本發(fā)明涉及一種以牛血清蛋白(BSA)為模板，采用化學(xué)還原方法合成直徑為2nm的牛血清蛋白-金納米團(tuán)簇(BSA-AuNCs)，并由BSA-AuNCs合成得到BSA-AuNCs-Cu²⁺熒光傳感器，以及利用該BSA-AuNCs-Cu²⁺熒光傳感器對(duì)多聚磷酸鹽含量進(jìn)行檢測(cè)的方法。

背景技術(shù)：

多聚磷酸鹽作為保水劑和品質(zhì)改良劑，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品的保存和運(yùn)輸過(guò)程中，起到保持水分、減少液滴流失、改善口感的作用，同時(shí)還可以調(diào)節(jié)pH值、乳化、緩沖、螯合金屬離子等。然而，在水產(chǎn)品加工過(guò)程中過(guò)多地使用多聚磷酸鹽，不僅危害了消費(fèi)者的權(quán)益，更是對(duì)廣大消費(fèi)者的健康造成影響。

攝入過(guò)量的多聚磷酸鹽，會(huì)促進(jìn)血液凝結(jié)，其降解產(chǎn)物磷酸鹽也可能增大攝入者心腦血管疾病發(fā)生的可能性；多磷酸鹽的過(guò)量殘留，也會(huì)影響人體中鈣、鐵、銅、鋅等必需元素的吸收平衡，體內(nèi)的多聚磷酸鹽不斷累積會(huì)導(dǎo)致機(jī)體鈣磷的失衡，影響鈣的吸收，容易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。

隨著我國(guó)加入世界貿(mào)易組織，水產(chǎn)品的出口需求量日益增多，很多國(guó)內(nèi)出口企業(yè)為提高出成率、保持水產(chǎn)品品質(zhì)、提高經(jīng)濟(jì)效益而出現(xiàn)了在水產(chǎn)品中過(guò)量添加多聚磷酸鹽的情況，超出歐盟以及國(guó)際食品法典(CODEX)規(guī)定最大限量，被頻頻通報(bào)多聚磷酸鹽超標(biāo)，因而形成貿(mào)易壁壘，嚴(yán)重影響我國(guó)出口企業(yè)的經(jīng)濟(jì)利益。食品法典(CODEX)允許多聚磷酸鹽在冷凍水產(chǎn)制品(魚片、蝦等)和終產(chǎn)品中最大濃度為1％，而歐盟法規(guī)允許最大用量為5g/kg，巴西和加拿大等國(guó)食品局規(guī)定在不同最終產(chǎn)品中最大濃度為0.1％或0.5％。因此，檢測(cè)水產(chǎn)品中的多聚磷酸鹽含量，顯得十分重要。

目前對(duì)于多聚磷酸鹽的檢測(cè)方法主要有薄層層析色譜法、高效毛細(xì)管電泳法、離子色譜法及核磁共振法等，其中薄層層析色譜法操作方便、設(shè)備簡(jiǎn)單、顯色容易，同時(shí)展開速率快，但靈敏度低，不能準(zhǔn)確定量且繁瑣耗時(shí)，不能滿足現(xiàn)代檢測(cè)需求；高效毛細(xì)管電泳法及核磁共振法均因操作過(guò)程繁瑣、對(duì)檢測(cè)人員要求較高以及食品基體較復(fù)雜等原因，不能廣泛地應(yīng)用到食品分析當(dāng)中；離子色譜法是常見的檢測(cè)水產(chǎn)品中多聚磷酸鹽含量的方法，具有分析效率高、速度快，檢測(cè)靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但定性能力較差。

近年來(lái)，納米技術(shù)發(fā)展迅速。熒光金納米團(tuán)簇(gold nanocluster，Au NCs)所展現(xiàn)出的尺寸小、水溶性好、低毒性、表面易于修飾、熒光穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，使其為生物分析及醫(yī)學(xué)診斷研究提供了新的標(biāo)記手段，開辟了新的應(yīng)用領(lǐng)域。利用金納米團(tuán)簇的熒光猝滅原理設(shè)計(jì)的熒光探針能特異性地檢測(cè)環(huán)境中的化學(xué)和生物制劑等。2009年，Xie等利用牛血清蛋白BSA作為模板合成了具有紅色熒光的BSA-AuNCs，加入Cu²⁺可以使BSA-AuNCs的熒光淬滅，而加入金屬螯合劑則可使熒光恢復(fù)。由此推測(cè)，加入金屬螯合劑多聚磷酸鈉PPy能使BSA-AuNCs-Cu²⁺的熒光恢復(fù)。本發(fā)明以BSA為模板，采用化學(xué)還原的方法制備直徑2nm的熒光生物傳感器BSA-AuNCs，通過(guò)確定最優(yōu)檢測(cè)，探索BSA-AuNCs-Cu²⁺對(duì)PPy的檢測(cè)機(jī)制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明以牛血清蛋白(BSA)為模板，采用化學(xué)還原方法合成直徑為2nm的牛血清蛋白-金納米團(tuán)簇(BSA-AuNCs)，能在波長(zhǎng)范圍為200nm-800nm紫外光的掃描下發(fā)出紅色的熒光。當(dāng)Cu²⁺與BSA鏈中的甘氨酸螯合生成BSA-AuNCs-Cu²⁺時(shí)，熒光會(huì)猝滅；當(dāng)加入多聚磷酸根(PPy)時(shí)，PPy將與Cu²⁺螯合使Cu²⁺從BSA-AuNCs-Cu²⁺表面脫離出來(lái)，形成BSA-AuNCs，熒光恢復(fù)?；谶@樣的原理，發(fā)明者設(shè)計(jì)出BSA-AuNCs-Cu²⁺熒光傳感器，對(duì)多聚磷酸鹽含量進(jìn)行檢測(cè)。這個(gè)熒光傳感器具有無(wú)污染、簡(jiǎn)單、快速、高選擇性的特點(diǎn)，線性范圍為10-100nM，檢出限為10nM。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PPy濃度越大，相應(yīng)的，系統(tǒng)的熒光恢復(fù)得更多，且PPy的濃度與系統(tǒng)的熒光恢復(fù)率呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

一方面，本發(fā)明涉及一種以牛血清蛋白(BSA)為模板，采用化學(xué)還原方法合成直徑為2nm的牛血清蛋白-金納米團(tuán)簇(BSA-AuNCs)。

另一方面，本發(fā)明涉及該牛血清蛋白-金納米團(tuán)簇(BSA-AuNCs)的制備方法，所述方法包括在37℃下將HAuCl₄溶液加入到BSA溶液中，劇烈攪拌后，加入NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至12，將該混合液在37℃下水浴12h。更具體地，HAuCl₄溶液的濃度為1.0M，BSA溶液的濃度為50mg/mL，NaOH溶液的濃度為1.0M。

另一方面，本發(fā)明涉及BSA-AuNCs-Cu²⁺熒光傳感器，其包含BSA-AuNCs溶液、pH為6的NaAc-HAc緩沖液、Cu²⁺溶液。具體地，所述Cu²⁺溶液的濃度為10μM。

另一方面，本發(fā)明涉及BSA-AuNCs-Cu²⁺熒光傳感器在測(cè)定多聚磷酸鹽含量中的用途。

本發(fā)明通過(guò)研究以BSA為模板，采用化學(xué)還原的方法成功制備了直徑2nm的熒光生物傳感器BSA-AuNCs，用以檢測(cè)PPy的含量。結(jié)果表明，金納米團(tuán)簇在BSA的作用下形成BSA-AuNCs，具有紅色的熒光。加入Cu²⁺時(shí)，Cu²⁺與BSA鏈中的甘氨酸螯合生成BSA-AuNCs-Cu²⁺，致使熒光淬滅。接著加入金屬螯合劑PPy，PPy具有更高的與Cu²⁺螯合的能力，與Cu²⁺螯合而使Cu²⁺從BSA-AuNCs表面脫離出來(lái)，使系統(tǒng)熒光恢復(fù)，且隨著加入的多聚磷酸根離子濃度的增大，相應(yīng)的，系統(tǒng)的熒光恢復(fù)得也越多?；谶@樣的原理，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種BSA-AuNCs熒光生物傳感器，用于檢測(cè)水產(chǎn)品中PPy的含量。此方法線性范圍為10nM-100nM，檢出限為10nM。因此，本發(fā)明檢測(cè)方法具有工藝流程簡(jiǎn)單，操作方便，檢測(cè)PPy靈敏度高、高效、快速，具有實(shí)用性等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1(a)示出了BSA-AuNCs溶液的紫外光譜圖。

圖1(b)示出了平均大小為2nm的BSA-AuNCs的電鏡圖(低倍數(shù))。

圖1(c)示出了Cu²⁺與BSA-AuNCs發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成BSA-AuNCs-Cu²⁺的電鏡圖(高倍數(shù))。

圖2示出了熒光生物傳感器BSA-AuNCs的設(shè)計(jì)程序與檢測(cè)機(jī)制圖解。

圖3(a)示出了BSA-AuNCs的熒光光譜圖。

圖3(b)示出了EDTA的熒光光譜圖。

圖4示出了不同濃度Cu²⁺的熒光光譜圖。

圖5示出了反應(yīng)時(shí)間與系統(tǒng)熒光值的關(guān)系。

圖6(a)和(b)示出了BSA-AuNCs熒光生物傳感器檢測(cè)PPy的含量。

具體實(shí)施方式

下面，將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

需要說(shuō)明的是，在本文中，術(shù)語(yǔ)“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過(guò)程、方法、物品或者設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒(méi)有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過(guò)程、方法、物品或者設(shè)備所固有的要素。

本發(fā)明以牛血清蛋白(BSA)為模板，采用化學(xué)還原方法合成直徑為2nm的牛血清蛋白-金納米團(tuán)簇(BSA-AuNCs)，能在波長(zhǎng)范圍為200nm-800nm紫外光的掃描下發(fā)出紅色的熒光。當(dāng)Cu²⁺與BSA鏈中的甘氨酸螯合生成BSA-AuNCs-Cu²⁺時(shí)，熒光會(huì)猝滅；當(dāng)加入多聚磷酸根(PPy)時(shí)，PPy將與Cu²⁺螯合使Cu²⁺從BSA-AuNCs-Cu²⁺表面脫離出來(lái)，形成BSA-AuNCs，熒光恢復(fù)。基于這樣的原理，發(fā)明者設(shè)計(jì)出BSA-AuNCs-Cu²⁺熒光傳感器，對(duì)多聚磷酸鹽含量進(jìn)行檢測(cè)。這個(gè)熒光傳感器具有無(wú)污染、簡(jiǎn)單、快速、高選擇性的特點(diǎn)，線性范圍為10-100nM，檢出限為10nM。結(jié)果表明，PPy濃度越大，相應(yīng)的，系統(tǒng)的熒光恢復(fù)得更多，且PPy的濃度與系統(tǒng)的熒光恢復(fù)率呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1.試劑與儀器

表1：實(shí)驗(yàn)試劑

表2：實(shí)驗(yàn)儀器

注：所有的化學(xué)物質(zhì)純度應(yīng)超過(guò)99％，并且沒(méi)有進(jìn)一步地凈化。每一個(gè)步驟所用的水應(yīng)為超純水。

2.BSA-AuNCs的制備

在37℃下，將15mL 10.0mM的HAuCl₄溶液加入15mL、50mg/mL BSA溶液中，劇烈攪拌。2min后，加入1.3mL、1.0M的NaOH調(diào)節(jié)pH值至12，該混合液在37℃下水浴12h。溶液的顏色將從淺黃色變?yōu)闇\棕色，然后變成深棕色。最后，BSA-AuNCs溶液得以制成，用超純水稀釋到200mL，并在4℃下保存以備用。

3.多聚磷酸鹽離子的檢測(cè)方法

將1.00mL BSA-AuNCs溶液、1.00mL pH為6的NaAc-HAc緩沖液、10μM Cu²⁺溶液以及1.00mL不同濃度的多聚磷酸鹽(PPy)加入10mL的比色管中，用超純水稀釋到10mL并快速混勻，靜置20min，使用熒光分度計(jì)測(cè)其熒光值。同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。

△F＝F₁-F₀……………………………………………(1)

式中：

△F—系統(tǒng)的相對(duì)熒光強(qiáng)度；

F1—溶液的熒光強(qiáng)度；

F0—空白溶液的熒光強(qiáng)度

熒光猝滅率＝△F/F₀……………………………………(2)

式中：

△F—系統(tǒng)的相對(duì)熒光強(qiáng)度；

F0—空白溶液的熒光強(qiáng)度

4.結(jié)果和討論

4.1BSA-AuNCs的紫外光譜分析

取上述配制好的BSA-AuNCs溶液，使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，掃描波長(zhǎng)范圍為200nm-800nm，得出紫外光譜圖如圖1(a)所示，其中，橫坐標(biāo)表示掃描波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)表示相應(yīng)的吸光度。從圖中可看出，在200nm-800nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，BSA-AuNCs沒(méi)有吸收峰，而是一條平滑向下延伸的曲線。對(duì)此進(jìn)行分析，出現(xiàn)這種情況的原因是，所合成的金納米團(tuán)簇尺寸很小，不會(huì)產(chǎn)生大尺寸金納米顆粒的特征吸收峰，因而在200nm-800nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)是沒(méi)有吸收峰的。

圖1(b)展現(xiàn)了電鏡下平均大小為2nm的BSA-AuNCs，它們呈球形，具有較好的分散性。當(dāng)Cu²⁺加入到BSA-AuNCs系統(tǒng)時(shí)，Cu²⁺與BSA-AuNCs發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成BSA-AuNCs-Cu²⁺(如圖1(c))所示，而體積也相應(yīng)地變大，熒光發(fā)生猝滅。當(dāng)往BSA-AuNCs-Cu²⁺中加入PPy時(shí)，BSA-AuNCs的尺寸大小便會(huì)恢復(fù)到大約2nm，這是因?yàn)镻Py與Cu²⁺發(fā)生螯合，Cu²⁺從BSA-AuNCs-Cu²⁺中移除而使BSA-AuNCs的體積減小到原來(lái)的大小，同時(shí)熒光特性恢復(fù)。上述檢測(cè)機(jī)制很好地說(shuō)明了，從BSA-AuNCs、BSA-AuNCs-Cu²⁺到BSA-AuNCs-Cu²⁺-PPy，它們的顆粒大小發(fā)生變化，相應(yīng)地，其熒光特性也發(fā)生變化。

4.2BSA–AuNCs熒光生物傳感器物檢測(cè)多聚磷酸根離子的機(jī)制

利用蛋白質(zhì)-牛血清白蛋白(bovine serumalbumin，BSA)作為模板原位合成BSA-Au NCs，該團(tuán)簇材料由25個(gè)金原子組成，具有紅色熒光(λem＝640nm)，熒光量子產(chǎn)率(QY)為6％。游離態(tài)Cu²⁺可與蛋白質(zhì)中的巰基結(jié)合，干擾巰基的活性。Cu²⁺會(huì)與金納米團(tuán)簇表面的谷胱甘肽(glutathine，GSH)保護(hù)層發(fā)生配位作用(GSH:Cu²⁺＝2:1)，該作用引起Au NCs團(tuán)聚從而導(dǎo)致熒光降低。值得注意的是，加入金屬離子螯合劑后^[13]，被Cu²⁺抑制的熒光又可得到恢復(fù)。

上述熒光感應(yīng)器的設(shè)計(jì)程序與檢測(cè)機(jī)制的圖解如圖2所示。BSA-AuNCs與Cu²⁺結(jié)合成為BSA-AuNCs-Cu²⁺，導(dǎo)致BSA-AuNCs熒光性降低；在上述系統(tǒng)中加入金屬螯合劑PPy，PPy與Cu²⁺螯合，使Cu²⁺從BSA-AuNCs表面釋放出來(lái)，BSA-AuNCs熒光值得以恢復(fù)。

如圖3(a)所示，一曲線表示將1.00mL BSA-AuNCs溶液、1.00mL pH為6的NaAc-HAc緩沖液、10μM Cu²⁺溶液混合并稀釋至10mL，靜置20min，使用熒光分度計(jì)測(cè)得的熒光光譜圖，其中激發(fā)波長(zhǎng)為400nm，掃描范圍為560-660nm，最大吸收峰在618nm處；另一曲線表示將1.00mL BSA-AuNCs溶液、1.00mL pH為6的NaAc-HAc緩沖液、10μM Cu²⁺及100nM PPy溶液混合并稀釋至10mL，靜置20min，使用熒光分度計(jì)測(cè)得的熒光光譜圖，其中激發(fā)波長(zhǎng)為400nm，掃描范圍為560-660nm，最大吸收峰在618nm處。由圖3(a)明顯可見，在BSA-AuNCs-Cu²⁺溶液中加入PPy后，熒光光譜曲線往上移動(dòng)，即熒光值增大了。這是因?yàn)镻Py具有更高的與Cu²⁺螯合的能力，當(dāng)系統(tǒng)加入PPy時(shí)，Cu²⁺將從BSA-AuNCs表面脫離出來(lái)而使熒光恢復(fù)。根據(jù)BSA-AuNCs-Cu²⁺的這些特性，一個(gè)新型的檢測(cè)PPy的熒光感應(yīng)器就設(shè)計(jì)出來(lái)了。

基于上述BSA-AuNCs-Cu²⁺熒光生物傳感器物的檢測(cè)原理，我們發(fā)現(xiàn)：添加的金屬螯合劑濃度越大，相應(yīng)的，BSA-AuNCs-Cu²⁺溶液體系的熒光恢復(fù)得越大，且呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系。根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)：配制不同濃度的金屬螯合劑EDTA，濃度分別為1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM，分別加入1.00mL BSA-AuNCs溶液、1.00mL10μM Cu²⁺溶液及1.00mL pH為6的NaAc-HAc緩沖液，溶混合并稀釋至10mL，靜置20min，使用熒光分度計(jì)分別測(cè)其熒光值，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得出曲線圖如圖3(b)所示。從圖中可以看出，隨著EDTA濃度的增大，(F1-F0)/F0的值也隨之增大。

4.3檢測(cè)多聚磷酸根離子的最佳外界條件

為了避免檢測(cè)過(guò)程中受其他外界因素的干擾，使多聚磷酸根離子濃度的檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確，因此，必須保證多聚磷酸根離子濃度的檢測(cè)是在最佳外界條件下進(jìn)行的。為使實(shí)驗(yàn)更為順利地進(jìn)行，在探索檢測(cè)多聚磷酸根離子濃度的最佳外界條件過(guò)程中，統(tǒng)一設(shè)定反應(yīng)溫度為室溫(25℃)，采用單一變量法，主要研究了試劑數(shù)量及反應(yīng)時(shí)間在靈敏性、選擇性、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性等方面的影響。

4.3.1BSA-AuNCs和Cu²⁺濃度的影響

為研究Cu²⁺濃度對(duì)系統(tǒng)熒光值的影響，現(xiàn)采用控制變量法，通過(guò)改變Cu²⁺的濃度，觀察系統(tǒng)的熒光值變化情況，以探求檢測(cè)體系熒光值中最佳的Cu²⁺濃度。

取1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM的Cu²⁺溶液，分別加入1.00mL BSA-AuNCs溶液及1.00mL pH為6的NaAc-HAc緩沖液，溶液混合并稀釋至10mL，靜置20min，使用熒光分度計(jì)分別測(cè)其熒光值，其中激發(fā)波長(zhǎng)為400nm，掃描波長(zhǎng)為500nm-700nm，最大吸收峰在618nm處。所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得出曲線圖如圖4所示。由圖4可知，隨著Cu²⁺濃度的增大，相應(yīng)地，縱坐標(biāo)的值也增大，且呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。即隨著Cu²⁺濃度的增大，相應(yīng)地，系統(tǒng)的相對(duì)熒光值下降，當(dāng)Cu²⁺濃度為10μM時(shí)，系統(tǒng)的相對(duì)熒光值達(dá)到最低值。因此，我們選定檢測(cè)系統(tǒng)熒光值最佳的Cu²⁺濃度為10μM。

4.3.2pH和反應(yīng)時(shí)間的影響

已有相關(guān)研究人員研究表明，當(dāng)1.0mL pH為6的BR緩沖溶液、Phosphate沖溶液、C₇H₁₅NO₄S、C₈H₁₈N₂O₄S、NaAc-HAc以及Tris-Hcl分別作為緩沖溶液，系統(tǒng)的△F值分別為7.9、16.4、6.3、27.3、36.5和31.3，相應(yīng)的，RSD％(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差)為4.3、3.7、4.1、2.9、2.3和3.0。結(jié)果表明，當(dāng)pH為6的NaAc-HAc作為緩沖液時(shí)，系統(tǒng)的△F達(dá)到最大值。不同pH的1mL NaAc-HAc緩沖溶液對(duì)系統(tǒng)△F值的影響也已作出評(píng)估。在pH為5時(shí)，BSA-AuNCs從溶液中沉淀出來(lái)，此時(shí)的pH接近BSA的等電點(diǎn)。在Ph為6-10的范圍內(nèi)，△F隨著pH的增加而降低。這是因?yàn)镃u²⁺在高pH值(pH＞6.0)條件下能大量水解，降低系統(tǒng)的熒光恢復(fù)率。系統(tǒng)的△F值在pH為6時(shí)達(dá)到最大值。因此，選定系統(tǒng)反應(yīng)的pH為6。

將1.00mL BSA-AuNCs溶液、1.00mL pH為6的NaAc-HAc緩沖液、10μM Cu²⁺溶液混合，并稀釋至10mL，分別靜置不同的時(shí)間，使用熒光分度計(jì)檢測(cè)熒光值，其中激發(fā)波長(zhǎng)為400nm,掃描范圍為550nm-750nm，最大吸收峰在618nm處。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，得到“時(shí)間-熒光值”關(guān)系圖如圖5所示。從圖5可知，溶液靜置0-6min時(shí)，溶液的熒光值是急劇下降的；靜置時(shí)間超過(guò)10min時(shí)，溶液的熒光值趨于平穩(wěn)。因此，我們可以統(tǒng)一取系統(tǒng)的反應(yīng)時(shí)間為20min。

BSA-AuNCs熒光生物傳感器物檢測(cè)多聚磷酸根離子濃度，須在最佳外界條件下進(jìn)行，根據(jù)前面的研究結(jié)果及相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，我們可以確定最佳檢測(cè)條件為：反應(yīng)溫度為室溫(25℃)，反應(yīng)體系pH為6，反應(yīng)時(shí)間為20min，Cu²⁺濃度為10μM。

4.4BSA-AuNCs熒光生物傳感器對(duì)PPy的檢測(cè)

BSA-AuNCs-Cu²⁺中加入金屬螯合劑后，被猝滅的熒光可得到恢復(fù)，PPy是金屬螯合劑，原理上可使BSA-AuNCs-Cu²⁺猝滅的熒光得到恢復(fù)。

取不同濃度的PPy溶液，分別加入1.00mL BSA-AuNCs溶液、1.00mL pH為6的NaAc-HAc緩沖液及1.00mL10μM的Cu²⁺溶液，溶液混合并稀釋至10mL，靜置20min，使用熒光分度計(jì)分別測(cè)其熒光值，其中激發(fā)波長(zhǎng)為400nm，掃描范圍為550nm-750nm，最大吸收峰在618nm處。所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得出曲線圖如圖6(a)所示。從圖6(a)可知，PPy濃度與熒光值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，隨著多聚磷酸根離子濃度的增大，其熒光值也相應(yīng)地增大。即加入PPy，使BSA-AuNCs-Cu²⁺猝滅的熒光得到增加，且隨著加入的PPy的濃度的增大，BSA-AuNCs-Cu²⁺被猝滅的熒光增加得更多。因此,可以利用BSA-AuNCs熒光生物傳感器物對(duì)PPy的含量進(jìn)行檢測(cè)。

對(duì)該次實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)再次進(jìn)行整理，得出曲線圖如圖6(b)所示。由圖可知，隨著PPy濃度的增大，相應(yīng)地，縱坐標(biāo)的值也增大，且呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，充分驗(yàn)證了BSA-AuNCs熒光生物傳感器物檢測(cè)PPy的原理：Cu²⁺與BSA鏈中的甘氨酸螯合生成BSA-AuNCs，該作用引起AuNCs團(tuán)聚從而導(dǎo)致熒光降低；加入金屬離子螯合劑PPy后，PPy與Cu²⁺螯合使Cu²⁺從BSA-AuNCs表面脫離出來(lái)，形成BSA-AuNCs，熒光恢復(fù)。

綜上所述，本發(fā)明以BSA為模板，采用化學(xué)還原的方法成功制備了直徑2nm的熒光生物傳感器BSA-AuNCs，用以檢測(cè)PPy的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金納米團(tuán)簇在BSA的作用下形成BSA-AuNCs，具有紅色的熒光。加入Cu²⁺時(shí)，Cu²⁺與BSA鏈中的甘氨酸螯合生成BSA-AuNCs-Cu²⁺，致使熒光淬滅。接著加入金屬螯合劑PPy，PPy具有更高的與Cu²⁺螯合的能力，與Cu²⁺螯合而使Cu²⁺從BSA-AuNCs表面脫離出來(lái)，使系統(tǒng)熒光恢復(fù)，且隨著加入的多聚磷酸根離子濃度的增大，相應(yīng)的，系統(tǒng)的熒光恢復(fù)得也越多。基于這樣的原理，設(shè)計(jì)了BSA-AuNCs熒光生物傳感器，用于檢測(cè)水產(chǎn)品中PPy的含量。此方法線性范圍為10nM-100nM，檢出限為10nM，檢測(cè)PPy靈敏、高效、快速，具有實(shí)用性。