本發(fā)明涉及一種細(xì)胞膜蛋白的定量方法，更具體的，本發(fā)明涉及使用納米酶原位定量細(xì)胞膜蛋白的方法。

背景技術(shù)：

納米酶是一類既有納米材料的獨(dú)特性能，又有催化功能的模擬酶。鑒于納米酶既有天然酶的高催化活性，又有性質(zhì)穩(wěn)定而經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，自2007年以來，納米酶的研究迅速崛起，研究的涉及面也逐漸廣泛，目前已經(jīng)包括材料科學(xué)、物理、化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)和環(huán)境等不同領(lǐng)域。

傳統(tǒng)的膜蛋白定量方法包括將細(xì)胞裂解，進(jìn)行簡單分離純化，然后利用酶聯(lián)免疫分析方法對所分離的蛋白粗提物進(jìn)行定量分析。但是，傳統(tǒng)方法面臨很多問題，例如膜蛋白提取和純化過程不可避免地存在蛋白損失，直接分析粗提蛋白或者復(fù)雜的生物樣本將面臨背景雜蛋白干擾，過程復(fù)雜而繁瑣，從而很難實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜蛋白的快速準(zhǔn)確定量。

因此，目前急需建立一種快速的、準(zhǔn)確的、可視化的原位定量細(xì)胞膜蛋白表達(dá)量的分析方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本申請?zhí)峁┝丝焖俚?、?zhǔn)確的、可視化的原位定量細(xì)胞膜蛋白表達(dá)量的方法。

具體的，本申請涉及一種原位定量細(xì)胞膜蛋白表達(dá)量的方法，所述方法包括：

1)使納米酶與細(xì)胞膜蛋白接觸；和

2)通過與細(xì)胞膜蛋白結(jié)合的納米酶原位定量細(xì)胞膜蛋白表達(dá)的量，

其中，所述納米酶含有與所述細(xì)胞膜蛋白結(jié)合的靶向肽。

在一些實(shí)施方案中，所述納米酶由金屬納米顆粒核心和靶向肽外殼組 成。

在一些實(shí)施方案中，納米酶可以是由金屬納米顆粒核心和靶向肽外殼組成的納米酶顆?；蚣{米酶團(tuán)簇。

在一些實(shí)施方案中，用于納米酶的金屬為本身在待測細(xì)胞中含量低的金屬，例如金或銀。

在一些實(shí)施方案中，納米酶中的靶向肽是經(jīng)過模板蛋白修飾的靶向肽，例如連接有牛血清白蛋白(bsa)的靶向肽。在一些實(shí)施方案中，模板蛋白(例如bsa)與靶向肽通過酰胺鍵連接或者通過偶氮鍵連接。

在一些實(shí)施方案中，模板蛋白(例如bsa)與靶向肽偶聯(lián)是通過碳二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)反應(yīng)形成酰胺鍵。具體的，模板蛋白(例如bsa)與靶向肽偶聯(lián)是通過靶向肽的氨基首先與琥珀酸酐反應(yīng)形成琥珀酸半酯，再經(jīng)過edc催化，與蛋白質(zhì)形成了酰胺鍵。

在一些實(shí)施方案中，模板蛋白(例如bsa)與靶向肽偶聯(lián)是通過重氮鹽修飾的靶向蛋白(例如bsa)與模板肽中的酪氨酸殘基上的鄰位發(fā)生反應(yīng)形成偶氮鍵。

在一些實(shí)施方案中，所述模板蛋白選自：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白及其它水溶性蛋白。

在一些實(shí)施方案中，所述納米酶顆粒通過以下步驟獲得：

1)將胱胺二鹽酸鹽在室溫下與金屬鹽溶液混合溶解，攪拌后加入nabh4水溶液攪拌反應(yīng)，之后離心獲得膠體納米金屬顆粒；

2)將多肽水溶液在室溫下與步驟1)獲得的納米金屬顆?；旌喜⒎磻?yīng)，離心獲得納米酶顆粒。

在一些實(shí)施方案中，所述納米酶團(tuán)簇通過以下步驟獲得：

1)將靶向肽與edc和nhs混合溶解攪拌，從而激活靶向肽的羧基，然后將模板蛋白(例如bsa)與上述混合物混合，室溫下繼續(xù)攪拌過夜，透析獲得模板蛋白修飾的靶向肽；

2)將金屬鹽溶液與步驟1)獲得的修飾的靶向肽溶液混合，之后加入naoh溶液調(diào)節(jié)ph值到12，所形成的溶液繼續(xù)在37℃攪拌，超濾獲得納米酶團(tuán)簇。

在一些實(shí)施方案中，所使用的金屬鹽溶液可以是，例如haucl4、agno3 溶液。

在一些實(shí)施方案中，所述靶向肽是天然來源或者合成的多肽，其可以靶向細(xì)胞膜蛋白，例如靶向整合素(例如gpiib/iiia、αvβ3)的多肽，如靶向肽為h2n-ckkkkqagdv-cooh或h2n-grgdsc-cooh；靶向表皮生長因子受體的多肽，如靶向肽為h2n-clarllt-cooh；靶向胰島素樣生長因子受體的多肽，如靶向肽為h2n-cskapklpaayc-cooh；靶向鈣粘連蛋白的多肽，如靶向肽為h2n-clfshavssng-cooh等。

在一些實(shí)施方案中，靶向整合素gpiib/iiia的靶向肽的序列為：h2n-ckkkkqagdv-cooh(seqidno.1：)。

在一些實(shí)施方案中，靶向整合素αvβ3的靶向肽的序列為：h2n-grgdsc-cooh(seqidno.2：)。

在一些實(shí)施方案中，所述原位定量通過以下進(jìn)行：

1)使用酶聯(lián)免疫的方法而進(jìn)行；或者

2)使用電感耦合等離子體質(zhì)譜(icp-ms)定量金屬元素的含量而進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，酶聯(lián)免疫方法通過化學(xué)顯色反應(yīng)(利用吸光度)或者熒光反應(yīng)(利用熒光強(qiáng)度)而進(jìn)行，例如使用對過氧化物酶催化敏感的化學(xué)試劑作為顯色底物或發(fā)光底物，例如3',3',5',5',-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)、重氮胺基苯(diazoaminobenzene,dab)、鄰苯二胺(o-phenylenediamine,opd)、amplexred、對苯二甲酸(terephthalicacid,ta)或二氫乙錠(hydroethidine,he)等。

在一些實(shí)施方案中，酶聯(lián)免疫方法通過納米酶催化h2o2與dab生成棕黃色產(chǎn)物而利用吸光度進(jìn)行原位定量。

在一些實(shí)施方案中，酶聯(lián)免疫方法通過納米酶催化h2o2與opd生成橘色產(chǎn)物而利用吸光度進(jìn)行原位定量。

在一些實(shí)施方案中，酶聯(lián)免疫方法通過納米酶催化h2o2與ta反應(yīng)生成發(fā)藍(lán)色熒光而利用熒光強(qiáng)度進(jìn)行原位定量。

在一些實(shí)施方案中，酶聯(lián)免疫方法通過納米酶催化h2o2與he反應(yīng)生成發(fā)紅色熒光產(chǎn)物而利用熒光強(qiáng)度進(jìn)行原位定量。

在一些實(shí)施方案中，所述酶聯(lián)免疫的方法包括制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的過程。

附圖說明

圖1：針對細(xì)胞膜蛋白整合素gpiib/iiia的金納米酶顆粒的高分辨透射電鏡圖。

圖2：(a)利用金納米酶顆粒進(jìn)行的微孔板式酶聯(lián)免疫反應(yīng)(elisa)的反應(yīng)原理。(b)是利用所制備的針對細(xì)胞膜蛋白整合素gpiib/iiia的金納米酶顆粒制備的酶聯(lián)免疫反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖3：(a)利用金納米酶原位定量細(xì)胞膜蛋白的反應(yīng)原理。(b)是利用所制備的針對細(xì)胞膜蛋白整合素gpiib/iiia的金納米酶顆粒原位定量膜蛋白表達(dá)量。

圖4是針對細(xì)胞膜蛋白整合素αvβ3的銀納米酶顆粒的高分辨透射電鏡圖。

圖5是利用所制備的針對細(xì)胞膜蛋白整合素αvβ3的銀納米酶顆粒制備的酶聯(lián)免疫反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖6是利用所制備的針對細(xì)胞膜蛋白整合素αvβ3的銀納米酶顆粒原位定量膜蛋白表達(dá)量。

圖7是針對細(xì)胞膜蛋白整合素gpiib/iiia的金納米酶團(tuán)簇的高分辨透射電鏡圖。

圖8是利用所制備的針對細(xì)胞膜蛋白整合素gpiib/iiia的金納米酶團(tuán)簇制備的酶聯(lián)免疫反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖9是利用所制備的針對細(xì)胞膜蛋白整合素gpiib/iiia的金納米酶團(tuán)簇原位定量膜蛋白表達(dá)量。

圖10是針對細(xì)胞膜蛋白整合素αvβ3的銀納米酶團(tuán)簇的高分辨透射電鏡圖。

圖11是利用所制備的針對細(xì)胞膜蛋白整合素αvβ3的銀納米酶團(tuán)簇制備的酶聯(lián)免疫反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖12是利用所制備的針對細(xì)胞膜蛋白整合素αvβ3的銀納米酶團(tuán)簇原位定量膜蛋白表達(dá)量。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，以便于本領(lǐng)域技術(shù) 人員理解和實(shí)施本發(fā)明，并進(jìn)一步認(rèn)識本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。

除非在本發(fā)明說明書中另有定義，否則在此所有的技術(shù)術(shù)語都是根據(jù)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所通常使用和理解的慣用定義來使用。下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1：針對整合素gpiib/iiia通過配體交換法制備納米酶

在本實(shí)施例中，采用金納米顆粒，靶向肽是靶向細(xì)胞膜蛋白整合素gpiib/iiia的多肽。

1)制備巰基小分子保護(hù)的金納米顆粒

在室溫下將600μl的150mm胱胺二鹽酸鹽與20ml的3.0mmhaucl4混合溶解，攪拌30分鐘。隨后加入25μl濃度為500mm的nabh4水溶液，室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)30分鐘后，得到了紅色的膠體分散液。之后，用截流分子量為100kda的超濾管,7500rpm轉(zhuǎn)速下離心5分鐘來濃縮膠體金納米顆粒。

2)制備含金納米顆粒核心和多肽外殼的納米酶

1ml包含2.5mg多肽(seqidno.1：h2n-ckkkkqagdv-cooh)的水溶液在室溫下與1ml濃度為250nm的步驟1)制備的巰基小分子保護(hù)的金納米顆?；旌希覝叵路磻?yīng)6h。之后，用截流分子量為100kda的超濾管,7500rpm轉(zhuǎn)速下離心5分鐘來濃縮多肽保護(hù)的金納米顆粒(多肽-金納米顆粒，也即納米酶)。由此獲得的納米酶在4℃下至少可以穩(wěn)定存在一個月。圖1顯示出納米酶的平均粒徑在3.8nm左右。

實(shí)施例2：使用納米酶原位定量細(xì)胞膜蛋白整合素gpiib/iiia

利用實(shí)施例1制備的納米酶通過酶聯(lián)免疫分析來原位定量細(xì)胞膜蛋白表達(dá)量的方法，包括下述步驟：

1)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

2ug/ml的針對目標(biāo)整合素gpiib/iiia的多克隆抗體(人血小板膜糖蛋白gpiib/iiiaelisa檢測試劑盒，北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司)首先以100ul/孔包被在酶標(biāo)板的底部，之后將含3％bsa的pbs加入各個孔板中阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)1小時，隨后將50μl濃度為0、31.25、62.5、125、250 和375ngml^-1的整合素gpiib/iiia(人血小板膜糖蛋白gpiib/iiiaelisa檢測試劑盒，北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司)標(biāo)準(zhǔn)液加入到孔板中，然后加入濃度為250nm的50μl實(shí)施例1制備的納米酶，室溫下孵育30分鐘。用pbs清洗各個孔板后，加入100μl含800μmtmb和200mmh2o2的水溶液，在37℃條件下催化反應(yīng)30分鐘后，采用酶標(biāo)儀記錄每個孔在652nm處的吸光度。以整合素gpiib/iiia濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。由圖2結(jié)果獲知，梯度的整合素gpiib/iiia捕獲梯度的納米酶，對應(yīng)著梯度的催化顯色，且標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好(r²＝0.99)。

2)原位定量膜蛋白表達(dá)量

將人紅白血病(hel)細(xì)胞接種到96孔板中并使孔板中細(xì)胞增殖到0、0.5×10⁴、1.0×10⁴、1.5×10⁴、2.0×10⁴和2.5×10⁴個/孔的細(xì)胞梯度。接下來，將含3％bsa的pbs溶液加入各個孔板中阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)1小時。隨后用125nm的100μl實(shí)施例1制備的納米酶標(biāo)記細(xì)胞30分鐘，然后用pbs沖洗細(xì)胞。之后，加入100μl含800μmtmb和200mm的h2o2水溶液，在37℃條件下催化反應(yīng)30分鐘后，采用酶標(biāo)儀記錄每個孔在652nm處的吸光度。將每個孔中的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中定量計(jì)算整合素gpiib/iiia在單細(xì)胞上的表達(dá)量(圖3)。

由圖3顯示的結(jié)果可見，在腫瘤細(xì)胞的原位免疫分析中，梯度數(shù)目的細(xì)胞含有梯度的蛋白會識別梯度的納米酶，在同樣的分析條件下，對應(yīng)著梯度的催化顯色，且線性關(guān)系良好(r²＝0.99)。

將這部分顯色結(jié)果代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中，可計(jì)算單細(xì)胞中的整合素gpiib/iiia的表達(dá)量。如研究0.5×10⁴個hel細(xì)胞上的整合素gpiib/iiia的表達(dá)量，由圖3中獲知0.5×10⁴個hel細(xì)胞對應(yīng)著體系的吸光度為0.16,將該吸光度數(shù)值帶入到標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)中，對應(yīng)整合素gpiib/iiia的濃度為200ngml^-1。再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品整合素gpiib/iiia的體積，分子量，可定量計(jì)算單細(xì)胞中的整合素gpiib/iiia的表達(dá)量為6.4×10⁶。

同時，由于納米酶含有金元素的質(zhì)量信息，也可以通過icp-ms定量金元素含量反推蛋白表達(dá)量。采用icp-ms分析方法測得的單個hel細(xì)胞表面的gpiib/iiia表達(dá)量為5.9×10⁶，二者結(jié)果非常接近，從而驗(yàn)證了原位類酶免疫分析方法的準(zhǔn)確性。另外，由以上實(shí)驗(yàn)可以看出，本實(shí)施例的方法可靈敏地 對5000個細(xì)胞進(jìn)行分析。

實(shí)施例3：針對整合素αvβ3通過配體交換法制備納米酶

在本實(shí)施例中，采用銀納米顆粒，靶向肽是靶向人細(xì)胞膜蛋白整合素αvβ3的多肽。

1)制備巰基小分子保護(hù)的銀納米顆粒

在室溫下將500μl的150mm胱胺二鹽酸鹽與15ml的2.0mmagno3混合，攪拌30分鐘。隨后加入20μl濃度為400mm的nabh4水溶液，室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)30分鐘后，得到了黃色的膠體分散液。之后，用截流分子量為100kda的超濾管,7500rpm轉(zhuǎn)速下離心5分鐘濃縮膠體銀納米顆粒。

2)制備含銀納米顆粒核心和多肽外殼的納米酶

1ml包含2.5mg的多肽(seqidno.2：h2n-grgdsc-cooh)水溶液在室溫下與1ml濃度為200nm的步驟1)制備的巰基小分子保護(hù)的銀納米顆?；旌?，室溫下反應(yīng)6小時。之后，用截流分子量為100kda的超濾管,7500rpm轉(zhuǎn)速下離心5分鐘濃縮多肽保護(hù)的銀納米顆粒(多肽-銀納米顆粒，也即納米酶)。由此獲得的納米酶在4℃下至少可以穩(wěn)定存在一個月。圖4顯示出納米酶的平均粒徑在4.5nm左右。

實(shí)施例4：使用納米酶原位定量細(xì)胞膜蛋白整合素αvβ3

利用實(shí)施例3制備的納米酶通過酶聯(lián)免疫分析來原位定量膜蛋白表達(dá)量方法，包括下述步驟：

1)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

2ug/ml針對目標(biāo)整合素αvβ3的多克隆抗體(人整合素αvβ3酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒，上海聯(lián)碩生物科技有限公司)首先以100ul/孔包被在酶標(biāo)板的底部，之后用含3％bsa的pbs加入各個孔板中阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)1小時。隨后將50μl的濃度為0、31.25、62.5、125、250和375ngml^-1的整合素αvβ3(人整合素αvβ3酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒，上海聯(lián)碩生物科技有限公司)標(biāo)準(zhǔn)液加入到孔板中，然后加入50μl的200nm實(shí)施例3制備的納米酶，室溫下孵育30分鐘。用pbs清洗各個孔板后，加入100μl含600μmtmb和100mmh2o2的水溶液，在37℃條件下催化反應(yīng)30分鐘后，采用酶標(biāo)儀 記錄每個孔在652nm處的吸光度。以整合素αvβ3濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)。由圖5結(jié)果獲知，梯度的整合素αvβ3捕獲梯度的納米酶，對應(yīng)著梯度的催化顯色，且線性關(guān)系良好(r²＝0.98)。

2)原位定量膜蛋白表達(dá)量

將肺癌細(xì)胞a549接種到96孔板中并使孔板中細(xì)胞增殖到0、0.5×10⁴、1.0×10⁴、1.5×10⁴、2.0×10⁴和2.5×10⁴個/孔的細(xì)胞梯度。接下來，將含3％bsa的pbs溶液加入各個孔板中阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)1小時。隨后用100nm的100μl實(shí)施例3制備的納米酶標(biāo)記細(xì)胞30分鐘，然后用pbs沖洗細(xì)胞。之后，加入100μl含600μmtmb和100mm的h2o2水溶液，在37℃條件下催化反應(yīng)30分鐘后，采用酶標(biāo)儀記錄每個孔在652nm處的吸光度。將每個孔中的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中定量計(jì)算整合素αvβ3在單細(xì)胞上的表達(dá)量(圖6)。

由圖6的結(jié)果可以看出，在腫瘤細(xì)胞的原位免疫分析中，梯度數(shù)目的細(xì)胞含有梯度的蛋白會識別梯度的納米酶，在同樣的分析條件下，對應(yīng)著梯度的催化顯色，且線性關(guān)系良好(r²＝0.98)。

將這部分顯色結(jié)果代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中，可計(jì)算單細(xì)胞中的整合素αvβ3的表達(dá)量。如研究0.5×10⁴個a549細(xì)胞上的整合素αvβ3的表達(dá)量，由圖6中獲知0.5×10⁴個a549細(xì)胞對應(yīng)著體系的吸光度為0.040,將該吸光度數(shù)值帶入到標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)中，對應(yīng)整合素αvβ3的濃度為30ngml^-1。再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品整合素αvβ3的體積、分子量，可定量計(jì)算單細(xì)胞中的整合素αvβ3的表達(dá)量為9.0×10⁵。

同時，由于納米酶含有銀元素的質(zhì)量信息，也可以通過icp-ms定量銀元素含量反推蛋白表達(dá)量。采用icp-ms分析方法測得的單個a549細(xì)胞表面的αvβ3表達(dá)量為7.9×10⁵，二者結(jié)果非常接近，從而驗(yàn)證了原位類酶免疫分析方法的準(zhǔn)確性。

另外，由以上實(shí)驗(yàn)可以看出，本實(shí)施例的方法可靈敏地對5000個細(xì)胞進(jìn)行分析。

實(shí)施例5：針對整合素gpiib/iiia通過生物分子模板制備納米酶

在本實(shí)施例中，采用具有更小尺寸的、光吸收截面積更小的金團(tuán)簇，靶 向肽是靶向hel細(xì)胞膜蛋白整合素gpiib/iiia的多肽。

1)制備bsa修飾的靶向肽

將帶有羧基的靶向肽(seqidno.1：h2n-ckkkkqagdv-cooh)在室溫下與edc和nhs按照摩爾比1.0:1.0:0.5混合溶解，攪拌(500rpm)30分鐘，激活多肽的羧基。然后將250mgbsa與上述混合物混合，室溫下繼續(xù)攪拌(500rpm)過夜。多肽與bsa之間通過形成酰胺鍵而連接。產(chǎn)物用截留量8000-12000的透析袋透析12小時，凍干備用。

2)制備納米酶

利用步驟1)制備的bsa修飾的靶向肽作為礦化模板用于生物礦化金團(tuán)簇。具體的，將5ml濃度為10mm的haucl4溶液與5ml濃度為50mgml^-1的步驟1)制備的bsa修飾的多肽蛋白溶液混合，室溫?cái)嚢?0分鐘，之后加入0.5ml濃度為1m的naoh溶液調(diào)節(jié)ph值到12，所形成的溶液繼續(xù)在37℃攪拌12小時，所合成的多肽修飾的金團(tuán)簇用截留量3000的超濾管超濾除掉游離的金屬離子。圖7顯示出多肽修飾的金團(tuán)簇(即納米酶)的平均粒徑在2.0nm左右。

該實(shí)施例制備的多肽修飾的金團(tuán)簇的光吸收截面積小，可用于催化以熒光信號為酶聯(lián)免疫反應(yīng)讀出信號的分析方法。

實(shí)施例6：使用納米酶原位定量細(xì)胞膜蛋白整合素gpiib/iiia

利用實(shí)施例5制備的納米酶通過酶聯(lián)免疫分析來原位定量細(xì)胞膜蛋白整合素gpiib/iiia表達(dá)量的方法，包括下述步驟：

1)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

2ug/ml針對目標(biāo)整合素gpiib/iiia的多克隆抗體(人血小板膜糖蛋白gpiib/iiiaelisa檢測試劑盒，北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司)首先以100ul/孔包被在酶標(biāo)板的底部，之后用含3％bsa的pbs加入各個孔板中阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)1小時，隨后將50μl濃度為0、31.25、62.5、125、250和375ngml^-1的整合素gpiib/iiia(北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司)標(biāo)準(zhǔn)液加入到孔板中，然后加入50μl的20μm實(shí)施例5制備的納米酶，室溫下孵育30分鐘。用pbs清洗各個孔板后，加入100μl含20μmamplexred和1.0mmh2o2水溶液。在37℃條件下催化反應(yīng)30分鐘后，采用酶標(biāo)儀記錄 每個孔在波長為585nm處的熒光強(qiáng)度，此熒光發(fā)射波長對應(yīng)于氧化的amplexred的中心熒光發(fā)射波長。以整合素gpiib/iiia濃度為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖8)。由圖8結(jié)果獲知，梯度的整合素gpiib/iiia捕獲梯度的納米酶，對應(yīng)著梯度的催化顯色，且線性關(guān)系良好(r²＝0.99)。

2)原位定量膜蛋白整合素gpiib/iiia表達(dá)量

將hel細(xì)胞接種到96孔板中并使孔板中細(xì)胞增殖到0、0.1×10⁴、0.5×10⁴、1.0×10⁴、1.5×10⁴、2.0×10⁴個/孔的細(xì)胞梯度。接下來，將含3％bsa的pbs溶液加入各個孔板中阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)1小時。隨后用10μm的100μl實(shí)施例5制備的納米酶標(biāo)記細(xì)胞30分鐘，然后用pbs沖洗細(xì)胞。之后，加入100μl含20μmamplexred和1.0mm的h2o2水溶液，在37℃條件下催化反應(yīng)30分鐘后，采用酶標(biāo)儀記錄每個孔在585nm處的熒光強(qiáng)度。將每個孔中的熒光強(qiáng)度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中定量計(jì)算整合素gpiib/iiia在單細(xì)胞上的表達(dá)量(圖9)。

由圖9的結(jié)果可以看出，在腫瘤細(xì)胞的原位免疫分析中，梯度數(shù)目的細(xì)胞含有梯度的蛋白會識別梯度的納米酶，在同樣的分析條件下，對應(yīng)著梯度的催化顯色，且線性關(guān)系良好(r²＝0.99)。

將這部分顯色結(jié)果代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中，可計(jì)算單細(xì)胞中的整合素gpiib/iiia的表達(dá)量。如研究0.5×10⁴個hel細(xì)胞上的整合素gpiib/iiia的表達(dá)量，由圖9中獲知0.5×10⁴個hel對應(yīng)著體系的熒光發(fā)射強(qiáng)度為310,將該熒光發(fā)射強(qiáng)度數(shù)值帶入到標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖8)中，對應(yīng)整合素gpiib/iiia的濃度為211ngml^-1。

再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品整合素gpiib/iiia的體積、分子量，可定量計(jì)算單細(xì)胞中的整合素gpiib/iiia的表達(dá)量為6.7×10⁶。

同時，由于納米酶含有金元素的質(zhì)量信息，也可以通過icp-ms定量金元素反推蛋白含量。采用icp-ms分析方法測得的單個hel細(xì)胞表面的gpiib/iiia表達(dá)量為5.2×10⁶，二者結(jié)果非常接近，從而驗(yàn)證了原位類酶免疫分析方法的準(zhǔn)確性。

另外，由以上實(shí)驗(yàn)可以看出，本實(shí)施例的方法可靈敏地對1000個細(xì)胞進(jìn)行分析。

實(shí)施例7：針對整合素αvβ3通過生物分子模板法制備納米酶

在本實(shí)施例中，采用銀團(tuán)簇，靶向肽是靶向a549細(xì)胞膜蛋白整合素αvβ3。

1)制備bsa修飾的多肽蛋白

將帶有羧基的多肽(seqidno.2：h2n-grgdsc-cooh)在室溫下與edc和nhs按照摩爾比1.0:1.2:0.6混合溶解，攪拌30分鐘，激活多肽的羧基。然后將300mgbsa與上述混合物混合，室溫下繼續(xù)以500rpm轉(zhuǎn)速攪拌過夜，產(chǎn)物用截留量8000-12000的透析袋透析12小時，凍干備用。

2)制備納米酶

將5ml濃度為20mm的agno3溶液與5ml濃度為60mgml^-1的步驟1)制備的bsa修飾的多肽蛋白溶液混合，室溫?cái)嚢?0分鐘，之后加入0.5ml濃度為1m的naoh溶液調(diào)節(jié)ph值到12，所形成的溶液繼續(xù)在37℃攪拌12小時。所合成的多肽修飾的銀團(tuán)簇用截留分子量為3000的超濾管超濾除掉游離的金屬離子。圖10顯示出多肽修飾的銀團(tuán)簇(即納米酶)的平均粒徑在1.5nm左右。

實(shí)施例8：使用納米酶原位定量細(xì)胞膜蛋白整合素αvβ3

利用實(shí)施例7制備的納米酶通過酶聯(lián)免疫分析來原位定量細(xì)胞膜蛋白整合素αvβ3表達(dá)量的方法，包括下述步驟：

1)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

2ug/ml針對目標(biāo)整合素αvβ3的多克隆抗體(人整合素αvβ3酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒，上海聯(lián)碩生物科技有限公司)首先以100ul/孔包被在酶標(biāo)板的底部，之后用含3％bsa的pbs加入各個孔板中阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)1小時。隨后將50μl濃度為0、7.81、31.25、62.5、125、250ngml^-1的整合素αvβ3(人整合素αvβ3酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒，上海聯(lián)碩生物科技有限公司)標(biāo)準(zhǔn)液加入到孔板中，然后加入50μl的40μm實(shí)施例7制備的納米酶，室溫下孵育30分鐘。用pbs清洗各個孔板后，加入100μl含20μmamplexred和1.0mmh2o2水溶液。在37℃條件下催化反應(yīng)30分鐘后，采用酶標(biāo)儀記錄每個孔在585nm處的熒光強(qiáng)度，此熒光發(fā)射波長對應(yīng)于氧化的 amplexred的中心熒光發(fā)射波長。以目標(biāo)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖11)。由圖11結(jié)果獲知，梯度的目標(biāo)蛋白捕獲梯度的納米酶，對應(yīng)著梯度的催化顯色，且線性關(guān)系良好(r²＝0.99)。

2)原位定量膜蛋白表達(dá)量

將a549細(xì)胞接種到96孔板中并使孔板中細(xì)胞增殖到0、0.1×10⁴、0.5×10⁴、1.0×10⁴、1.5×10⁴、2.0×10⁴個/孔的細(xì)胞梯度。接下來，將含3％bsa的pbs溶液加入各個孔板中阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)1小時。隨后用20μm的100μl實(shí)施例7制備的納米酶標(biāo)記細(xì)胞30分鐘，然后用pbs沖洗細(xì)胞。之后，加入100μl含20μm的amplexred和1.0mm的h2o2水溶液。在37℃條件下催化反應(yīng)30分鐘后，采用酶標(biāo)儀記錄每個孔在585nm處的熒光強(qiáng)度。將每個孔中的熒光強(qiáng)度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中定量計(jì)算整合素αvβ3在單細(xì)胞上的表達(dá)量(圖12)。

由圖12的結(jié)果可以看出，在腫瘤細(xì)胞的原位免疫分析中，梯度數(shù)目的細(xì)胞含有梯度的蛋白會識別梯度的探針，在同樣的分析條件下，對應(yīng)著梯度的催化顯色，且線性關(guān)系良好(r²＝0.99)。

將這部分顯色結(jié)果代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中，可計(jì)算單細(xì)胞中的整合素αvβ3的表達(dá)量。如研究0.5×10⁴個a549細(xì)胞上的整合素αvβ3的表達(dá)量，由圖12中獲知0.5×10⁴個hel對應(yīng)著體系的熒光發(fā)射強(qiáng)度為103,將該熒光發(fā)射強(qiáng)度數(shù)值帶入到標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖11)中，對應(yīng)整合素αvβ3的濃度為31ngml^-1。

再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品整合素αvβ3的體積，分子量，可定量計(jì)算單細(xì)胞中的整合素αvβ3的表達(dá)量為9.3×10⁵。

同時，由于納米酶含有銀元素的質(zhì)量信息，也可以通過icp-ms定量銀元素含量反推蛋白表達(dá)量。采用icp-ms分析方法測得的單個a549細(xì)胞表面的αvβ3表達(dá)量為8.3×10⁵，二者結(jié)果非常接近，從而驗(yàn)證了原位類酶免疫分析方法的準(zhǔn)確性。

另外，由以上實(shí)驗(yàn)可以看出，本實(shí)施例的方法可靈敏地對1000個細(xì)胞進(jìn)行分析。

結(jié)論

我們分別以配體交換法與生物分子模板法制備了小粒徑的金屬納米 顆粒和金屬納米團(tuán)簇作為納米酶。多肽外殼可以特異性識別細(xì)胞表面的標(biāo)記物分子。利用納米酶對底物的吸光度或熒光強(qiáng)度的催化放大實(shí)現(xiàn)原位酶聯(lián)免疫分析檢測。該方法利用納米酶選擇性識別與催化性質(zhì)，在細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)蛋白的原位標(biāo)記與準(zhǔn)確定量。該定量方法簡單、直接，無需經(jīng)過純化和分離。同時，由于納米酶攜帶金屬元素的質(zhì)量信息，也可利用電感耦合等離子體質(zhì)譜對元素定量，反推蛋白表達(dá)量，檢驗(yàn)納米酶催化定量結(jié)果。根據(jù)金屬元素種類不同，可采用細(xì)胞本底元素極低的au或者ag元素進(jìn)行單標(biāo)記或者多標(biāo)記。

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