本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，涉及一種甘膽酸均相酶免疫診斷試劑的制備方法。

背景技術：

甘膽酸是血清中膽酸和甘氨酸結合而成的結合型膽酸之一，分子結構式如下：

甘膽酸由肝細胞合成，同膽汁進入腸道，經(jīng)門靜脈再回肝臟，當肝細胞受損時，肝細胞攝取甘膽酸能力下降，致使血中含量增加，因此，甘膽酸是肝細胞功能及其肝膽系物質循環(huán)功能的敏感指標，急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、膽石癥伴黃疸患者膽管、膽囊排泄功能障礙、梗阻性肝病、腸-肝循環(huán)障礙、肝癌都會引起甘膽酸升高，甘膽酸也是檢測膽汁郁積和早期酒精肝損傷的重要指標，同時甘膽酸的檢測對孕婦妊娠期肝內膽汁淤積癥(ICP)的診斷具有重要的臨床意義。

目前，體外定量測定甘膽酸主要使用放射免疫分析法(RIA)，化學發(fā)光免疫分析法(CLIA)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。放射免疫法需要有專業(yè)放免設施，普通實驗室難以開展，且放免法準確度低，放射性射線還會對操作人員的健康產生極大的危害，國際上已很少使用?；瘜W發(fā)光法靈敏度較高，但是測定速度較慢， 測試結果的準確度和試劑穩(wěn)定性較差，而且需要昂貴的專用化學發(fā)光檢測設備，不利于常規(guī)實驗室開展，臨床應用局限性明顯。酶聯(lián)免疫法一般用于半定量測定，且操作繁瑣，檢測時間長，自動化程度低，重復性較差，不利于廣泛應用于臨床檢驗。

目前市場上缺乏靈敏度高、特異性強的甘膽酸檢測試劑，尤其是質量好的自動化檢驗試劑。

均相酶免疫檢測法，以其檢測速度快、操作簡單、靈敏度高、特異性強且可以在全自動生化分析儀上實現(xiàn)對小分子物質的高通量快速化檢測的優(yōu)點，開始得到越來越多的關注。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術存在的上述問題，提出了一種安全快速、高效、靈敏、能準確檢測出待測樣本中甘膽酸含量的甘膽酸均相酶免疫診斷試劑的制備方法。

本發(fā)明的目的可通過下列技術方案來實現(xiàn)：一種甘膽酸均相酶免疫診斷試劑的制備方法，所述制備方法包括甘膽酸抗體溶液的制備、甘膽酸酶偶聯(lián)物溶液的制備、甘膽酸校準品的制備；

甘膽酸抗體溶液的制備：將甘膽酸抗體加入到Tris-HCl緩沖液中，并加入酶底物6-磷酸葡萄糖、NADP、輔助試劑，混合均勻，即為甘膽酸抗體溶液；

甘膽酸酶偶聯(lián)物溶液的制備：將甘膽酸加入到MES緩沖液中，加入羧基活化劑進行羧基活化，然后在羧基活化后的甘膽酸中加入6-磷酸葡萄糖脫氫酶進行縮合反應得到甘膽酸酶偶聯(lián)物粗品，經(jīng)透析純化后加入到Tris-HCl緩沖液中，并加入輔助試劑，混合均勻，即為甘膽酸酶偶聯(lián)物溶液；

甘膽酸校準品的制備：將BSA溶于PBS緩沖液中制成BSA-PBS溶液，再將甘膽酸溶于BSA-PBS溶液中，即為甘膽酸校準品。

本發(fā)明通過對甘膽酸分子結構上的羧基進行活化后，與蛋白酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶上的氨基共價結合，生成甘膽酸酶偶聯(lián)物。在液相均相反應體系中，待測樣品中游離的甘膽酸與甘膽酸酶偶聯(lián)物競爭性結合抗甘膽酸特異性抗體位點。待測樣品中游離的甘膽酸越多，競爭結合的抗體位點越多，抗體釋放出的酶標偶聯(lián)物越多。游離出的酶標偶聯(lián)物催化NAD⁺生成NADH，待測樣品中甘膽酸的含量與NADH的生成量成正比，在340nm波長下測定NADH的生成速率可計算出甘膽酸的含量。本發(fā)明甘膽酸均相酶免疫診斷試劑的制備方法操作過程簡單，反應穩(wěn)定可靠，制得的試劑高效準確靈敏。

作為優(yōu)選，所述甘膽酸校準品的濃度范圍為0-50μg/ml。

將甘膽酸校準品的濃度范圍設置在上述數(shù)值范圍內，標準曲線線性好，比較適合取樣量的大小以及控制準確度。在上述數(shù)值范圍內選取若干點值，以甘膽酸校準品的濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制甘膽酸校準曲線，以待測樣品的吸光度值在標準曲線上可求得相應甘膽酸的含量。

作為優(yōu)選，所述甘膽酸抗體溶液中甘膽酸抗體的濃度為0.05-10mg/ml。

作為優(yōu)選，所述甘膽酸酶偶聯(lián)物濃度為1.0-10.0μg/ml。

作為優(yōu)選，所述羧基活化劑為EDC-NHS。

采用EDC-NHS對甘膽酸進行羧基活化，活化效率高，活化條件易控制，后續(xù)純化過程較易進行。

作為優(yōu)選，所述甘膽酸進行羧基活化的溫度為0-37℃，時間為5-60min，pH為5.5-6.5。

在上述反應條件下，羧基活化反應平穩(wěn)，速度較快，反應較完全。

作為優(yōu)選，所述縮合反應時加入的6-磷酸葡萄糖脫氫酶與甘膽酸的質量比為1:1000-1000:1。

作為優(yōu)選，所述透析純化的透析液為PBS緩沖液，pH為7.4-7.8，溫度為0-5℃，透析時間10-20h。

在上述條件下透析能將生成的甘膽酸酶偶聯(lián)物保留在透析袋內，而將其他雜質分子排出透析袋外，從而達到純化甘膽酸酶偶聯(lián)物的目的，同時保證適當?shù)耐肝鏊俣?，保持在較低的溫度下保證透析液在透析過程中不發(fā)生變質。

作為優(yōu)選，甘膽酸抗體溶液中所述輔助試劑包括穩(wěn)定劑、防腐劑，所述穩(wěn)定劑為BSA、蔗糖、甘露糖、海藻糖、PEG中的一種或多種，所述防腐劑為疊氮化鈉。

甘膽酸抗體是一種蛋白質，蛋白在高濃度時不容易降解(>1mg/ml)，在低濃度時(<0.1mg/ml)易降解而失活，因此需要加入穩(wěn)定劑確保其活性，加入的穩(wěn)定劑也可以減少抗體由于管壁吸附所造成的損失。

作為優(yōu)選，甘膽酸酶偶聯(lián)物溶液中所述輔助試劑包括金屬離子化合物、防腐劑，所述金屬離子化合物選自含Mg²⁺、Ba²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺的化合物中的一種或多種，如MgCl₂、BaCl₂、CaCl₂、CuCl₂、ZnCl₂等，所述防腐劑為疊氮化鈉。

作為優(yōu)選，甘膽酸酶偶聯(lián)物溶液中所述金屬離子的濃度為0.5-20mmol/L。

上述金屬離子作為酶蛋白輔助因子酶的重要組成成分，能與酶及底物形成各種形式的三元絡合物，不僅保證了酶與底物的正確定向結合，而且金屬離子還可作為催化基團，參與各種方式的催化作用，在酶促反應中起著傳遞電子、原子或某些化學基團的作用。

作為優(yōu)選，所述甘膽酸抗體溶液和甘膽酸酶偶聯(lián)物溶液中疊氮化鈉的質量百分比含量為0.1-0.3％。

作為優(yōu)選，所述甘膽酸抗體溶液和甘膽酸酶偶聯(lián)物溶液中Tris-HCl緩沖液的pH均為7.4-9.0。

甘膽酸酶偶聯(lián)物的合成路線如下：

甘膽酸均相酶免疫診斷試劑用于人血清中甘膽酸含量的體外定量測定，使用方法如下：

(1)在甘膽酸校準品中分別加入甘膽酸抗體溶液，混勻，在37℃下孵育3-5min，然后加入甘膽酸酶偶聯(lián)物溶液，混勻，37℃孵育1.5min，在測定波長下連續(xù)監(jiān)測1-3分鐘的吸光度變化，計算△A/min，以甘膽酸校準品的濃度為橫坐標，以所得的△A/min為縱坐標繪制校準曲線。

(2)按照上述方法檢測計算新鮮血清標本的△A/min，以△A/min在校準曲線上可求得新鮮血清標本中甘膽酸的含量。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的制備方法制備過程簡單易控，制備出的膽酸均相酶免疫診斷試劑使用起來操作簡單，對檢測人員要求不高，安全快速、高效、靈敏，能準確檢測出待測樣本中甘膽酸含量。

附圖說明

圖1為甘膽酸校準品的校準曲線圖。

具體實施方式

以下是本發(fā)明的具體實施例，對本發(fā)明的技術方案作進一步的描述，但本發(fā)明并不限于這些實施例。

下面通過具體實施例1-5對本發(fā)明中的甘膽酸均相酶免疫診斷試劑的制備方法作進一步解釋，通過實施例6-10對本發(fā)明中的甘膽酸均相酶免疫診斷試劑在人血清甘膽酸含量的體外測定中的應用作進一步解釋。

實施例1

一種甘膽酸均相酶免疫診斷試劑的制備方法：

(1)制備甘膽酸抗體溶液，

將甘膽酸抗體加入到pH為7.4的Tris-HCl緩沖液中，并加入6-磷酸葡萄糖、NADP、BSA、疊氮化鈉，混合均勻，即為甘膽酸抗體溶液，在甘膽酸抗體溶液中甘膽酸抗體的濃度為0.05mg/ml，疊氮化鈉的質量百分比含量為0.1％；

(2)制備甘膽酸酶偶聯(lián)物溶液，

將甘膽酸加入到MES緩沖液中，加入羧基活化劑EDC-NHS進行羧基活化，羧基活化的溫度為0℃，時間為5min，pH為5.5，然后在羧基活化后的甘膽酸中加入6-磷酸葡萄糖脫氫酶進行縮合反應得到甘膽酸酶偶聯(lián)物粗品，6-磷酸葡萄糖脫氫酶與甘膽酸的質量比為1:1000，將甘膽酸酶偶聯(lián)物粗品在pH為7.4的PBS緩沖液中透析10h后得到甘膽酸酶偶聯(lián)物，透析溫度為0℃，

將甘膽酸酶偶聯(lián)物加入到pH為7.4的Tris-HCl緩沖液中，并加入MgCl₂、疊氮化鈉，混合均勻，即為甘膽酸酶偶聯(lián)物溶液，甘膽酸酶偶聯(lián)物濃度為1.0μg/ml，MgCl₂濃度為0.5mmol/L，疊氮化鈉的質量百分比含量為0.1％；

(3)制備甘膽酸校準品，將質量百分比為0.2％的BSA溶于PH7.4的PBS緩沖液中制成BSA-PBS溶液，再將甘膽酸溶于 BSA-PBS溶液中制成濃度分別為0、2.5、5、10、20、50μg/ml的甘膽酸校準品。

實施例2

一種甘膽酸均相酶免疫診斷試劑的制備方法：

(1)制備甘膽酸抗體溶液，

將甘膽酸抗體加入到pH為8.0的Tris-HCl緩沖液中，并加入6-磷酸葡萄糖、NADP、蔗糖、疊氮化鈉，混合均勻，即為甘膽酸抗體溶液，其中，甘膽酸抗體的濃度為0.2mg/ml，疊氮化鈉的質量百分比含量為0.2％；

(2)制備甘膽酸酶偶聯(lián)物溶液，

將甘膽酸加入到MES緩沖液中，加入羧基活化劑EDC-NHS進行羧基活化，羧基活化的溫度為10℃，時間為15min，pH為6.0，然后在羧基活化后的甘膽酸中加入6-磷酸葡萄糖脫氫酶進行縮合反應得到甘膽酸酶偶聯(lián)物粗品，其中，6-磷酸葡萄糖脫氫酶與甘膽酸的質量比為1:10，將甘膽酸酶偶聯(lián)物粗品在pH為7.8的PBS緩沖液中透析13h后得到甘膽酸酶偶聯(lián)物，透析溫度為2℃，

將甘膽酸酶偶聯(lián)物加入到pH為8.0的Tris-HCl緩沖液中，并加入BaCl₂、疊氮化鈉，混合均勻，即為甘膽酸酶偶聯(lián)物溶液，其中，甘膽酸酶偶聯(lián)物濃度為3.0μg/ml，BaCl₂濃度為2.0mmol/L，疊氮化鈉的質量百分比含量為0.2％；

(3)制備甘膽酸校準品，將質量百分比為0.5％的BSA溶于PH7.4的PBS緩沖液中制成BSA-PBS溶液，再將甘膽酸溶于BSA-PBS溶液中制成濃度分別為0、5、10、15、25、50μg/ml的甘膽酸校準品。

實施例3

一種甘膽酸均相酶免疫診斷試劑的制備方法：

(1)制備甘膽酸抗體溶液，

將甘膽酸抗體加入到pH為8.5的Tris-HCl緩沖液中，并加入6-磷酸葡萄糖、NADP、甘露糖、疊氮化鈉，混合均勻，即為甘膽酸抗體溶液，其中，甘膽酸抗體的濃度為5mg/ml，疊氮化鈉的質量百分比含量為0.3％；

(2)制備甘膽酸酶偶聯(lián)物溶液，

將甘膽酸加入到MES緩沖液中，加入羧基活化劑EDC-NHS進行羧基活化，羧基活化的溫度為20℃，時間為25min，pH為6.5，然后在羧基活化后的甘膽酸中加入6-磷酸葡萄糖脫氫酶進行縮合反應得到甘膽酸酶偶聯(lián)物粗品，其中，6-磷酸葡萄糖脫氫酶與甘膽酸的質量比為1:1，將甘膽酸酶偶聯(lián)物粗品在pH為7.4的PBS緩沖液中透析15h后得到甘膽酸酶偶聯(lián)物，透析溫度為3℃，

將甘膽酸酶偶聯(lián)物加入到pH為8.5的Tris-HCl緩沖液中，并加入CaCl₂、疊氮化鈉，混合均勻，即為甘膽酸酶偶聯(lián)物溶液，其中，甘膽酸酶偶聯(lián)物濃度為5.0μg/ml，CaCl₂濃度為5mmol/L，疊氮化鈉的質量百分比含量為0.3％；

(3)制備甘膽酸校準品，將質量百分比為1.0％的BSA溶于PH7.4的PBS緩沖液中制成BSA-PBS溶液，再將甘膽酸溶于BSA-PBS溶液中制成濃度分別為0、2.5、5、10、20、50μg/ml的甘膽酸校準品。

實施例4

一種甘膽酸均相酶免疫診斷試劑的制備方法：

(1)制備甘膽酸抗體溶液，

將甘膽酸抗體加入到pH為9.0的Tris-HCl緩沖液中，并加入6-磷酸葡萄糖、NADP、海藻糖、疊氮化鈉，混合均勻，即為甘膽酸抗體溶液，其中，甘膽酸抗體的濃度為8mg/ml，疊氮化鈉的質量百分比含量為0.1％；

(2)制備甘膽酸酶偶聯(lián)物溶液，

將甘膽酸加入到MES緩沖液中，加入羧基活化劑EDC-NHS 進行羧基活化，羧基活化的溫度為30℃，時間為40min，pH為5.5，然后在羧基活化后的甘膽酸中加入6-磷酸葡萄糖脫氫酶進行縮合反應得到甘膽酸酶偶聯(lián)物粗品，6-磷酸葡萄糖脫氫酶與甘膽酸的質量比為10:1，將甘膽酸酶偶聯(lián)物粗品在pH為7.8的PBS緩沖液中透析18h后得到甘膽酸酶偶聯(lián)物，透析溫度為4℃，

將甘膽酸酶偶聯(lián)物加入到pH為7.4的Tris-HCl緩沖液中，并加入CuCl₂、疊氮化鈉，混合均勻，即為甘膽酸酶偶聯(lián)物溶液，其中，甘膽酸酶偶聯(lián)物濃度為9.0μg/ml，CuCl₂濃度為10mmol/L，疊氮化鈉的質量百分比含量為0.1％；

(3)制備甘膽酸校準品，將質量百分比為2％的BSA溶于PH7.4的PBS緩沖液中制成BSA-PBS溶液，再將甘膽酸溶于BSA-PBS溶液中制成濃度分別為0、5、10、15、25、50μg/ml的甘膽酸校準品。

實施例5

一種甘膽酸均相酶免疫診斷試劑的制備方法：

(1)制備甘膽酸抗體溶液，

將甘膽酸抗體加入到pH為8.0的Tris-HCl緩沖液中，并加入6-磷酸葡萄糖、NADP、PEG、疊氮化鈉，混合均勻，即為甘膽酸抗體溶液，甘膽酸抗體的濃度為10mg/ml，疊氮化鈉的質量百分比含量為0.3％；

(2)制備甘膽酸酶偶聯(lián)物溶液，

將甘膽酸加入到MES緩沖液中，加入羧基活化劑EDC-NHS進行羧基活化，羧基活化的溫度為37℃，時間為60min，pH為6.0，然后在羧基活化后的甘膽酸中加入6-磷酸葡萄糖脫氫酶進行縮合反應得到甘膽酸酶偶聯(lián)物粗品，6-磷酸葡萄糖脫氫酶與甘膽酸的質量比為1000:1，將甘膽酸酶偶聯(lián)物粗品在pH為7.4的PBS緩沖液中透析20h后得到甘膽酸酶偶聯(lián)物，透析溫度為5℃，

將甘膽酸酶偶聯(lián)物加入到pH為8.0的Tris-HCl緩沖液中，并 加入ZnCl₂、疊氮化鈉，混合均勻，即為甘膽酸酶偶聯(lián)物溶液，其中，甘膽酸酶偶聯(lián)物濃度為10.0μg/ml，ZnCl₂濃度為20mmol/L，疊氮化鈉的質量百分比含量為0.3％；

(3)制備甘膽酸校準品，將質量百分比為5％的BSA溶于PH7.4的PBS緩沖液中制成BSA-PBS溶液，再將甘膽酸溶于BSA-PBS溶液中制成濃度分別為0、2.5、5、10、20、50μg/ml的甘膽酸校準品。

實施例6

(1)取實施例1中制備的甘膽酸均相酶免疫診斷試劑，在甘膽酸校準品中分別加入200μl的甘膽酸抗體溶液，混勻，在37℃下孵育3min，然后加入50μl甘膽酸酶偶聯(lián)物溶液，混勻，37℃孵育1.5min，在測定波長下連續(xù)監(jiān)測1分鐘的吸光度變化，計算△A/min，以甘膽酸校準品的濃度為橫坐標，以所得的△A/min為縱坐標繪制校準曲線，如圖1所示。

(2)按照上述方法檢測計算12μl的新鮮血清標本的△A/min，以△A/min在校準曲線上可求得新鮮血清標本中甘膽酸的含量。

實施例7-10

分別取實施例2-5中制備的甘膽酸均相酶免疫診斷試劑，按實施例6中所述的方法檢測新鮮血清標本中甘膽酸的含量，此處不再累述。

對本發(fā)明中制備的甘膽酸均相酶免疫診斷試劑的準確度和精確度進行檢驗：

(1)準確度的檢驗：

采用比對試驗，選用不同已知濃度的待測樣品樣品1-樣品5，采用本發(fā)明實施例1中制備的試劑進行測定，測定結果如表1所示。

表1：準確度檢驗結果

求得線性回歸方程：y＝0.914x+0.661，理論值與測得值的相關系數(shù)r²＝0.9976≥0.95，說明測得值與理論值的相關性較好。

(2)精確度的檢驗：

批內精密度測定：

分別取較低濃度和較高濃度的兩個血清樣品，采用本發(fā)明實施例1中方法制備的同一批次試劑分別進行10次測定，計算標準差、相對偏差和批內變異系數(shù)，所得數(shù)值如表2所示，所得標準差數(shù)值較小，說明測定值較接近平均值，測定結果穩(wěn)定。

表2批內精密度測定數(shù)值

批間精密度測定：

選取較低濃度和較高濃度的兩個血清樣品，采用本發(fā)明實施 例1中方法制備的三個不同批次的試劑進行測定，所得結果如表3所示。

表3批間精密度測定數(shù)據(jù)

綜上所述，本發(fā)明采用對甘膽酸進行羧基活化然后與6-磷酸葡萄糖脫氫酶縮合制備的方式甘膽酸酶偶聯(lián)物，甘膽酸酶偶聯(lián)物與甘膽酸抗體、甘膽酸校準品共同構成甘膽酸均相酶免疫診斷試劑，該甘膽酸均相酶免疫診斷試劑安全快速、高效、靈敏、能準確檢測出待測樣本中甘膽酸含量的甘膽酸均相酶免疫診斷試劑的制備方法，并且使用起來操作簡單，對檢測人員要求不高；該制備方法制備過程簡單易控。

本文中所描述的具體實施例僅僅是對本發(fā)明精神作舉例說明。本發(fā)明所屬技術領域的技術人員可以對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，但并不會偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權利要求書所定義的范圍。