本發(fā)明總體上涉及對包括特定的感興趣點(diǎn)的透明樣本進(jìn)行光學(xué)分析的領(lǐng)域。所述感興趣點(diǎn)可以特別地為生物顆粒，從而樣本為生物樣本。

本發(fā)明可以特別地應(yīng)用于微生物學(xué)診斷，并且更特別地應(yīng)用于通過光譜學(xué)(特別地通過拉曼光譜或通過熒光光譜)或者甚至通過衍射或擴(kuò)散來分析微生物。

本發(fā)明更特別地但非限制性地涉及對在分析光束波長處透明的顆粒的分析。

背景技術(shù)：

對諸如生物顆粒之類的小顆粒的分析、更特別地對微生物的分析傳統(tǒng)上可以使用被稱為分析路徑的光學(xué)探頭來進(jìn)行。該光學(xué)探頭將分析光束聚焦到待分析的顆粒上，并在光束與顆粒交互后測量該光束的物理屬性，例如光束的拉曼光譜或熒光光譜。對顆粒的分析可以用于顆粒的識別或表征。分析光束可以是其束腰被定位在顆粒上的激光束、或者聚焦在顆粒上的光束。術(shù)語“聚焦光斑”在下文中用來描述激光束的束腰或者光束的聚焦光斑，并且兩種情況均將指的是分析光束的聚焦。

分析光束在待分析的顆粒上的聚焦光斑的定位必須特別精確，所述聚焦光斑的大小大體上與待分析的顆粒的大小相同。

分析光束在顆粒上的定位、更具體地分析光束的聚焦光斑的定位通常在顯微鏡下目測執(zhí)行。為此，除上文中描述的分析路徑之外，系統(tǒng)還包括位置控制路徑。位置控制路徑用來控制感興趣點(diǎn)(特別地，顆粒)相對于分析路徑的定位。在測量前的階段中，分析路徑配置成當(dāng)顆粒位于分析路徑的聚焦點(diǎn)處時，使顆粒的圖像清晰并且位于控制路徑的傳感器所識別的位置處。

圖1示出了這樣的分析系統(tǒng)100的一個示例。在該示例中，感興趣點(diǎn)是顆粒。

分析路徑包括用來照亮感興趣顆粒的第一光源，例如激光器170。激光器170發(fā)出的光束被稱為分析光束。分析路徑還包括第一光學(xué)系統(tǒng)140，在這種情況下，第一光學(xué)系統(tǒng)由顯微物鏡組成。第一光學(xué)系統(tǒng)140的光軸被標(biāo)記為d。

在示出的示例中，分析路徑還包括用于在光束與顆粒p交互之后測量所述光束的物理屬性的測量裝置180。

顯微物鏡將激光束的束腰聚焦在焦平面π0上。分束板175(例如二向色板)將激光源發(fā)出的光束分束，并且該光束與顆粒p交互。

位置控制路徑包括用于照亮顆粒p的光源110、顯微物鏡140、管透鏡150和圖像傳感器160。在物鏡140的輸出端，顆粒的通過光源110形成的圖像延伸到無限遠(yuǎn)處，然后通過管透鏡150投射到傳感器160的平面上。

分析路徑和位置控制路徑由于偏轉(zhuǎn)鏡149而共享同一顯微物鏡以及同一焦平面π0。交替使用這兩個路徑。

在測量之前的調(diào)整階段形成兩個路徑之間的對應(yīng)關(guān)系。例如，調(diào)整階段包括通過使在測量裝置180上獲得的信號最大化來將用于控制分析光束的控制物體(例如不透明結(jié)構(gòu)的聚焦圖案)放置在最大聚焦點(diǎn)處。然后，對控制路徑的傳感器160的位置進(jìn)行調(diào)整以在控制路徑的所述傳感器的識別位置處產(chǎn)生控制物體的清晰圖像。

在對樣本的顆粒進(jìn)行測量時，根據(jù)以下兩個步驟來執(zhí)行所述顆粒在分析光束的焦點(diǎn)處的定位。

在第一步驟中，關(guān)閉激光器170，打開光源110，定位偏轉(zhuǎn)鏡149，以及使用圖像傳感器采集焦平面的圖像。當(dāng)顆粒在所述圖像中比較清晰時，該顆粒位于焦平面內(nèi)。然后，將顆粒水平地定位在將在上文中描述的儀器調(diào)整階段期間確定的識別點(diǎn)上。

在第二步驟中，關(guān)閉光源110，打開激光器170并移除偏轉(zhuǎn)鏡149。如果顆粒未移動，則分析光束的聚焦光斑位于所述顆粒上。

然而，當(dāng)顆粒在可見光譜中是透明的時，進(jìn)行定位是有難度的、或者甚至是不可能的。在下文中的描述中，術(shù)語透明顆粒將描述如下顆粒：具有非常低的可見光吸收度(即，在可見光譜中或者更一般地在從300nm至1000nm的光譜帶中透射系數(shù)大于或等于70％)的顆粒、以及折射率與其周圍環(huán)境相差很小(例如，折射率差小于0.1)的顆粒。某些細(xì)胞(未標(biāo)記真核細(xì)胞和原核細(xì)胞)和由介電材料制成的某些顆?？梢砸虼吮划?dāng)作透明的。

一個已知的解決方案包括暫時移走顆粒p。因此，將容納生物顆粒的基板安裝在平移臺上，用于沿與物鏡140的光軸平行的軸平移。

該方案包括將上文中所描述的第二步驟分成兩個子步驟。

在第一子步驟中，在散焦條件下使用位置控制路徑。換言之，顆粒沿顯微物鏡的光軸偏移以使其不再位于顯微物鏡的焦平面中。

該散焦使得能夠獲得顆粒p的不清晰圖像，盡管如此，透明顆粒也可以與周圍環(huán)境區(qū)分開來。因此，可以知道顆粒p在與物鏡的光軸垂直的平面內(nèi)的水平位置

在第二子步驟中，顆粒被重新定位在顯微物鏡的焦平面內(nèi)。顆粒的圖像在位置控制路徑上消失，然而分析光束聚焦光斑位于顆粒上。

該解決方案的一個缺點(diǎn)在于：如果在第一子步驟與測量步驟之間顆粒從其基板上移動、轉(zhuǎn)移或分離(例如，在通過基板捕獲的細(xì)菌的情況下)，則在測量時該顆粒不再處于分析光束的聚焦點(diǎn)處。因此，不能保證分析的完整性，并且甚至利用反饋來動態(tài)地控制顆粒的位置上的分析光束是不太可能的。

因此，本發(fā)明的目的在于使得能夠?qū)崟r地控制顆粒的位置、具體地為透明顆粒的位置，特別地以使用分析光束保證對顆粒的分析的可靠性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一種用于對樣本的感興趣顆粒進(jìn)行分析的系統(tǒng)，該分析系統(tǒng)包括：

-分析路徑，包括發(fā)出分析光束的第一光源以及第一光學(xué)系統(tǒng)，第一光學(xué)系統(tǒng)設(shè)置成將分析光束聚焦在與第一光學(xué)系統(tǒng)的光軸正交的被稱為焦平面的平面上；以及

-位置控制路徑，包括第二光源、圖像傳感器和第二光學(xué)系統(tǒng)，該第二光學(xué)系統(tǒng)與第一光學(xué)系統(tǒng)至少部分地融合以使第一光學(xué)系統(tǒng)和第二光學(xué)系統(tǒng)包括同一所謂的共享光學(xué)系統(tǒng)。

根據(jù)本發(fā)明，圖像傳感器經(jīng)第二光學(xué)系統(tǒng)相對于焦平面的圖像偏移。

使用圖像傳感器獲得的散焦圖像來檢查顆粒正確地位于期望位置。該檢查可以執(zhí)行與當(dāng)顆粒位于所述目標(biāo)位置時所獲得的散焦圖像的簡單比較。

本發(fā)明不需要任何涉及移動顯微物鏡或樣本的中間步驟。

可以同時、或者相繼地但要在非常短的時間間隔內(nèi)獲得散焦圖像和聚焦光斑的指向(pointagedelatachedefocalisation)。這保證了分析的可靠性，這是由于在用于使聚焦光斑指向所述顆粒必須位于的位置處的每個操作之前檢測到了顆粒的位移。

此外，使分析激光束指向顆粒處提供了可以將顆粒與顆粒所接合到的基板分開的能量。根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)使得能夠容易地驗(yàn)證聚焦光斑定位在顆粒上未導(dǎo)致顆粒移動。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的分析光束包括計算裝置，計算裝置配置成通過數(shù)值傳播根據(jù)圖像傳感器提供的圖像來計算至少一個重建圖像。

因此，通過傳感器獲得的散焦圖像使得能夠通過計算來獲得圖像，所述圖像與圖像傳感器的不同于其真實(shí)位置的虛擬位置相關(guān)聯(lián)。使用術(shù)語虛擬位置是因?yàn)閷?shí)際上圖像傳感器保持不動并且僅對圖像傳感器的位移進(jìn)行數(shù)字仿真。如下文中所描述的，因此可以以精確的方式來定位感興趣顆粒。

分析系統(tǒng)可以包括部分和/或選擇性偏轉(zhuǎn)裝置，部分和/或選擇性偏轉(zhuǎn)裝置設(shè)置成在輸入端將位置控制路徑和分析路徑合并成共享光學(xué)系統(tǒng)。

可替換地，第一光源和第二光源具有不同的波長，并且偏轉(zhuǎn)裝置是波長選擇性裝置。

根據(jù)一有利實(shí)施例，計算裝置在其輸入端接收圖像傳感器提供的圖像，并且被配置成基于圖像傳感器提供的圖像以及通過數(shù)值傳播來計算焦平面π0的圖像πi中的感興趣顆粒的重建圖像。

計算裝置可以在其輸入端接收圖像傳感器提供的圖像，并且可以被配置成基于圖像傳感器提供的圖像以及通過數(shù)值傳播來計算重建平面中的一系列重建圖像，該一系列重建圖像中的每一個重建圖像相對于圖像傳感器的平面偏移。

有利地，計算裝置包括用于基于所述一系列重建平面確定相對于圖像傳感器的平面的偏移的裝置，該偏移被稱為最佳偏移、與重建平面和容納感興趣顆粒的圖像的平面之間的通過第二光學(xué)系統(tǒng)的最小偏移相關(guān)聯(lián)。

優(yōu)選地，計算裝置包括用于將最佳偏移與圖像傳感器的平面和焦平面的圖像之間的通過第二光學(xué)系統(tǒng)的距離進(jìn)行比較的裝置，比較結(jié)果確定了軸向位移命令，并且分析系統(tǒng)包括配置成響應(yīng)于所述軸向位移命令使用于容納樣本的支承件移動的位移裝置。

計算裝置可以包括用于將控制圖像與被稱為聚焦圖像的重建圖像進(jìn)行比較的裝置，該聚焦圖像與對應(yīng)的重建平面和容納感興趣顆粒的圖像的平面之間的通過第二光學(xué)系統(tǒng)的最小偏移相關(guān)聯(lián)。

有利地，分析系統(tǒng)包括用于對重建圖像求閾值的裝置，該閾值通過ith＝iav+3σ來限定，其中，iav是重建圖像中的像素強(qiáng)度的均值，而σ是重建圖像中的像素強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)差。

根據(jù)一有利實(shí)施例，控制圖像和聚焦圖像的比較結(jié)果確定來橫向位移命令，并且分析系統(tǒng)包括配置成響應(yīng)于所述橫向位移命令使用于容納樣本的支承件移動的位移裝置。

本發(fā)明還涉及一種在根據(jù)本發(fā)明的分析系統(tǒng)內(nèi)實(shí)施的用于對生物樣本的感興趣顆粒進(jìn)行分析的方法，該方法包括使用分析路徑來分析感興趣顆粒的步驟，以及使用位置控制路徑來控制感興趣顆粒的位置的步驟。根據(jù)本發(fā)明，這兩個步驟的實(shí)施沒有被用于使樣本相對于分析路徑和位置控制路徑移動的中間步驟分開。

優(yōu)選地，分析步驟和位置控制步驟是同時實(shí)施的。

根據(jù)一優(yōu)選實(shí)施例，位置控制步驟包括以下子步驟：

-使用位置控制路徑的圖像傳感器采集感興趣顆粒的圖像；

-通過數(shù)值傳播，使用所述圖像而在相對于圖像傳感器的平面偏移的重建平面中構(gòu)建至少一個重建圖像。

根據(jù)本發(fā)明的方法可以包括計算重建平面中的一系列重建圖像，該一系列重建圖像中的每一個重建圖像相對于圖像傳感器的平面偏移，以及選擇與對應(yīng)的重建平面和容納感興趣顆粒的圖像的平面之間的通過第二光學(xué)系統(tǒng)的最小偏移相關(guān)聯(lián)的重建圖像。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法包括計算焦平面的圖像中的感興趣顆粒的重建圖像。

附圖說明

通過閱讀參照附圖給出的以下優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將變得明顯，在附圖中：

-圖1以簡圖的方式示出了根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的分析系統(tǒng)；

-圖2以簡圖的方式示出了根據(jù)本發(fā)明的分析系統(tǒng)的第一實(shí)施例；

-圖3以簡圖的方式示出了根據(jù)本發(fā)明的分析系統(tǒng)的第二實(shí)施例；

-圖4a和圖4b以簡圖的方式示出了求閾值后的重建圖像和求閾值后經(jīng)處理的重建圖像以定位顆粒；

-圖5示出了獲得根據(jù)本發(fā)明的一系列重建圖像；

-圖6示出了針對一系列重建圖像根據(jù)與所述圖像相關(guān)聯(lián)的偏移而給出圖像中的標(biāo)準(zhǔn)差的曲線；

-圖7以簡圖的方式示出了從樣本的一系列重建圖像中提取感興趣區(qū)域的一系列重建圖像；

-圖8以簡圖的方式示出了根據(jù)與每個圖像相關(guān)聯(lián)的偏移的、感興趣區(qū)域的一系列重建圖像中的標(biāo)準(zhǔn)差曲線；

-圖9以簡圖的方式示出了采用根據(jù)本發(fā)明的方法實(shí)施以確保正確定位分析光束的聚焦光斑的步驟。

具體實(shí)施方式

除了在上述系統(tǒng)中實(shí)施分析方法之外，根據(jù)本發(fā)明初步描述了一個分析系統(tǒng)。

圖2示出了根據(jù)本發(fā)明的用于對顆粒的位置、尤其是透明顆粒的位置進(jìn)行視覺控制的分析系統(tǒng)的第一實(shí)施例。

分析系統(tǒng)200包括第一所謂的分析路徑和第二所謂的位置控制路徑。將僅針對分析系統(tǒng)200與圖1中的系統(tǒng)的差異來描述系統(tǒng)200。

樣本可以以諸如水、緩沖溶液、培養(yǎng)基或反應(yīng)介質(zhì)之類的包含顆粒的液體介質(zhì)的形式來呈現(xiàn)。有利地，顆粒被固定到諸如顯微鏡載玻片之類的基板上。

可替換地，樣本可以以諸如瓊脂之類的包含正在討論的顆粒的固體介質(zhì)的形式來呈現(xiàn)。有利地，顆?？梢晕挥谠诮橘|(zhì)內(nèi)部或樣本的表面上。

可替換地，樣本可以以氣體介質(zhì)的形式來呈現(xiàn)，從而顆粒位于該介質(zhì)中或者優(yōu)選地固定到諸如顯微鏡載玻片之類的基板上。

待分析的顆粒p可以是生物顆粒、灰塵(例如污染物)或者甚至是介電材料顆粒。當(dāng)所述顆粒如上文中限定的那樣是透明的時，本發(fā)明是特別有利的。

在液體樣本的情況下，樣本可以被裝在由下層板131(例如傳統(tǒng)的顯微鏡載玻片)和上層板132(例如顯微鏡蓋玻片)豎直界定的分析室130中。分析室由密封件135水平界定。下層板和上層板對第一光源和第二光源的波長是透明的(見下文)。

有利地，根據(jù)本發(fā)明的分析系統(tǒng)包括用于容納包含感興趣顆粒的樣本的受監(jiān)視支承件(未示出)。

第一分束板175將激光器170發(fā)出的分析光束朝著樣本反射。在板175上的反射之后，沿光軸d使分析光束對準(zhǔn)。分析光束穿過第二二向色板147(其優(yōu)點(diǎn)在下文進(jìn)行描述)，然后到達(dá)第一光學(xué)系統(tǒng)140，最后到達(dá)樣本上，特別地到達(dá)感興趣顆粒p^*上。在第一光學(xué)系統(tǒng)140上游，分析光束是準(zhǔn)直激光束。

焦平面π0是與光軸d正交的平面，由第一光學(xué)系統(tǒng)140形成的分析激光束的束腰位于該焦平面中。在這種情況下，該平面πo與第一光學(xué)系統(tǒng)140的物方焦平面對應(yīng)。在圖2中示出的實(shí)施例中，假定顆粒、特別地為感興趣顆粒是在焦平面πo中被發(fā)現(xiàn)的。

與感興趣顆粒p^*交互過的分析光束中的至少一部分返回到第一光學(xué)系統(tǒng)140中。該經(jīng)背散射的分析光束穿過第一光學(xué)系統(tǒng)140、第二分束板147，然后穿過第一分束板175，以通過測量裝置180進(jìn)行分析。

這些測量裝置180實(shí)施對與感興趣顆粒交互過的分析光束的屬性的測量。特別地，這些測量裝置180可以包括光譜儀或圖像探測器，以執(zhí)行拉曼光譜測量或熒光測量。測量裝置可以包括聚焦裝置(未示出)，以將與感興趣顆粒交互過的分析光束聚焦到傳感器上。

位置控制路徑包括優(yōu)選地空間相干并且可能時間相干的第二光源110。優(yōu)選地，第一光源具有低光譜帶寬，例如小于200nm、或者甚至小于100nm或25nm。特別地，該光源可以為激光二極管或發(fā)光二極管。出于方便起見，光源發(fā)出的光束可以借助于待分析的樣本下面(第一光學(xué)系統(tǒng)140的相對側(cè)上)的光纖120來提供。必要時，光纖發(fā)出的光束受到光闌125的限制。第二光源發(fā)出的光束被稱為控制光束。

位置控制路徑還包括包含顯微鏡物鏡140和透鏡150(稱為管透鏡)的第二光學(xué)系統(tǒng)。

第二光學(xué)系統(tǒng)與第一光學(xué)系統(tǒng)共享顯微物鏡140。第一光學(xué)系統(tǒng)和第二光學(xué)系統(tǒng)部分融合。顯微物鏡140形成屬于分析路徑和位置控制路徑兩者的所謂的共享光學(xué)系統(tǒng)。該共享是永久的，從而可移除的偏轉(zhuǎn)鏡149可以被部分偏轉(zhuǎn)裝置或選擇性偏轉(zhuǎn)裝置所替換，在這種情況下，也可以被實(shí)施波長選擇性偏轉(zhuǎn)的第二二向色板147所替換。

第二光學(xué)系統(tǒng)可選地包括可位于物鏡前方或后方的光纖(未示出)。

在被感興趣顆粒p^*衍射后，控制光束穿過共享光學(xué)系統(tǒng)(顯微物鏡140)，然后被二向色板147反射。該光束然后在到達(dá)圖像傳感器160(例如，相機(jī)的ccd或cmos傳感器)之前穿過管透鏡150。

感興趣顆粒p^*位于焦平面πo中，在這種情況下，即位于顯微物鏡140的物方焦平面中。因此，被感興趣顆粒p^*衍射的光束通過顯微物鏡延伸到無限遠(yuǎn)處。管透鏡150用來將該光束聚焦到平面πi中。平面πi是焦平面πo經(jīng)第二光學(xué)系統(tǒng)(物鏡140和透鏡150)的圖像。這兩個平面通過物鏡和透鏡150共軛。

根據(jù)本發(fā)明，圖像傳感器160沒有位于該圖像平面πi中，而是相對于該平面偏移。圖像傳感器沿第二光學(xué)系統(tǒng)的光軸偏移。該偏移例如介于+1μm和200mm之間或-1μm和-200mm之間、例如介于+10μm和+5mm之間或-10μm和-5mm之間、或者介于+5μm和+1000μm之間、優(yōu)選地介于+10μm和+2000μm之間或者-10μm和-2000μm之間。

管透鏡150的光軸和物鏡140的光軸相融合(confondus)，從而板147僅使得該軸不能沿直線延伸。傳感器位于與所述光軸正交的平面中。其中，z為沿所述光軸的坐標(biāo)，z坐標(biāo)的原點(diǎn)位于平面πi中，z＝z表示圖像傳感器160的散焦距離。x軸和y軸采用z正交坐標(biāo)系統(tǒng)來限定。

圖像傳感器160采集感興趣顆粒的傳輸圖像。在圖像傳感器上形成的圖像是全息圖像，這只由于由顆粒所衍射的波和穿過樣本而不與樣本交互的參考波之間干涉的結(jié)果。

即使感興趣顆粒是透明顆粒，圖像傳感器160采集的圖像也使得能夠以間接方式控制感興趣顆粒的位置。在下文中公開了不同的控制示例。

在圖2中示出的實(shí)施例中，控制路徑和分析路徑通過二向色板147進(jìn)行波分復(fù)用。第一光源和第二光源具有不相交的光譜。例如，第二光源是光譜的中心在約450nm處的gainn激光二極管，而第一光源是在532nm處發(fā)光的倍頻yag激光器。二向色板147在450nm處將光反射到圖像傳感器160上，并且使得該光能夠在532nm處穿過。(如果測量裝置180由拉曼光譜儀形成，則選擇分束板175在532nm處反射光并使得更大的波長能夠通過。)

波分復(fù)用的優(yōu)點(diǎn)在于能夠?qū)崟r地并且在分析的同時確定感興趣顆粒的位置。這使得能夠利用時間常數(shù)非常低的反饋來控制分析激光束在感興趣顆粒上的位置。

可替換地，位置控制路徑和分析路徑是時間復(fù)用的。在第一時間間隔期間，通過光源110來控制感興趣顆粒的位置，因此光源170關(guān)閉。在第二時間間隔期間，關(guān)閉光源110，而打開光源170，并對顆粒進(jìn)行分析。

板147可以是半反射板，更特別地但是非窮盡地適于時間復(fù)用。

在所有情況下，感興趣顆粒并未相對于第一光學(xué)系統(tǒng)和第二光學(xué)系統(tǒng)在控制位置和分析位置之間移動。因此，可以同時或者在非常短的時間間隔內(nèi)執(zhí)行這兩個步驟。當(dāng)位置控制路徑和分析路徑相對于彼此固定時，可以達(dá)到該目的。

根據(jù)一替代性實(shí)施例(未示出)，圖像傳感器被固定在用于沿第二光學(xué)系統(tǒng)的光軸平移的平移設(shè)備上，以將該圖像傳感器定位在取決于物鏡140和透鏡150的光學(xué)屬性的最佳散焦距離處。

根據(jù)另一替代性實(shí)施例(未示出)，第一光源170發(fā)出非準(zhǔn)直光束。第一光學(xué)系統(tǒng)包括與物鏡140配合的透鏡以將聚焦光斑定位在焦平面π0中，該焦平面不一定是物鏡140的物方焦平面。在這種情況下，可以對管透鏡150的屬性進(jìn)行調(diào)整。

控制路徑和分析路徑可以置換，從而分束板147使位置控制光束偏轉(zhuǎn)，并反射與感興趣顆粒交互過的分析光束。

管透鏡150可以如圖2中示出的那樣被定位在位置控制路徑的傳感器160和分束板147之間，或者被定位在分束板147和顯微物鏡140之間。在這種情況下，管透鏡150和物鏡140由第一光學(xué)系統(tǒng)和第二光學(xué)系統(tǒng)共享，這需要調(diào)整剩余的第一光學(xué)系統(tǒng)。

在這種情況下，假設(shè)先驗(yàn)信息在樣本的顆粒的相對位置上是可用的。在定位顆粒后，從所定位的顆粒中選擇感興趣顆粒p^*用于分析。在下文中，假設(shè)感興趣顆粒被放置在通常在光軸上以及在焦平面中選取的目標(biāo)位置中。感興趣顆粒的位置可以隨時間而移位。本發(fā)明被設(shè)計成確定顆粒的位置是否已改變，以及必要時，設(shè)計成將感興趣顆粒放回到所述目標(biāo)位置。顆粒沿xy平面的位移將首先被檢查。

計算裝置201(例如處理器)接收在圖像傳感器160上形成的圖像。

計算裝置201使用該圖像通過數(shù)值傳播來計算從圖像傳感器的檢測表面的平面偏移的重建平面中的樣本的重建圖像、更特別的計算感興趣顆粒的重建圖像。以下描述將更簡單地陳述與相對于圖像傳感器平面的偏移相關(guān)聯(lián)的重建平面。換言之，通過計算所述重建圖像來仿真?zhèn)鞲衅飨鄬τ谄溆行恢玫钠啤?/p>

傳感器采集的圖像可以在應(yīng)用傳播算子前被標(biāo)準(zhǔn)化。也可以從所采集的圖像中提取該圖像的dc分量。

可以在sang-hyuklee等人發(fā)表的文章：標(biāo)題為“全息地捕獲的三維結(jié)構(gòu)的全息顯微術(shù)(holographicmicroscopyofholographicallytrappedthree-dimensionalstructures)”opticsexpress第15卷；4號,2007年2月19日，1505-1512頁中找到對數(shù)值傳播的圖像計算方法的描述。

例如，如果將瑞利-索末菲傳播函數(shù)寫為hz(r)，即：

其中：

z是圖像傳感器的“虛擬”位置和有效位置之間的距離，或者換言之是重建平面和圖像傳感器的平面之間的偏移，

r＝(x,y)是傳感器提供的圖像平面中的位置。

r²＝r²+z²，以及k＝2πn/λ是相對于傳播介質(zhì)的波數(shù)。

此處，距離z選擇成使得重建平面位于平面πi內(nèi)，或者(例如，根據(jù)傳感器的最小平移步長)大體上位于所述平面中。在任何情況下，與重建圖像相關(guān)聯(lián)的重建平面比圖像傳感器的平面更接近平面πi。

坐標(biāo)平面z中的波可以如下表達(dá)：

其中：

b(q)是b(r)的傅里葉變換，即衍射波在傳感器的有效位置處的強(qiáng)度(此處假設(shè)參考波的強(qiáng)度是常數(shù))，

h-z(q)是h-z(r)的傅里葉變換，以及

q是r在傅里葉變換中的對偶變量。

計算中間重建圖像，該中間重建圖像的每個像素的值通過復(fù)振幅a(r,zn)來限定。該圖像為復(fù)圖像，從而每個像素與具有實(shí)部和虛部的復(fù)數(shù)值相關(guān)聯(lián)。

重建圖像是根據(jù)該中間重建圖像建立的以呈現(xiàn)給用戶。重建圖像基于復(fù)振幅a(r,zn)來定義。重建圖像的每個像素可以通過復(fù)振幅的平方模|a(r,zn)|²來定義?？商鎿Q地，每個像素可以通過復(fù)振幅的虛部的平方來定義。

可以在重建圖像中容易地識別顆粒，即使它們是透明的。對于通過將圖像傳感器定位在平面πi中進(jìn)行仿真而是通過將傳感器有效地定位在所述平面中而獲得的真實(shí)圖像，不會是這種情況。

將重建圖像饋送到顯示屏202上。

處理器201可以執(zhí)行對重建圖像求閾值，從而該閾值例如通過以下來定義：

ith＝iav+3σ(3)

其中，iav和σ分別是重建圖像的強(qiáng)度的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。獲得如圖4a中示出的圖像?？梢酝ㄟ^將重建圖像在該點(diǎn)的強(qiáng)度與所述閾值進(jìn)行比較以驗(yàn)證顆粒出現(xiàn)在目標(biāo)位置。

可以通過輪廓檢測方法和形態(tài)濾波運(yùn)算(開、閉)對求閾值進(jìn)行補(bǔ)充。由于這些操作，可以從圖像中排除與顆粒不對應(yīng)的物體。此外，重建圖像因此可以以點(diǎn)的分布的形式來呈現(xiàn)，這些點(diǎn)中的每一個點(diǎn)與顆粒的中心對應(yīng)。圖4b中示出了該點(diǎn)分布。

經(jīng)上述處理的重建圖像的顯示使得用戶能夠容易地驗(yàn)證顆粒出現(xiàn)在期望的位置中。沒有任何顆粒接近目標(biāo)位置可以是由于以下事實(shí)：目標(biāo)位置變得與基板分離。顯示屏可以顯示諸如聚焦圖案之類的符號以快速地將感興趣顆粒沿x軸和y軸的位置與目標(biāo)進(jìn)行比較。

如本文中的情況，對感興趣顆粒的位置控制可以包括顯示與圖像平面πi相關(guān)聯(lián)的重建圖像。額外地或者可替換地，該控制包括提供有關(guān)感興趣顆粒在期望的位置中出現(xiàn)或不出現(xiàn)的信息、和/或提供有關(guān)感興趣顆粒相對于其期望位置的位移的信息。

圖3以簡圖的方式示出了根據(jù)本發(fā)明的分析系統(tǒng)300的第二實(shí)施例。將僅針對圖3相對于圖2的差異來描述圖3。

計算裝置201和屏幕202被諸如處理器之類的計算裝置301和用于移動容納樣本的支承件311的位移裝置312所替換。

位移裝置312例如包括用于沿x軸和y軸平移的平移臺，以及在必要時包括用于沿z軸平移的平移臺。

將通過傳感器160檢測的圖像提供給形成用于計算位移命令的裝置的處理器301。將該位移命令饋送給位移裝置312。位移命令根據(jù)感興趣顆粒相對于目標(biāo)位置的測量到的位移來確定，并且用來將所述顆粒重定位在目標(biāo)位置。

處理器301執(zhí)行對一系列重建圖像的計算，該組重建圖像中的每一個重建圖像同圖像傳感器的“虛擬”位置與其有效位置之間的預(yù)定偏移相關(guān)聯(lián)，或者換言之同重建平面與圖像傳感器的平面之間的預(yù)定偏移相關(guān)聯(lián)。重建平面分布在容納感興趣顆粒的平面通過第二光學(xué)系統(tǒng)的圖像的期望位置的兩側(cè)上(在這種情況下，分布在圖像平面πi的兩側(cè)上)。例如，如果給圖像傳感器的利用0.25μm的步長在平面π0周圍+/-5μm物方空間中的位移使用100的橫向放大率，則該組重建平面利用對應(yīng)的2.5μm的步長來掃描平面πi周圍+/-50μm的間隔。

根據(jù)上文中所解釋的算法基于圖像傳感器采集的相同圖像來計算每個重建圖像。所述重建圖像是針對圖像傳感器的不同位置z1，…，zn觀察到的圖像。獲得了一系列重建圖像i1，…，in。

圖5示出了基于圖像傳感器采集的圖像i0獲得的一系列重建圖像i1，…，in。

處理器使用所述重建圖像來確定感興趣顆粒相對于其目標(biāo)位置沿z軸、然后沿x軸及y軸的位移。該目標(biāo)位置例如與分析激光束的聚焦點(diǎn)對應(yīng)。

首先，對用于確定感興趣顆粒沿z軸的所述位移的步驟進(jìn)行描述。

根據(jù)重建圖像沿z軸的位置，尋找對重建圖像的參數(shù)的變化進(jìn)行描述的函數(shù)的奇點(diǎn)?？商鎿Q地，該函數(shù)取決于被引入第二光學(xué)系統(tǒng)的物方平面的重建平面的位置。

有利地，該參數(shù)表示重建圖像的對比度，例如在預(yù)定區(qū)域中的梯度的標(biāo)準(zhǔn)差和均值。奇點(diǎn)有利地是最大值，然而它也可以是拐點(diǎn)。該奇點(diǎn)與位于容納顆粒、更特別地感興趣顆粒的圖像平面的平面中的重建平面對應(yīng)。因此，通過測量容納所述顆粒的圖像平面的位移來確定顆粒沿z軸的位移。

有利地，通過引進(jìn)第二光學(xué)系統(tǒng)的物理參數(shù)(例如，第二光學(xué)系統(tǒng)的放大率)，直接計算感興趣顆粒相對于目標(biāo)位置沿z軸在物方空間中的位移。

圖6示出了根據(jù)引入圖像傳感器的平面和重建平面之間的物方空間的偏移給出該系列圖像的標(biāo)準(zhǔn)差的曲線。

在這種情況下，目標(biāo)位置的平面是與第二光學(xué)系統(tǒng)的物方空間中的平面π0對應(yīng)的平面πi。該平面近似位于z′＝40μm處，其中z′為引入圖像傳感器的平面和重建平面之間的所述物方空間的偏移。

針對離散偏移值z′n獲得標(biāo)準(zhǔn)差值，并且例如使用樣條函數(shù)對所述標(biāo)準(zhǔn)差值作插值處理以根據(jù)偏移z’獲得標(biāo)準(zhǔn)差曲線c(z’)。確定z′foc＝argmax(c(z))，然后將其與z′foc的設(shè)定值進(jìn)行比較以計算在第二光學(xué)系統(tǒng)的物方空間中的位移。

可替換地，首先確定在圖像空間中的位移，然后計算在第二光學(xué)系統(tǒng)的物方空間中的對應(yīng)位移。

z′foc的值不一定與有效重建的圖像對應(yīng)。其可以僅是重建平面的相對粗略的采樣間隔，這由于待重建的圖像的數(shù)量少而需要少量的計算。

可替換地，不執(zhí)行任何插值處理，以使對z′foc的確定與在一系列重建圖像中選擇最接近聚焦條件的圖像對應(yīng)。該圖像為與顆粒通過第二光學(xué)系統(tǒng)的圖像平面最接近的圖像。所述圖像被稱為聚焦圖像ifoc。

可替換地，使用第一采樣間隔和第一系列重建圖像執(zhí)行對沿z軸的位置的第一近似確定，然后使用更小的采樣間隔和以之前確定的近似位置為中心的第二系列重建圖像來細(xì)化所述確定。

優(yōu)選地，使用以感興趣顆粒為中心的感興趣區(qū)域的一系列重建圖像來確定感興趣顆粒沿z軸的位置。事實(shí)上，這些顆粒不一定全部處于與光軸正交的同一平面中。為此，可以計算第一系列圖像、可以選擇聚焦圖像ifoc并使用該聚焦圖像來確定感興趣顆粒沿x軸和y軸的近似位置，然后可以使用以感興趣顆粒為中心的一系列重建圖像來精確地確定感興趣顆粒沿z軸的位置。

感興趣區(qū)域的大小可以大于或小于待分析顆粒的區(qū)域的大小。

圖7以簡圖的方式示出了一系列圖像i1，…，in和以感興趣顆粒p為中心的感興趣區(qū)域的一系列重建圖像b1，…，bn。

圖8示出了根據(jù)該系列圖像的排列而給出感興趣區(qū)域的一系列重建圖像中的標(biāo)準(zhǔn)差的曲線。與有關(guān)聚焦圖像ifoc的感興趣區(qū)域相關(guān)聯(lián)，聚焦圖像與整個樣本相關(guān)聯(lián)。與感興趣區(qū)域的具有最大標(biāo)準(zhǔn)差的重建圖像對應(yīng)。應(yīng)該理解的是，當(dāng)對比度測量被限制到感興趣區(qū)域時，關(guān)于聚焦圖像過去是最佳的第一選擇不再是最佳的。

本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將在專利申請fr1460947中獲得關(guān)于該定位的更詳細(xì)的信息。物方空間中的偏移和圖像空間中的偏移通過簡單的放大率相關(guān)聯(lián)。

一旦計算了沿z軸的位移，則可以估算感興趣顆粒沿xy平面的位移。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，在與沿z軸事先確定的位移校正的平面πi的位置對應(yīng)的坐標(biāo)處使用與重建平面相關(guān)聯(lián)的重建圖像。該圖像可以選自一系列事先重建的圖像，或者該圖像可以是明確重建的圖像(例如，如果使用插值法確定了沿z軸的位移)。

處理器301將該重建圖像(如參照圖2所描述的那樣潛在地進(jìn)行閾值化和濾波處理)與控制圖像進(jìn)行比較，其中，每個顆粒呈現(xiàn)在其目標(biāo)位置?？刂茍D像在樣本中形成顆粒的分布規(guī)劃?？梢砸耘c重建圖像相同的方式來初步確定控制圖像，然后將該控制圖像與重建圖像進(jìn)行比較。

對位移的估算可以實(shí)施圖像配準(zhǔn)方法，例如控制圖像和重建圖像之間的互相關(guān)法、或者所述圖像之間的均方根偏差的最小化法或者所述圖像之間的互信息的最小化法。

因此，最終獲得沿z軸的軸向位移和沿xy平面的橫向位移。使用所述位移，處理器301制定饋送給位移裝置的位移命令以將感興趣顆粒置于標(biāo)目位置。

因此，可以利用反饋來對分析激光束在感興趣顆粒上的聚焦光斑進(jìn)行控制。

因此，由于使用簡單的圖像比較來確定顆粒的橫向位移，所以本發(fā)明繞過對顆粒的位置的明確確定。

可替換地，可以明確確定感興趣顆粒的位置以用于與目標(biāo)位置進(jìn)行比較。

優(yōu)選地，重建圖像包括包含感興趣顆粒在內(nèi)的多個顆粒。對感興趣顆粒周圍的多個顆粒的位置進(jìn)行檢測以確保觀察到正確的感興趣顆粒。

現(xiàn)在，該描述將參照圖9公開用于直接根據(jù)圖像傳感器采集的散焦圖像來確定顆粒在兩個時刻之間的位移的方法的步驟。該方法在根據(jù)本發(fā)明的設(shè)置有用于沿x軸和y軸平移的平移臺的分析系統(tǒng)內(nèi)被實(shí)施。

在步驟910中，通過控制路徑在第一時刻采集樣本的初始圖像i0。然后基于圖像i0重建多個重建圖像i1，…，in(步驟920)，以及選擇聚焦圖像ifoc，所述聚焦圖像通過第二光學(xué)系統(tǒng)與容納感興趣顆粒的圖像平面的位置對應(yīng)(步驟930)。然后，如上文中描述的那樣對聚焦圖像ifoc執(zhí)行求閾值運(yùn)算，以及在必要時施加形態(tài)濾波器(步驟940)。在步驟940結(jié)束時，獲得樣本的以光軸為中心、包括感興趣顆粒和多個鄰近顆粒的第一特征圖像。將該圖像存儲在暫存器中。

稍后，重復(fù)進(jìn)行步驟910至940(在該圖中具有附圖標(biāo)記910’至940’的步驟)，并獲得樣本的第二特征圖像。

因此，在步驟950中，通過將第一特征圖像與第二特征圖像進(jìn)行比較來估算感興趣顆粒在第一時刻和第二時刻之間的位移。

如上文中所述，第一特征圖像形成控制圖像.

位移的估算例如實(shí)施互相關(guān)計算，并且如果相關(guān)函數(shù)的最大值小于預(yù)定閾值，則可能生成警告。事實(shí)上，這可已意味著大大干擾了在樣本中的在感興趣顆粒附近的顆粒的分布。

在步驟960中，使樣本沿與在前一步驟中確定的位移矢量正交的矢量平移。

使用新的第二特征圖像，可以檢查新的位移矢量為零矢量(步驟970)?；蛘唑?yàn)證事先計算的位移矢量，或者生成誤差信號并要求操作者選擇新的感興趣顆粒。

上述驗(yàn)證的位移矢量用來控制感興趣顆粒的位置，特別地通過對平移臺進(jìn)行控制利用反饋來控制感興趣顆粒在xy平面中的位置。

換言之，本發(fā)明還包括用于在根據(jù)本發(fā)明的分析系統(tǒng)中對感興趣顆粒的位置進(jìn)行控制的方法，以使：

-在第一時刻，采集樣本的第一圖像，通過數(shù)值傳播根據(jù)該第一圖像推導(dǎo)出所述樣本的、與重建平面相對于圖像平面的不同偏移值對應(yīng)的第一系列重建圖像，并且從所述第一系列圖像中選擇具有最大對比度的圖像作為樣本的第一特征圖像；

-在第二時刻，采集樣本的第二圖像，通過數(shù)值傳播根據(jù)該第二圖像推導(dǎo)出所述樣本的、與重建平面相對于圖像平面的不同偏移值對應(yīng)的第二系列重建圖像，并且從所述第二系列圖像中選擇具有最大對比度的圖像作為樣本的第二特征圖像；

-基于第一特征圖像與第二特征圖像來估算感興趣顆粒在第一時刻和第二時刻之間的位移。

因此，根據(jù)本發(fā)明的分析系統(tǒng)包括：

-計算裝置，用于基于第一(以及第二)采集圖像通過數(shù)值傳播來計算所述樣本的、與重建平面相對于圖像平面的不同偏移值對應(yīng)的第一系列(以及第二系列)重建圖像；

-選擇裝置，用于從第一(以及第二)系列重建圖像中選擇具有最大對比度的圖像作為樣本的第一(以及第二)特征圖像；

-估算裝置，用于基于第一特征圖像與第二特征圖像來估算感興趣顆粒在第一時刻和第二時刻之間的位移。

根據(jù)最后的實(shí)施例(未示出)，計算至少一個重建圖像的步驟被繞過。

事實(shí)上，可以以簡單的方式通過將圖像傳感器采集的散焦圖像與參考圖像進(jìn)行比較來識別透明顆粒的位移。該比較可以使用計算裝置來執(zhí)行?？商鎿Q地，將通過傳感器直接采集的圖像顯示在屏幕上，以使當(dāng)透明顆粒移動時，用戶識別到所顯示的圖像的改變。因此，可以確保透明樣本的感興趣點(diǎn)處于正確且期望的位置中，所述位置特別地為分析光束的聚焦點(diǎn)。在分析裝置測量所需的時間段后優(yōu)選地實(shí)施該驗(yàn)證。

該實(shí)施例使得能夠繞過重建圖像計算步驟。例如在將感興趣點(diǎn)定位分析光束上之前或之后，對圖像傳感器采集的散焦圖像的簡單比較用來檢測感興趣點(diǎn)是否已經(jīng)被分析光束移動或損壞。上述操作通過構(gòu)成了測量有效性測試，該測量有效性測試易于通過簡單地使用提供位于分析光束的聚焦點(diǎn)的平面的散焦圖像的檢測器來實(shí)施。

本發(fā)明不限于所公開的示例，在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下可以設(shè)想多種替代方案。特別地，圖2和圖3中的實(shí)施例可以進(jìn)行組合。圖2中的分析系統(tǒng)還包括可以通過人工操作的輪來移動的用于樣本的支承件，以使得將感興趣顆粒人工地重新定位在目標(biāo)位置。