本發(fā)明涉及一種中藥制劑中農(nóng)藥殘留物質(zhì)的檢測方法，特別涉及一種檢測益心復(fù)脈顆粒中74種農(nóng)殘的方法。
背景技術(shù)：
藥物首要的質(zhì)量特征是安全性。中藥的安全性除了自身的物質(zhì)基礎(chǔ)影響外，就是生長、加工、儲存、生產(chǎn)等環(huán)節(jié)中引入的外來有害物質(zhì)，殘留農(nóng)藥就是其中之一。所謂農(nóng)藥殘留：指受生長環(huán)境的影響或者在中藥種植、加工、貯藏過程中使用農(nóng)藥后，殘留在藥用部位中的農(nóng)藥母體以及有毒理學(xué)意義的特殊衍生物，如降解或轉(zhuǎn)化產(chǎn)物、代謝物以及工業(yè)雜質(zhì)等。以農(nóng)藥殘留為代表的外源性有害殘留物是影響中藥質(zhì)量及安全性的重要因素，已成為制約中藥走向國際市場的瓶頸之一，嚴(yán)重滯后了我國中藥材現(xiàn)代化、國際化的步伐。因此，為了保證藥品的安全性，必須對農(nóng)藥殘留的檢測和控制予以足夠的重視。
益心復(fù)脈顆粒是天津天士力(遼寧)制藥有限責(zé)任公司出品的藥品，其功能主治為益氣養(yǎng)陰，活血復(fù)脈；用于氣陰兩虛，心血內(nèi)阻，胸痹心痛，胸悶不舒，心悸脈結(jié)代。具有載藥量高、起效快、無異味、攜帶方便等特性。益心復(fù)脈顆粒是由生曬參、黃芪、麥冬、五味子、丹參、川芎6味藥材組成的復(fù)方制劑，其中
生曬參：具有大補(bǔ)元?dú)?，益血，養(yǎng)心安神的作用。生曬參能提高腦、體力活動能力和免疫功能，增強(qiáng)抗應(yīng)激、抗疲勞、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、益心、復(fù)脈、安神生津、補(bǔ)肺健脾。
黃芪：有補(bǔ)氣升陽、生血行滯之力，現(xiàn)在藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪還可清除氧自由基，減輕機(jī)體脂質(zhì)過氧化損傷。
麥冬：具有甘寒清潤，善清心肺之熱而養(yǎng)陰除煩，兼可清潤胃腸而止渴潤燥?？箤?shí)驗性心律失常、增加冠脈流量。
五味子：是一種具有辛、甘、酸、苦、咸五種藥性。選用傳統(tǒng)正品北五味入藥，品質(zhì)優(yōu)良。收斂固澀，益氣生津，補(bǔ)腎寧心。用于久嗽虛喘，夢遺滑精，遺尿尿頻，久瀉不止，自汗，盜汗，津傷口渴，短氣脈虛，內(nèi)熱消渴，心悸失眠。
丹參：有活血祛瘀之功，不僅可以抑制血小板聚集，抑制血栓形成而且所含丹參素還可抑制膽固醇的合成、抗細(xì)胞氧化。
川芎：活血行氣，祛風(fēng)止痛。可提高血小板中camp含量，降低txa2活性；降低血小板表面活性、抑制血小板聚集、使已聚集血小板解聚。
益心復(fù)脈顆粒的藥物活性成分很多，主要包括：黃芪甲苷，川芎嗪，三七皂苷，丹參酮等。
本發(fā)明意在通過在原有質(zhì)量控制的基礎(chǔ)上，增加農(nóng)藥殘留的檢測。
中藥之所以會受到農(nóng)藥殘留的污染，一方面是藥材在生長過程中從環(huán)境如土壤、水源、空氣中攝入，另一個方面是農(nóng)藥的不合理使用引起的，如過量使用化學(xué)農(nóng)藥或使用已禁用的農(nóng)藥等。此外，為了延長儲存時間，中藥材多噴撒農(nóng)藥或采用農(nóng)藥熏蒸以達(dá)到防蟲、防霉的目的。另外，炮制加工過程中輔料也是引入農(nóng)藥污染的途徑之一。
中藥殘留的檢測方法，比較有代表性的是《中國藥典》2005年版中出現(xiàn)的對單味中藥中農(nóng)藥殘留的檢測，單味中藥有黃芪和甘草等，涉及的檢測內(nèi)容包括檢測有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留、有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留。方法是氣相色譜法，氣相色譜法常用的檢測器有氮磷檢測器(npd)、氫火焰離子化檢測器(fid)、電子捕獲檢測器(ecd)和火焰光度檢測器(fpd)。在多農(nóng)殘分析中，由于農(nóng)藥種類多、理化性質(zhì)差異較大，普通氣相檢測器多具有針對性(如含磷化合物可采用npd和fpd檢測器)，難以滿足不同元素組成、不同極性的農(nóng)殘檢測。此外，常規(guī)檢測器抗基質(zhì)干擾能力弱，對檢測結(jié)果缺乏準(zhǔn)確判斷，特別是假陽性結(jié)果難以排除。因此，針對復(fù)雜基質(zhì)中多農(nóng)殘檢測，一般推薦采用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。
氣相色譜串聯(lián)-質(zhì)譜法對農(nóng)藥殘留的檢測，涉及的范圍還主要是蔬菜、水果、單味的中藥和土壤等，該方法中對樣品的前處理包括對樣品的提取和凈化，其中提取所用的試劑多為乙腈、乙酸乙酯和丙酮，至今沒有見到采用該方法對中藥復(fù)方制劑的農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測的報道。
本發(fā)明采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法檢測益心復(fù)脈顆粒中74種農(nóng)殘的方法，該方法靈敏度高、準(zhǔn)確、可靠。通過本發(fā)明的檢測方法可以更加嚴(yán)格的控制產(chǎn)品質(zhì)量，確保益心復(fù)脈顆粒的品質(zhì)和提高安全性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供的一種氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法檢測益心復(fù)脈顆粒中74種農(nóng)殘的方法，包括以下步驟：
1)供試品溶液的制備；
取益心復(fù)脈顆粒，加入水使溶解，再加入正己烷，超聲提取，隨后加入氯化鈉和醋酸鈉混勻，離心得到上清液，水浴旋蒸至近干，用丙酮復(fù)溶，加入無水硫酸鎂、硅酸鎂吸附劑和c18，離心，得到上清供試品溶液。
2)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備
標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：取農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品10mg于10ml量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1.0g/l的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于4℃冰箱中備用；
混合儲備溶液：分別精密移取一定體積的各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10ml量瓶中，用丙酮稀釋定容，配制成各農(nóng)藥組分質(zhì)量濃度均為10.0mg/l的混合儲備溶液，于-20℃冰箱中保存；(說明，此部分所述混合儲備溶液為74種農(nóng)藥對照品的混合物，各農(nóng)藥的濃度為10.0mg/l，下同)
混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：向10ml量瓶中加入適量內(nèi)標(biāo)溶液及混合儲備溶液，用丙酮稀釋定容，得到質(zhì)量濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.25μg/l的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；
基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：按照供試品溶液的步驟提取、凈化不含目標(biāo)化合物的“空白”樣品，以凈化液作為溶劑，將混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中的丙酮用凈化液替換，其余步驟同上，最終得到基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；
對照品為敵敵畏、四氯硝基苯、二苯胺、殺蟲脒、氟樂靈、α-六六六、六氯苯、五氯苯甲醚、氯硝胺、β-六六六、五氯硝基苯、γ-六六六、特丁硫磷、δ-六六六、七氟菊酯、百菌清、五氯苯胺、甲基對硫磷、甲基毒死蜱、乙烯菌核利、七氯、皮蠅磷、八氯二丙醚、殺螟硫磷、甲基五氯苯硫醚、抑菌靈、艾氏劑、毒死蜱、對硫磷、三氯殺螨醇、氯酞酸二甲酯、三唑酮、仲丁靈、溴硫磷、二甲戊樂靈、氟蟲腈、環(huán)氧七氯b、環(huán)氧七氯a、氧化氯丹、哌草丹、三唑醇、腐霉利、反式氯丹、乙基溴硫磷、o,p'-dde、氟節(jié)胺、α-硫丹、順式氯丹、p,p'-dde、狄氏劑、o,p'-ddd、異狄氏劑、蟲螨腈、除草醚、β－硫丹、p,p'-ddt、o,p'-ddt、硫丹硫酸酯、p,p'-ddd、溴螨酯、聯(lián)苯菊酯、甲氧滴滴涕、甲氰菊酯、苯醚菊酯、滅蟻靈、氯氟氰菊酯、氟丙菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、喹禾靈、氟氰戊菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯；
3)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器的色譜條件如下：
所述色譜條件為：氣相色譜柱(28-32m×0.23-0.27μm×0.23-0.27mm)；載氣：氦氣，流速為1.6-1.75ml/min；進(jìn)樣口溫度為240-260℃；進(jìn)樣量0.08-1.2μl，不分流進(jìn)樣；升溫程序：48-52℃保持0.08-1.2min，以23-27℃/min的速度升溫至120-130℃，再以8-12℃/min升溫至280-320℃，保持6-8min，總運(yùn)行時間為28-30min；
所述質(zhì)譜條件為：電子轟擊電離源(ei源)電壓為68-72ev；離子源溫度180-220℃；接口溫度240-260℃；溶劑延遲時間2.7-2.9min；碰撞氣：氬氣；通過全掃描模式確定各組分的保留時間和一級碎片離子；通過選擇離子監(jiān)測模式確定各組分的二級碎片離子和相應(yīng)的碰撞電壓；4)分別精密吸取供試品溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各1μl，注入氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，得到色譜圖，按內(nèi)標(biāo)校正曲線法計算供試品中的農(nóng)藥殘留量。
優(yōu)選的，本發(fā)明所述的方法，包括以下步驟：
1)供試品溶液的制備；
稱取益心復(fù)脈顆粒1.8-2.2g加入8-12ml水使完全溶解，加入18-22ml正己烷，渦旋混勻后超聲提取4-6min，加入3-5g氯化鈉和2-4g醋酸鈉，渦旋混勻，劇烈震蕩0.8-1.2min，隨后以8000-12000r/min的速率離心4-6min，精確移取8-12ml上清液，于38-42℃水浴旋蒸至近干，用1.8-2.2ml丙酮復(fù)溶，移取1.4-1.6ml提取液到預(yù)先裝有48-52mg無水硫酸鎂、48-52mg硅酸鎂和48-52mgc18的聚乙烯離心管中，渦旋混勻，以10000-14000r/min的速率離心2-4min，得到上清供試品溶液。
2)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備
標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：取農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品10mg于10ml量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1.0g/l的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于4℃冰箱中備用；
混合儲備溶液：分別精密移取一定體積的各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10ml量瓶中，用丙酮稀釋定容，配制成各農(nóng)藥組分質(zhì)量濃度均為10.0mg/l的混合儲備溶液，于-20℃冰箱中保存；
混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：向10ml量瓶中加入適量內(nèi)標(biāo)溶液及混合儲備溶液，用丙酮稀釋定容，得到質(zhì)量濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.25μg/l的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；
基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：按照供試品溶液的步驟提取、凈化不含目標(biāo)化合物的“空白”樣品，以凈化液作為溶劑，將混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中的丙酮用凈化液替換，其余步驟同上，最終得到基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；
3)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器的色譜條件如下：
所述色譜條件為：inertcap5ms/hp氣相色譜柱(30m×0.25μm×0.25mm；shimadzu，日本)；載氣：氦氣(純度≥99.999％)，流速為1.69ml/min；進(jìn)樣口溫度為250℃；進(jìn)樣量1.0μl，不分流進(jìn)樣；升溫程序：50℃保持1min，以25℃/min的速度升溫至125℃，再以10℃/min升溫至300℃，保持7min，總運(yùn)行時間為28.5min。
所述質(zhì)譜條件為：電子轟擊電離源(ei源)電壓為70ev；離子源溫度200℃；接口溫度250℃；溶劑延遲時間2.8min；碰撞氣：氬氣(純度≥99.999％)；島津gcsolution工作站；通過全掃描模式(q3scan)確定各組分的保留時間和一級碎片離子；通過選擇離子監(jiān)測模式(sim)確定各組分的二級碎片離子和相應(yīng)的碰撞電壓；
4)分別精密吸取供試品溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各1μl，注入氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，得到色譜圖，按內(nèi)標(biāo)校正曲線法計算供試品中的農(nóng)藥殘留量。
進(jìn)一步優(yōu)選，所述方法包括以下步驟：
1)供試品溶液的制備
精確稱取益心復(fù)脈顆粒2.0g，加入10ml水使完全溶解，加入20ml正己烷，渦旋混勻后超聲提取5min，加入4.0g氯化鈉和3g醋酸鈉，渦旋混勻，劇烈震蕩1min，隨后以10000r/min的速率離心5min，精確移取10.0ml上清液，于40℃水浴旋蒸至近干，用2ml丙酮復(fù)溶，移取1.5ml提取液于預(yù)先裝有50mg無水硫酸鎂、50mg硅酸鎂和50mgc18的聚乙烯離心管中，渦旋混勻，以12000r/min的速率離心3min，得上清液；
2)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備
標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：取農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品10mg于10ml量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1.0g/l的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于4℃冰箱中備用；
混合儲備溶液：分別精密移取一定體積的各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10ml量瓶中，用丙酮稀釋定容，配制成各農(nóng)藥組分質(zhì)量濃度均為10.0mg/l的混合儲備溶液，于-20℃冰箱中保存；
混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：向10ml量瓶中加入適量內(nèi)標(biāo)溶液及混合儲備溶液，用丙酮稀釋定容，得到質(zhì)量濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.25μg/l的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；
基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：按照供試品溶液的步驟提取、凈化不含目標(biāo)化合物的“空白”樣品，將凈化液作為溶劑，將混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中的中的丙酮用凈化液替換，其余步驟同上，最終得到基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；
3)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器的色譜條件如下：
色譜條件inertcap5ms/hp氣相色譜柱(30m×0.25μm×0.25mm；shimadzu，日本)；載氣：氦氣(純度≥99.999％)，流速為1.69ml/min；進(jìn)樣口溫度為250℃；進(jìn)樣量1.0μl，不分流進(jìn)樣；升溫程序：50℃保持1min，以25℃/min的速度升溫至125℃，再以10℃/min升溫至300℃，保持7min，總運(yùn)行時間為28.5min；
質(zhì)譜條件電子轟擊電離源(ei源)電壓為70ev；離子源溫度200℃；接口溫度250℃；溶劑延遲時間2.8min；碰撞氣：氬氣(純度≥99.999％)；島津gcsolution工作站；
4)分別精密吸取供試品溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各1μl，注入氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀，得到色譜圖，按內(nèi)標(biāo)校正曲線法計算供試品中的農(nóng)藥殘留量。
上述方法中：
所用內(nèi)標(biāo)物質(zhì)為氘代毒死蜱-d10；
所述內(nèi)標(biāo)溶液的配制方法如下：將氘代毒死蜱-d10用丙酮稀釋并定容至5mg/l，即得。
更具體的，內(nèi)標(biāo)溶液的制備包括以下步驟：
1)取氘代毒死蜱-d10標(biāo)準(zhǔn)品10mg，精密稱定，置10ml量瓶中，用丙酮溶解并稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為1.0g/l的內(nèi)標(biāo)儲備液；
2)內(nèi)標(biāo)溶液精密移取內(nèi)標(biāo)儲備液適量，用丙酮定量稀釋，制成質(zhì)量濃度為5mg/l的內(nèi)標(biāo)溶液，儲存于4℃冰箱中。
需要說明的是：在基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備過程中，有“按照供試品溶液的步驟提取、凈化不含目標(biāo)化合物的“空白”樣品”此處的空白樣品為不含農(nóng)藥殘留的益心復(fù)脈顆粒經(jīng)過供試品溶液的制備方法制備得到的樣品。
本發(fā)明的方法是經(jīng)過篩選獲得的，篩選過程如下：
實(shí)驗1
1實(shí)驗部分
1.1儀器
三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(gcms-tq8030，shimadzu，日本)；
臺式離心機(jī)(micro17，thermo，美國)；
臺式離心機(jī)(cf16rn，hitachi，日本)；
分析天平(xs105，mettlertoledo，美國)；
水浴振蕩器(hzs-h，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司，中國)；
冷凝水系統(tǒng)(flex2500，thermo，美國)；
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(rotavaporr-215，buchi，瑞士)；
真空泵(vacuumpumpv-700，buchi，瑞士)；
粉碎機(jī)(allbasic，ika，德國)
1.2試劑與材料
乙腈、正己烷、丙酮(色譜級，merck)；醋酸、無水醋酸鈉(優(yōu)級純，天津威晨試劑)；氯化鈉、無水硫酸鎂(分析純，天津康科德)；n-丙基-乙二胺(psa)、十八烷基鍵合硅膠(c18)、弗羅里硅土(硅酸鎂)、中性氧化鋁(al-n)(優(yōu)級純，dikma)；農(nóng)藥對照品(dr.ehrenstorfer公司)；
1.3樣品制備方法
1.3.1供試品溶液的制備
精確稱取2.0g試樣于50ml聚乙烯離心管中，加入10ml水使試樣完全溶解。加入20ml正己烷，渦旋混勻后放入超聲儀中超聲提取5min，加入4.0g氯化鈉和3g醋酸鈉，渦旋混勻，劇烈震蕩1min，隨后以10000r/min的速率離心5min。精確移取10.0ml上清液于100ml圓底燒瓶中，于40℃水浴旋蒸至近干，用2ml丙酮復(fù)溶，移取1.5ml提取液于預(yù)先裝有50mg無水硫酸鎂、50mg硅酸鎂和50mgc18的聚乙烯離心管中，渦旋混勻，以12000r/min的速率離心3min。上清液待gc-ms/ms分析；
1.3.2基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備
標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：取農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品10mg于10ml量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1.0g/l的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于4℃冰箱中備用；
混合儲備溶液：分別精密移取一定體積的各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10ml量瓶中，用丙酮稀釋定容，配制成各農(nóng)藥組分質(zhì)量濃度均為10.0mg/l的混合儲備溶液，于-20℃冰箱中保存；
混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：向5ml量瓶中加入適量內(nèi)標(biāo)溶液及混合儲備溶液，得到質(zhì)量濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.25μg/l標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；
基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：按照供試品溶液的步驟提取、凈化不含目標(biāo)化合物的“空白”樣品，將凈化液作為溶劑，將混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中的丙酮用凈化液替換，其余步驟同上，最終得到基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；
所述內(nèi)標(biāo)溶液的制備包括以下步驟：
1)取氘代毒死蜱-d10標(biāo)準(zhǔn)品10mg，精密稱定，置10ml量瓶中，用丙酮溶解并稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為1.0g/l的內(nèi)標(biāo)儲備液；
2)內(nèi)標(biāo)溶液精密移取內(nèi)標(biāo)儲備液適量，用丙酮定量稀釋，制成質(zhì)量濃度為5mg/l的內(nèi)標(biāo)溶液，儲存于4℃冰箱中。
1.4氣相色譜-質(zhì)譜條件
色譜條件inertcap5ms/hp氣相色譜柱(30m×0.25μm×0.25mm；shimadzu，日本)；載氣：氦氣(純度≥99.999％)，流速為1.69ml/min；進(jìn)樣口溫度為250℃；進(jìn)樣量1.0μl，不分流進(jìn)樣；升溫程序：50℃保持1min，以25℃/min的速度升溫至125℃，再以10℃/min升溫至300℃，保持7min，總運(yùn)行時間為28.5min。
質(zhì)譜條件電子轟擊電離源(ei源)電壓為70ev；離子源溫度200℃；接口溫度250℃；溶劑延遲時間2.8min；碰撞氣：氬氣(純度≥99.999％)；島津gcsolution工作站。
1.5檢測分別精密吸取混合對照品儲備液、供試品溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各1μl，注入氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀，得到色譜圖，按內(nèi)標(biāo)校正曲線法計算供試品中農(nóng)的藥殘留量。
通過全掃描模式(q3scan)確定各組分的保留時間和一級碎片離子；通過選擇離子監(jiān)測模式(sim)確定各組分的二級碎片離子和相應(yīng)的碰撞電壓。各農(nóng)藥組分的質(zhì)譜參數(shù)見表1。
表174種農(nóng)藥的保留時間和質(zhì)譜參數(shù)
2結(jié)果
2.1線性
基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液經(jīng)gc-ms/ms測定后，以相對峰面積(a對照品/a內(nèi)標(biāo))對濃度c對照品作圖，繪制工作曲線，見表2。
結(jié)果表明，在濃度為0.005～0.25mg/l范圍內(nèi)，各農(nóng)藥濃度和響應(yīng)值之間均顯示良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99。
2.2定量限
采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，向空白樣品中加入1.3.2方法中的混合儲備溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，制備加標(biāo)水平分別為0.01、0.02、0.04mg/kg的樣品各6份，按1.3.2項下操作，并進(jìn)行g(shù)c-ms/ms分析，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法定量，計算平均回收率及重復(fù)性(rsd)。根據(jù)《sanco12571/2013歐盟農(nóng)殘質(zhì)量分析和驗證程序》中的要求，回收率(70％～120％)及重復(fù)性(≤20％)滿足要求的前提下，該條件對應(yīng)下的加標(biāo)水平即為方法的定量限(loq)，結(jié)果見表2。
結(jié)果表明，除殺蟲脒、百菌清、抑菌靈、環(huán)氧七氯b、溴蟲腈、硫丹硫酸酯、苯醚菊酯和溴氰菊酯外，其他農(nóng)藥的loq均不超過0.01mg/kg，滿足歐盟相關(guān)規(guī)定。
2.3準(zhǔn)確度和精密度
采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，向空白樣品中加入1.3.2方法中的混合儲備溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，制備加標(biāo)水平分別為0.01mg/kg、0.05mg/kg和0.1mg/kg的樣品各3份，按1.3.2項下操作，并進(jìn)行g(shù)c-ms/ms分析，基質(zhì)匹配內(nèi)標(biāo)法定量，計算平均回收率及重復(fù)性(rsd)，結(jié)果見表2。
除溴蟲腈、百菌清和硫丹硫酸酯外，其余農(nóng)藥的回收率均在54％～130％之間，rsd在0.3％～27.8％之間，符合農(nóng)殘檢測要求。
表2益心復(fù)脈顆粒中74種農(nóng)藥的線性、定量限、回收率及重復(fù)性
nd：未檢測到。
有關(guān)的農(nóng)藥殘留限度國家標(biāo)準(zhǔn)見表3：
注：“/”表示無限量要求。
本發(fā)明的檢測方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：
1、復(fù)方中藥由兩味或兩味以上藥味組成，相比于單味藥材或制劑而言，所含化學(xué)成分復(fù)雜、理化性質(zhì)各異。由于農(nóng)殘檢測屬于痕量分析范疇，濃度處于納克級水平，樣品中的農(nóng)藥殘留往往需要經(jīng)過凈化、濃縮才能達(dá)到儀器可檢測的水平。而復(fù)方中藥中的未知成分會對提取和凈化等步驟產(chǎn)生干擾，由于未知物而導(dǎo)致農(nóng)殘檢測中的假陽性結(jié)果時有發(fā)生。因此，相比于其他類型的研究對象而言，復(fù)方中藥在前處理方法摸索和檢測方法開發(fā)中都提出了許多未知的挑戰(zhàn)，實(shí)驗過程中存在很多不可預(yù)知的因素，增加了方法開發(fā)的難度。
2、條件篩選
1)提取溶劑的選擇：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測農(nóng)藥殘留的方法中，乙腈、乙酸乙酯、丙酮等是常用的提取溶劑，針對益心復(fù)脈顆粒，發(fā)明人考察了乙腈、乙酸乙酯、丙酮和正己烷四種有機(jī)溶劑復(fù)方顆粒中74種農(nóng)藥的提取效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)采用丙酮提取時，由于丙酮與水互溶，即使加入鹽析劑后也很難使其分層。乙酸乙酯與水部分互溶，但整體回收率較乙腈和正己烷低。乙腈和正己烷的萃取效率相當(dāng)，絕大部分農(nóng)藥均獲得較好的回收率。但乙腈由于極性較強(qiáng)，在提取過程中，對基質(zhì)中非目標(biāo)組分的提取能力也較強(qiáng)，造成提取液中存在大量的基質(zhì)干擾物，增加了后續(xù)凈化的壓力。因此，綜合考慮，最終選取正己烷為提取溶劑。
發(fā)明人選擇正己烷作為供試品的提取溶劑，其揮發(fā)性高，在操作時要迅速。另外，雖然大多數(shù)農(nóng)藥殘留回收率均很高，但是極個別的成分如殺蟲脒和溴螨酯回收率偏低。因此，發(fā)明人通過添加不同量的醋酸鈉使ph達(dá)到一個酸堿敏感化合物均適合提取的ph環(huán)境。
殺蟲脒是堿性化合物，益心復(fù)脈顆粒水溶后呈酸性(ph4.5左右)，造成殺蟲脒回收率低，調(diào)節(jié)ph至中性后，殺蟲脒取得滿意的回收率，同時中性條件下，酸性的化合物(如百菌清等)回收率仍正常，因此最后選擇ph偏中性。
在復(fù)溶時，發(fā)明人曾經(jīng)嘗試使用正己烷復(fù)溶，但是發(fā)現(xiàn)：正己烷跟大多數(shù)的吸附劑(偏極性)的互溶性不好，最終導(dǎo)致凈化效果差，回收率低。為了尋找適宜的復(fù)溶溶劑，發(fā)明人進(jìn)行了大量的篩選，如丙酮、乙酸乙酯和二氯甲烷。二氯甲烷毒性大，乙酸乙酯回收率較低，而丙酮由于具有良好的溶解性，最終試驗整體回收率較好，因此，最終選擇丙酮為復(fù)溶溶劑。
2)凈化劑的選擇
益心復(fù)脈顆粒基質(zhì)復(fù)雜，主要含有蒽醌類、生物堿類和酚酸類等多種化學(xué)物質(zhì)，同時，由于色素含量較多，造成提取液顏色較深，嚴(yán)重干擾目標(biāo)組分離子化過程。因此，在進(jìn)行多農(nóng)殘分析時，供試品溶液往往需要經(jīng)過適當(dāng)?shù)姆椒▋艋駝t難以獲得準(zhǔn)確的分析結(jié)果。
發(fā)明人考察了分散固相萃取中常用的幾種吸附劑(psa、c18、硅酸鎂、al-n和gcb)的吸附性能。psa屬于陰離子交換劑，硅酸鎂和al-n屬于極性吸附劑，三者能有效去除復(fù)雜基質(zhì)中的有機(jī)酸和糖類等極性干擾物。c18屬于非極性吸附劑，能有效去除油脂等非極性物質(zhì)。gcb為非選擇性吸附劑，對色素和甾醇類物質(zhì)均有較好的凈化效果。通過比較，發(fā)現(xiàn)不同組合形式的吸附劑(①psa+c18+gcb；②硅酸鎂+c18+gcb；③al-n+c18+gcb)的除雜效果存在明顯差異。第③組中由于al-n的極性較強(qiáng)，部分極性化合物的回收率普遍偏低。而第①組和第②組的效果相當(dāng)，絕大部分的農(nóng)藥均獲得較好的回收率。但由于psa中含有兩個氨基，在凈化過程中往往使ph升高至8以上，造成堿敏感性化合物的回收率偏低，如百菌清的回收率僅為20％左右。因此，綜合考慮方法性能，最終選取硅酸鎂+c18+gcb為凈化劑。
3、本發(fā)明采用分散固相萃取技術(shù)結(jié)合氣相色譜-三重四級桿質(zhì)譜建立了益心復(fù)脈顆粒中74種農(nóng)藥殘留同時測定的分析方法。該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，滿足益心復(fù)脈顆粒中農(nóng)藥殘留檢測的要求。
具體實(shí)施方式
以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1檢測益心復(fù)脈顆粒中74種農(nóng)殘的方法
1、供試品溶液的制備
精確稱取益心復(fù)脈顆粒2.0g于50ml聚乙烯離心管中，加入10ml水使試樣完全溶解。加入20ml正己烷，渦旋混勻后放入超聲儀中超聲提取5min，加入4.0g氯化鈉和3g醋酸鈉，渦旋混勻，劇烈震蕩1min，隨后以10000r/min的速率離心5min。精確移取10.0ml上清液于100ml圓底燒瓶中，于40℃水浴旋蒸至近干，用2ml丙酮復(fù)溶，移取1.5ml提取液于預(yù)先裝有50mg無水硫酸鎂、50mg硅酸鎂和50mgc18的聚乙烯離心管中，渦旋混勻，以12000r/min的速率離心3min，得上清液；
2、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備
標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：取農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品10mg于10ml量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1.0g/l的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于4℃冰箱中備用；
混合儲備溶液：分別精密移取一定體積的各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10ml量瓶中，用丙酮稀釋定容，配制成各農(nóng)藥組分質(zhì)量濃度均為10.0mg/l的混合儲備溶液，于-20℃冰箱中保存；
混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：向10ml量瓶中加入適量內(nèi)標(biāo)溶液及混合儲備溶液，用丙酮稀釋定容，得到質(zhì)量濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.25μg/l的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；
基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：按照供試品溶液的步驟提取、凈化不含目標(biāo)化合物的“空白”樣品，將凈化液作為溶劑，將混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中的中的丙酮用凈化液替換，其余步驟同上，最終得到基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；
3、氣相色譜-質(zhì)譜條件
色譜條件inertcap5ms/hp氣相色譜柱(30m×0.25μm×0.25mm；shimadzu，日本)；載氣：氦氣(純度≥99.999％)，流速為1.69ml/min；進(jìn)樣口溫度為250℃；進(jìn)樣量1.0μl，不分流進(jìn)樣；升溫程序：50℃保持1min，以25℃/min的速度升溫至125℃，再以10℃/min升溫至300℃，保持7min，總運(yùn)行時間為28.5min；
質(zhì)譜條件電子轟擊電離源(ei源)電壓為70ev；離子源溫度200℃；接口溫度250℃；溶劑延遲時間2.8min；碰撞氣：氬氣(純度≥99.999％)；島津gcsolution工作站；
4、分別精密吸取供試品溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各1μl，注入氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀，得到色譜圖，按內(nèi)標(biāo)校正曲線法計算供試品中農(nóng)的藥殘留量。
對實(shí)際生產(chǎn)出的6批產(chǎn)品進(jìn)行了上述檢測，結(jié)果見表4：
表4：益心復(fù)脈顆粒中74種農(nóng)藥殘留的家呢結(jié)果
注：“/”表示未檢測到。
上述結(jié)果顯示，檢測樣品的74種農(nóng)藥殘留均在限度范圍內(nèi)，樣品合格。
實(shí)施例2
采用中國藥典2015年版的農(nóng)藥殘留檢測方法，具體見《中國藥典》2015年版四部通則2341中農(nóng)藥殘留量測定法——第四法氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測實(shí)施例1的樣品。
該法的研究對象為藥材或飲片，樣品經(jīng)1％冰醋酸-乙腈溶液提取后，采用n-丙基乙二胺、十八烷基鍵合硅膠、硅膠和石墨化碳黑進(jìn)行除雜凈化，最后上機(jī)分析。
本發(fā)明的研究對象為復(fù)方中藥制劑——益心復(fù)脈顆粒，采用藥典規(guī)定的方法對其中74種農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測時，發(fā)現(xiàn)部分農(nóng)藥提取效率不高，且在凈化過程中損失較大，因此認(rèn)為該法不適于益心復(fù)脈顆粒中74種農(nóng)藥殘留的檢測。
發(fā)明人根據(jù)益心復(fù)脈顆粒的基質(zhì)特點(diǎn)，結(jié)合74種農(nóng)藥殘留的理化特定，開發(fā)了簡便、快速的分析方法，解決了益心復(fù)脈顆粒中74種農(nóng)藥殘留的檢測難題。