本發(fā)明涉及的是生物分析技術(shù)和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及一種測(cè)定過(guò)氧化物酶活性的電泳滴定方法。
背景技術(shù)：
酶分析在臨床醫(yī)藥學(xué)(abraham,e.c.；huff,t.a.；cope,n.d.；wilson,j.b.；bramsomeelisa,,e.d.jr.；huisman,t.h.j.diabetes1978,27,931–937.)生物學(xué)(tannu,n.s.；hemby,s.e.natureprotocols2006,1,1732-1942.)和藥物篩選(li,juan；wu,ling-jie；guo,shan-shan；fu,hua-e；chen,guo-nan；yang,huang-hao,nanoscale,2013,5,619-623.)領(lǐng)域中有著重要的作用。傳統(tǒng)檢測(cè)方法一般基于檢測(cè)酶反應(yīng)體系中底物減少和產(chǎn)物生成來(lái)進(jìn)行催化速率，活性，米氏常數(shù)的測(cè)定。目前已有很多方法可以用于酶檢測(cè)，例如質(zhì)譜(northen,tr；lee,jc；hoang,l；raymond,j；hwang,dr；yannone,sm；wong,ch；siuzdak,g,proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica,2008,105,3678-3683.),電泳electrophoresis(yfchen,llxu,wwzhao,lpguo,lyang,anal.chem.,2012,84,2961-2967.),液相色譜(lahoz,a；donato,mt；castell,jv；gomez-lechon,mj,currentdrugmetabolism,2008,9,12-19.)和電化學(xué)方法(bernhardt,paulv.chem.com.,2011,47,1663-1673.)以及酶聯(lián)免疫檢測(cè)elisa(ciaccafava,a；infossi,p；ilbert,m；guiral,m；lecomte,s；giudici-orticoni,mt；lojou,e,angewandtechemie-internationaledition,2012,51,953-956.)。
過(guò)氧化物酶是一類氧化還原酶,能催化很多反應(yīng)。過(guò)氧化物酶是以過(guò)氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶。主要存在于細(xì)胞的過(guò)氧化物酶體中，以鐵卟啉為輔基，可催化過(guò)氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過(guò)氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。而對(duì)于過(guò)氧化物酶的測(cè)定，常用的方法是用三甲基聯(lián)苯胺作為氫離子供體通過(guò)比色法測(cè)定辣根過(guò)氧化物酶的活性(volkerherzoga；h.dariushfahimia,analyticalbiochemistry,october1973,554–562.)，也有以對(duì)氨基苯酚為底物通過(guò)測(cè)定反應(yīng)前后電導(dǎo)率變化來(lái)測(cè)定過(guò)氧化物酶的電化學(xué)方法(weisuna；kuijiao,analyticachimicaacta,434,2001,43–50.)。以上這些方法有很多優(yōu)點(diǎn)，但是同時(shí)面臨一些不足，例如通量低，成本高以及樣品消耗量大等等。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明提供了一種電泳滴定方法(movingreactionboundaryelectrophoresistitration,mrbet)，具體為一種測(cè)定過(guò)氧化物酶活性的電泳滴定方法。本發(fā)明進(jìn)行了創(chuàng)新性的理論和技術(shù)發(fā)展，成功實(shí)現(xiàn)了過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
本發(fā)明涉及一種測(cè)定過(guò)氧化物酶活性的電泳滴定方法，所述方法包括以下步驟：
a、將芯片的通道部分灌滿凝膠，陽(yáng)極池中注入鹽酸溶液與背景電解質(zhì)溶液的混合溶液a，陰極池中注入化學(xué)發(fā)光底液與背景電解質(zhì)溶液的混合溶液b；
b、將過(guò)氧化物酶溶液注入陰極池中，使之催化化學(xué)發(fā)光底液反應(yīng)生成激發(fā)態(tài)魯米諾陰離子l*；
c、酶催化反應(yīng)穩(wěn)定后，施加電場(chǎng)，使陰極池中生成的激發(fā)態(tài)魯米諾陰離子l*與陽(yáng)極池中的氫離子h+形成mrb,生成的mrb移向陽(yáng)極；
d、根據(jù)mrb移動(dòng)速率與過(guò)氧化物酶活性存在的函數(shù)關(guān)系，測(cè)得過(guò)氧化物酶活性指標(biāo)。
優(yōu)選地，步驟a中，所述凝膠為瓊脂糖凝膠，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％～2％。
優(yōu)選地，步驟a中，所述凝膠中含有背景電解質(zhì)溶液。
優(yōu)選地，步驟a中，所述背景電解質(zhì)溶液為離子強(qiáng)度為20mmol/l～250mmol/l的氯化鈉或者氯化鉀溶液。
優(yōu)選地，所述凝膠中的背景電解質(zhì)溶液的離子強(qiáng)度與混合溶液a離子強(qiáng)度相同。
優(yōu)選地，所述凝膠中的背景電解質(zhì)溶液的離子強(qiáng)度與陰極池中背景電解質(zhì)溶液的離子強(qiáng)度相同。
步驟a中，陽(yáng)極池中的電解液是鹽酸和離子強(qiáng)度為20mmol/l～250mmol/l的氯化鈉或者氯化鉀混合溶液，所述陽(yáng)極池中的電解液的離子強(qiáng)度和凝膠中的背景電解質(zhì)溶液的離子強(qiáng)度相同；所述步驟b中，陰極池中的電解液為離子強(qiáng)度為20mmol/l～250mmol/l的氯化鈉或者氯化鉀溶液，所述陰極池中的電解液的離子強(qiáng)度和所述凝膠中的背景電解質(zhì)溶液的離子強(qiáng)度相同。
優(yōu)選地，步驟c中，所述施加的電場(chǎng)為10v/mm～15v/mm。
優(yōu)選地，步驟d中，所述過(guò)氧化物酶活性指標(biāo)包括酶活性，酶促反應(yīng)速率，最大反應(yīng)速率，催化常數(shù)。
優(yōu)選地，所述酶活性的計(jì)算方程式為：
所述酶的比活性的計(jì)算方程式為：
所述酶促反應(yīng)速率計(jì)算方程式為：
所述最大反應(yīng)速率和米氏常數(shù)的計(jì)算方程式為：
調(diào)整底物h2o2的濃度，根據(jù)不同底物濃度情況下測(cè)出vmrb，可以得到vmax與km。
所述催化常數(shù)計(jì)算方程式為：
其中，上述方程式中，cl*和vl*分別是激發(fā)態(tài)魯米諾陰離子的濃度(mol/l)和遷移速率(m/s),ch+和vh+分別是氫離子的濃度(mol/l)和遷移速率(m/s)；vmrb,為mrb的移動(dòng)速率(m/s)；ven和δten分別是酶催化反應(yīng)體系的溶液體積(ml)和酶促反應(yīng)時(shí)間(s)；cen是陰極池中酶促反應(yīng)池中的酶濃度(mg/ml)δt是施加電場(chǎng)時(shí)間(s)；cl,cu是底物的和瞬時(shí)濃度(mg/ml)；[et]是酶的濃度(mg/ml)。
所述mrbet中函數(shù)推導(dǎo)過(guò)程如下：
mrb移動(dòng)速率為：
l1是t1時(shí)間mrb移動(dòng)的距離，l2是t2時(shí)間mrb移動(dòng)的距離。t1為第一次施加電場(chǎng)的時(shí)間，t2為第二次施加電場(chǎng)的的時(shí)間。
由激發(fā)態(tài)魯米諾陰離子l*與氫離子h+形成的mrb移動(dòng)速率為：
其中cl*andvl*分別是激發(fā)態(tài)魯米諾陰離子的濃度(mol/l)和遷移速率(m/s),ch+和vh+分別是氫離子的濃度(mol/l)和遷移速率(m/s)。所以，激發(fā)態(tài)魯米諾陰離子的濃度可以被簡(jiǎn)單地表示成：
假設(shè)經(jīng)過(guò)酶促反應(yīng)所有的底物(魯米諾)都轉(zhuǎn)化生成了產(chǎn)物(激發(fā)態(tài)魯米諾陰離子l*),那么酶促反應(yīng)池中底物濃度可以表示成：
cl,in和cl,cu分別是底物(魯米諾)的初始濃度和瞬時(shí)濃度。
根據(jù)酶活性的定義(1u＝1μmol/min),可以得到以下酶活性表達(dá)式：
將表達(dá)式(4)代入(5)，得到：
ven和δten分別是陰極池中酶催化反應(yīng)體系的溶液體積和酶促反應(yīng)時(shí)間。因此，酶的比活性可以表示為：
其中，cen指的是陰極池中酶促反應(yīng)池中的酶濃度(mg/ml)。
酶促反應(yīng)速率vrate被定義為
δt是酶催化反應(yīng)時(shí)間(s)；δc是底物濃度變化。
將表達(dá)式(3)代入表達(dá)式(8)中,式(3)中的cl*對(duì)應(yīng)式(8)中的δc，可以得到
在表達(dá)式(9)中,mrb移動(dòng)速率可以從表達(dá)式(1)獲得。
在酶促動(dòng)力學(xué)中，米氏方程如下：
vrate是酶促反應(yīng)速率，km是米氏常數(shù),vmax是最大酶促反應(yīng)速率,[h2o2]是底物h2o2的濃度.將表達(dá)式(9)代入表達(dá)式(10),可以得到：
由于在反應(yīng)中，
在酶反應(yīng)體系中，米氏方程可以表示為：
將表達(dá)式(9)以及[h2o2]＝2cl,cu代入表達(dá)式(13),可以得到
調(diào)整底物h2o2的濃度，根據(jù)不同底物濃度情況下測(cè)出vmrb，可以得到vmax與km。
且根據(jù)：
vmax＝kcat[et](15)
此處,[et]是反應(yīng)體系中酶的總濃度(mg/ml)，結(jié)合表達(dá)式(14)和(15)，可以得到：
表達(dá)式(16)是酶催化常數(shù)通過(guò)移動(dòng)反應(yīng)界面計(jì)算的表達(dá)式。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
1、該方法能夠有效地檢測(cè)過(guò)各種過(guò)氧化物酶的活性；
2、該方法速度快，滴定過(guò)程能在20秒內(nèi)完成；
3、該方法僅需要暗室環(huán)境下可視化，無(wú)需復(fù)雜光學(xué)檢測(cè)儀器設(shè)備。
附圖說(shuō)明
通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：
圖1為本發(fā)明的mrbet示意圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1
在本實(shí)施例中，采用電泳滴定方法測(cè)定辣根過(guò)氧化物酶活性，所述的電泳滴定方法如圖1所示。首先將芯片的通道部分灌滿凝膠,陽(yáng)極池中注入鹽酸溶液與背景電解質(zhì)溶液的混合溶液a，陰極池中注入化學(xué)發(fā)光底液與與背景電解質(zhì)溶液的混合溶液b；然后立即將辣根過(guò)氧化酶溶液注入陰極池中，使之催化化學(xué)發(fā)光底液反應(yīng)生成發(fā)出藍(lán)色熒光的激發(fā)態(tài)魯米諾陰離子l*；酶催化反應(yīng)穩(wěn)定一段時(shí)間后后，施加電壓，使得陰極池中生成的激發(fā)態(tài)魯米諾陰離子l*向陽(yáng)極移動(dòng)并與陽(yáng)極池中向陰極方向移動(dòng)的氫離子h+形成mrb,mrb移向陽(yáng)極；滴定時(shí)，藍(lán)色熒光即標(biāo)示了界面的位置，可進(jìn)行可視化觀測(cè)；之后，利用mrb界面移動(dòng)速率與魯米諾濃度之間的關(guān)系，根據(jù)一系列推導(dǎo)公式，可以計(jì)算得出酶促反應(yīng)速率，辣根過(guò)氧化物酶的酶活性，米氏常數(shù)，最大酶促反應(yīng)速率，催化常數(shù)。
所述mrb界面移動(dòng)速率與魯米諾濃度之間的關(guān)系為
l1是t1時(shí)間mrb移動(dòng)的距離，l2是t2時(shí)間mrb移動(dòng)的距離。t1為第一次施加電場(chǎng)的時(shí)間，t2為第二次施加電場(chǎng)的的時(shí)間。
所述酶活性的計(jì)算公式為：
venandδten分別是酶催化反應(yīng)體系的溶液體積和酶促反應(yīng)時(shí)間。
所述酶的比活性計(jì)算公式為：
cen指的是酶促反應(yīng)池中的酶濃度(mg/ml)。
所述酶促反應(yīng)速率計(jì)算公式為：
改變底物過(guò)氧化氫濃度，得出不同條件下mrb界面移動(dòng)速率。
按照表達(dá)式(3)計(jì)算得出不同底物濃度條件下激發(fā)態(tài)魯米諾的濃度。
將計(jì)算得出的不同底物濃度條件下激發(fā)態(tài)魯米諾的濃度帶入表達(dá)式(13)中，可以得到最大酶促反應(yīng)速率與米氏常數(shù)的關(guān)系式：
調(diào)整底物h2o2的濃度，根據(jù)不同底物濃度情況下測(cè)出vmrb，可以得到vmax與km。
又由以下公式,
vmax＝kcat[et](15)
[et]表示酶的濃度。因此，結(jié)合表達(dá)式(14)和(15)，得到酶的催化常數(shù)kcat，
所述mrbet滴定中采用的凝膠為瓊脂糖凝膠，重量分?jǐn)?shù)為1％～2％。
所述凝膠中含有背景電解質(zhì)溶液。
所述背景電解質(zhì)溶液為離子強(qiáng)度從20mmol/l到250mmol/l的氯化鈉或者氯化鉀溶液。
所述凝膠中的背景電解質(zhì)溶液的離子強(qiáng)度與混合溶液a離子強(qiáng)度相同。
所述凝膠中的背景電解質(zhì)溶液的離子強(qiáng)度與陰極池中背景電解質(zhì)溶液的離子強(qiáng)度相同。
本實(shí)施例測(cè)得的辣根過(guò)氧化物酶活性指標(biāo)結(jié)果為：最大反應(yīng)速率：3.1×10-4mm/s；米氏常數(shù)：3.15×10-4，催化常數(shù)：619。
本實(shí)施例的辣根過(guò)氧化物酶活性采用傳統(tǒng)的熒光酶標(biāo)儀方法進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果為：最大反應(yīng)速率：3.15×10-4mm/s；米氏常數(shù)：3.09×10-4，催化常數(shù)：615。與本實(shí)施例測(cè)定的結(jié)果一致，說(shuō)明本發(fā)明方法的可靠性。
綜上所述，本發(fā)明所述的測(cè)定過(guò)氧化物酶活性的電泳滴定方法，能夠有效地檢測(cè)過(guò)各種過(guò)氧化物酶的活性；該方法速度快，滴定過(guò)程能在20秒內(nèi)完成；該方法僅需要暗室環(huán)境下可視化，無(wú)需復(fù)雜光學(xué)檢測(cè)儀器設(shè)備。
以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。