發(fā)明領域

本發(fā)明涉及用于測定疑似包含所述分析物的樣品中的分析物的方法，其包括a)使至少所述分析物的第一和第二捕獲化合物與所述樣品接觸，其中所述第一和第二捕獲化合物是不同的捕獲化合物，且其中所述捕獲化合物競爭結合所述分析物；b)使與所述樣品接觸的所述捕獲化合物與指定劑接觸，其中所述指定劑與所述分析物競爭結合所述捕獲化合物；c)測定包含所述指定劑和捕獲化合物的復合物的量；和d)基于步驟c)的結果測定樣品中的所述分析物。本發(fā)明還涉及用于改善用于測定分析物的間接免疫測定的特異性的方法，其包括通過不同的捕獲化合物替代至少10％的捕獲化合物；其中被替代的捕獲化合物與引入的捕獲化合物競爭結合所述分析物。本發(fā)明還涉及與上述方法相關的試劑盒、設備和用途。

相關技術

實驗室測試，特別是免疫學測試，已成為疾病診斷中的無價工具。具體地，免疫測定已提供了在復雜混合物，例如體液諸如血液或血漿中特異性檢測單一分析物或分析物組的可能性。然而，已經(jīng)鑒定了免疫測定中的干擾的幾個原因，例如，干擾物質與捕獲化合物的交叉反應性，檢測劑化合物與固相的非特異性結合，通過異嗜性抗體或特別是人抗小鼠抗體(hama)對捕獲化合物和檢測劑化合物的“橋接”結合，僅舉幾例(參見例如park&kricka(2013),ch.5.3-interferencesinimmunoassay,intheimmunoassayhandbook(fourthedition),由davidwild編輯,elsevier,oxford:403;schiettecatte(2012),interferencesinimmunoassays,advancesinimmunoassaytechnology,dr.normanh.l.chiu(ed.))。

在競爭性免疫測定中，包含在樣品中的分析物與標記的分析物(指定劑)競爭結合捕獲化合物，其通常為抗體，或者在測試血清樣品中例如病原體的抗體的存在的情況下，所述病原體的抗原。在樣品中分析物的濃度高的情況下，則存在強烈競爭，導致指定劑與捕獲化合物的結合減少，引起信號降低，其取決于測試形式，導致定量或定性測試結果。本領域已知的免疫測定的缺點是用作捕獲化合物的抗原也可以被來自樣品的干擾化合物結合。這些干擾化合物與指定劑競爭結合捕獲化合物的表位。根據(jù)競爭的嚴重程度，假測試結果是可能的，其引起相應免疫測定的特異性降低。如果使用潛在地甚至由具有大量構象表位的幾個亞單位組成的復合捕獲化合物，例如病毒衣殼，則特異性的這種降低可以是特別顯著的。在這種情況下，消除干擾的經(jīng)典方法，例如，添加干擾化合物的替代靶標，可能是低效的。

在非競爭性免疫測定中，通過使分析物與特異性結合分析物并攜帶標記本身或作為攜帶標記的第二分子的靶標的化合物接觸來檢測分析物。因此，在非競爭性免疫測定中，通過測定分析物和攜帶標記的檢測劑化合物之間形成的復合物的量來測定分析物的量。因此，可能如上所述面臨類似的特異性問題。

僅免疫學輕微不同的抗原(例如通過在不同表達系統(tǒng)中產(chǎn)生，不同的氨基酸序列，糖基化的差異，純化和重折疊程序的差異以及緩沖液和儲存條件的差異)具有各自的干擾范圍。因此，導致用抗原x1進行免疫測定的錯誤結果的樣品可以在用抗原x2的測試中提供正確的結果，反之亦然。因此，頻繁用抗原交換不同抗原不會導致特異性的改善，但僅導致引起錯誤結果的樣品范圍的變化。

待解決的問題

因此，本發(fā)明的目的是提供避免上述問題的改善的免疫測定法。

發(fā)明概述

這些問題通過具有獨立權利要求的特征的方法、試劑盒、設備和組合物來解決。在從屬權利要求中列出了可能以分離的方式或任何任意組合實現(xiàn)的典型實施方案。

因此，本發(fā)明涉及用于測定疑似含有所述分析物的樣品中的分析物的方法，其包括

a)使至少所述分析物的第一和第二捕獲化合物與所述樣品接觸，其中所述第一和第二捕獲化合物是不同的捕獲化合物，且其中所述捕獲化合物競爭結合所述分析物；

b)使與所述樣品接觸的所述捕獲化合物與指定劑接觸，其中所述指定劑與所述分析物競爭結合所述捕獲化合物；

c)測定包含所述指定劑和捕獲化合物的復合物的量；和

d)基于步驟c)的結果測定樣品中的所述分析物。

如以下中所使用，術語“具有”、“包含”或“包括”或其任意語法變體以非排他性的方式使用。因此，這些術語既可以是指其中除了這些術語引入的特征之外在本上下文中描述的實體中沒有另外特征存在的情況，而且可以是指其中存在一個或多個另外特征的情況。作為實例，表述“a具有b”、“a包含b”和“a包括b”既可以是指其中除了b之外在a中沒有另外要素存在的情況(即其中單獨且僅由b組成的情況)，而且可以是指其中除了b之外在實體a中存在一種或多種另外要素諸如要素c、要素c和d或甚至其它要素的情況。

此外，如下所用，術語“優(yōu)選”、“更優(yōu)選”、“最優(yōu)選”、“具體地”、“更具體地”、“特別地”、“更特別地”或類似術語與任選的特征結合使用，而不限制可替代的可能性。因此，這些術語引入的特征是任選的特征，并不意圖以任何方式限制權利要求的范圍。如本領域技術人員將認識到，可以通過使用替代特征來執(zhí)行本發(fā)明。類似地，通過“在本發(fā)明的實施方案中”或類似表述引入的特征意圖是任選的特征，關于本發(fā)明的替代實施方案沒有任何限制，關于本發(fā)明的范圍沒有任何限制，并且關于將以這樣的方式引入的特征與本發(fā)明的其它任選或非任選特征組合可能性的沒有任何限制。在本發(fā)明的具體值或比率的上下文中的術語“約”是指所述值或比率+/-30%、+/-20%、+/-10%，或者在一個實施方案中+/-5%的給定值或比率。

在一個實施方案中，本發(fā)明的方法是體外方法。此外，它可以包括除了具體提到的步驟之外的步驟。具體地，步驟b)可以包括提供樣品的步驟，或者步驟c)可以包括添加其它化合物以促進結合和檢測。此外，一些或所有步驟可以通過自動化設備輔助。

如本文中所使用，術語“測定”是指通過本發(fā)明的方法測定樣品中的待測定的分析物的至少一種免疫學特征。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的免疫學特征是分析物的結構特征，其促進通過免疫學方式檢測樣品中的分析物。在一個實施方案中，所述免疫學特征促進鑒定，在另一個實施方案中，通過免疫學方式定量分析物。因此，典型的免疫學特征是促進區(qū)分所述分析物與樣品中其它化合物的特征。在一個實施方案中，測定分析物是確定分析物是否以高于方法檢測限值的濃度存在于樣品中。確定檢測限值的方法是本領域技術人員已知的。在另一個實施方案中，測定是半定量或定量地測定樣品中分析物的量或濃度。為了進行定量測定，將測定分析物的絕對或精確量，或將測定分析物的相對量?？梢栽诜治鑫锏木_量無法測定或不應測定的情況下測定相對量。在所述情況下，可以確定分析物的存在量相對于包含第二量的分析物的第二樣品是增加還是減少。

如本領域技術人員將理解，通常不需要分別測定第一捕獲化合物/分析物和第二捕獲化合物/分析物復合物。因此，在一個實施方案中，一起測定第一捕獲化合物和分析物的復合物以及第二捕獲化合物和分析物的復合物，即在所述第一和所述第二捕獲化合物之間不加區(qū)分。因此，在一個實施方案中，測定與第一捕獲化合物或第二捕獲化合物的復合物中存在的分析物的總量。

如本領域技術人員將進一步理解，分析物/捕獲化合物復合物的測定將取決于所選擇的測定形式。在一個實施方案中，測定法是競爭性免疫測定法，通常是競爭性、非均相免疫測定法，即免疫測定法，其中分析物與所述分析物的標記衍生物競爭結合與固體表面結合的捕獲化合物，且其中測定與所述捕獲化合物結合的所述分析物的標記的衍生物的量。在一個實施方案中，競爭性測定法是抗hbc、抗hav(抗甲型肝炎病毒)、抗hbe(抗乙型肝炎e抗原)、葉酸、葉酸rbc(紅血細胞)、抗tsh-r、總維生素d、維生素b12、甲狀腺素(tyroxin)t4、ft4(游離甲狀腺素)、甲狀腺素t3、ft3(游離三碘甲狀腺原氨酸)、睪酮、孕酮、洋地黃毒苷、抗tg、抗tpo(抗甲狀腺過氧化物酶)、dgea或雌二醇的測定法。在另一個實施方案中，免疫測定法是雙抗原夾心測定法(“dags”)，其中二價分析物，例如，抗體結合至與固體表面結合的捕獲化合物，且其中通過如下文所述的檢測劑化合物與所述分析物/捕獲化合物復合物的結合來測定分析物/捕獲化合物復合物的量。在一個實施方案中，dags測定法是抗弓形體igg、抗風疹igg、抗hbs1g、hcv(丙型肝炎病毒)、例如hcvii、cmv(巨細胞病毒)igg、梅毒、htlv(人類t細胞淋巴細胞病毒)或查加斯病(美洲錐蟲病)。

術語“生物分子”是本領域技術人員已知的，并且通常涉及由至少一種生物體的代謝產(chǎn)生的分子。因此，術語“生物大分子”在一個實施方案中涉及由生物體從單體前體產(chǎn)生的聚合物。典型的生物大分子是多肽、dna、rna或多糖。

如本文中所使用，術語“分析物”涉及化學分子，在一個實施方案中，有機分子，其以足夠的親和力結合本發(fā)明的捕獲化合物和/或檢測劑化合物，以允許檢測分析物/捕獲化合物和/或檢測劑化合物復合物。在一個實施方案中，分析物/配體復合物的解離常數(shù)(kd)為至多10^-7mol/l，在另一個實施方案中為至多10^-8mol/l，在另一個實施方案中為至多10^-9mol/l。在一個實施方案中，本發(fā)明的第一捕獲化合物與分析物之間形成的復合物的解離常數(shù)和本發(fā)明的第二捕獲化合物與分析物之間形成的復合物的解離常數(shù)相差不超過5倍；在一個實施方案中不超過2倍；在另一個實施方案中不超過1.5倍。在一個實施方案中，第一捕獲化合物和分析物之間形成的復合物的解離常數(shù)具有第二捕獲化合物和分析物之間形成的復合物的解離常數(shù)的70％至130％的值。在另一個實施方案中，第一捕獲化合物和分析物之間形成的復合物的解離常數(shù)具有第二捕獲化合物和分析物之間形成的復合物的解離常數(shù)的80％至120％的值。在另一個實施方案中，第一捕獲化合物和分析物之間形成的復合物的解離常數(shù)具有第二捕獲化合物和分析物之間形成的復合物的解離常數(shù)的90％至110％的值。在另一個實施方案中，第一捕獲化合物和分析物之間形成的復合物的解離常數(shù)和第二捕獲化合物和分析物之間形成的復合物的解離常數(shù)基本上相等或相等。在一個實施方案中，分析物的分子量為至少100(對應于100原子質量單位，和100da；1da對應于1.66×10^?27kg)，在另一個實施方案中，至少250，在另一個實施方案中，至少500個，或在另一個實施方案中至少1000。在一個實施方案中，分析物是生物分子，在另一個實施方案中，分析物是生物大分子。在另一個實施方案中，分析物是多肽。

在一個實施方案中，在本發(fā)明的分析物是多肽的情況下，多肽是由感染病原體，例如病毒或細菌產(chǎn)生的抗原，或抗體，例如由受試者針對由感染病原體產(chǎn)生的抗原產(chǎn)生的抗體。在一個實施方案中，分析物是多肽，在另一個實施方案中，是針對病毒抗原的抗體，在另一個實施方案中，是針對病毒多肽的抗體，或者在另一個實施方案中，是針對病毒衣殼多肽的抗體。在一個實施方案中，病毒衣殼多肽是肝炎病毒衣殼多肽，在一個實施方案中，是乙型肝炎病毒(hb)衣殼多肽，或在另一個實施方案中是hb核心(hbc)抗原。因此，在一個實施方案中，分析物是針對肝炎病毒衣殼多肽、例如針對乙型肝炎病毒(hb)衣殼多肽、通常針對hb核心(hbc)抗原或hbe抗原的的抗體。在一個實施方案中，第一捕獲化合物是hbc抗原，如genbankaccno:q17ut2gi:123867942(seqidno:1)所示。在另一個實施方案中，第一種捕獲化合物是如genbankaccno:q17ut2gi:123867942(乙型肝炎病毒亞型adw2核心抗原，seqidno:1)所示的hbc抗原，且第二種捕獲化合物是如genbankaccno.p03147.1gi:116947(乙型肝炎病毒基因型d亞型adw核心抗原，seqidno:2)所示的hbc抗原。在另一個實施方案中，第一和第二捕獲化合物是選自本領域已知的hbc抗原序列的hbc抗原序列，諸如通過其genbankacc.no:p03148.3gi:166215076、p03149.1gi:116945、np_647607.1gi:21326588和ay123424.1gi:22203511標識的hbcag蛋白序列。

在一個實施方案中，為了促進克隆，可以通過缺失所述抗原序列的n-和/或c-端氨基酸的1-5個氨基酸來縮短每個hbv核心抗原序列的n-和/或c-端末端。在另一個實施方案中，可以將包含2至15個氨基酸的標簽添加至抗原的n-端或c-端末端或兩個末端，而不干擾hbv核心抗原的抗原性質。

在一個實施方案中，如本文中所使用的術語多肽包括特別指定的多肽的變體和片段。變體包括包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與特別指定的氨基酸序列(例如seqidno:1或2中所示)具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性。百分比同一性值優(yōu)選地在整個氨基酸序列區(qū)域計算。技術人員可用基于各種算法的一系列程序用于比較不同序列。在這種背景下，needleman和wunsch或smith和waterman的算法給出特別可靠的結果。為了進行序列比對，可使用程序pileup(j.mol.evolution.,25,351-360,1987,higginsetal.,cabios,51989:151-153)或程序gap和bestfit[needleman和wunsch(j.mol.biol.48;443-453(1970))和smith和waterman(adv.appl.math.2;482-489(1981))]，它們是gcg軟件包的一部分[geneticscomputergroup,575sciencedrive,madison,wisconsin,usa53711(1991)]。優(yōu)選地使用程序gap在整個序列區(qū)域用以下設置測定以百分比(％)表示的序列同一性值：空位權重：50，長度權重：3，平均匹配：10.000和平均錯配：0.000，其除非另有規(guī)定，否則應始終用作序列比對的標準設置。

在一個實施方案中，包含任何前述多肽序列的片段的多肽也作為本發(fā)明的多肽被包括。該片段是仍作為上述捕獲化合物或檢測劑化合物的多肽。因此，多肽可以包含賦予所述生物活性的本發(fā)明多肽的結構域或由其組成。如本文意指的片段優(yōu)選包含前述氨基酸序列中任一個的至少50個、至少100個、至少250個或至少500個連續(xù)的氨基酸序列，其包含前述氨基酸序列中任一個的至少20個、至少30個、至少50個、至少80個、至少100個或至少150個連續(xù)氨基酸。

本發(fā)明的多肽基本上由上述氨基酸序列組成或包含上述氨基酸序列。因此，它們也可以含有另外的多肽序列。具體地，本發(fā)明的多肽可以是融合蛋白，其中融合蛋白的一個配偶體是如上所述的多肽。這樣的融合蛋白可以包含作為脂肪酸或脂質生物合成途徑的其它酶的其它部分，用于監(jiān)測表達的多肽(例如綠色、黃色、藍色或紅色熒光蛋白、堿性磷酸酶等)或所謂的“標簽”，其可以用作可檢測標記或用作用于純化目的或將所述多肽結合至固體表面的輔助量度。用于不同目的的標簽是本領域眾所周知的，并且包含flag-標簽、6-組氨酸-標簽、myc-標簽、生物素等。

然而，還設想分析物是可以通過與捕獲化合物形成復合物測定的低分子量化合物，包括例如，甲狀腺素(t4)、三碘甲狀腺原氨酸(t3)、葉酸、葉酸結合蛋白、維生素b12、內在因子等。

如本文中所使用，術語“捕獲化合物”涉及直接或間接地結合上文所述的本發(fā)明的分析物并結合至固體表面或適于結合至固體表面的化學分子。

在一個實施方案中，捕獲化合物是有機分子，在另一個實施方案中，是如上文所述的生物大分子，例如上文所述的多肽。在一個實施方案中，捕獲化合物以足夠的親和力間接結合本發(fā)明的分析物，以允許檢測包含分析物和捕獲化合物的復合物；即在這種情況下，捕獲化合物是間接配體。如本文中所使用，術語“間接結合”涉及結合，其中配體不直接接觸分析物，但接觸結合分析物的化學分子，在一個實施方案中，特異性結合分析物，其中，在一個實施方案中，結合分析物的所述分子是直接結合分析物的分子，即是直接配體。因此，在一個實施方案中，分析物，結合分析物的化學分子，和間接配體形成具有上述性質的復合物，特別是具有如所示的解離常數(shù)。如本領域技術人員將理解，術語“競爭結合”的定義加上必要的變更適用于本發(fā)明的間接配體，即間接配體，在一個實施方案中具有不能同時結合至結合分析物的所述分子的性質。在另一個實施方案中，捕獲化合物以足夠的親和力直接結合本發(fā)明的分析物，以允許檢測如上文所述的分析物/捕獲化合物復合物。因此，在一個實施方案中，捕獲化合物是直接配體。

根據(jù)本發(fā)明，提供至少第一和第二捕獲化合物，其中所述第一和第二捕獲化合物是不同的捕獲化合物。如本文中所使用，術語“不同的”捕獲化合物涉及在至少一種化學和/或物理性質中可測量地不同的兩種或更多種捕獲化合物分子。通常，所述至少一種化學和/或物理性質不是指示劑，且不是與所述捕獲化合物與固體表面的結合相關的性質。典型的性質是氨基酸序列、糖基化、三維折疊和/或構象以及多肽鏈的長度。然而，本發(fā)明還考慮相同捕獲化合物的兩種制備物中濃度的差異和/或雜質的同一性。因此，在一個實施方案中，第二捕獲化合物通過以下至少一種來衍生或可衍生自第一捕獲化合物：(i)將至少一個氨基酸交換引入所述第一捕獲化合物的氨基酸序列，(ii)在與所述第一捕獲化合物相比不同的細胞背景中產(chǎn)生所述第二捕獲化合物，(iii)與所述第一捕獲化合物相比，除去或阻止所述第二捕獲化合物的糖基化，(iv)通過與所述第一捕獲化合物相比不同的方式純化所述第二捕獲化合物，(v)在與所述第一捕獲化合物相比不同的條件下變性和/或重折疊所述第二捕獲化合物，和(vi)在與所述第一捕獲化合物相比不同的條件下儲存所述第二捕獲化合物。在一個實施方案中，所述第一和第二捕獲化合物是識別基本相同的表位的抗體，且所述第二捕獲化合物是作為第一捕獲化合物的抗體的變體。在另一個實施方案中，所述第一和第二捕獲化合物中的至少一種不是抗體。在另一個實施方案中，所述第一和第二捕獲化合物不是抗體。

根據(jù)本發(fā)明，提供至少第一和第二捕獲化合物，其中所述捕獲化合物競爭結合所述分析物。如本文中所使用，表示兩種化合物“競爭結合”分析物的術語涉及所述化合物不能同時結合所述分析物的基本相同的結合位點的分子性質。因此，通常，在兩種捕獲化合物競爭結合分析物的情況下，和在所述分析物具有所述捕獲化合物的一個結合位點的情況下，在每個時間點，只有一個分子的所述捕獲化合物可以結合所述分析物。本領域技術人員將理解，在分析物具有捕獲化合物的兩個或更多個結合位點的情況下，上述加上必要的變更適用。本領域技術人員知道如何確定結合中的競爭。在一個實施方案中，競爭結合分析物是結合所述分析物的相同或基本上相同的亞結構。在另一個實施方案中，在分析物是多肽的情況下，由第一捕獲化合物結合的表位和由第二捕獲化合物結合的表位具有共同的分析物的至少3個氨基酸，在一個實施方案中具有共同的分析物的3個連續(xù)氨基酸。通常，在這種情況下，由第一捕獲化合物結合的表位和由第二捕獲化合物結合的表位具有共同的分析物的至少4、5、6或7個氨基酸。

在一個實施方案中，第一和第二捕獲化合物不競爭結合干擾化合物。如本文中所使用的術語“干擾化合物”涉及降低免疫測定法的特異性的化合物。在一個實施方案中，干擾化合物是結合本發(fā)明的捕獲化合物的化合物，其不是分析物。

在一個實施方案中，第一和第二捕獲化合物以1:5至5:1、通常1:2至2:1、約1:1或1:1的比率使用。在另一個實施方案中，三種捕獲化合物以約2:1:1、1:2:1或1:1:2、約1:1:1或1:1:1的比率使用。因此，在一個實施方案中，第一和第二捕獲化合物和潛在存在的另外的捕獲化合物以約相同量(在另一個實施方案中以相同量)存在于反應混合物中。

將生物分子(通常為多肽)與固體表面結合的方法是本領域熟知的，并且包括例如，通過疏水相互作用結合，生物素化和經(jīng)由固定的鏈霉抗生物素蛋白結合，共價結合，抗體-抗原相互作用等，或這些相互作用的組合，例如抗體和病原體多肽之間的抗體-抗原相互作用，其中所述抗體被生物素化并經(jīng)由固定的鏈霉抗生物素蛋白結合至固體表面。因此，捕獲化合物也可以優(yōu)選為捕獲復合物。在一個實施方案中，捕獲化合物是直接結合分析物的捕獲復合物的化合物。本領域技術人員知道如何將捕獲化合物或復合物與固體表面結合，這取決于所選擇的固體表面。在一個實施方案中，捕獲化合物是病毒多肽，例如病毒衣殼多肽。在一個實施方案中，所述捕獲化合物是肝炎病毒衣殼多肽，在一個實施方案中是乙型肝炎病毒(hb)衣殼多肽，例如hb核心(hbc)抗原或hbe抗原。然而，也設想捕獲化合物是抗體。

如本文中所使用的術語“抗體”包括單克隆抗體，由至少兩個完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們顯示出如本文別處所指定的所需結合活性。在一個實施方案中，抗體不是包含在抗血清中的抗體，通常不是多克隆抗體或多克隆血清。因此，在一個實施方案中，抗體是包含在混合物中的抗體，其中包含在所述混合物中的至少80％，在一個實施方案中至少90％，在另一個實施方案中至少95％的抗體分子是至少一種捕獲化合物或至少一種本發(fā)明的檢測劑化合物。在一個實施方案中，所述抗體是單克隆抗體。在一個實施方案中，所述抗體是全長抗體或抗體片段。

根據(jù)其重鏈的恒定結構域的氨基酸序列，抗體(免疫球蛋白)可以被分配到不同的類別。存在五種主要類別的免疫球蛋白：iga、igd、ige、igg和igm，其中幾種可進一步分為亞類(同種型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。不同類別的免疫球蛋白的亞基結構和三維構型是熟知的，并且通常描述于例如abbas等人,cellularandmol.immunology,第4版,w.b.saunders,co.(2000)?？贵w可以是通過抗體與一種或多種其它蛋白或肽的共價或非共價締合形成的較大融合分子的一部分。

術語“全長抗體”、“完整抗體”和“整個抗體”在本文中可互換地用于指其基本上完整形式的抗體，而不是如下定義的抗體片段。術語特別是指具有含有fc區(qū)的重鏈的抗體。在一個實施方案中，“抗體片段”包含完整抗體的一部分，其包含其抗原結合區(qū)?？贵w片段的實例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；雙體；線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體?？贵w的木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩個相同的抗原結合片段(稱為“fab”片段，各自具有單一抗原結合位點)和剩余的“fc”片段(其名稱反映了其容易結晶的能力)。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個f(ab′)2片段，其具有兩個抗原結合位點且仍能夠交聯(lián)抗原?！癴v”是含有完整抗原結合位點的最小抗體片段。在一個實施方案中，雙鏈fv種類由緊密、非共價締合的一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域的二聚體組成。在單鏈fv(scfv)種類中，一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域可以通過柔性肽接頭共價連接，使得輕鏈和重鏈可以以類似于雙鏈fv種類的“二聚”結構締合。正是以這種構型，每個可變結構域的三個高變區(qū)(hvr)相互作用以限定抗原結合位點?？偣擦鶄€hvr賦予抗體抗原結合特異性。然而，甚至單個可變結構域(或僅包含對抗原特異性的三個hvr的半個fv)也具有識別和結合抗原的能力，盡管親和力低于整個結合位點。術語“雙體”是指具有兩個抗原結合位點的抗體片段，所述片段包含與相同多肽鏈(vh-vl)中的輕鏈可變結構域(vl)連接的重鏈可變結構域(vh)。通過使用太短而不允許同一鏈上的兩個結構域之間的配對的接頭，迫使所述結構域與另一條鏈的互補結構域配對并產(chǎn)生兩個抗原結合位點。雙體可以是二價或雙特異性的。雙體更完全地描述于例如，ep0404097;wo1993/01161;hudson等人,nat.med.9(2003)129-134;和hollinger等人,pnasusa90(1993)6444-6448。三體和四體也描述于hudson等人,nat.med.9(2003)129-134。

如本文中所使用的術語“單克隆抗體”是指從基本上均質的抗體群體獲得的抗體，即構成群體的單一抗體除了可以少量存在的可能突變(例如天然存在的突變)以外是相同的。因此，修飾語“單克隆”表示抗體的特征不是離散抗體的混合物。在某些實施方案中，這樣的單克隆抗體通常包括包含結合分析物的多肽序列的抗體，其中通過包括從多個多肽序列中選擇單個分析物結合多肽序列的方法獲得分析物結合多肽序列。例如，選擇過程可以是從許多克隆諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組dna克隆的合并物中選擇獨特克隆。應當理解，選擇的靶標結合序列可進一步改變，例如以改善對靶標的親和力、將靶標結合序列人源化、改善其在細胞培養(yǎng)物中的產(chǎn)量、降低其在體內的免疫原性、產(chǎn)生多特異性抗體等，并且包含改變的靶標結合序列的抗體也是本發(fā)明的單克隆抗體。與包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物相反，單克隆抗體制備物的每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。除了其特異性之外，單克隆抗體制備物的優(yōu)勢在于它們通常未被其它免疫球蛋白污染。

如本文中所使用，術語“固體表面”涉及適于結合本發(fā)明的捕獲化合物且適于例如通過物理方式從樣品分離的任何合適的固體表面。在一個實施方案中，所述固體表面是珠粒的表面，在一個實施方案中，是微珠例如磁性或順磁性微珠。在一個實施方案中，所述表面適于改善捕獲化合物的結合，例如通過共價或非共價地附接結合捕獲化合物的亞結構的分子。結合捕獲化合物的亞結構的典型分子是，例如抗體、鏈霉抗生物素蛋白、復合鎳離子等。在另一個實施方案中，固體表面通過共價或非共價鍵結合所述捕獲化合物，例如，通過疏水相互作用。因此，在一個實施方案中，所述固體表面是多簇板的表面。在一個實施方案中，將多簇板的表面預處理以增加結合捕獲化合物的親和力和/或能力。合適的預處理是本領域已知的。

如本文中所使用的術語“樣品”涉及懷疑包含本發(fā)明分析物的樣品。在一個實施方案中，所述樣品是或包含體液的樣品，來自組織或器官的樣品，或洗滌/漂洗液的樣品或從外或內體表面獲得的拭子或涂物。在一個實施方案中，所述樣品包含至少一種如本文別處指定的分析物。本發(fā)明的方法包括血液、血漿、血清、尿液、唾液或淚液的樣品?？梢酝ㄟ^使用刷子、(棉花)拭子、抹刀、漂洗/洗滌液、鉆取活檢設備、用針或柳葉刀穿刺腔或通過外科手術儀器化來獲得樣品。然而，通過眾所周知的技術獲得的樣品，包括在一個實施方案中，來自泌尿生殖道、肛周區(qū)域、肛管、口腔、上呼吸消化道和表皮的刮擦物、拭子或活檢，也被包括作為本發(fā)明的樣品?？梢酝ㄟ^裂解技術諸如均質化和/或通過分離技術諸如過濾或離心從體液或組織或器官獲得無細胞的液體。在一個實施方案中，樣品獲得自已知包含hb病毒多肽或/和針對至少一種hb病毒多肽的抗體的體液，即在一個實施方案中，血液、血漿、血清、唾液等。應當理解，可以進一步處理樣品以便實施本發(fā)明的方法。具體地，可以通過本領域已知的方法和方式從樣品中除去細胞。此外，可以通過本領域已知的方法和方式從樣品提取和/或純化至少一種分析物。因此，術語樣品還可以涉及包含或懷疑包含至少一種分析物的制備物，其從樣品稀釋、富集、純化和/或提取。

在一個實施方案中，本發(fā)明的方法是競爭性免疫測定。因此，該方法還包括將指定劑混合至樣品。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法是異質競爭性免疫測定，并且包括通過測定在所述指定劑和所述不同的捕獲化合物之間形成的復合物的量來間接測定分析物與兩種不同的捕獲化合物之間形成的復合物的量。

如本發(fā)明的方法的上下文中使用的術語“接觸”是本領域技術人員理解的。在一個實施方案中，該術語涉及使本發(fā)明的化合物與樣品或另外的化合物物理接觸，由此例如允許樣品和化合物相互作用。

術語“指定劑”是本領域技術人員已知的，并且涉及與分析物競爭結合與指定劑結合的捕獲化合物的化合物。通常，指定劑在結構上類似于分析物。通常，指定劑包含被與指示劑結合的捕獲化合物結合的分子的亞結構。在一個實施方案中，所述指定劑是包含分析物和作為結構元件的指示劑的化合物，或者所述指定劑由與指示劑共價結合的分析物組成。

如本文中所使用的術語“指示劑”是適于使包含所述指示劑的分子或復合物的存在可檢測的化合物。通常，所述指示劑具有可檢測的性質，通常為光學或/和酶學性質。然而，還設想所述可檢測性質是發(fā)射放射性的性質。

如本文中所使用的術語“光學性質”涉及可由光學儀器檢測的任何性質。具體地，光學可測定的性質可以是或可以包含至少一種選自以下的性質：反射性、透射性、發(fā)射性、散射性、熒光性、磷光性、衍射性和極化性。本發(fā)明設想的另外的光學性質是顏色、熒光、發(fā)光或折射。在一個實施方案中，本文所提及的光學可測定的性質是指可以光學檢測的化學化合物的性質，諸如光吸收、發(fā)光、光緩解或與其相關的性質。應當理解，檢測如本文中所使用的光學可測定的性質包括檢測以前不可檢測的性質的存在，檢測以前沒有檢測到的性質的不存在，以及檢測性質的定量變化，即檢測與至少一種光學性質的變化程度相關的信號強度的變化。應當理解，在一個實施方案中，術語“光學可測定的性質”也涉及電化學發(fā)光，其也稱為電致化學發(fā)光。

如本文中所使用的術語“酶性質”涉及通過生物催化從底物產(chǎn)生可檢測產(chǎn)物的指標的性質。因此，酶特性通常由所述指示劑中具有所述酶性質的多肽的存在賦予。通常，酶性質是選自以下的至少一種酶活性：磷酸酶活性(例如堿性磷酸酶)、過氧化物酶活性(例如辣根過氧化物酶)和糖苷酶活性(例如β-半乳糖苷酶)。酶活性的典型底物是本領域熟知的。通常，所述酶活性產(chǎn)生具有如上文所述的可測定光學性質的產(chǎn)物，或/和所述酶活性產(chǎn)生可由電子儀器測定的產(chǎn)物。

在一個實施方案中，本發(fā)明的方法是雙抗原夾心測定法(“dags”)。因此，所述方法還包括通過以下步驟檢測所述分析物和所述捕獲化合物之間形成的復合物：(i)使所述復合物與至少一種檢測劑化合物接觸，和(ii)測定包含所述分析物、所述捕獲化合物和所述檢測劑化合物的三元復合物的量。

在dags測定法的實施方案中，使用檢測劑化合物。如本文中所使用的術語“檢測劑化合物”涉及直接或間接地結合上文指定的本發(fā)明的分析物并與如本文別處指定的指示劑結合的化學分子。在一個實施方案中，檢測劑化合物不與固體表面結合，并且不適于結合至固體表面。如本領域技術人員將理解，檢測劑化合物也可以是間接檢測劑化合物，即不與分析物直接接觸的檢測劑化合物，如上文對于本發(fā)明的配體所指定。在一個實施方案中，檢測劑化合物是直接檢測劑化合物。因此，在一個實施方案中，上述針對本發(fā)明的捕獲化合物提供的定義，只要它們不涉及化合物與固體表面的結合，就加上必要的變更適用于本發(fā)明的檢測劑化合物。

如本領域技術人員將理解，術語“特異性”用于表示存在于樣品中的其它化合物(通常為生物分子)不顯著結合本發(fā)明的配體(捕獲化合物或檢測劑化合物)；如本領域技術人員將理解，這不排除化學化合物與捕獲化合物或檢測劑化合物分子的區(qū)域的結合，所述區(qū)域不參與與分析物、指定劑或標簽的相互作用，所述分析物、指定劑或標簽用作調節(jié)與固相的結合的功能部分。

此外，本發(fā)明涉及

(i)改善用于測定分析物的間接免疫測定的特異性的方法，其包括通過不同的捕獲化合物替代至少10％，在一個實施方案中，至少25％，在另一個實施方案中，至少40％，在另一個實施方案中，至少45％，在另一個實施方案中，約50％的捕獲化合物，其中替代的捕獲化合物與引入的捕獲化合物競爭結合所述分析物；或者

(ii)改善用于測定分析物的雙抗原夾心免疫測定的特異性的方法，

其包括通過不同的捕獲化合物替代至少50％，在一個實施方案中，至少75％，在另一個實施方案中，至少90％，在另一個實施方案中，約100％的捕獲化合物，其中替代的捕獲化合物與引入的捕獲化合物競爭結合所述分析物，且其中所述至少一種捕獲化合物和至少一種檢測劑化合物是所述分析物的不同的配體，或者

其包括通過不同的檢測劑化合物替代至少50％，在一個實施方案中，至少75％，在另一個實施方案中，至少90％，在另一個實施方案中，約100％的檢測劑化合物，其中替代的檢測劑化合物與引入的檢測劑化合物競爭結合所述分析物，且其中所述至少一種捕獲化合物和至少一種檢測劑化合物是所述分析物的不同的配體。

通常，將選擇替代的捕獲化合物或檢測劑化合物的級分，使得可以理論上預期替代的可測量的影響。如本領域技術人員將理解，可測量的效果的預期將取決于用于替代的不同配體的數(shù)量。例如，如果在改善后的測定中使用三種捕獲化合物代替一種捕獲化合物，則優(yōu)選替代例如66％的初始捕獲化合物。通常，設想給定捕獲化合物或檢測劑化合物的分數(shù)為(100%/n)±50%，其中n=(測定中使用的不同捕獲化合物或檢測劑化合物的數(shù)目)。在另一個實施方案中，使用(100%/n)±20%的級分。如本領域技術人員將理解，使用的級分的總和將加起來為100％。因此，在一個實施方案中，替代的捕獲化合物或檢測劑化合物的級分為10％至90％，在一個實施方案中為25％至75％，在另一個實施方案中為40％至60％，在另一個實施方案中為約50％。

此外，本發(fā)明涉及用于檢測樣品中的分析物的試劑盒，其包含

(i)所述分析物的至少兩種不同的捕獲化合物，其中所述捕獲化合物競爭結合所述分析物；或

(ii)所述分析物的至少兩種不同的檢測劑化合物，其中所述檢測劑化合物競爭結合所述分析物。

在一個另外的實施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測樣品中的分析物的試劑盒，其包含

(i)所述分析物的至少兩種不同的捕獲化合物，其中所述捕獲化合物競爭結合所述分析物，和

(ii)指示劑，其中所述指定劑與所述分析物競爭結合所述捕獲化合物。

如本文中所使用的術語“試劑盒”是指可以包裝在一起或可以不包裝在一起的本發(fā)明的上述化合物、方法或試劑的集合。試劑盒的組分可以由單獨的小瓶(即，作為單獨部分的試劑盒)包含或提供在單個小瓶中。此外，應當理解，本發(fā)明的試劑盒用于實施上文所述的方法。在一個實施方案中，設想為了實踐上述方法，所有組分都以即用方式提供。此外，在一個實施方案中，試劑盒含有用于實施所述方法的說明書。說明書可以由用戶手冊以紙張或電子形式提供。例如，所述手冊可以包含用于解釋當使用本發(fā)明的試劑盒實施上述方法時獲得的結果的說明書。在一個實施方案中，用于檢測樣品中的分析物的試劑盒（包含至少兩種不同的本發(fā)明的捕獲化合物）還包含至少兩種不同的檢測劑化合物，其中所述檢測劑化合物競爭結合所述分析物，且其中所述捕獲化合物不與所述檢測劑化合物競爭結合所述分析物。在另一個實施方案中，所述試劑盒還包含用于固定所述捕獲化合物或固定分析物的固體支持物。

在一個實施方案中，所述試劑盒中包含2至10種所述分析物的捕獲化合物，在一個實施方案中，2至5種所述分析物的捕獲化合物，在一個實施方案中，2至4種捕獲化合物，在一個實施方案中，2至3種所述分析物的捕獲化合物。在另一個實施方案中，所述試劑盒中包含2至10種所述分析物的檢測劑化合物，在一個實施方案中，2至5種所述分析物的檢測劑化合物，在一個實施方案中，2至4種檢測劑化合物，在一個實施方案中，2至3種所述分析物的檢測劑化合物。

此外，本發(fā)明涉及用于檢測樣品中的分析物的設備，其包含

(i)所述分析物的至少兩種不同的捕獲化合物，其中所述捕獲化合物競爭結合所述分析物；或

(ii)所述分析物的至少兩種不同的檢測劑化合物，其中所述檢測劑化合物競爭結合所述分析物，和任選地用于測定所述檢測劑化合物中包含的指示劑的光學或/和酶性質的裝置。

如本文中所使用，術語“設備”涉及包含至少上述可操作相互連接以允許測定的裝置的裝置系統(tǒng)。上文結合本發(fā)明的方法公開了用于測定分析物的量的典型裝置和用于進行測定的裝置。如何以操作方式連接裝置將取決于設備中包含的裝置的類型。在一個實施方案中，所述裝置由單個設備包含。因此，所述設備可以包括(i)用于測量所應用樣品中分析物的量的分析單元和(ii)用于處理用于評估的所得數(shù)據(jù)的計算機單元。關于與上述本發(fā)明的方法相關的實施方案公開了用于檢測的典型裝置。在這種情況下，可操作連接所述裝置，因為系統(tǒng)的用戶由于手冊中給出的說明和解釋將指示劑和分析物的光學或/和電化學上可測定的性質的測定結果匯集在一起，或者所述說明和解釋包括在所述設備中包含的可執(zhí)行程序代碼中，使得作為測定的結果，將所應用的樣品中的分析物的量或濃度輸出至所述用戶。本領域技術人員將意識到如何無需再費周折地連接所述裝置。典型的設備是可以在沒有專門技術人員的特定知識的情況下應用的設備，例如僅需要用樣品上樣的測試條或電子設備。結果可以給出為原始數(shù)據(jù)的輸出，其需要由技術人員解釋。然而，在一個實施方案中，該設備的輸出是處理，即評估的原始數(shù)據(jù)，其解釋不需要技術人員。其它典型的設備包括分析單元/設備(例如，生物傳感器，陣列，與特異性識別肽的配體偶聯(lián)的固體支持物，等離子體表面共振設備，nmr光譜儀，質譜儀等)或上述根據(jù)本發(fā)明的方法提及的評估單元/設備。

在一個實施方案中，所述設備中包含2至10種所述分析物的捕獲化合物，在一個實施方案中，2至5種所述分析物的捕獲化合物，在一個實施方案中，2至4種捕獲化合物，在一個實施方案中，2至3種所述分析物的捕獲化合物。在另一個實施方案中，所述設備中包含2至10種所述分析物的檢測劑化合物，在一個實施方案中，2至5種所述分析物的檢測劑化合物，在一個實施方案中，2至4種檢測劑化合物，在一個實施方案中，2至3種所述分析物的檢測劑化合物。

此外，本發(fā)明涉及組合物，其包含(i)指示疾病的分析物的至少兩種不同的捕獲化合物，其中所述捕獲化合物競爭結合所述分析物；或(ii)指示疾病的分析物的至少兩種不同的檢測劑化合物，其中所述檢測劑化合物競爭結合所述分析物；其用于診斷中。

如本文中所使用的術語“組合物”是指以固體、液體或氣體形式配制的任何組合物。所述組合物包含本發(fā)明的化合物，任選地與合適的輔助化合物諸如稀釋劑或載體或另外成分一起。合適的稀釋劑和/或載體取決于組合物待使用的目的和其它成分。本領域技術人員可以無需再費周折地確定這樣的合適的稀釋劑和/或載體。在一個實施方案中，用于診斷中的組合物（包含至少兩種不同的本發(fā)明的捕獲化合物）還包含至少兩種不同的檢測劑化合物，其中所述檢測劑化合物競爭結合所述分析物，且其中所述捕獲化合物不與所述檢測劑化合物競爭結合所述分析物。

如本文中所使用的術語“診斷”是指受試者患有或將患有疾病或病況的概率的評價。如本領域技術人員將理解，這樣的評價通常并非意圖對于待診斷的100％受試者是正確的。然而，該術語要求統(tǒng)計學顯著部分的受試者可被正確診斷為患有疾病或病況。本領域技術人員可以使用各種眾所周知的統(tǒng)計評估工具來無需再費周折地確定部分是否是統(tǒng)計學顯著的，例如，置信區(qū)間的確定，p-值確定，student′st-檢驗，mann-whitney檢驗等。詳情見于dowdy和wearden,statisticsforresearch,johnwiley&sons,newyork1983。優(yōu)選的置信區(qū)間為至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。p-值優(yōu)選為0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。優(yōu)選地，本發(fā)明設想的概率允許將針對給定組群或群體的至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的受試者校正診斷。待診斷的典型狀況是例如生育狀態(tài)或懷孕。待診斷的典型疾病是，例如，普遍或以前感染病原體，例如病毒，甲狀腺功能亢進或甲狀腺功能減退，維生素缺乏等。

此外，本發(fā)明涉及組合物用于測定樣品中的分析物的用途，所述組合物包含(i)第一和第二捕獲化合物，其中所述第一和第二捕獲化合物是不同的捕獲化合物，且其中所述捕獲化合物競爭結合所述分析物，或(ii)第一和第二檢測劑化合物，其中所述第一和第二檢測劑化合物是不同的檢測劑化合物，且其中所述檢測劑化合物競爭結合所述分析物。

概述本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，公開了以下實施方案：

實施方案1.用于測定疑似包含所述分析物的樣品中的分析物的方法，其包括

a)使至少所述分析物的第一和第二捕獲化合物與所述樣品接觸，其中所述第一和第二捕獲化合物是不同的捕獲化合物，且其中所述捕獲化合物競爭結合所述分析物；

b)使與所述樣品接觸的所述捕獲化合物與以下接觸：

(i)檢測劑化合物，其中所述檢測劑化合物與所述捕獲化合物競爭結合所述分析物；或

(ii)指定劑，其中所述指定劑與所述分析物競爭結合所述捕獲化合物；

c)測定包含以下的復合物的量：

(i)所述檢測劑化合物和捕獲化合物，或

(ii)所述指定劑和捕獲化合物；和

d)基于步驟c)的結果測定樣品中的所述分析物。

實施方案2.實施方案1的方法，其中競爭結合分子是結合所述分子的基本上相同或相同的亞結構，在一個實施方案中，其中競爭結合所述分析物是結合所述分析物的基本上相同或相同的亞結構，在一個實施方案中，其中競爭結合所述捕獲化合物是結合所述至少一種（在一個實施方案中所有）捕獲化合物的基本上相同或相同的亞結構。

實施方案3.實施方案1或2的方法，其中所述不同的捕獲化合物是生物分子，在一個實施方案中，生物大分子，在另一個實施方案中多肽。

實施方案4.實施方案1至3中任一項的方法，其中所述兩種不同的捕獲化合物是病毒多肽的變體，在一個實施方案中，病毒衣殼多肽的變體。

實施方案5.實施方案1至4中任一項的方法，其中所述兩種不同的捕獲化合物是肝炎病毒衣殼多肽的變體，在一個實施方案中，乙型肝炎病毒(hb)衣殼多肽的變體，在另一個實施方案中，hb核心(hbc)抗原的變體。

實施方案6.實施方案1至2中任一項的方法，其中所述第二捕獲化合物是作為第一捕獲化合物的抗體的變體；或其中所述第一和第二捕獲化合物是識別基本相同的表位的抗體。

實施方案7.實施方案1至6中任一項的方法，其中所述第二捕獲化合物通過以下至少一種來衍生或可衍生自所述第一捕獲化合物：

(i)將至少一個氨基酸交換引入所述第一捕獲化合物的氨基酸序列，

(ii)在與所述第一捕獲化合物相比不同的細胞背景中產(chǎn)生所述第二捕獲化合物，

(iii)與所述第一捕獲化合物相比，除去或阻止所述第二捕獲化合物的糖基化，

(iv)通過與所述第一捕獲化合物相比不同的方式和/或通過不同的方法純化所述第二捕獲化合物，

(v)在與所述第一捕獲化合物相比不同的條件下變性和/或重折疊所述第二捕獲化合物，和

(vi)在與所述第一捕獲化合物相比不同的條件下儲存所述第二捕獲化合物。

實施方案8.實施方案1至7中任一項的方法，其中所述分析物是生物大分子。

實施方案9.實施方案1至8中任一項的方法，其中所述分析物是多肽。

實施方案10.實施方案1至9中任一項的方法，其中所述分析物是針對病毒抗原的抗體，在一個實施方案中針對病毒多肽的抗體，在另一個實施方案中針對病毒衣殼多肽的抗體。

實施方案11.實施方案1至10中任一項的方法，其中所述分析物是針對肝炎病毒衣殼多肽的抗體，在一個實施方案中，針對乙型肝炎病毒(hb)衣殼多肽的抗體，在另一個實施方案中，針對hb核心(hbc)抗原的抗體。

實施方案12.實施方案9至11中任一項的方法，其中由所述捕獲化合物結合的表位具有共同的至少3個氨基酸。

實施方案13.實施方案1至12中任一項的方法，其中所述測定分析物定性或定量地測定所述分析物的量。

實施方案14.實施方案1至13中任一項的方法，其中步驟a)包括使2至10種所述分析物的捕獲化合物，在一個實施方案中，2至5種所述分析物的捕獲化合物，在一個實施方案中，2至4種捕獲化合物，在一個實施方案中，2至3種所述分析物的捕獲化合物與所述樣品接觸。

實施方案15.實施方案1至14中任一項的方法，其中所述指定劑包含被與指示劑結合的捕獲化合物結合的分子的亞結構。

實施方案16.實施方案1至15中任一項的方法，其中所述指定劑是包含分析物和指示劑的化合物。

實施方案17.實施方案1至16中任一項的方法，其中所述指定劑由共價結合至指示劑的分析物組成。

實施方案18：實施方案1至17中任一項的方法，其中所述捕獲化合物不包含在多克隆抗血清中，在一個實施方案中不是多克隆抗體。

實施方案19.實施方案1至18中任一項的方法，其中所述第一和第二捕獲化合物不競爭結合干擾化合物。

實施方案20.實施方案1至19中任一項的方法，其包括步驟：

a)使至少所述分析物的第一和第二捕獲化合物與所述樣品接觸，其中所述第一和第二捕獲化合物是不同的捕獲化合物，且其中所述捕獲化合物競爭結合所述分析物；

b)使與所述樣品接觸的所述捕獲化合物與指定劑接觸，其中所述指定劑與所述分析物競爭結合所述捕獲化合物；

c)測定包含所述指定劑和捕獲化合物的復合物的量；和

d)基于步驟c)的結果測定樣品中的所述分析物。

實施方案21.用于測定疑似包含所述分析物的樣品中的分析物的方法，其包括

a)使所述樣品與至少所述分析物的第一和第二檢測劑化合物接觸，其中所述第一和第二檢測劑化合物是不同的檢測劑化合物，且其中所述檢測劑化合物競爭結合所述分析物；

b)使包括至少所述分析物的所述樣品的成分與固體表面結合，

c)測定包含與所述固體表面結合的檢測劑化合物的復合物的量；和

d)基于步驟c)的結果測定樣品中的所述分析物。

實施方案22.實施方案22的方法，其中所述分析物包含抗體，在一個實施方案中為抗體。

實施方案23.實施方案21至22中任一項的方法，其中所述檢測劑化合物還包括指示劑。

實施方案24.實施方案15至17或23中任一項的方法，其中所述指示劑是具有可檢測性質、在一個實施方案中光學或/和酶學性質的化合物。

實施方案25.實施方案20至24中任一項的方法，其中所述第一和第二檢測劑化合物不競爭結合干擾化合物。

實施方案26.實施方案20至25中任一項的方法，其中步驟a)在步驟b)之后進行。

實施方案27.改善以下的特異性的方法：

(a)(i)用于測定分析物的間接免疫測定法或(ii)用于測定分析物的雙抗原夾心免疫測定法，其包括：

通過不同的捕獲化合物替代至少10％，在一個實施方案中，至少25％，在另一個實施方案中，至少40％，在另一個實施方案中，至少45％，在另一個實施方案中，約50％的捕獲化合物，其中被替代的捕獲化合物與引入的捕獲化合物競爭結合所述分析物；或者

(b)用于測定分析物的雙抗原夾心免疫測定法，其包括：

通過不同的檢測劑化合物替代至少25％，在一個實施方案中，至少40％，在另一個實施方案中，至少45％，在另一個實施方案中，約50％的檢測劑化合物，其中被替代的檢測劑化合物與引入的檢測劑化合物競爭結合所述分析物，且其中所述至少一種捕獲化合物和至少一種檢測劑化合物是不同的所述分析物的捕獲化合物。

實施方案28.實施方案1至27中任一項的方法，其中所述捕獲化合物和/或結合所述分析物的所述檢測劑化合物中的化學結構在所有所述不同的捕獲化合物和/或所有所述不同的檢測劑化合物中是相同的。

實施方案29.

用于檢測樣品中的分析物的試劑盒，其包含

(i)所述分析物的至少兩種不同的捕獲化合物，在一個實施方案中，2至10種所述分析物的捕獲化合物，在一個實施方案中，2至5種所述分析物的捕獲化合物，在一個實施方案中，2至4種捕獲化合物，在一個實施方案中，2至3種所述分析物的捕獲化合物，其中所述捕獲化合物競爭結合所述分析物；或

(ii)所述分析物的至少兩種不同的檢測劑化合物，在一個實施方案中，2至10種所述分析物的檢測劑化合物，在一個實施方案中，2至5種所述分析物的檢測劑化合物，在一個實施方案中，2至4種檢測劑化合物，在一個實施方案中，2至3種所述分析物的檢測劑化合物，其中所述檢測劑化合物競爭結合所述分析物。

實施方案30.實施方案29的試劑盒，其還包含用于固定所述捕獲化合物的固體支持物或包含至少所述分析物的所述樣品的組分。

實施方案31.用于測定樣品中的分析物的設備，其包含

(i)所述分析物的至少兩種不同的捕獲化合物，在一個實施方案中，2至10種所述分析物的捕獲化合物，在一個實施方案中，2至5種所述分析物的捕獲化合物，在一個實施方案中，2至4種捕獲化合物，在一個實施方案中，2至3種所述分析物的捕獲化合物，其中所述捕獲化合物競爭結合所述分析物；或

(ii)所述分析物的至少兩種不同的檢測劑化合物，在一個實施方案中，2至10種所述分析物的檢測劑化合物，在一個實施方案中，2至5種所述分析物的檢測劑化合物，在一個實施方案中，2至4種檢測劑化合物，在一個實施方案中，2至3種所述分析物的檢測劑化合物，其中所述檢測劑化合物競爭結合所述分析物，和任選地用于測定所述檢測劑化合物中包含的指示劑的光學或/和酶性質的裝置。

實施方案32.組合物，其包含

(i)指示疾病的分析物的至少兩種不同的捕獲化合物，其中所述捕獲化合物競爭結合所述分析物，或

(ii)指示疾病的分析物的至少兩種不同的檢測劑化合物，其中所述檢測劑化合物競爭結合所述分析物；

其用于診斷疾病。

實施方案33.(i)用于分析物的至少兩種不同的捕獲化合物，其中所述捕獲化合物競爭結合所述分析物；和/或

(ii)用于分析物的至少兩種不同的檢測劑化合物，其中所述檢測劑化合物競爭結合所述分析物；

用于制造診斷組合物或診斷設備的用途。

實施方案34.用于實施方案32的或用于實施方案33的組合物，其中所述疾病是病毒性肝炎。

實施方案35.包含以下的組合物用于測定樣品中的分析物的用途：(i)第一和第二捕獲化合物，其中所述第一和第二捕獲化合物是不同的捕獲化合物，且其中所述捕獲化合物競爭結合所述分析物；或(ii)第一和第二檢測劑化合物，其中所述第一和第二檢測劑化合物是不同的檢測劑化合物，且其中所述檢測劑化合物競爭結合所述分析物。

附圖簡要說明

將在后續(xù)的實施方案的描述中，在一個實施方案中，結合從屬權利要求來更詳細地公開本發(fā)明的另外的任選的特征和實施方案。其中，各個任選的特征可以以分離的方式以及任何任意可行的組合來實現(xiàn)，如本領域技術人員將實現(xiàn)。本發(fā)明的范圍不受公開的實施方案的限制。在附圖中示意性地描繪實施方案。其中，這些圖中相同的參考數(shù)字是指相同或功能相當?shù)囊亍?/p>

在圖中：

圖1示意性地表示如應用于競爭性測定法的本發(fā)明的原理；a：分析物，s：指定劑，c1：捕獲化合物1，c2：捕獲化合物2，i1:干擾劑1，i2：干擾劑2。a)在分析物不存在的情況下，指定劑與捕獲化合物1結合。b)在分析物存在的情況下，分析物結合捕獲化合物1并防止指定劑結合捕獲化合物1。c)在對捕獲化合物1具有親和力(但對捕獲化合物2沒有)的干擾劑1存在的情況下，干擾劑1結合捕獲化合物1，因此防止指定劑結合。d)在對捕獲化合物2具有親和力(但對捕獲化合物1沒有)的干擾劑2存在的情況下，干擾劑2不結合捕獲化合物1，因此允許指定劑結合捕獲化合物1。相反，e)在對捕獲化合物1具有親和力(但對捕獲化合物2沒有)的干擾劑1不結合捕獲化合物2，因此允許指定劑結合捕獲化合物2；且f)干擾劑2的確結合捕獲化合物2，因此防止指定劑結合。(g)和h))在例如以1:1比率使用捕獲化合物1和2的情況下，由干擾劑1或干擾劑2誘導的假信號降低將降低至約50％。

圖2示意性地顯示抗肝炎核心(hbc)抗原抗體的競爭性測試的測試原理。hbc：乙型肝炎核心抗原；α-hbc：抗hbc抗原抗體；以雙周長描繪的非綴合的α-hbc抗體是可能存在于來自患者的樣品中的抗體，以單周長描繪的綴合抗體是在測定期間添加的α-hbc抗體；用ru：釕-絡合物或bio：生物素綴合；strp:固體支持物的鏈霉抗生物素蛋白-涂層。a)在分析物(α-hbc抗體)不存在的情況下，ru-綴合和bio-綴合的α-hbc抗體可以結合添加至測定混合物的hbc。經(jīng)由bio-strp-相互作用，所述絡合物與固體支持物結合，并且在洗滌后，可以測量由ru-綴合產(chǎn)生的信號。b)在分析物(α-hbc抗體)存在的情況下，防止α-hbc-bio抗體和ru-綴合的抗體結合添加至測定混合物的hbc，因此防止絡合物與固體支持物的結合。因此，洗滌后，不能從ru-絡合物產(chǎn)生信號，因為這將被洗掉。在圖2中，hbc以及α-hbc-bio綴合物是捕獲化合物復合物的一部分。

圖3示意性地表示如應用于雙抗原夾心(dags)形式的本發(fā)明的原理。a：分析物，d：檢測劑化合物，c1：捕獲化合物1，c2：捕獲化合物2，i1：干擾劑1，i2：干擾劑2。a)在分析物不存在的情況下，沒有分析物結合至固定在固體支持物上的捕獲化合物1(或2)，因此，將在洗滌步驟中洗掉檢測劑化合物。b)在分析物(例如，抗體)存在的情況下，分析物結合捕獲化合物1和檢測劑化合物，因此介導檢測劑化合物與固體表面的結合。c)在結合捕獲化合物1和檢測劑化合物，但不結合捕獲化合物2的干擾劑1存在的情況下，檢測劑化合物變得經(jīng)由與干擾劑1的相互作用固定至固體支持物。d)在結合捕獲化合物2和檢測劑化合物、但不結合捕獲化合物1的干擾劑2存在的情況下，檢測劑化合物不經(jīng)由干擾劑1固定至固體支持物。相反，e)在干擾劑存在的情況下，檢測劑化合物不經(jīng)由與干擾劑2的相互作用固定至固體支持物；且f)在干擾劑2存在的情況下，檢測劑化合物將經(jīng)由捕獲化合物2固定至固體支持物。(g)和h))在例如以1:1比率使用捕獲化合物1和2的情況下，由干擾劑1或干擾劑2誘導的假信號增加將降低至約50％?？梢约由媳匾兏乩L制用于使用兩種不同的檢測劑化合物。

實施方案的詳述：

實施例1

重組乙型肝炎核心抗原的克隆和純化

編碼乙型肝炎核心抗原(hbcag)的合成基因購自eurofinsmwgoperon(ebersberg,germany)?；趎ovagen(madison,wi,usa)的pet24a表達質粒，進行以下克隆步驟。用bamh1和xho1消化載體，并插入包含hbcag的盒。將所得質粒的插入物測序，并發(fā)現(xiàn)其編碼所需蛋白。所得蛋白的氨基酸序列顯示于本發(fā)明的序列方案中。重組hbcag不含c-端六組氨酸標簽。

根據(jù)以下方案純化重組hbcag。使攜帶表達質粒的大腸桿菌bl21(de3)細胞在加有卡那霉素(30μg/ml)的lb培養(yǎng)基中生長至od600為1，并通過添加異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)至1mm的最終濃度而誘導細胞溶質過表達，生長溫度為37℃。誘導后4小時，通過離心(5000xg，20分鐘)而收獲細胞，冷凍并儲存于-20℃。對于細胞裂解，將冷凍的沉淀物重懸浮于每50ml緩沖液(蛋白酶抑制劑混合物)25mm磷酸鈉ph8.5、6mmmgcl2、10u/mlbenzonase^?、1片complete^?和1片complete^?edta-free中，并通過高壓均質化來裂解所得懸浮液。將粗裂解物離心，并用硫酸銨(35%w/v)沉淀上清液中的hbcag。另外離心后，將沉淀物重新懸浮并針對磷酸鹽緩沖液透析，隨后為加熱步驟(70℃，30分鐘)。離心后，將澄清的上清液施加到在25mm磷酸鉀ph7中預平衡的toyopearldeae650-11柱(來自tosohbioscience)上。然后通過施加梯度至500mm的氯化鉀濃度來洗脫蛋白。最后，將蛋白進行大小排阻色譜(s400)，并合并含蛋白的級分。

實施例2

用于以競爭性測試形式檢測抗hbc抗體的免疫測定

在自動化cobase?分析儀(rochediagnosticsgmbh)中在競爭性抗hbceclia(電化學發(fā)光免疫測定)中分析來自一組健康獻血者的血清樣品中抗hbc抗體的存在。cobase?和elecsys?是roche集團的注冊商標。樣品用至少一種ce標記的抗-hbc測定法測試為陰性，所述ce標記的抗-hbc測定法不同于elecsys?抗-hbc測定法并且可商購。

在測定中，血清與hbc反應。在添加生物素化抗體和釕絡合物(三(2,2'-聯(lián)吡啶)釕(ii)-絡合物；(ru(bpy)32+)-標記的抗體，兩者對hbcag特異性，與鏈霉抗生物素蛋白包被的微粒一起)之后，hbc-抗原上的仍可用的（still-free）結合位點變得被占據(jù)。整個復合物經(jīng)由生物素和鏈霉抗生物素蛋白的相互作用而與固相結合。在除去未結合的物質后，向電極施加電壓，并在鉑電極處激發(fā)后誘導在620nm的化學發(fā)光，其通過光電倍增管測量。

高測量值表示添加的生物素化抗體和釕絡合物標記的抗體的結合以及因此樣品中不存在抗hbc抗體。在樣品中存在抗hbc抗體的情況下，這些抗體與兩種類型的測定特異性抗體競爭結合抗原h(huán)bcag，導致在鉑電極處激發(fā)后620nm處的發(fā)光減少。信號輸出為任意光單位。

因此，具有高于截止指數(shù)1.0的測量值的樣品被認為是不反應的，而具有低于或等于截止指數(shù)1.0的測量值的樣品被認為是反應的。

基于競爭性elecsys?抗hbc測定形式，測試了三種不同的hbcag設置?！癶bcagx”是指包含seqidno:2的抗原；“hbcagy”是指包含seqidno:1的抗原。只有抗原設置被修飾，所有其它試劑和條件保持不變。應用hbcagx和y的組合作為第一和第二捕獲化合物不影響真陽性(感染)樣品的結果(數(shù)據(jù)未顯示)。表1僅是指樣品組的差異(=假)陽性結果。三種不同的設置如下：

a)hbcagx用作競爭性抗hbc測定中的靶標。

b)hbcagy(略微不同于hbcagy)用作競爭性抗hbc測定中的靶標。

c)hbcagx和hbcagy的組合一起用作競爭性抗hbc測定中的靶標。

表1顯示競爭性抗hbc-eclia(電化學發(fā)光免疫測定)的結果。使用針對hbc抗原的抗體陰性的市售血清(巴伐利亞紅十字會)作為樣品。表1僅列出具有差異發(fā)現(xiàn)的那些結果。不同的hbcag顯示差異陽性抗hbc結果的個體模式。當使用hbc-抗原(hbcag)的兩種不同制備物時，當使用hbcagx時，11個樣品被測試為(假)陽性(反應性)，僅當使用第二hbcagy時7個樣品被測試為(假)陽性，而2個樣品用hbcagx和hbcagy測試為(假)陽性。相比之下，當使用兩種抗原(即hbcagx和hbcagy)的1:1混合物時，這18個樣品中只有5個被測試為陽性，使假陽性測試次數(shù)減少超過3倍。詳細地，當使用所述兩種抗原(hbcagx和hbcagy)的1:1混合物時，使用僅hbcagx測試為假陽性的樣品數(shù)量從11降低至3，而僅使用hbcagy測試假陽性的樣品數(shù)量在從9降低至5。如所預期，兩個樣品用兩種抗原都測試為假陽性(樣品編號2942和3657)，并且用混合物也測試為假陽性。

因此，當將至少兩種略微不同的hbc抗原作為混合物應用時，這種競爭性免疫測定的特異性增加。

通過在基于競爭性測試形式的方法中應用使用兩種略微不同的第一和第二分析物的捕獲化合物的原理，可以顯著增加特異性，即可以在相當程度上避免假陽性結果。

表1：競爭性抗hbceclia(電化學發(fā)光免疫測定)的結果，coi：截止指數(shù)。

。

序列表

<110>rochediagnosticsgmbh

f.hoffmann-larocheag

<120>降低干擾的方法

<130>rd11433pc

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>185

<212>prt

<213>乙型肝炎病毒

<400>1

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151015

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