本發(fā)明涉及一種微藻胞內(nèi)代謝物樣品提取方法。

背景技術(shù)：

微藻為自養(yǎng)型微生物，因其細胞內(nèi)存在光合作用系統(tǒng)也稱為微藻植物。微藻具有高效吸收太陽能、固定二氧化碳產(chǎn)生生物質(zhì)的能力(即光合作用能力)；同時微藻作為微生物的一種，其增殖速度較快。作為單細胞生物，微藻的主要組成為蛋白、脂肪、碳水化合物和核酸等。目前，微藻已經(jīng)是重要的養(yǎng)殖餌料被養(yǎng)殖企業(yè)廣泛應(yīng)用，同時微藻也已經(jīng)成為類胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、多糖等保健食品的來源。隨著化石能源枯竭的預(yù)期加劇，微藻在能源制品和精細化學(xué)品的潛在應(yīng)用也得到了極大關(guān)注。為了有效利用微藻生物資源，或?qū)⑽⒃遄鳛榧毎S而定向調(diào)控微藻，微藻胞內(nèi)代謝物分析都在其中起了重要作用。越來越多的研究表明，在代謝物研究過程中，樣品提取方法對后期結(jié)果有很大的營養(yǎng)，一方面，胞內(nèi)酶系的存在，有可能在樣品處理過程中產(chǎn)生內(nèi)源性轉(zhuǎn)化，使得結(jié)果偏離預(yù)期，另一方面，不同極性和溶解性物質(zhì)的存在，大多現(xiàn)有方法會丟失一部分樣品，降低了樣品的利用率，或操作復(fù)雜，耗時長(cn102472741b，cn103713075a，cn102495152b和cn102517349b)。

針對內(nèi)源性降解，常用的方法包括低溫失活、低溫溶劑失活或高溫溶劑失活幾種。對于微藻來說，其培養(yǎng)體系為水環(huán)境，干基生物質(zhì)質(zhì)量含量通常在千分之幾水平，因此現(xiàn)有方法是先離心再失活處理。盡管4℃離心時間僅有幾分鐘，但是該過程中細胞仍具有一定的活性。比較好的方法應(yīng)先使胞內(nèi)酶失活再進行生物質(zhì)收集。離心收集的微藻生物質(zhì)含水量在10-90％之間。

常規(guī)提取方法中，樣品收集后會采用冷凍干燥進行水分的去除。但是 無論是對極性物質(zhì)的水提，還是利用有機溶劑進行抽提，通常提取劑的用量會遠遠高于離心收集到微藻細胞沉淀中的水量，后者對于大多數(shù)后續(xù)測定不產(chǎn)生實質(zhì)影響。

同時，在常規(guī)提取方法中，多僅選擇性收集其中一相進行后續(xù)分析，如果能夠?qū)Χ鄠€組分進行分析，能夠從有限的樣品中獲得更多的信息。

因此，本發(fā)明基于上述分析，針對微藻代謝物研究，尤其是組學(xué)層次研究特點，提出了一種新的胞內(nèi)代謝物樣品制備流程。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一種用于微藻代謝胞內(nèi)代謝物樣品制備的方法，首先通過低溫冰浴失活胞內(nèi)酶，再離心收集細胞，并在二氯甲烷或者氯仿中超聲破碎細胞，使用含有甲醇的水相進行代謝物分離，獲得可溶的極性(水相)、非極性(溶劑相)和不溶的多糖及蛋白組分，用于后續(xù)的代謝組學(xué)研究。具體操作如下：

(1)冰浴失活胞內(nèi)酶。將經(jīng)過0.22微米濾膜過濾除菌的微藻培養(yǎng)基或與待處理微藻胞內(nèi)滲透壓相當(dāng)?shù)牡葷B溶液，于15ml或50ml離心試管中存放于-80℃冰箱中，制備冰斜面。所使用的培養(yǎng)基或者等滲溶液最多不超過離心試管體積的一半。將待分析的微藻培養(yǎng)液直接加入到冰斜面上，體積不超過冰斜面所用溶液的體積。劇烈振蕩直至冰剛剛?cè)诨А?/p>

(2)離心收集細胞。將(1)中的細胞懸液迅速轉(zhuǎn)移至遇冷的4℃離心機中，在2000～12000g轉(zhuǎn)速下離心5～10分鐘，收集細胞，棄上清。

(3)細胞清洗。將收集的藻細胞用與經(jīng)過預(yù)冷至4℃的、取樣時藻液體積相同的(1)中0.22微米濾膜過濾除菌的溶液重懸后，按照(2)條件離心收集細胞，棄上清。重復(fù)該步操作2～3次。最終獲得的細胞沉淀可以保存于-80℃或者直接進行步驟(4)的操作。

(4)超聲破碎。按照初始每2～8mg細胞加入2ml二氯甲烷或者氯仿的比例，加入到所收集的細胞沉淀中，在冰水混合物中進行超聲破碎。以 2ml上述體系為例，超聲功率300-500w，按照超聲5～8s，停止5～15s間隔循環(huán)操作至溶液中無肉眼可見細胞聚集體。

(5)萃取。對于每2ml二氯甲烷或氯仿，加入1ml0～4℃預(yù)冷的甲醇水溶液(其中甲醇和水的體積比約1:4)，充分混合，0～4℃靜置5～10分鐘至體系明顯分層，4℃，12000g離心10分鐘，獲得三相。其中上層為水相，主要是極性分子，下層為有機相，主要是非極性分子，中間固形物為多糖和蛋白質(zhì)等。將上述三相分別取出用于后續(xù)分析。

在上述方法中，可以根據(jù)后續(xù)分析的需要，在二氯甲烷或氯仿中，以及萃取使用的甲醇水溶液中，加入內(nèi)標(biāo)物，進行定量。

實驗表明，該方法即適用于真核微藻，也適用于原核的藍藻。

本發(fā)明使用冰浴方式迅速失活胞內(nèi)酶，通過二氯甲烷或者氯仿超聲破碎，以二氯甲烷(或氯仿)：甲醇：水三相體系進行快速極性、非極性化合物、不溶性糖和蛋白的分離，用于后續(xù)代謝組學(xué)分析。本發(fā)明具有操作步驟少，可同時測定極性和非極性胞內(nèi)組分的特點。

具體實施方式

下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實施例1

1)湛江等鞭金藻(isochrysiszhangjiangensis)培養(yǎng)于添加f/2培養(yǎng)基的海水中，所使用的f/2營養(yǎng)鹽主要成分的終濃度為nano375mg/l，nah2po4·2h2o5mg/l，vitaminb120.5μg/l，biotin0.5μg/l，vitaminb10.1mg/l，fecl3·6h2o3.16mg/l,na2edta·2h2o4.36mg/l，cuso4·5h2o9.8μg/l，na2moo4·2h2o6.3μg/l，znso4·7h2o22μg/l，cocl2·6h2o12μg/l，mncl2·4h2o0.18mg/l。在500ml光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)六天，分別于3、4、5和6天取樣各7ml(對應(yīng)生物量為3.4,5.5,7.5和7.2mg)。提前一天，取經(jīng)0.22微米濾膜過濾除菌的海水7ml，裝入15ml帶蓋離心試管中，水平放置于-80℃冰箱中,制備成與水平面成45度的冰斜面。取樣 后，直接加入到制備好冰斜面的15ml離心式管中，蓋好蓋子，劇烈振蕩直至肉眼可見的冰剛剛?cè)芙?。迅速轉(zhuǎn)移至遇冷的4℃離心機中，在10000g轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，收集細胞，棄上清。

2)將收集的金藻細胞用預(yù)冷至4℃的、經(jīng)0.22微米濾膜過濾除菌的海水7ml重懸，再按照前述條件離心進行清洗操作。重復(fù)清洗操作過程1次，即清洗操作進行2次。

3)在藻細胞沉淀中加入2ml氯仿，在冰水混合物的保護下，進行超聲破碎。超聲功率300-500w，按照超聲6s，停止6s間隔循環(huán)操作3次，溶液中無肉眼可見細胞聚集體。

4)以初始氯仿體積進行計算，按照2:1的體積比，在上述細胞裂解液中加入加入1ml4℃預(yù)冷的甲醇水溶液(其中甲醇和水的體積比約1:4)，充分混合后，4℃靜置5～10分鐘至體系明顯分層，4℃，12000g離心10分鐘，獲得三相。其中上層為水相，主要是極性分子，下層為有機相，主要是非極性分子，中間固形物為多糖和蛋白質(zhì)等。將上述三相分別取出用于后續(xù)分析。

實施例2：同實施例1的操作，與實施例1不同之處在于：在上述操作過程中，在甲醇水溶液中加入終濃度為0.125μg/ml的同位素標(biāo)記的乳酸、蘋果酸和琥珀酸，用于后續(xù)通過色質(zhì)聯(lián)用對水相中有機小分子進行定量。

實施例3：在上述實施例1操作過程后，將有機相取出，以n2氣吹掃溶劑至恒重后稱重，獲得重量法測定的總脂溶性物質(zhì)量。或，同時可以將有機相稀釋至1mg/ml(使用體積比為65:35的乙腈：異丙醇溶液)，對其中的脂質(zhì)進行進行質(zhì)譜測定。

實施例4：在上述實施例1操作過程后，將固形物取出，將實施例1中的固形物使用硫酸蒽酮法測定總糖。

實施例5：同實施例1的操作，與實施例1不同之處在于：在步驟1)后獲取5mg亞心型四爿藻細胞，按照實施例1方法制備游離氨基酸水相代謝物樣品。

實施例6：同實施例1的操作，與實施例1不同之處在于：取約4mg使用tap培養(yǎng)基培養(yǎng)的萊茵衣藻細胞，使用經(jīng)過過濾除菌的tap培養(yǎng)基替代實施例1中的海水，收集樣品，用于蛋白質(zhì)譜解析。