本發(fā)明涉及藥物分析
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種銀杏葉制劑中有效成分的鑒別方法，主要通過薄層色譜法定性分析銀杏葉制劑中的有效成分，特別是分析黃酮類化合物。
背景技術(shù)：
：銀杏(GinkgoBiloba)是目前世界上現(xiàn)存種子植物中最古老的一種，也是可追溯到2億多年前二疊紀(jì)時的銀杏家族的唯一幸存者。銀杏葉的植藥提取物在中國及很多國家都用于藥物治療，其藥用價值非常高，具有拮抗血小板活化因子、清除自由基、抗炎、抗過敏、擴張血管、保護心腦血管、改善外周血液循環(huán)、降低血清膽固醇及輔助抗癌等多種藥理學(xué)活性。銀杏葉中的黃酮苷和萜類內(nèi)酯是產(chǎn)生上述藥理學(xué)活性的主要成分，也是銀杏葉提取物中的主要有效成分和質(zhì)量控制指標(biāo)。銀杏葉中的主要有效成分之一是黃酮類化合物，包括至少14種不同的化合物，例如黃酮醇、黃酮、黃烷酮和雙黃酮等等，這些化合物中，黃酮苷和黃酮醇苷包括山奈素、槲皮素和異鼠李素與葡萄糖或鼠李糖結(jié)合物(統(tǒng)稱總黃酮醇苷)，是市場上常用于治療目的的銀杏葉制劑中(例如等)最顯著的成分，實驗表明黃酮苷和黃酮醇苷為有力的抗氧劑，可清除氧自由基從而避免由于年齡老化而引起的細(xì)胞和組織損傷，它們會嚴(yán)重影響大腦功能，包括記憶力和注意力，參考文獻如：J.Pincemail等人,LaPresseMedicaleVol.15(1996),1475-1479；J.Robak等人,BiochemPharmacolVol.37(1988),837-841；J.Kleijnen與P.KnipschildGinkgobiloba(DrugProfiles),theLancet340:1136(1992)。目前，臨床或市售的各類銀杏葉制劑(包括但不限于膠囊劑、注射劑、與其他藥效成分聯(lián)用的復(fù)方制劑等)中，主藥成分為銀杏葉或其提取物，也是將總黃酮醇苷和萜類內(nèi)酯作為有效成分進行質(zhì)量控制?，F(xiàn)有銀杏葉制劑的質(zhì)量控制方法，參照中國藥典的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行(詳見2015版《中國藥典》一部,P1491-1493)，總黃酮醇苷的薄層色譜鑒別步驟為：點樣量：3μl，固定相：含4％醋酸鈉的羧甲基纖維素鈉溶液為粘合劑的硅膠G板，展開劑：乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5:3:1:1)，顯色劑：3％三氯化鋁乙醇溶液，置于紫外光燈(365nm)下檢視其熒光，檢視結(jié)果見圖1。該方法的不足之處在于：斑點間界限模糊，拖尾，成線條狀，說明分離效果差，不利于鑒別，難以對銀杏葉制劑中有效成分進行定性分析與質(zhì)量控制。劉瑞明、郭莉等，在《中成藥中銀杏葉薄層色譜快速鑒別》一文(時珍國醫(yī)國藥,1999年第10卷第4期,P265)中提出一種快速鑒別銀杏葉的方法，其薄層色譜的鑒別步驟為：點樣量：10μl，固定相：硅膠G板，展開劑：正丁醇-醋酸-水(4:1:5)，置于紫外光燈(365nm)下檢視其熒光，檢視結(jié)果見圖2(圖2中序號1指復(fù)膽片，序號2指銀杏葉對照藥材，序號3指銀杏葉膠囊)。該方法的不足之處在于：該方法不能對銀杏葉提取物中的各有效成分進行分離，點板后的檢視結(jié)果僅顯現(xiàn)主斑點，僅表明產(chǎn)品含有銀杏葉提取物，區(qū)分度差。CN1508542A公開了名為《銀杏葉組合物及制備方法與應(yīng)用》的中國發(fā)明專利，涉及一種鑒定和定量分析銀杏葉制劑中的有效成分的方法，其黃酮的薄層色譜的鑒別步驟為：點樣量：10μl，固定相：硅膠G板，展開劑：乙酸乙酯-甲酸-乙酸-水(100:11:11:26)，顯色劑：1％三氯化鋁乙醇溶液，置于紫外光燈(365nm)下檢視其熒光(詳見說明書實施5部分)。該方法的不足之處在于：實施案例中僅文字描述檢視結(jié)果顯示有8個黃色斑點，并無圖譜證明，無法判斷鑒定的準(zhǔn)確性。CN1939392A公開了名為《一種中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制方法》的中國發(fā)明專利，涉及對總黃酮醇苷的鑒別測試方法，采用薄層色譜的鑒別步驟為：點樣量：1～30μl，固定相：0.1～8％醋酸鈉的羧甲基纖維素鈉溶液為粘合劑的硅膠G板，展開劑：乙酸乙酯/甲酸乙酯-丁酮/丙酮-甲醇/乙醇-水＝(1-20)：(0.5-10)：(0.1-5)：(0.1-5)，顯色劑：0.5～10％三氯化鋁乙醇溶液，置于紫外光燈(365nm)下檢視其熒光(詳見權(quán)4的d步驟、權(quán)5的d步驟和實施例6部分)。該方法的不足之處在于：從實施例6的展開劑篩選結(jié)果可知，僅僅當(dāng)采用固定相：0.4％醋酸鈉的羧甲基纖維素鈉溶液為粘合劑的硅膠G板、展開劑：乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(5:3:1:1)時，總黃酮醇苷的分離效果清晰，但存在邊緣效應(yīng)的缺陷。CN1772013A公開了名為《銀杏達(dá)莫注射制劑的質(zhì)量控制方法》的中國發(fā)明專利，涉及銀杏葉注射劑中黃酮類物質(zhì)的鑒別方法，其薄層色譜的鑒別步驟為：點樣量：5～20μl，固定相：聚酰胺薄膜，展開劑：二氯甲烷-冰醋酸-50～99％乙醇＝(1～10)：(1～6)：(0.2～5)，顯色劑：0.1～20％三氯化鋁乙醇溶液，置于紫外光燈(365nm)下檢視其熒光(詳見說明書實施例1部分)。該方法的不足之處在于：展開劑的選擇由于物質(zhì)極性的差異，會使得在薄層板兩邊沿的濃度比在中間的低，導(dǎo)致比移值不合適，影響展析結(jié)果，不利于定性分析。綜上所述，如何改進中國藥典所規(guī)定的銀杏葉制劑中有效成分的鑒別方法，提供一種適宜的鑒別方法，尤其是選擇一種合適的展開劑，能夠準(zhǔn)確鑒別銀杏葉制劑中各類有效成分(黃酮類)，實現(xiàn)對有效成分的定性分析，是本領(lǐng)域技術(shù)人員尚未攻克的技術(shù)難題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供了一種銀杏葉制劑中有效成分的鑒別方法，改進了現(xiàn)有的薄層色譜條件，使得黃酮類有效成分能夠清晰分離、精準(zhǔn)鑒別，且方法重現(xiàn)性好，解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案具體如下：一種銀杏葉制劑中有效成分的鑒別方法，包括如下步驟：(1)供試品的制備：取待測銀杏葉制劑適量，加正丁醇提取、過濾，濾液蒸干，殘渣加乙醇使溶解，作為供試品溶液；(2)對照品的制備：取銀杏葉對照制劑適量，加正丁醇提取、過濾，濾液蒸干，殘渣加乙醇使溶解，作為對照品溶液；(3)薄層色譜層析：吸取供試品溶液和對照品溶液各1～10μl，分別點樣于同一硅膠G板，以乙酸乙酯、異丙醇、甲醇和水的混合物展開，取出薄板、空氣中晾干，噴以1～5％三氯化鋁乙醇溶液，置于365nm紫外光燈檢視熒光，觀察斑點；其中，硅膠G板為以含4％醋酸鈉的羧甲基纖維素鈉溶液為粘合劑的硅膠G薄層板，展開劑中各組分的體積比為乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水＝(1～4)：(6～9)：(0.5～1)：(1～2)。優(yōu)選的，步驟(1)和步驟(2)中，加正丁醇15ml，溫浸15分鐘并時時振搖，放冷，過濾，濾液蒸干，殘渣加乙醇2ml使溶解。優(yōu)選的，步驟(3)中，供試品溶液、對照品溶液的點樣量為3μl。優(yōu)選的，步驟(3)中，顯色劑為3％三氯化鋁乙醇溶液。優(yōu)選的，步驟(3)中，展開劑的各組分及體積比為乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水＝2:6:1:1。本發(fā)明中采用薄層色譜鑒別銀杏葉制劑有效成分的原理為：根據(jù)組分(即各有效成分，下同)在吸附劑和展開劑中的吸附系數(shù)不同，在薄層板上進行無數(shù)次吸附，解吸附，再吸附，再解吸附，吸附系數(shù)大的在板上的移動速度慢，吸附系數(shù)小的在板上移動速度快，在薄層板上產(chǎn)生差速遷移為得到分離。因此吸附劑與展開劑的選擇往往是決定試驗成功與否的重要因素。具體到本發(fā)明中，由于吸附劑通常為硅膠G板，替換選擇的可能性較低，而展開劑的選擇對分離效果、分離時間、斑點形狀等影響較大，故選擇合適的展開劑非常關(guān)鍵。我們知道，在薄層色譜過程中，色譜條件的確定、色譜結(jié)果的判斷是非常重要的，而色譜斑點的好壞是判斷色譜結(jié)果的關(guān)鍵。選擇不合適的展開劑會出現(xiàn)拖尾、邊緣效應(yīng)、比移值不合適等情況，嚴(yán)重干擾色譜結(jié)果的判斷，影響樣品鑒別的準(zhǔn)確性及可靠性。例如展開劑的pH值會影響樣液中酸、堿成分在其中的解離形式，不同形式的物質(zhì)極性不同，在薄層板上移動的速度就不同，容易造成拖尾現(xiàn)象。又例如在使用混合溶劑展開時，極性較弱和沸點較低的展開劑在薄層板兩邊沿處較易揮發(fā)，致使在薄層板兩邊沿的濃度比在中間的低，板上展開劑的比例不一致(即比移值不合適)，極性發(fā)生改變，展析結(jié)果容易產(chǎn)生邊緣效應(yīng)。因此，發(fā)明人在選擇展開劑時，是根據(jù)組分的極性、吸附劑的活度、展開劑的極性這三者的相對關(guān)系進行選擇，通過組分分子與展開劑分子爭奪吸附劑表面活性中心而得到分離；在充分考慮各種影響因素的基礎(chǔ)上，經(jīng)多次創(chuàng)造性的實驗探索，才篩選出適合本發(fā)明鑒別方法的專屬展開劑，具有創(chuàng)新價值。需要補充說明的是，本發(fā)明所涉及的銀杏葉制劑有效成分，是指黃酮類化合物，具體涉及槲皮素、山奈素、異鼠李素這三種成分，這三種成分也是目前學(xué)術(shù)界判斷藥理活性的共識成分?？傊?，本發(fā)明提供的銀杏葉制劑中有效成分的鑒別方法，改進了現(xiàn)有技術(shù)的薄層色譜條件，篩選恰當(dāng)?shù)恼归_劑，使得銀杏葉制劑的有效成分在鑒別過程中分離效果好、斑點清晰、比移值適中，能夠準(zhǔn)確鑒別各有效成分，有利于定性分析和質(zhì)量控制；而且該鑒別方法的重現(xiàn)性好、通用性強，可適用于市售的各類銀杏葉制劑的有效成分鑒別，應(yīng)用價值大。附圖說明1、圖1為采用中國藥典方法的薄層色譜檢視結(jié)果圖。2、圖2為采用文獻《中成藥中銀杏葉薄層色譜快速鑒別》方法的薄層色譜檢視結(jié)果圖。3、圖3為實施例1采用本發(fā)明方法的薄層色譜檢視結(jié)果圖。具體實施方式實施例1銀杏葉制劑有效成分的鑒別方法(1)供試品的制備：取待測銀杏葉制劑適量(約相當(dāng)于總黃酮醇苷48mg)，加正丁醇15ml提取，溫浸15分鐘并時時振搖，放冷，過濾，濾液蒸干，殘渣加乙醇2ml使溶解，作為供試品溶液；(2)對照品的制備：取銀杏葉對照制劑適量(約0.2mg)，加正丁醇15ml提取，溫浸15分鐘并時時振搖，放冷，過濾，濾液蒸干，殘渣加乙醇2ml使溶解，作為對照品溶液；(3)薄層色譜層析：吸取供試品溶液和對照品溶液各3μl，分別點樣于同一以含4％醋酸鈉的羧甲基纖維素鈉溶液為粘合劑的硅膠G薄層板，以乙酸乙酯、異丙醇、甲醇和水的混合物展開，展開劑的各組分及體積比：乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水＝2:6:1:1，取出薄板、空氣中晾干，噴以3％三氯化鋁乙醇溶液，置于365nm紫外光燈檢視熒光，觀察斑點。檢視結(jié)果見圖3，清晰顯示有3個斑點，分別對應(yīng)為槲皮素、山奈素、異鼠李素。實施例2銀杏葉制劑有效成分的鑒別方法本實施例中，薄層色譜層析的條件改成：點樣量為10μl，展開劑為乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水＝4:9:0.5:2，顯色劑為5％三氯化鋁乙醇溶液，其余鑒別步驟參照實施例1。檢視結(jié)果清晰顯示有3個斑點。實施例3銀杏葉制劑有效成分的鑒別方法本實施例中，薄層色譜層析的條件改成：點樣量為1μl，展開劑為乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水＝1:6:1:1，顯色劑為1％三氯化鋁乙醇溶液，其余鑒別步驟參照實施例1。檢視結(jié)果清晰顯示有3個斑點。實施例4展開劑的篩選由于銀杏葉制劑有效成分之槲皮素、山奈素、異鼠李素的理化性質(zhì)各不相同，且極性差異的影響對于點板、分離甚為關(guān)鍵，加上可能存在的陰性干擾，普通條件難以達(dá)到精準(zhǔn)鑒別的要求，為此發(fā)明人根據(jù)相似相容原則進行展開劑影響因素的考察，以篩選合適的展開劑?？疾旆椒▍⒄毡景l(fā)明提供的鑒別方法實行，僅替換各種展開劑，其他實驗條件不變，篩選結(jié)果見下表所示。序號條件現(xiàn)象1乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水＝5:3:1:1斑點間界限模糊，拖尾，成線條狀2乙酸乙酯-甲醇-水-正己烷＝10:2:1:5斑點間界限模糊，拖尾，成線條狀3乙酸乙酯-乙酸-正己烷＝5:3:1對照品展開至前沿4乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水＝2:6:1:1分離最清晰，Rf值最適中，陰性無干擾5乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水＝4:9:0.5:2分離清晰，Rf值適中，陰性無干擾6乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水＝1:6:1:1分離清晰，Rf值適中，陰性無干擾上述列表中，序號1對應(yīng)中國藥典，序號4-6對應(yīng)本發(fā)明實施例1-3，可知：當(dāng)選擇以含4％醋酸鈉的羧甲基纖維素鈉溶液為粘合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水＝2:6:1:1為展開劑時，展開效果最佳，此時三種有效成分的分離最清晰，Rf值最適中，陰性無干擾。當(dāng)前第1頁1 2 3