本發(fā)明涉及一種采用高效液相色譜法測定蚓激酶注射劑中高分子蛋白和小分子雜質含量的方法。

背景技術：

從安全性角度考慮，患者在使用含有高分子蛋白和小分子雜質的注射劑之前需要進行皮試試驗。但皮試試驗僅能對速發(fā)型I型變態(tài)反應有預測作用，且陽性符合度僅30％。即使皮試試驗呈陰性也不能說明以后不會發(fā)生過敏反應，而臨床可能出現(xiàn)的II、III、IV型變態(tài)反應是皮試試驗無法預測的。

因此，為了確保臨床用藥的安全性，對注射劑中高分子蛋白和小分子雜質的含量要同時進行檢測，對可能帶入的高分子蛋白和小分子雜質進行有效地監(jiān)控，進而從源頭上控制了臨床過敏反應的發(fā)生。這樣做既可以節(jié)約寶貴的臨床急救時間(因注射劑在臨床上大多數(shù)為急救用藥，進行皮試試驗必然浪費搶救時間)，同時也提高了臨床醫(yī)護人員與患者的便利性，并減輕了患者的用藥痛苦，意義重大。

本發(fā)明人從1999年開始先后申請并獲得兩項蚓激酶工藝發(fā)明專利證書(CN1089369C/CN1128220C)，注射用蚓激酶的質量研究和質量標準的確定首先在中國藥品生物制品檢定所生化藥物室完成；后經吉林省藥品檢定所的技術復核，確定了蚓激酶溶液的質量標準。質量標準規(guī)定不得檢出高分子蛋白和小分子雜質相對百分含量之和不得過5％。

2002年，本發(fā)明人開始進行蚓激酶注射液研發(fā)工作，其質量標準再次經過北京市藥品檢定所的技術復核，質量標準同樣規(guī)定不得檢出高分子蛋白和小分子雜質相對百分含量之和不得過5％。

因此，本單位作為藥品注冊申請人，于2003年和2005年已經先后在國家食品藥品監(jiān)督管理局獲得了注射用蚓激酶(批件號為2003L01103)和蚓激酶注射液(2005L01954)的藥物臨床研究批件，并分別完成61例健康志愿者的注射用蚓激酶和92例健康志愿者的蚓激酶注射液I期臨床研究。由于在工藝和檢測兩個方面同時嚴格控制無高分子蛋白以及小分子雜質相對百分含量之和不得過5％。因此，不僅每個批次的豚鼠的過敏試驗呈陰性，而且兩次I期臨床研究的皮試試驗的篩選過程均呈陰性。兩次I期臨床研究的共153例健康志愿者經單次給藥和多次給藥均未發(fā)生過敏性不良反應。這為蚓激酶溶液同時檢測高分子蛋白和小分子雜質百分含量之和提供檢測方法，進而為代替人體皮試試驗過敏方法提供了臨床依據(jù)。

上述事實證明：對人而言，雖然蚓激酶是分子量在2-4萬之間的外源性蛋白，但只要純度達到本專利規(guī)定的標準，就不會對人體產生過敏反應。本發(fā)明的實際效果已經顛覆了本研究領域目前的錯誤觀點，那就是蚓激酶作為分子量在2-4萬之間的外源性蛋白，其在靜脈的應用必將引起過敏反應。這個錯誤的觀點不僅導致有人想采用酶切天然蚓激酶獲取具有抗栓活性的小分子片斷的方法來解決蚓激酶的過敏問題(如CN101255412A)，而且讓更多的人想采用甲氧基聚乙二醇化學修飾的方法來解決蚓激酶的過敏問題(如CN102787109A、CN102660523B和CN103289981A)；這不僅增加了工藝難度，產生了化學污染，而且產品的比活力較低，僅僅每毫克≥3萬IU(CN102660523B)。

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：

一種測定蚓激酶注射劑中高分子蛋白和小分子雜質含量的方法。該方法用蚓激酶本身作為參照物，采用高效液相色譜法測定在蚓激酶主峰保留時間之前無高分子蛋白峰；同時用胰島素作為參照物，測定在胰島素峰保留時間之后的小分子雜質含量。

由于蚓激酶溶液是制備蚓激酶注射劑的中間體，而且沒有制劑輔料干擾檢測。因此，作為本發(fā)明一個實施方案，本發(fā)明提供一種同時測定蚓激酶溶液中高分子蛋白和小分子雜質含量的方法。

其方法如下：

取供試品溶液10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取胰島素對照品適量，用流動相制成每1mL中含1mg的溶液，取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。在供試品色譜圖中，其主峰前不得檢出高分子蛋白峰；在胰島素保留時間之后，如出現(xiàn)小分子雜質峰，按峰面積歸一化法計算相對百分含量應不大于5.0％。

其中，作為優(yōu)選方案，所述的高效液相色譜法的色譜條件：色譜柱為凝膠填充劑(如TSK GEL-2000SW，7.8mm×300mm)；流動相為三氟醋酸-乙氰-水，體積比可以為0.025～0.10∶8～30∶70～92，優(yōu)選為0.05∶10∶90；檢測波長為280±1nm，流速為0.5～1.0mL/min，優(yōu)選流速為0.7mL/min。理論板數(shù)按蚓激酶峰計算應不小于700。

同時測定高分子蛋白和小分子雜質的一般方法包括薄層色譜法、高效液相色譜法和電泳法等。本發(fā)明優(yōu)選采用高效液相色譜法(HPLC)測定。用蚓激酶本身作為參照物，測定在蚓激酶主峰保留時間之前的高分子蛋白；同時用胰島素作為參照物，測定在胰島素保留時間之后的小分子雜質峰。色譜條件：色譜柱用凝膠為填充劑，流動相的基本組成為水、有機溶劑和三氟醋酸，以及紫外檢測器，其中所述的有機溶劑為乙腈、甲醇和丙酮等。

蚯蚓在中藥中稱為地龍，其蛋白提取物同時具有纖溶酶原激活活性和纖維蛋白溶解活性。因此，注射用蚓激酶也可以被稱作蚯蚓纖溶酶凍干粉針和注射用地龍凍干粉針，三者實際上是同一物質(例如CN1128220C/CN1520829A/CN1537938A/CN101407801B)。

本發(fā)明所述的注射劑(Injection of Lumbrokinase)的劑型包括藥物制成的注入人體體內的滅菌溶液、乳狀液和混懸液以及供臨用前配成溶液或混懸液的無菌粉末，例如注射用濃溶液、溶液型注射劑、注射用無菌粉末、混懸型注射劑和乳懸型注射劑。

本發(fā)明所述的注射劑可能含有高分子蛋白和小分子雜質，高分子蛋白的分子量大于蚓激酶的平均分子量(25000)；小分子雜質的分子量小于胰島素分子量5808。本發(fā)明所述的蚓激酶溶液是從鮮活的蚯蚓中提取并分離的符合靜脈注射要求的蚓激酶濃溶液，它不僅濃度高達1mg/mL，而且每毫克的比活力≥14萬IU，進而經注射用水稀釋后可以制成無菌粉針劑和水針劑(例如CN1128220C)。

上述定量分析方法，具有快速、準確、靈敏度高、干擾少等特點，可以有效地對蚓激酶注射劑中高分子蛋白和小分子雜質進行檢測和監(jiān)控，進而從源頭上控制臨床過敏反應的發(fā)生，并取消皮試試驗，減輕患者用藥的痛苦，節(jié)約臨床上寶貴的急救時間。

附圖說明

圖1：牛血清白蛋白(分子量66446)色譜圖

圖2：胰島素(分子量5808)色譜圖

圖3：酪氨酸(分子量181.2)色譜圖

圖4：三種標準分子量物質混合進樣色譜圖

圖5：蚓激酶溶液(批號991216)色譜圖

圖6：蚓激酶溶液(批號20000104)色譜圖

圖7：蚓激酶溶液(批號20000105)色譜圖

具體實施方式

一、試驗材料與儀器

1、標準分子量物質

2、試劑

三氟醋酸 化學純(理工大學化學與材料學院)

乙腈 色譜純(迪馬公司)

3、儀器

可見紫外分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司UV-2000)

高效液相色譜儀 日本島津2010A

色譜條件：

色譜柱：凝膠填充劑(TSK GEL-2000SW，7.8mm×300mm)；

流動相：三氟醋酸-乙氰-水，體積比為0.05∶10∶90；

紫外檢測器，檢測波長為280±1nm

流速為0.7mL/min

二、實施案例

以下通過實例進一步說明本發(fā)明，但不構成對本發(fā)明保護范圍的限制。

實施例1：測定標準分子量物質的線性定量范圍

取標準分子量物質，牛血清白蛋白66446，人胰島素5808，酪氨酸181.2，分別加流動相溶解成1mg/mL的濃度，取適量樣品分析，測定結果見表1和圖1-4。

表1 線性試驗結果

試驗結果表明，該方法對分子量66446-181范圍是呈線性分離的，既以分子量對數(shù)為縱坐標，以保留時間為橫坐標，用最小二乘法，進行線性回歸計算，方程：LogM＝7.767-0.3905t_R，線性關系r＝-0.9972。

實施例2 重復性試驗

取胰島素標準品適量，加流動相稀釋成0.8mg/mL、1.0mg/mL和1.2mg/mL，分別測定3次，結果見表2。

表2 重復性試驗結果

試驗結果說明本發(fā)明方法重復性非常好。

實施例3：高效液相色譜法測定蚓激酶溶液中高分子蛋白和小分子雜質含量

測定法取蚓激酶溶液(批號991216、20000104和20000105，1mg/mL，北京儒展生化藥物研究中心制備)10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取胰島素對照品適量，用流動相制成每1mL中含1mg的溶液，取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。在蚓激酶溶液色譜圖中，其主峰的保留時間之前不得檢出高分子蛋白峰；在胰島素峰的保留時間之后，如出小分子雜質峰，按峰面積歸一化法計算應不大于5.0％。結果見表3和圖5-7。

表3 蚓激酶溶液中高分子蛋白和小分子雜質含量的測定結果

實施例4 蚓激酶溶液不同濃度樣品對保留時間測定的影響

取蚓激酶溶液(991216)，分別加流動相稀釋成如下濃度：1.0mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL和0.125mg/mL。按照實施例3所述方法測定，結果見表4。

表4、濃度對測定的影響

試驗結果說明，本發(fā)明方法，供試品在用流動相稀釋至1-8倍后，其測定結果幾乎無變化。

實施例5：穩(wěn)定性試驗

取蚓激酶溶液(991216)，室溫放置，分別在0、1、2、3、4、5小時注入測定。按照實施例3所述方法測定，結果見表5。

表5 穩(wěn)定性試驗

試驗結果說明，本發(fā)明方法在5小時內測定蚓激酶溶液是可靠的。

實施例6：精密度試驗

取蚓激酶溶液(991216)，連續(xù)進樣5次。按照實施例3所述方法測定，結果見表6。

表6 精密度試驗

結果表明，本發(fā)明精密度符合要求。