本發(fā)明涉及一種肺癌篩查試劑盒。

背景技術(shù)：
肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，目前發(fā)病率居世界首位，嚴(yán)重威脅著人類健康和生命。肺癌的病因復(fù)雜，一般認(rèn)為影響因素包括：①吸煙；②環(huán)境污染：如霧霾、室內(nèi)裝修；③不良生活方式：如飲食習(xí)慣差、生活壓力大；④慢性肺部疾?。喝绶谓Y(jié)核、塵肺，矽肺、慢性支氣管炎；⑤人體內(nèi)在因素：如家族遺傳、免疫機(jī)能降低、內(nèi)分泌功能失調(diào)等。同時(shí)，肺癌是一種善于隱匿的疾病，經(jīng)常在疾病發(fā)展到晚期才表現(xiàn)出臨床癥狀，70～80％的肺癌患者在診斷出患有肺癌癥狀時(shí)已是中、晚期，癌細(xì)胞已經(jīng)擴(kuò)散，錯(cuò)過了最佳治愈時(shí)機(jī)，五年生存率低。對(duì)于早期的肺癌患者，經(jīng)過及時(shí)治療可大大提高患者的5年及以上生存率和生存質(zhì)量。因此肺癌的早期診斷和進(jìn)行有效的篩查至關(guān)重要。肺癌的篩查，是指對(duì)那些沒有肺癌相關(guān)癥狀的人群進(jìn)行常規(guī)體檢，在出現(xiàn)癥狀前及時(shí)發(fā)現(xiàn)肺癌。如果可以找到血液里面的肺癌分子標(biāo)志物，用于提示臨床醫(yī)生早期對(duì)患者采取相關(guān)的治療措施或者決策具有重要的意義。Cerberus，又稱Cerberus1、CER-1，最早是從非洲蟾蜍體內(nèi)分離得到，是一種Wnt信號(hào)通路拮抗劑，Cerberus通過直接與Wnt蛋白相連從而阻止Wnt與受體蛋白復(fù)合物相連。目前未見關(guān)于Cerberus與肺癌相關(guān)的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決上述問題，發(fā)明人對(duì)肺癌進(jìn)行了詳細(xì)研究，發(fā)現(xiàn)了Cerberus可以作為其分子標(biāo)志物。其中，Cerberus在血清中的表達(dá)水平與肺癌呈正相關(guān)。因此，通過檢測(cè)血清中Cerberus的表達(dá)水平，可以預(yù)測(cè)待檢人群患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)此，本發(fā)明提供了一種肺癌篩查試劑盒，以及檢測(cè)Cerberus的表達(dá)水平的試劑在制備肺癌篩查試劑中的用途。本發(fā)明的肺癌篩查試劑盒，它包括任選的用于檢測(cè)Cerberus表達(dá)水平的試劑。其中，所述試劑是用于檢測(cè)血清中Cerberus表達(dá)水平的試劑。其中，所述檢測(cè)Cerberus表達(dá)水平的試劑為蛋白芯片檢測(cè)方法用試劑。其中，所述檢測(cè)Cerberus表達(dá)水平的試劑為ELISA檢測(cè)方法用試劑或WesternBlot檢測(cè)方法用試劑。本發(fā)明還提供了檢測(cè)Cerberus表達(dá)水平的試劑在制備肺癌篩查用試劑中的用途。其中，所述試劑是用于檢測(cè)血清中Cerberus表達(dá)水平的試劑。其中，所述檢測(cè)Cerberus表達(dá)水平的試劑為蛋白芯片檢測(cè)方法用試劑。其中，所述檢測(cè)Cerberus表達(dá)水平的試劑為ELISA檢測(cè)方法用試劑或WesternBlot檢測(cè)方法用試劑。本發(fā)明試劑盒通過檢測(cè)Cerberus的表達(dá)水平，可以判斷待檢人群患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)：若Cerberus的表達(dá)水平高，則患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)高，若Cerberus的表達(dá)水平低，則患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)低，可用于臨床肺癌的輔助診斷，臨床應(yīng)用前景良好。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。附圖說明圖1為早期肺癌患者與健康對(duì)照血漿Cerberus檢測(cè)結(jié)果圖具體實(shí)施方式實(shí)施例1Cerberus表達(dá)水平與肺癌的關(guān)系實(shí)驗(yàn)方法如下：一、臨床資料選取早期肺癌患者15例，健康對(duì)照10例，基本信息如下：基本信息肺癌患者健康對(duì)照人數(shù)1510年齡61.2±12.249.5±10.6男性比例10(66.7％)6(60.0％)二、Cerberus表達(dá)水平的檢測(cè)(定量檢測(cè)Cerberus的含量)采用在RayBiotech公司購(gòu)買的AAH-BLG-CUST試劑盒(貨號(hào)：AAH-BLG-CUST)，按照如下方法檢測(cè)Cerberus的表達(dá)水平：1、樣品透析抽取肺癌患者及健康對(duì)照的血液，EDTA抗凝后離心(1200rpm，10min)，將上清吸取后進(jìn)行第二次離心(3000rpm，15min)，吸取第二次離心后的上清即血漿，作為檢測(cè)標(biāo)本，分裝后-80℃保存。血漿樣品在生物素標(biāo)記前需要利用透析管進(jìn)行透析。分別取樣品100μL加入到透析管中，然后在4000mL的1×PBS(pH＝8)中4℃邊攪拌邊透析。間隔3小時(shí)更換透析液一次，透析三次后收集樣品至1.5mL離心管。注：1×PBS的配制：1.0gKCl,40gNaCl,1.0gKH2PO4,5.75gNa2HPO4用4,500ml去離子水溶解，用1MNaOH調(diào)節(jié)pH＝8.0，最后用去離子水定容至5,000ml。2、生物素標(biāo)記樣品在整個(gè)生物素標(biāo)記樣品的過程，避免任何試劑受到胺類物質(zhì)或疊氮鈉的污染。1)使用標(biāo)記試劑前，將標(biāo)記試劑(LabelingReagent)小管快速離心后，管中加入100μL1×PBS溶解標(biāo)記試劑粉末，上下吹打?qū)?biāo)記試劑混勻，制備成1×標(biāo)記試劑溶液。2)向裝有35ul樣本的離心管中加入22ul的1×標(biāo)記試劑溶液和155ul標(biāo)記緩沖液?？焖倩靹颍瑩u床上室溫孵育30min，每5min輕彈離心管，混合反應(yīng)試劑。3)孵育30min后，在上步反應(yīng)液中加入3μL終止液(StopSolution)；4)分別取樣品已加入終止液后樣品各100μL加入透析管中，然后在4000mL的1×PBS(pH＝8)中4℃邊攪拌邊透析。間隔3小時(shí)更換透析液一次。透析三次以后收集樣品。3、玻片芯片的完全干燥將玻片芯片(Biotinlabel-basedhumanantibodyarray1and2)從盒子中取出來，在室溫平衡20-30min后，將包裝袋打開，揭開密封條，然后將芯片放在真空干燥器或者室溫干燥1-2小時(shí)。4、封閉和孵育1)每個(gè)芯片孔中加入100μL的封閉緩沖液(BlockingBuffer)，室溫?fù)u床上孵育1h，避免產(chǎn)生氣泡；2)抽去封閉液，每個(gè)孔中添加100μL透析后樣品，一個(gè)陣列一個(gè)樣品，4℃振蕩孵育12-16h。3)清洗使用ThermoScientificWellwashVersa芯片洗板機(jī)清洗玻片，分為兩步：首先用1×洗液I(WashBufferI)(用去離子水稀釋20×洗液I得到)進(jìn)行清洗，每孔250μL的1×洗液I，清洗5次，每次震蕩10s，震蕩強(qiáng)度選擇高；然后換用1×洗液II通道進(jìn)行清洗，每孔250μL的1×洗液II(WashBufferII)(用去離子水稀釋20×洗液II得到)，清洗3次，每次震蕩10s，震蕩強(qiáng)度選擇高。4)抽去1×洗液II，每孔加入100uL用封閉液1500稀釋的Cy3equivalent室溫避光振蕩孵育2小時(shí)。5)按照步驟3)和4)洗玻片。5、熒光檢測(cè)采用激光掃描儀例如AxonGenePix掃描信號(hào)，采用Cy3或者綠色通道(激發(fā)頻率＝532nm)，掃描儀器：GenePix4000BMicroarrayScanner(產(chǎn)地：MolecularDevices,LLC；1311OrleansDriveSunnyvale,CA94089-1136UnitedStates)，掃描參數(shù)：PMT:高強(qiáng)度,Wavelengh：532nm；resolution：10um。采用儀器自帶分析軟件提取數(shù)據(jù)，采用AAH-BLG-CUST的數(shù)據(jù)分析軟件來進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)分析后，可直接得出各樣品的Cerberus蛋白濃度。三、結(jié)果分析差異性分析：采用SPSS17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)組(肺癌患者)和對(duì)照組(健康體檢人群)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。圖片制作：用GraphPadPrism5.0軟件完成。四、Cerberus的表達(dá)水平與肺癌的相關(guān)性肺癌患者與健康對(duì)照血清中Cerberus的表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果見圖1。由圖1可見，肺癌患者的血清Cerberus平均表達(dá)水平為2020pg/ml，健康對(duì)照的血清Cerberus平均表達(dá)水平為750pg/ml，Cerberus在早期肺癌患者中顯著升高，與健康對(duì)照組相比，Cerberus表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由以上結(jié)果可以看出，與正常人群相比，早期肺癌患者的Cerberus表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，說明肺癌與Cerberus表達(dá)水平呈正相關(guān)，Cerberus的高表達(dá)會(huì)顯著提高患肺癌的可能性，因此，可以通過檢測(cè)待檢人群的Cerberus的表達(dá)水平，將肺癌的易感人群篩查出來。實(shí)施例2本發(fā)明檢測(cè)血液Cerberus表達(dá)水平的試劑盒的組成及其使用方法一、Cerberus檢測(cè)試劑盒的組成檢測(cè)試劑盒(30人份)：二、Cerberus檢測(cè)試劑盒的使用方法使用方法如下：1、樣品透析抽取肺癌患者及健康對(duì)照的血液，EDTA抗凝后離心(1200rpm，10min)，將上清吸取后進(jìn)行第二次離心(3000rpm，15min)，吸取第二次離心后的上清即血漿，作為檢測(cè)標(biāo)本，分裝后-80℃保存。血漿樣品在生物素標(biāo)記前需要利用透析管進(jìn)行透析。分別取樣品100μL加入到透析管中，然后在4000mL的1×PBS(pH＝8)中4℃邊攪拌邊透析。間隔3小時(shí)更換透析液一次，透析三次后收集樣品至1.5mL離心管。注：1×PBS的配制：1.0gKCl,40gNaCl,1.0gKH2PO4,5.75gNa2HPO4用4,500ml去離子水溶解，用1MNaOH調(diào)節(jié)pH＝8.0，最后用去離子水定容至5,000ml。2、生物素標(biāo)記樣品在整個(gè)生物素標(biāo)記樣品的過程，避免任何試劑受到胺類物質(zhì)或疊氮鈉的污染。1)使用標(biāo)記試劑前，將標(biāo)記試劑(LabelingReagent)小管快速離心后，管中加入100μL1×PBS溶解標(biāo)記試劑粉末，上下吹打?qū)?biāo)記試劑混勻，制備成1×標(biāo)記試劑溶液。2)向裝有35ul樣本的離心管中加入22ul的1×標(biāo)記試劑溶液和155ul標(biāo)記緩沖液?？焖倩靹?，搖床上室溫孵育30min，每5min輕彈離心管，混合反應(yīng)試劑。3)孵育30min后，在上步反應(yīng)液中加入3μL終止液(StopSolution)；4)分別取樣品已加入終止液后樣品各100μL加入透析管中，然后在4000mL的1×PBS(pH＝8)中4℃邊攪拌邊透析。間隔3小時(shí)更換透析液一次。透析三次以后收集樣品。3、玻片芯片的完全干燥將玻片芯片(Biotinlabel-basedhumanantibodyarray1and2)從盒子中取出來，在室溫平衡20-30min后，將包裝袋打開，揭開密封條，然后將芯片放在真空干燥器或者室溫干燥1-2小時(shí)。4、封閉和孵育1)每個(gè)芯片孔中加入100μL的封閉緩沖液(BlockingBuffer)，室溫?fù)u床上孵育1h，避免產(chǎn)生氣泡；2)抽去封閉液，每個(gè)孔中添加100μL透析后樣品，一個(gè)陣列一個(gè)樣品，4℃振蕩孵育12-16h。3)清洗使用ThermoScientificWellwashVersa芯片洗板機(jī)清洗玻片，分為兩步：首先用1×洗液I(WashBufferI)(用去離子水稀釋20×洗液I得到)進(jìn)行清洗，每孔250μL的1×洗液I，清洗5次，每次震蕩10s，震蕩強(qiáng)度選擇高；然后換用1×洗液II通道進(jìn)行清洗，每孔250μL的1×洗液II(WashBufferII)(用去離子水稀釋20×洗液II得到)，清洗3次，每次震蕩10s，震蕩強(qiáng)度選擇高。4)抽去1×洗液II，每孔加入100uL用封閉液1500稀釋的Cy3equivalent室溫避光振蕩孵育2小時(shí)。5)按照步驟3)和4)洗玻片。5、熒光檢測(cè)采用激光掃描儀例如AxonGenePix掃描信號(hào)，采用Cy3或者綠色通道(激發(fā)頻率＝532nm)，掃描儀器：GenePix4000BMicroarrayScanner(產(chǎn)地：MolecularDevices,LLC；1311OrleansDriveSunnyvale,CA94089-1136UnitedStates)，掃描參數(shù)：PMT:高強(qiáng)度,Wavelengh：532nm；resolution：10um。采用儀器自帶分析軟件提取數(shù)據(jù)，采用AAH-BLG-CUST的數(shù)據(jù)分析軟件來進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)分析后，可直接得出各樣品的Cerberus蛋白濃度。綜上，本發(fā)明試劑盒通過檢測(cè)Cerberus的表達(dá)水平，可以篩查待檢人群患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)：若Cerberus的表達(dá)水平高，則患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)高，若Cerberus的表達(dá)水平低，則患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)低，可用于臨床肺癌的輔助診斷，為患者采取相關(guān)的治療措施或者決策提供有效的依據(jù)，臨床應(yīng)用前景良好。