用于檢測(cè)β-受體激動(dòng)劑的組合檢測(cè)試劑及其檢測(cè)方法技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬于藥物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)β-受體激動(dòng)劑的組合檢測(cè)試劑及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：
β-受體激動(dòng)劑在動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中過(guò)量使用的情況下表現(xiàn)為營(yíng)養(yǎng)再分配效應(yīng)，尤其是當(dāng)用藥量為治療劑量的5-10倍時(shí)，能改變養(yǎng)分的代謝途徑，促進(jìn)動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)，促進(jìn)動(dòng)物體蛋白質(zhì)沉積，特別是骨骼肌中蛋白質(zhì)的合成，抑制脂肪的合成和積累，促使?fàn)I養(yǎng)成分由脂肪向肌肉轉(zhuǎn)移，瘦肉可相對(duì)增加10％以上。β-受體激動(dòng)劑易在動(dòng)物組織，特別是內(nèi)臟中積聚殘留，并通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體。人體中累計(jì)攝入劑量超過(guò)一定值，或食用β-受體激動(dòng)劑類濃度較高的內(nèi)臟組織如肝、腎、或肺時(shí)，易出現(xiàn)毒副反應(yīng)，危害人體健康，造成安全隱患。因此，雖然β-受體激動(dòng)劑能起到“瘦肉”作用，卻對(duì)人體健康危害過(guò)大，因而它們也在全球遭到禁用。其中，β-受體激動(dòng)劑中僅雷托巴胺是比較特殊的“瘦肉精”，瘦肉效率非常高，在動(dòng)物體內(nèi)幾乎不積累，人體試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)攝入量不超過(guò)67μg/kg時(shí)，對(duì)于人體沒有明顯損害，約二十個(gè)國(guó)家允許使用雷托巴胺，但仍有超過(guò)一百六十個(gè)國(guó)家禁止使用該藥。其它的“瘦肉精”，則幾乎被全世界所有國(guó)家禁用。我國(guó)禁止任何β-受體激動(dòng)劑用作動(dòng)物促生長(zhǎng)劑。目前，關(guān)于β-受體激動(dòng)劑類藥物的檢測(cè)方法已有很多的文獻(xiàn)報(bào)道，包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、膠體金免疫層析法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、毛細(xì)管電泳法、免疫傳感器法等。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、膠體金免疫層析法、免疫傳感器法等生物檢測(cè)法僅用于大批量樣品的篩選，但是卻很難分辨樣品中的各詳細(xì)組分，假陰性假陽(yáng)性率高，靈敏度低或準(zhǔn)確性差；現(xiàn)有的高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、毛細(xì)管電泳法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法，則存在檢測(cè)的化合物少，樣品使用量大，操作繁瑣，耗用化學(xué)試劑量大，不環(huán)保，檢測(cè)通量低，分析時(shí)間長(zhǎng)等問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述β-受體激動(dòng)劑檢測(cè)的現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供了一種用于檢測(cè)β-受體激動(dòng)劑的組合檢測(cè)試劑及其檢測(cè)方法，本發(fā)明提供的組合檢測(cè)試劑可以檢測(cè)畜、禽肉、組織及其相關(guān)制品和畜、禽尿、唾液等體液生物樣品中多達(dá)33種β-受體激動(dòng)劑。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明提供了用于檢測(cè)β-受體激動(dòng)劑的組合檢測(cè)試劑，所述組合檢測(cè)試劑包括：含有多種β-受體激動(dòng)劑對(duì)照品的有機(jī)溶劑溶液、水解酶和蛋白沉淀劑，所述水解酶為β-葡萄糖苷酸酶和/或芳基硫酸酯酶；含有的每種β-受體激動(dòng)劑對(duì)照品在有機(jī)溶劑溶液中的濃度均為0.1ng-20ng/mL，所述蛋白沉淀劑為甲醇、乙腈或乙酸乙酯。進(jìn)一步的：所述含有多種β-受體激動(dòng)劑對(duì)照品的有機(jī)溶劑溶液為含有33種β-受體激動(dòng)劑的體積比為50％的甲醇溶液；所述33種β-受體激動(dòng)劑為沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、班布特羅、特布他林、齊帕特羅、塞曼特羅、西布特羅、溴布特羅、克倫丙羅、妥布特羅、利托君、馬噴特羅、噴布洛爾、馬布特羅、福莫特羅、阿福特羅、克侖潘特、溴氯布特羅、奧西那林、利妥特靈、苯氧丙酚胺、克侖塞羅、R-美托洛爾、S-美托洛爾、苯乙醇胺A、非諾特羅、拉貝特羅、異克侖潘特和丙卡特羅。進(jìn)一步的：所述蛋白沉淀劑為乙腈。進(jìn)一步的：所述組合檢測(cè)試劑還包括流動(dòng)相添加劑，所述流動(dòng)相添加劑為甲酸。本發(fā)明還提供了利用所述的用于檢測(cè)β-受體激動(dòng)劑的組合檢測(cè)試劑的檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法包括以下步驟：(1)生物樣品前處理：對(duì)待檢測(cè)樣品利用液液萃取法、蛋白沉淀法或?yàn)V膜過(guò)濾法進(jìn)行預(yù)處理；(2)取所述含有多種β-受體激動(dòng)劑對(duì)照品的有機(jī)溶劑溶液直接進(jìn)樣；獲得每種β-受體激動(dòng)劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線；得到線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍；(3)對(duì)預(yù)處理后的待檢測(cè)樣品進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)：(4)將質(zhì)譜檢測(cè)得到的各β-受體激動(dòng)劑的峰面積，代入步驟(2)中對(duì)照品獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到對(duì)應(yīng)β-受體激動(dòng)劑的含量。進(jìn)一步的：所述步驟(1)中液液萃取法為：將待檢測(cè)固體樣品粉碎，加水，勻漿，所述水的加入體積與樣品重量比為1:1-6:1；之后勻漿液用乙酸乙酯萃取，離心，35-45℃的條件下將有機(jī)相吹干，加入甲醇復(fù)融，離心，微孔濾膜過(guò)濾，取濾液用于分析。進(jìn)一步的：所述步驟(1)中蛋白沉淀法為：將待檢測(cè)固體樣品粉碎，加水，勻漿，之后勻漿液加入甲醇或乙腈沉淀，所述甲醇或乙腈的加入體積與樣品重量比為1:1-6:1；離心，取上清液，微孔濾膜過(guò)濾，取濾液用于分析。進(jìn)一步的：所述步驟(1)中濾膜過(guò)濾法為：將液體待檢測(cè)樣品用微孔濾膜過(guò)濾，濾液加入甲醇或乙腈沉淀，所述甲醇或乙腈的加入體積與樣品重量比為1:1-6:1；離心，取上清液用于分析。進(jìn)一步的：所述步驟(3)中色譜條件為：采用硅膠鍵合相填料柱，流動(dòng)相由A相+B相組成：A相為乙腈水，含體積百分比為0.002％-0.1％的甲酸，B相為乙腈，含體積百分比為0.002％-0.1％的甲酸，A相：B相的體積比為1-99％：99-1％。進(jìn)一步的：所述步驟(3)中質(zhì)譜條件為：電噴霧電離源ESI，正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描MRM，氣簾氣35～40psi，離子化電壓+5500V，溫度450～550℃，噴霧氣40～55psi，輔助加熱氣40～60psi。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果是：1、本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑組合可以同時(shí)分析33種β-受體激動(dòng)劑，檢測(cè)范圍最廣泛；2、本發(fā)明配制的對(duì)照品溶劑，無(wú)需處理可直接進(jìn)樣；3、本發(fā)明采用水解酶可以將代謝產(chǎn)物水解成原型化合物，提高分析物濃度；4、本發(fā)明樣品處理中采用蛋白沉淀或液液萃取的方案，對(duì)生物樣品中的33種β-受體激動(dòng)劑進(jìn)行凈化和富集；5、本發(fā)明在樣品的色譜分離中，采用細(xì)口徑的色譜短柱和梯度洗脫法，降低樣品基質(zhì)對(duì)質(zhì)譜響應(yīng)抑制的同時(shí)對(duì)33種β-受體激動(dòng)劑進(jìn)行快速分離，保證測(cè)定結(jié)果的正確性情況下，簡(jiǎn)化了操作步驟。6、應(yīng)用本發(fā)明所述試劑組合的檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)；而且所需樣本量少，化學(xué)試劑使用量小，綠色環(huán)保；樣品處理無(wú)需衍生化等復(fù)雜步驟；檢測(cè)結(jié)果不受內(nèi)源性物質(zhì)的干擾；假陰性假陽(yáng)性率低；試劑成本低廉，適用于大量樣本的快速分析。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明中33種β-受體激動(dòng)劑的提取離子流色譜圖；其中圖1a、圖1b、圖1c、圖1d為33種β-受體激動(dòng)劑的提取離子流色譜圖。圖2是本發(fā)明實(shí)施例2中豬肝樣品中檢測(cè)到克倫特羅的提取離子流色譜。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步說(shuō)明。該例子僅是應(yīng)用范例。不能理解為對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍的一種限制。實(shí)施例11.實(shí)驗(yàn)儀器與試劑1.1實(shí)驗(yàn)儀器AcQuityTMUPLC超高壓液相色譜儀、OasisMCX固相萃取(SPE)小柱(6mL，150mg)均購(gòu)自美國(guó)Waters，API5500Qtrap質(zhì)譜儀購(gòu)自美國(guó)AB，漩渦混合器，TTL-DCII型氮吹儀，IKA高速組織勻漿機(jī)，超純水儀(Simplicity，默克密理博公司)，超聲波提取儀(KQ-250B，昆山市超聲儀器有限公司)、IKAT18Basic高速分散機(jī)(德國(guó))。1.2實(shí)驗(yàn)試劑三氯乙酸(分析純)，甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，甲酸純度為99％，33種β-受體激動(dòng)劑(純度均≥99％):西馬特羅、福莫特羅、沙丁胺醇、苯乙醇胺A、班布特羅、齊帕特羅均購(gòu)自美國(guó)Sigma，氯丙那林、馬布特羅、溴布特羅、非諾特羅、克倫丙羅、妥布特羅、特布它林、克倫特羅、萊克多巴胺、苯氧丙酚胺、克倫潘特、克倫異潘特、馬噴特羅、利托君、丙卡特羅、吡布特羅、溴代克倫特羅、克倫賽羅、異丙喘寧、塞布特羅均購(gòu)自德國(guó)Dr.EhrenstorferGmbH。2.檢測(cè)方法2.1待檢測(cè)樣品前處理選取豬肝樣品，切塊，去筋膜，準(zhǔn)確稱取1.00g，加入3ml水，經(jīng)高速組織搗碎機(jī)均勻搗碎制成勻漿樣品，準(zhǔn)確稱取2.00g勻漿樣品，置于10mL離心管內(nèi)，加入5μL的β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，混勻，37酸孵育30min，加入甲醇3mL，渦旋混勻5min，超聲提取15min，4℃14000g離心10min；收集上清液，待過(guò)固相萃取小柱。MCX柱用6mL甲醇、6mL水活化，將上清液過(guò)柱，棄去濾液，用6mL水淋洗，最后用6mL5％甲醇氨洗脫，洗脫液用氮?dú)獯蹈珊螅?.1％甲酸水溶液定容至0.2mL，漩渦混合1min，微孔濾膜過(guò)濾，UPLC-MS/MS進(jìn)樣20μl測(cè)定。2.2液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析色譜條件：色譜柱:ACQUITYUPLCTMBEHC18柱(50mm×2.1mm，1.7μm)；柱溫40℃；進(jìn)樣體積20μL；采用硅膠鍵合相填料柱，流動(dòng)相A為乙腈水(乙睛和水的體積比為5：95)，含0.05％的甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈，含0.05％的甲酸溶液；流速0.3mL/min；流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1。表133種β-受體激動(dòng)劑的液相洗脫條件質(zhì)譜條件:采用電噴霧電離源ESI正離子的離子化模式，進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描，氣簾氣35～40psi，離子化電壓+5500V，溫度450～550℃，噴霧氣40～55psi，輔助加熱氣40～60psi，接口加熱氣On，碰撞氣Medium。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)種，每個(gè)化合物檢測(cè)兩對(duì)離子，一對(duì)用于定量，一對(duì)用于定性。3技術(shù)方案的優(yōu)化3.1、色譜條件優(yōu)化本發(fā)明選用2.1×50mm，1.7μm的C18色譜柱在相對(duì)較短時(shí)間內(nèi)保證33種β受體激動(dòng)劑的有效分離。實(shí)驗(yàn)比較甲醇-水、乙腈-水體系作為流動(dòng)相對(duì)33種β受體激動(dòng)劑的分離效果的影響，為了提高分析的效率減少分析時(shí)間，采用洗脫能力較強(qiáng)的乙腈-水流動(dòng)相系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫方式獲得理想的色譜分離效果，單個(gè)運(yùn)行過(guò)程時(shí)間僅需6min。通過(guò)優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中甲酸含量為0.05％時(shí)，33種β-受體激動(dòng)劑的靈敏度最高，且基質(zhì)效應(yīng)最小。3.2、質(zhì)譜條件優(yōu)化采用流動(dòng)注射方式，在正離子和負(fù)離子模式下對(duì)每種化合物進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描獲得其分子離子峰；在確定各類化合物的準(zhǔn)分子離子峰后分別對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，獲得其碎片離子信息，確定定量離子和輔助定性離子。通過(guò)優(yōu)化碎裂電壓(Fragmentor，V)、碰撞電壓(CollisionEnergy，eV)等參數(shù)，使33種β受體激動(dòng)劑的準(zhǔn)分子離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子對(duì)強(qiáng)度達(dá)到最大；對(duì)毛細(xì)管電壓、霧化壓力、干燥氣溫度、干燥氣流量等進(jìn)行優(yōu)化，使每種待測(cè)化合物的離子化效率達(dá)到最佳。質(zhì)譜離子源參數(shù)見表2。表233種β受體激動(dòng)劑的質(zhì)譜離子源條件(帶*者為定量離子)3.3、樣品前處理優(yōu)化由于β-受體激動(dòng)劑的母核為苯乙胺基團(tuán)，呈弱堿性，因此在酸性溶液中易于解離提取。已知強(qiáng)酸型蛋白沉淀劑如高氯酸等對(duì)這類物質(zhì)提取效果較好，此外，加入適量的有機(jī)溶劑可能會(huì)改善提取效率。常用的水解方法有酶水解、酸水解和堿水解。本發(fā)明采用酶水解方式，簡(jiǎn)化了操作步驟，節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間，能更好地滿足快速檢測(cè)的需求。待測(cè)33種β受體激動(dòng)劑溶于甲醇、乙腈等有機(jī)試劑，本發(fā)明采用甲醇作為沉淀劑，以清除樣品中的蛋白質(zhì)，經(jīng)優(yōu)化發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲醇與勻漿樣品3:1時(shí)，質(zhì)譜分析幾乎不存在離子抑制(基質(zhì)效應(yīng))。經(jīng)比對(duì)，本發(fā)明檢測(cè)方法可直接采用試劑組合中的溶液進(jìn)樣，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，不需要空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)選用甲醇作為提取試劑，振蕩混勻后超聲提取30min，過(guò)0.22μm有機(jī)濾膜后進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果顯示甲醇/水體系對(duì)33種β受體激動(dòng)劑的提取效率高達(dá)90％以上。4、線性范圍與檢出限將33種β受體激動(dòng)劑的標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到空白基質(zhì)中做標(biāo)準(zhǔn)曲線，配制濃度為0.1、0.313、0.625、1.25、2.5、5、10、20ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制33種β受體激動(dòng)劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)均大于0.99(見表3)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖1所示)線性良好r≥0.99(n＝5)。33種β受體激動(dòng)劑總離子流圖見圖1a、圖1b、圖1c、圖1d所示，從圖1中可以看出，沙丁胺醇保留時(shí)間為2.07min；克倫特羅保留時(shí)間為2.37min；萊克多巴胺保留時(shí)間為2.25min；氯丙那林保留時(shí)間為2.30min；班布特羅保留時(shí)間為2.39min；特布他林保留時(shí)間為2.07min；齊帕特羅保留時(shí)間為2.05min；塞曼特羅保留時(shí)間為2.52min；西布特羅保留時(shí)間為2.24min；溴布特羅保留時(shí)間為2.42min；克倫丙羅保留時(shí)間為2.34min；妥布特羅保留時(shí)間為2.36min；利托君保留時(shí)間為2.17min；馬噴特羅保留時(shí)間為3.11min；噴布洛爾保留時(shí)間為2.45min；馬布特羅保留時(shí)間為2.46min；福莫特羅保留時(shí)間為2.33min；阿福特羅保留時(shí)間為2.65min；克侖潘特保留時(shí)間為2.34min；溴氯布特羅保留時(shí)間為2.43min；奧西那林保留時(shí)間為2.52min；異丙腎上腺素保留時(shí)間為2.65min；苯氧丙酚胺保留時(shí)間為2.65min；克侖塞羅保留時(shí)間為2.79min；苯乙醇胺A保留時(shí)間為2.23min；非諾特羅保留時(shí)間為2.22min；拉貝特羅保留時(shí)間為2.73min；異克侖潘特保留時(shí)間為2.20min；吡布特羅保留時(shí)間為2.24min；沙美特羅保留時(shí)間為2.53min；克倫異磅特羅保留時(shí)間為2.76min；克倫磅特羅保留時(shí)間為2.37min；羥甲基克倫特羅保留時(shí)間為2.37min。表333種β-受體激動(dòng)劑在豬肝中的定量限、線性范圍和相關(guān)系數(shù)5、回收率與精密度本發(fā)明考察了該方法的回收率及精密度，在空白樣品中添加3個(gè)不同水平(0.2、2、20ng/mL)的33種β受體激動(dòng)劑按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定回收率，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6次。結(jié)果顯示，33種β受體激動(dòng)劑的平均回收率為90.2％～111％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于8.24％(結(jié)果見表4)。表4方法加標(biāo)回收率及精密度實(shí)施例2、待檢測(cè)樣品的具體檢測(cè)分析實(shí)驗(yàn)待檢測(cè)的實(shí)際待檢測(cè)樣品從山東省市場(chǎng)購(gòu)買，處理后，儲(chǔ)存在4℃的冰箱中備用。用本發(fā)明檢測(cè)方法對(duì)購(gòu)買的10份豬肝樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)一例陽(yáng)性樣品，克倫特羅含量為0.71ng/mL，見圖2所示。本實(shí)施例具體檢測(cè)方法如下：(1)生物樣品預(yù)處理：本實(shí)施例預(yù)處理采用蛋白沉淀法(使用所述組合檢測(cè)試劑中的蛋白沉淀劑)進(jìn)行處理。豬肝樣品，切塊，去筋膜，準(zhǔn)確稱取1.00g，加入3ml水，經(jīng)高速組織搗碎機(jī)均勻搗碎制成勻漿樣品，準(zhǔn)確稱取2.00g勻漿樣品，置于10mL離心管內(nèi)，加入5μL的β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，混勻，37酸孵育30min，加入甲醇3mL，渦旋混勻5min，超聲提取15min，4℃14000g離心10min；收集上清液。(2)取所述組合檢測(cè)試劑中的含有多種β-受體激動(dòng)劑對(duì)照品的有機(jī)溶劑溶液直接進(jìn)樣；獲得每種β受體激動(dòng)劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線；得到線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。(3)對(duì)預(yù)處理后的待測(cè)樣品進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析：將MCX柱用6mL甲醇、6mL水活化，將上清液過(guò)柱，棄去濾液，用6mL水淋洗，最后用6mL5％甲醇氨洗脫，洗脫液用氮?dú)獯蹈珊?，?.1％甲酸水溶液定容至0.2mL，漩渦混合1min，微孔濾膜過(guò)濾，UPLC-MS/MS進(jìn)樣20μl測(cè)定。液相色譜、質(zhì)譜條件同實(shí)施例中的2.2，質(zhì)譜離子源部分優(yōu)化參數(shù)見實(shí)施例1中的表2。(4)將質(zhì)譜檢測(cè)得到的各化合物的峰面積，代入步驟(2)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到對(duì)應(yīng)β受體激動(dòng)劑的含量。本發(fā)明采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了33種β受體激動(dòng)劑的分析方法。該方法操作簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可以同時(shí)測(cè)定33種β受體激動(dòng)劑，實(shí)現(xiàn)了其高通量分析，可滿足中33種β受體激動(dòng)劑的快速分析的要求。上述雖然結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但并非對(duì)發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。