(shí)施方案進(jìn)行了描述。參考圖7，示出了用于提取生物材料14中目標(biāo)熒光團(tuán)15的圖像的系統(tǒng)10的示例性實(shí)施方案。系統(tǒng)10包含用雙重?zé)晒饧ぐl(fā)光照射生物材料14的照射裝置12(例如，配置以照射生物材料的光源)，用于獲取從自體熒光和目標(biāo)熒光團(tuán)二者和從自體熒光單獨(dú)產(chǎn)生的熒光圖像的裝置16(例如，配置以獲得熒光圖像的圖像采集組件)，和用于處理獲得的熒光圖像以提取僅表示目標(biāo)熒光團(tuán)的圖像的裝置18(例如，配置以處理獲得的圖像的處理器組件)。在各個(gè)實(shí)施方案中，用于照射的裝置12包含例如示于圖8的照射模塊20。照射模塊20包含操作配置為提供具有合適的強(qiáng)度和合適的波長(zhǎng)的熒光激發(fā)的熒光激發(fā)源22，用于激發(fā)目標(biāo)熒光團(tuán)和引起自體熒光的熒光團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，熒光激發(fā)源22可以是具有雙重激發(fā)能力的單一激發(fā)源，提供用于誘導(dǎo)從自體熒光和目標(biāo)熒光團(tuán)的熒光二者產(chǎn)生的發(fā)射的第一激發(fā)光，和用于誘導(dǎo)僅從自體熒光產(chǎn)生的發(fā)射的第二激發(fā)光。在另一個(gè)實(shí)施方案中，熒光激發(fā)源22可包含兩個(gè)激發(fā)源(未示出)，一個(gè)用于提供第一激發(fā)光和另一個(gè)用于提供第二激發(fā)光。在各個(gè)實(shí)施方案中，熒光激發(fā)源22包括，例如，激光二極管(其可包含，例如一個(gè)或多個(gè)光纖耦合二極管激光器)、一個(gè)或多個(gè)led、弧光燈，或足夠的強(qiáng)度和適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)的其它光源技術(shù)，用于提供第一和第二激發(fā)光。在各個(gè)實(shí)施方案中，來自熒光激發(fā)源22的第一和第二激發(fā)光可通過光學(xué)元件(即，一個(gè)或多個(gè)光學(xué)元件)投射，以成形和引導(dǎo)被用來照射生物樣品的輸出。成形的光學(xué)元件可例如由一個(gè)或多個(gè)透鏡、光導(dǎo)和散光器組成。如在圖8中說明的，從熒光激發(fā)源22的輸出24通過一個(gè)或多個(gè)聚焦透鏡26，然后通過均質(zhì)化光管28，例如通?？蓮膎ewportcorporation,usa獲得的光管。最后，光通過散光器30(即，一個(gè)或多個(gè)散光器或衍射元件)，例如也可從newportcorporation,usa獲得的磨砂玻璃散光器。熒光激發(fā)源22本身的電源由例如大電流激光驅(qū)動(dòng)器例如可從luminapowerinc.,usa獲得的那些提供。在其中熒光激發(fā)源22是激光的實(shí)施方案中，激光可以在圖像采集過程期間以脈沖模式操作。在該實(shí)施方案中，光學(xué)傳感器例如固態(tài)光電二極管32被結(jié)合到照射模塊20中，經(jīng)由分散或緩解來自各個(gè)光學(xué)元件的反射，對(duì)由照射模塊20產(chǎn)生的光照強(qiáng)度取樣。

在備選的實(shí)施方案中，用于照射的裝置12也可被配置以提供一個(gè)額外的功能例如白光照射。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)還可包含獲得代表目標(biāo)熒光團(tuán)的第三熒光圖像并使代表目標(biāo)熒光團(tuán)的第三熒光圖像與生物材料的白光圖像合并。以這種方式，目標(biāo)熒光團(tuán)的位置可在生物材料的方面內(nèi)被可視化。這在其中生物材料不能用人眼直接觀察的情況下是有用的。

在各個(gè)實(shí)施方案中，圖8中的照射模塊20包含用于調(diào)制(未示出)來自熒光激發(fā)源22的第一和第二激發(fā)光的相對(duì)強(qiáng)度，使得允許調(diào)節(jié)強(qiáng)度的裝置。這樣的用于調(diào)制的裝置可包括對(duì)光源的功率調(diào)制、光束被快門、光圈或斬波器的機(jī)械中斷、光學(xué)、光機(jī)或電光轉(zhuǎn)換、光束的過濾或阻斷或類似的裝置。

回顧圖7，用于獲取的裝置16例如包含圖9中所示的熒光發(fā)射采集模塊30(例如，相機(jī)模塊)，用于獲得第一和第二熒光圖像。如在圖9中所示，收集來自生物材料中的目標(biāo)熒光團(tuán)的熒光發(fā)射42和來自引起自體熒光的其它熒光團(tuán)的熒光發(fā)射或二者并使用各種光學(xué)元件，例如46a、46b、48和50的布置聚焦到圖像傳感器44上。由圖像傳感器44轉(zhuǎn)導(dǎo)的光信號(hào)產(chǎn)生的電荷被熒光發(fā)射采集模塊30中的適當(dāng)讀出和放大的電子器件轉(zhuǎn)換為視頻信號(hào)。

回顧圖7，在各個(gè)實(shí)施方案中，用于處理的裝置18(例如，處理器組件)例如包含分析發(fā)射信號(hào)的處理器模塊(未示出)，進(jìn)行從第一熒光圖像減去第二熒光圖像的計(jì)算，以將計(jì)算的信息輸出到適當(dāng)?shù)娘@示和/或記錄設(shè)備。在各個(gè)實(shí)施方案中，處理器模塊包含任何計(jì)算機(jī)或計(jì)算裝置例如平板電腦、筆記本電腦、臺(tái)式機(jī)或網(wǎng)絡(luò)計(jì)算機(jī)。在各個(gè)實(shí)施方案中，處理器模塊可具有保存數(shù)據(jù)(例如，圖像序列)功能至有形的永久計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)(例如，內(nèi)存、硬盤或閃存)的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)模塊，以便能夠記錄和/或后處理獲得的數(shù)據(jù)。在各個(gè)實(shí)施方案中，處理器模塊可具有內(nèi)置時(shí)鐘以便能夠控制各個(gè)元件并確保正確的照射和傳感器快門的定時(shí)。在各個(gè)其它實(shí)施方案中，處理器模塊也可提供用戶輸入和輸出的圖形顯示。成像系統(tǒng)可任選地配置視頻顯示器(未示出)以顯示圖像，因?yàn)樗鼈円驯猾@取或在錄制后回放，或進(jìn)一步使在方法的各個(gè)階段生成的數(shù)據(jù)可視化。在各個(gè)實(shí)施方案中，用于處理的裝置與成像系統(tǒng)通信或是成像系統(tǒng)的部件。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的成像系統(tǒng)的例子是內(nèi)窺鏡。

在操作中，且繼續(xù)參考在圖7-9中的實(shí)施方案，生物材料被定位在包含照射模塊20的系統(tǒng)10的照射裝置12的照射路徑中，且使得例如照射模塊20產(chǎn)生一個(gè)基本上跨越生物材料整個(gè)區(qū)域的基本均勻的照射區(qū)域。打開熒光激發(fā)源22(例如，激光二極管)并啟動(dòng)圖像傳感器(例如，熒光發(fā)射采集模塊30的圖像傳感器44)的快門序列。來自生物材料的熒光發(fā)射通過熒光發(fā)射采集模塊30的前面成像光學(xué)器件(例如在圖9中在選擇的波段(例如，對(duì)于卟啉，選擇的波長(zhǎng)是約600nm)的光學(xué)器件46a)收集，并計(jì)算相對(duì)強(qiáng)度的比率。如果計(jì)算的比率是合適的(例如，對(duì)于卟啉，合適的計(jì)算的比率是在約0.98-1.02的范圍內(nèi))，則獲得第一和第二熒光圖像。如果比率是不合適的，則調(diào)制第一和第二激發(fā)光的相對(duì)強(qiáng)度并重新計(jì)算比率直至達(dá)到合適的比率。然后對(duì)獲得的第一和第二熒光圖像作減法，以提取僅表示目標(biāo)熒光團(tuán)的第三熒光圖像。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種具有其上插入的計(jì)算機(jī)-可執(zhí)行(可讀)程序代碼裝置的有形永久計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其包括一種提取生物材料中的目標(biāo)熒光團(tuán)的圖像的方法，其中生物材料中目標(biāo)熒光團(tuán)發(fā)射的波段重疊自體熒光發(fā)射的波段，該方法包括：

用第一激發(fā)光照射生物材料以誘導(dǎo)由生物材料的自體熒光和目標(biāo)熒光團(tuán)的熒光二者產(chǎn)生的第一熒光發(fā)射，并用第二激發(fā)光照射生物材料以誘導(dǎo)由生物材料的自體熒光產(chǎn)生的第二熒光發(fā)射；

從第一熒光發(fā)射獲得第一熒光圖像和從第二熒光發(fā)射獲得第二熒光圖像；和

處理第一和第二熒光圖像以提取代表目標(biāo)熒光團(tuán)的第三熒光圖像，其中在獲得第一和第二熒光圖像之前，調(diào)制第一和第二激發(fā)光的相對(duì)強(qiáng)度。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，根據(jù)各個(gè)實(shí)施方案的程序代碼裝置可以任何合適的編程語言編寫并以許多形式傳遞至處理器，包括例如但不限于永久存儲(chǔ)在非可寫存儲(chǔ)介質(zhì)(例如，只讀存儲(chǔ)設(shè)備例如rom或cd-rom光盤)的信息、可變存儲(chǔ)在可寫存儲(chǔ)介質(zhì)(例如，硬盤驅(qū)動(dòng)器)的信息、通過通信介質(zhì)傳達(dá)至處理器的信息，例如局域網(wǎng)、公共網(wǎng)絡(luò)例如互聯(lián)網(wǎng)，或適合于存儲(chǔ)電子指令的任何類型的介質(zhì)。當(dāng)攜帶可實(shí)施本發(fā)明方法的各個(gè)實(shí)施方案的計(jì)算機(jī)可讀指令時(shí)，這樣的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)代表本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案的實(shí)例。在各個(gè)實(shí)施方案中，有形永久計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)包括所有計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，且本發(fā)明范圍限于計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中介質(zhì)既是有形又是永久的。

在又一方面，提供包含如結(jié)合各個(gè)實(shí)施方案描述的系統(tǒng)和外生熒光團(tuán)的試劑盒。

因此，本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案促進(jìn)感興趣的熒光與自體熒光和感興趣的熒光的未知組合的區(qū)分。本發(fā)明促進(jìn)目標(biāo)熒光團(tuán)的圖像品質(zhì)的改進(jìn)，保存信號(hào)熒光，同時(shí)消除自體熒光以及背景，并增加生成的信號(hào)與自體熒光的比率和檢測(cè)的總靈敏性。本發(fā)明適應(yīng)于各種生物材料，并可應(yīng)用于任何熒光成像應(yīng)用。本發(fā)明可被用來成像并分析生物樣品以識(shí)別生物材料中的一個(gè)或多個(gè)熒光團(tuán)目標(biāo)的存在、不存在、濃度,和/或空間分布。本發(fā)明可被進(jìn)一步用作醫(yī)療評(píng)估或生物評(píng)估(例如，生物現(xiàn)象的評(píng)估)、診斷評(píng)估、治療評(píng)估、生理評(píng)估，或其組合的補(bǔ)充工具。

雖然本發(fā)明已結(jié)合詳細(xì)示出和描述的各個(gè)實(shí)施方案進(jìn)行了說明和描述，但并不打算限于所示的細(xì)節(jié)，因?yàn)楦鞣N修改和結(jié)構(gòu)變化可以不偏離本發(fā)明范圍的任何方式進(jìn)行。所說明的實(shí)施方案，以及本發(fā)明的其它實(shí)施方案的形式、組成布置、步驟、細(xì)節(jié)和操作次序的各種修改可以不背離本發(fā)明范圍的任何方式進(jìn)行，并在本領(lǐng)域技術(shù)人員參考了本說明書后將變得顯而易見。因此考慮到所附權(quán)利要求將覆蓋這樣的修飾和實(shí)施方案，因?yàn)樗鼈兟淙氡景l(fā)明的確切范圍內(nèi)。對(duì)于術(shù)語“例如”和“如”及其語法等同表述，應(yīng)理解為遵循短語“且不限于”，除非另有明確陳述。如本文所用的，單數(shù)形式“一”、“一個(gè)”和“該”包括復(fù)數(shù)對(duì)象，除非上下文另外清楚地指明。