本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種評(píng)價(jià)消化酶在棉鈴蟲(chóng)Bt蛋白抗性中作用的方法。

背景技術(shù)：
蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis,Bt)屬革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，能產(chǎn)生多種類(lèi)型的伴孢晶體蛋白，即δ-內(nèi)毒素或稱(chēng)為殺蟲(chóng)晶體蛋白(insecticidalcrystalprotein,ICPs)，對(duì)鱗翅目(Lepidoptera)、雙翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多種昆蟲(chóng)，以及線蟲(chóng)、螨類(lèi)和原生動(dòng)物等具有特異性的殺蟲(chóng)活性。關(guān)于Bt毒素作用機(jī)理的假說(shuō)有很多，穿孔模型是被廣泛認(rèn)可的一種。穿孔模型包括以下幾個(gè)步驟：(i)攝入的毒素晶體在昆蟲(chóng)中腸特殊的堿性條件下水解，前毒素釋放出來(lái)；(ii)前毒素在中腸蛋白酶的作用下水解為有活性的毒素單體分子；(iii)經(jīng)過(guò)中腸上皮細(xì)胞糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定的受體分子定位，毒素單體分子與中腸上皮細(xì)胞上的鈣粘蛋白受體結(jié)合；(iv)在中腸特定的蛋白酶的作用下，毒素單體分子結(jié)構(gòu)域Ⅰ中的α-1螺旋被剪切掉，毒素單體分子寡聚化；(v)寡聚化的毒素分子結(jié)合錨定在中腸上皮細(xì)胞的氨肽酶(aminopeptidaseN,APN)和堿性磷酸酯酶(alkalinephosphatase,ALP)，大量聚集的毒素分子導(dǎo)致上皮細(xì)胞穿孔,最終導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡。中腸蛋白酶在Bt前毒素的活化中起著重要作用，由于蛋白酶的缺失使前毒素的活化程度降低而產(chǎn)生的抗性是抗性品系中較普通的機(jī)制。Oppert等人發(fā)現(xiàn),印度谷螟的(Plodiainterpunctella)中腸因缺少胰蛋白酶(trypsin)的活化作用而對(duì)Cry1A毒素產(chǎn)生了抗性；在玉米螟(Ostrinianubilalis)和煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)的抗性品系中也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的情況。劉晨曦等報(bào)道在棉鈴蟲(chóng)的一個(gè)Cry1Ac抗性品系中，類(lèi)胰蛋白酶的突變引起了棉鈴蟲(chóng)對(duì)Cry1Ac的抗性；Rajagopal等也報(bào)道在棉鈴蟲(chóng)的抗性品系中,一種絲氨酸蛋白酶HaSP2(serineprotease2)的缺失致使前毒素不能正常水解與活化。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種評(píng)價(jià)消化酶在棉鈴蟲(chóng)Bt蛋白抗性中作用的方法。Bt蛋白的活化在Bt作用模型中是非常關(guān)鍵的一步，同時(shí)也是昆蟲(chóng)對(duì)Bt產(chǎn)生抗性的重要因素。鑒于目前尚未建立一套行之有效的、快速的評(píng)價(jià)各種消化酶參與Bt抗性的方法，本發(fā)明提供一種評(píng)價(jià)消化酶在棉鈴蟲(chóng)Bt蛋白抗性中作用的方法，利用特異性消化酶抑制劑分別處理對(duì)Bt蛋白敏感和對(duì)Bt蛋白具有抗性的棉鈴蟲(chóng)，然后進(jìn)行生物測(cè)定(分析其抗性倍數(shù)和抑制效率)，通過(guò)比較所述消化酶抑制劑對(duì)抗、感品系棉鈴蟲(chóng)的Bt蛋白毒力的抑制效果，來(lái)評(píng)價(jià)所述消化酶抑制劑對(duì)應(yīng)的消化酶在參與Bt蛋白抗性形成中的作用。本發(fā)明所述特異性消化酶抑制劑對(duì)應(yīng)于棉鈴蟲(chóng)中腸消化酶中一種特定的消化酶，例如所述特異性消化酶抑制劑包括類(lèi)胰蛋白酶的抑制劑N-tosyl-L-lysinechloromethylketone(TLCK)。具體地，本發(fā)明的一種評(píng)價(jià)消化酶在棉鈴蟲(chóng)Bt蛋白抗性中作用的方法，包括以下步驟：1)配制一定濃度的特異性消化酶抑制劑溶液；2)選抗、感品系棉鈴蟲(chóng)，將步驟1)配制的消化酶抑制劑溶液點(diǎn)滴在每頭棉鈴蟲(chóng)背部，然后飼喂含不同濃度Cry1Ac的飼料，飼喂一段時(shí)間后，進(jìn)行生物測(cè)定，比較抗、感品系棉鈴蟲(chóng)對(duì)Bt蛋白毒力的變化。前述的方法，選2日齡的抗、感品系棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)進(jìn)行點(diǎn)滴處理。前述的方法，步驟1)中用適當(dāng)溶劑(例如，二甲基亞砜DMSO)溶解所述特異性消化酶抑制劑，配制濃度為10mg/mL的溶液，并以溶劑為對(duì)照。前述的方法，步驟2)中用微量點(diǎn)滴器將約1μL所述消化酶抑制劑溶液點(diǎn)滴在每頭棉鈴蟲(chóng)背部，然后飼喂含不同濃度Cry1Ac的飼料，飼喂7d后，進(jìn)行生物測(cè)定。本發(fā)明方法直觀、簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，可用于初步分析不同消化酶參與棉鈴蟲(chóng)對(duì)Bt蛋白抗性形成的作用，為研究昆蟲(chóng)抗性機(jī)制及抗性治理提供思路。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實(shí)施例1類(lèi)胰蛋白酶在Cry1Ac抗性棉鈴蟲(chóng)中的作用分析配制類(lèi)胰蛋白酶(棉鈴蟲(chóng)中腸消化酶中的一種蛋白酶)的特異性酶抑制劑TLCK，用DMSO將其溶解，配制成濃度為10mg/mL的酶抑制劑溶液，并以DMSO為對(duì)照；選Cry1Ac抗、感品系棉鈴蟲(chóng)(即對(duì)Cry1Ac具有抗性或敏感的棉鈴蟲(chóng)，本實(shí)施例中以LF做為敏感品系棉鈴蟲(chóng)，LF120作為抗性品系棉鈴蟲(chóng))，分別準(zhǔn)備72頭2日齡棉鈴蟲(chóng)(分3次重復(fù))；配制含不同濃度Cry1Ac的人工飼料；用微量點(diǎn)滴器將準(zhǔn)備好的約1μL酶抑制劑溶液，點(diǎn)滴在每頭棉鈴蟲(chóng)背部；將抑制劑處理后的幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到含Cry1Ac的人工飼料上進(jìn)行生物測(cè)定；7日后對(duì)生測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析其抗性倍數(shù)和抑制效率，通過(guò)比較抗、感品系棉鈴蟲(chóng)對(duì)抑制劑的反應(yīng)，來(lái)初步評(píng)價(jià)類(lèi)胰蛋白酶在Cry1Ac抗性形成中作用。根據(jù)7日后的生物測(cè)定結(jié)果(表1)，與敏感品系LF相比，LF120品系棉鈴蟲(chóng)對(duì)Cry1Ac產(chǎn)生了1601.72倍的抗性。類(lèi)胰蛋白酶抑制劑對(duì)敏感品系的抑制效率是2.34倍，說(shuō)明類(lèi)胰蛋白酶參與了棉鈴蟲(chóng)對(duì)Cry1Ac的活化作用。抑制劑對(duì)LF120的抑制效果是1.78倍，說(shuō)明類(lèi)胰蛋白酶在一定水平上參與了LF120品系對(duì)Cry1Ac抗性的形成；同時(shí)加入抑制劑后，棉鈴蟲(chóng)對(duì)Cry1Ac的抗性倍數(shù)也從1601.72ng/cm2降為了888.62ng/cm2，說(shuō)明其他的消化酶也可能參與毒素的消化過(guò)程，另外受體蛋白的變化等可能也是抗性產(chǎn)生的原因。表1類(lèi)胰蛋白酶抑制劑對(duì)抗、感品系棉鈴蟲(chóng)的抑制效果注：/：無(wú)處理或不分析；DMSO：溶劑為對(duì)照，生測(cè)前進(jìn)行點(diǎn)滴處理；TLCK：生測(cè)前進(jìn)行抑制劑點(diǎn)滴處理；抗性倍數(shù)：LF120的LC50除以LF的LC50抑制率：在同一品系中，TLCK處理的LC50除以DMSO的LC50。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。參考文獻(xiàn)Oppert,B.；Kramer,K.J.；Beenman,R.W.；Johnson,D.；McGaughey,W.H.Proteinase-mediatedinsectresistancetoBacillusthuringiensistoxin.J.Biol.Chem.1997,272,23473-23476Liu,C.X.；Xiao,Y.T.；Li,X.C.；Oppert,B.；Tabashnik,B.；Wu,K.M.Cis-mediateddown-regulationofatrypsingeneassociatedwithBtresistanceincottonbollworm.ScientificReports2014,4,DOI:10.1038/srep07219Rajagopal,R.；Arora,N.；Sivakumar,S.；Rao,N.G.V.；Nimbalkar,S.A.ResistanceofHelicoverpaarmigeratoCry1ActoxinfromBacuillusthuringiensisisduetoimproperprocessingoftheprotoxin.Biochem.J.2009,419,309–316