本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)或多肽的定量分析方法，尤其是涉及一種基于輕同位素近同重標記的整體蛋白質(zhì)定量分析方法。

背景技術(shù)：
近兩三年來，商業(yè)化的高質(zhì)量分辨、高質(zhì)量測量精度質(zhì)譜儀有了飛躍式發(fā)展，也就是軌道阱質(zhì)譜儀的出現(xiàn)。軌道阱質(zhì)譜儀跟傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀分辨率和精度相當(dāng)；但價格相對便宜，質(zhì)譜采集速度更快、解離效率更高。該質(zhì)譜儀的相對普及為分子量相對較大的整體蛋白的質(zhì)譜及串級質(zhì)譜分析提供了堅實的基礎(chǔ)。在整體蛋白定量標記方面，基于SILAC的體內(nèi)標記和基于TMT的體外標記，由于靶向氨基酸的非完全標記(如重的賴氨酸或精氨酸在SILAC中的非完全替代)和非靶向氨基酸的非選擇性標記(如蘇氨酸的TMT標記)，其應(yīng)用范圍受到了比較大的限制。二甲基(同位素，isotopic或同重，isobaric)標記由于其試劑易得，標記效率高，在多肽定量方面已得到了廣泛的研究和應(yīng)用；我國科學(xué)家在這個定量技術(shù)方面也做出了巨大的貢獻，發(fā)展了多種不同形式的二甲基標記；其中中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所張玉奎院士和張麗華研究員課題組發(fā)展的N端同重二甲基標記和復(fù)旦大學(xué)楊芃原教授和陸豪杰教授課題組發(fā)展的賴氨酸殘基上的氨基的胍化保護組合起來可直接應(yīng)用于蛋白的定量標記，有較好的前景。然而，上述同重二甲基標記中所使用的重同位素(13C和D)試劑都非常昂貴，如1mL20％13C甲醛(H13CHO)的價格為4350元(CambridgeIsotopeLab，產(chǎn)品代碼CLM-806-PK)，1g氘代氰基硼氫化鈉的價格為2377.25元(Sigma，產(chǎn)品代碼190020-1G)。因此，新型高效但廉價的試劑有著廣闊的前景和市場。申請人前期在整體蛋白質(zhì)定性定量分析方面已經(jīng)做了較多的工作，有較好的基礎(chǔ)。在定量數(shù)據(jù)挖掘方面，公布號為CN103389335A的中國專利公布了一種鑒定生物大分子的分析裝置和方法。公布號為CN104765984A的中國專利公布了一種生物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫快速建立與搜索的方法。公布號為CN104359967A的中國專利公布了一種生物質(zhì)譜重疊同位素輪廓的解析方法。上述專利中公布了同位素輪廓指紋比對算法(isotopicenvelopefingerprinting，iEF)，直接在原始數(shù)據(jù)上進行匹配離子的搜索和蛋白質(zhì)的鑒定。該算法無需對實驗數(shù)據(jù)進行“去同位素”預(yù)處理，可以節(jié)省相應(yīng)的時間；根據(jù)各個離子中是否有同位素峰缺失和同位素峰相對強度的偏差對理想及非理想實驗數(shù)據(jù)進行很好的區(qū)分，保證蛋白鑒定的可信度；根據(jù)已知重疊離子的同位素峰相對強度關(guān)系對重疊實驗數(shù)據(jù)進行有效的解析?；谠撍惴ㄉ暾埲顺晒Φ亻_發(fā)了整體蛋白數(shù)據(jù)庫搜索引擎ProteinGoggle，在單個標準蛋白(泛素、肌紅蛋白)及整體蛋白質(zhì)組混合物(組蛋白H4家族翻譯后修飾異構(gòu)體、大腸桿菌)的定性鑒定中，表現(xiàn)出較高的可信度和較好的應(yīng)用前景。在定量分析方面，ProteinGoggle有著它內(nèi)在的和獨特的潛在優(yōu)勢；一方面基于同位素輪廓及其中每個同位素的指紋比對可以快速精確地搜索同位素或同重標記的定量離子對；另一方面，搜索過程中每個離子中每個同位素峰的實驗強度都被記錄和輸出，可以用來直接計算相對定量比。在定量標記方面，公布號為CN105137088A的中國專利公布了一種整體蛋白質(zhì)定量分析方法。公布號為CN105242050A的中國專利公布了一種不同生理或病理條件下整體蛋白質(zhì)的定量分析方法，該專利對N端氨基進行同重標記，分別標記為-N(CH2D)2和-N(13CH3)2。上述兩份專利均是基于重同位素的定量標記方法。由于采用重同位素(13C和D)，因此其費用仍然很高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種基于輕同位素近同重標記的整體蛋白質(zhì)定量分析方法。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：一種基于輕同位素近同重標記的整體蛋白質(zhì)定量分析方法，包括以下步驟：(1)將兩組不同生理或病理條件的整體蛋白分別作為控制組與疾病組，分別進行賴氨酸ε-氨基及N端氨基全部同重標記，分別標記為-N(C5H11O2CH2)2和-N(C5H11SCH2)2，其單個標記后氨基的質(zhì)量差異為0.017759Da；(2)同重標記后兩組蛋白按等比例混合進行高分辨質(zhì)譜和串級質(zhì)譜分析得到一個數(shù)據(jù)組；(3)對數(shù)據(jù)組進行定性、定量數(shù)據(jù)庫搜索，得到蛋白質(zhì)的ID及疾病組每一個蛋白質(zhì)相對于控制組的相對比例，即疾病條件下所有蛋白的上調(diào)或下調(diào)情況，上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)最大的蛋白即為與該疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的蛋白。優(yōu)選地，步驟(1)中，控制組蛋白或疾病組蛋白，一組蛋白質(zhì)用氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)和4-(甲氧基甲氧基)丁醛(C5H11O2CHO)標記，另一組蛋白質(zhì)用氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)和5-(甲硫基)戊醛(C5H11SCHO)標記。優(yōu)選地，步驟(1)中進行同重標記的反應(yīng)過程和條件如下：蛋白溶解在乙酸鈉緩沖溶液后，加入4-(甲氧基甲氧基)丁醛或5-(甲硫基)戊醛，在攪拌條件下加入氰基硼氫化鈉溶液，室溫反應(yīng)1小時后，用氨水淬滅。優(yōu)選地，所述的乙酸鈉緩沖溶液為100mmol/L，pH為5-6。優(yōu)選地，所述的4-(甲氧基甲氧基)丁醛或5-(甲硫基)戊醛溶液質(zhì)量分數(shù)為4％(w/w)。優(yōu)選地，所述的氨水溶液體積分數(shù)為4％(v/v)。步驟(2)所述的等比例混合指：按照控制組與疾病組的重量、體積或摩爾量以1:1比例進行混合。步驟(3)中對數(shù)據(jù)組進行定性、定量數(shù)據(jù)庫搜索，得到蛋白質(zhì)的ID及疾病組每一個蛋白質(zhì)相對于控制組的相對比例為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，優(yōu)選使用背景技術(shù)中介紹的整體蛋白數(shù)據(jù)庫搜索引擎ProteinGoggle，同時也可以使用其他數(shù)據(jù)庫。本發(fā)明涉及的方法同樣適用于蛋白質(zhì)序列中賴氨酸ε-氨基及N端氨基其他基于正常輕同位素的全同重化學(xué)共價標記以及氨基酸其他特定官能團的基于正常輕同位素的全同重化學(xué)共價標記。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的解析方法基于所述質(zhì)譜的原始二級質(zhì)譜，通過計算含標記基團碎片離子的平均相對強度從而計算標記蛋白在不同生理或病理條件下的相對強度。本發(fā)明的定量方法對整體蛋白質(zhì)序列中賴氨酸ε-氨基及N端氨基的同重標記和其高分辨串級質(zhì)譜標記碎片離子同位素輪廓指紋比對原位數(shù)據(jù)解析，標記效率高，準確度高，適用于整體蛋白質(zhì)基于高分辨串級質(zhì)譜的定量分析。附圖說明圖1、基于輕同位素近同重標記的整體蛋白質(zhì)定量分析方法流程圖。圖2、蛋白質(zhì)分子賴氨酸ε-氨基和N端氨基全同重標記示意圖。具體實施方式下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。實施例一種基于輕同位素近同重標記的整體蛋白質(zhì)定量分析方法，包括以下步驟：(1)將兩組不同生理或病理條件的整體蛋白分別作為控制組與疾病組，分別進行賴氨酸ε-氨基及N端氨基全部同重標記，一組用氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)和4-(甲氧基甲氧基)丁醛(C5H11O2CHO)，另一組用用氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)和5-(甲硫基)戊醛(C5H11SCHO)(如圖1所示)；也就是分別標記為-N(C5H11O2CH2)2和-N(C5H11SCH2)2(如圖2所示)，其單個標記后氨基的質(zhì)量差異為0.017759Da，反應(yīng)過程和條件如下：蛋白溶解在乙酸鈉緩沖溶液(100mM,pH5-6)后，加入剛剛配制的4％(w/w)的醛溶液；在攪拌條件下加入600mM的新配制的氰基硼氫化鈉溶液。室溫反應(yīng)1小時后，反應(yīng)用4％(v/v)的氨水淬滅；(2)同重標記后兩組蛋白按等比例混合進行高分辨質(zhì)譜和串級質(zhì)譜分析得到一個數(shù)據(jù)組，等比例混合指：按照控制組與疾病組的重量、體積或摩爾量以1:1比例進行混合；(3)對數(shù)據(jù)組進行定性、定量數(shù)據(jù)庫搜索，得到蛋白質(zhì)的ID及疾病組每一個蛋白質(zhì)相對于控制組的相對比例，即疾病條件下所有蛋白的上調(diào)或下調(diào)情況，上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)最大的蛋白即為與該疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的蛋白。對數(shù)據(jù)組進行定性、定量數(shù)據(jù)庫搜索，得到蛋白質(zhì)的ID及疾病組每一個蛋白質(zhì)相對于控制組的相對比例為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，優(yōu)選使用背景技術(shù)中介紹的整體蛋白數(shù)據(jù)庫搜索引擎ProteinGoggle，同時也可以使用其他數(shù)據(jù)庫。以上實施例的方法同樣適用于蛋白質(zhì)序列中賴氨酸ε-氨基及N端氨基其他基于正常輕同位素的全同重化學(xué)共價標記以及氨基酸其他特定官能團的基于正常輕同位素的全同重化學(xué)共價標記。以上解析方法基于所述質(zhì)譜的原始二級質(zhì)譜，通過計算含標記基團碎片離子的平均相對強度從而計算標記蛋白在不同生理或病理條件下的相對強度。本發(fā)明的定量方法對整體蛋白質(zhì)序列中賴氨酸ε-氨基及N端氨基的同重標記和其高分辨串級質(zhì)譜標記碎片離子同位素輪廓指紋比對原位數(shù)據(jù)解析，標記效率高，準確度高，適用于整體蛋白質(zhì)基于高分辨串級質(zhì)譜的定量分析。上述的對實施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應(yīng)用到其他實施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動。因此，本發(fā)明不限于上述實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。