本發(fā)明屬于生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種抗凝血酶活性檢測試劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

一、人體的止血(凝血)機制

止血(凝血)機制是人體的一項非常重要的自我保護功能，止血(凝血)機制包括凝血和抗凝兩個方面，兩者間的動態(tài)平衡是正常機體維持體內(nèi)血液流動狀態(tài)和防止血液丟失的關(guān)鍵，它能在血管受傷破損時通過血小板的凝聚來封閉血管的傷口從而防止大量的血液流失。止血(凝血)過程是一系列凝血因子被相繼酶解激活的過程，止血(凝血)過程最終生成凝血酶，形成纖維蛋白凝塊。尤其止血(凝血)過程是一個被精準(zhǔn)調(diào)控的過程，血小板的凝聚既要有一定的量來保證封閉住血管的傷口又不能凝聚過多反而堵塞血管。機體的正常止凝血，主要依賴于完整的血管壁結(jié)構(gòu)和功能、有效的血小板質(zhì)量和數(shù)量，以及正常的血漿凝血因子活性。

這樣一個復(fù)雜的精準(zhǔn)調(diào)控的過程分為：初期止血、二期止血、三期止血，是由血小板、血管壁和一系列凝血因子和纖維蛋白溶解因子共同參與和相互作用完成的。初期止血涉及受損血管的收縮、內(nèi)皮下膠原組織的暴露以及血小板在受損血管表面的粘附、聚集和形成初期止血栓。由于它們在強度上還不足以抵抗血液在血管中流動所產(chǎn)生的剪切力帶來的沖擊，故人體止血(凝血)機制還需要纖維蛋白凝聚物的進一步結(jié)合作用和穩(wěn)定作用才能夠完成封閉住血管的傷口的任務(wù)。二期止血是指在形成初期止血栓的部位進一步形成纖維蛋白凝塊的過程。纖維蛋白凝聚物的產(chǎn)生是一個復(fù)雜的過程。血管壁受傷破損導(dǎo)致一系列凝血因子的活化，通過凝血瀑布的傳遞活化了因子(即凝血因子)X，活化因子X(以下簡稱FXa)進一步把凝血酶原活化為凝血酶。凝血酶是一種多功能的蛋白酶，它在止血過程中非常關(guān)鍵，是一個處于核心地位的凝血因子。它把纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，纖維蛋白隨后多聚體化形成纖維蛋白凝聚物。纖維蛋白凝聚物通過和血小板凝聚物細胞膜表面上蛋白的進一步作用來穩(wěn)定它們增加它們的強度。這樣才能封閉住血管的傷口防止血液更多流失。當(dāng)血管的傷口愈合修復(fù)時，血液中的纖維蛋白溶解過程啟動來除去這些纖維蛋白凝聚物避免血管堵塞以及其它的危害。三期止血是由血小板聚合物、纖維蛋白絲和陷入的紅細胞所組成的疏松的網(wǎng)狀物，通過此過程形成了牢固的凝血塊。在正常情況下，血管沒有受傷時，血液系統(tǒng)中有一些機制來防止止血過程非正常啟動從而引起纖維蛋白凝聚物形成甚至血栓。抗凝血酶(又稱抗凝血酶III，英文縮寫為ATIII)就是其中重要的一個。

二、血液中抗凝血酶測定的臨床意義

抗凝血酶能抑制凝血酶以及其它一些凝血瀑布中的絲氨酸蛋白酶比如活化因子X(FXa)，活化因子IX(FIXa)和活化因子XI(FXIa)，這些蛋白酶的活性位點和抗凝血酶的反應(yīng)中心會形成復(fù)合物從而這些蛋白酶的活性受到抑制。但是抗凝血酶抑制這些蛋白酶的效率并不高，而當(dāng)人體內(nèi)的一些葡萄糖胺聚糖，比如硫酸類肝素在血管壁和抗凝血酶結(jié)合時，則會引起抗凝血酶的構(gòu)象變化導(dǎo)致抗凝血酶抑制這些蛋白酶的效率增加千倍左右。醫(yī)療上應(yīng)用的肝素提取自?；蜇i的腸，它被廣泛的用作抗凝劑。它和抗凝血酶結(jié)合，具有和硫酸類肝素類似的作用，也會極大的增加抗凝血酶抑制這些蛋白酶的效率。

抗凝血酶在防止止血機制過度使用和血栓形成上有重要作用，且抗凝血酶缺失會導(dǎo)致靜脈血栓或者肺栓塞癥，而抗凝血酶含量或者活性低的個體患上易栓癥和形成血栓的危險性也比較高?？鼓溉笔в羞z傳性的也有獲得性的：遺傳性抗凝血酶缺失癥在1965年在一個經(jīng)常發(fā)生血栓性栓塞的挪威家庭發(fā)現(xiàn)。正常人的抗凝血酶的活性被定義為100％，通常75％-125％是正常范圍，而這類患者的抗凝血酶活性只有正常人的40-70％。獲得性抗凝血酶缺失癥的原因有多種，包括肝病引起的抗凝血酶合成減少，腎病引起的抗凝血酶流失，使用肝素等藥物引起的抗凝血酶損失，以及彌散性血管內(nèi)凝血引起的抗凝血酶消耗。抗凝血酶缺失癥的治療包括使用肝素、華伐令或者純化抗凝血酶。無論是遺傳性的還是獲得性的抗凝血酶缺失癥都給患者帶來血栓的風(fēng)險，給他們的健康和生命帶來難以預(yù)測的威脅。而對抗凝血酶的準(zhǔn)確檢測則會對抗凝血酶缺失癥、易栓癥、靜脈血栓以及肺栓塞癥的及時的診斷和治療具有重大的意義。

三、抗凝血酶測定的影響因素

據(jù)了解，現(xiàn)有的公開的對抗凝血酶的檢測大致有三類方法，分別是凝固法、免疫法和以凝血酶為基礎(chǔ)的發(fā)色底物法。凝固法主要是比較待測血漿和參考血漿在凝血瀑布被相應(yīng)試劑激活后凝固時間來測定抗凝血酶的活性。雖然凝固法可以直接使用待測血漿也可以將待測血漿加熱脫纖維蛋白然后使用，但其操作繁瑣而且凝固時間變異較大，不利于準(zhǔn)確測算。免疫類方法分為兩種，第一種是酶聯(lián)免疫法。這種方法是在微量滴定板的孔中包被上抗凝血酶的抗體，然后加入不同比例稀釋的樣本血漿和標(biāo)準(zhǔn)血漿孵育，清洗之后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗抗凝血酶的抗體，再次清洗之后加入辣根過氧化物酶的底物，反應(yīng)完全后讀取吸光度，最后通過標(biāo)準(zhǔn)血漿的吸光度得到標(biāo)準(zhǔn)曲線再推算出標(biāo)準(zhǔn)血漿的抗凝血酶含量。免疫類方法中的另一種方法稱為勞瑞爾火箭電泳法，是將抗抗凝血酶的抗體和融化的瓊脂混合然后冷卻成膠，加上樣本血漿和標(biāo)準(zhǔn)血漿后進行電泳，電泳完成后抗原抗體復(fù)合物用考馬斯藍染色來檢測。不同抗凝血酶含量的血漿形成的抗原抗體復(fù)合物具有不同的高度，而其含量和濃度是成正比的。據(jù)此可以得出標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣本血漿中抗凝血酶的含量。；由于上述免疫類方法是手工操作，故不同檢測批次間的差異較大，步驟繁瑣，準(zhǔn)確度不高，且不能進行自動化操作。

第三類方法是以凝血酶為基礎(chǔ)的發(fā)色底物法。此法是在待測血漿中加入肝素以及過量的凝血酶進行孵育，試劑中的凝血酶在肝素的存在下與待測血漿中的抗凝血酶形成凝血酶和抗凝血酶的復(fù)合物，使凝血酶的活性受到抑制。此后再加入凝血酶的發(fā)色底物進行孵育，這里的發(fā)色底物是由三到四個氨基酸和共價結(jié)合在末端的4-硝基苯胺(4-nitroaniline，pNA)組成，其可以被剩余的未被抑制的凝血酶裂解并釋放出4-硝基苯胺，這種反應(yīng)可引起在405納米處吸光度的變化，而產(chǎn)生的4-硝基苯胺的量是和樣品中抗凝血酶的活性成反比的。因此，利用測量405nm處吸光度的變化就可以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并推算出樣品中抗凝血酶的活性。

由于該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好、檢測時間短，能夠適用于多種自動化分析儀器，且在國產(chǎn)化檢測試劑的發(fā)展下，大幅降低了臨床檢測費用，在臨床應(yīng)用中應(yīng)用也越加廣泛。實際上，雖然此法已在臨床應(yīng)用中廣泛使用，但在其測定過程中大多還是有檢測結(jié)果受血漿中多種干擾物質(zhì)影響的情況發(fā)生。例如，采用以凝血酶為基礎(chǔ)的發(fā)色底物法測定抗凝血酶活性，如果樣品中含有凝血酶抑制劑(如水蛭素、阿加曲班等)，將會使檢測結(jié)果偏高；又如血液中自然存在的肝素輔因子II和肝素結(jié)合，可以抑制凝血酶活性，使此法測定抗凝血酶受到肝素輔因子II的影響從而高估樣品中抗凝血酶的活性。因此，此法的使用范圍受到了一定的限制。

四、現(xiàn)有技術(shù)的局限性

為了降低肝素輔因子II的影響，美國專利US5985582和中國專利CN102690862A中，公開了一種抗凝血酶III測定試劑盒(ATIII發(fā)色底物法)，是以凝血酶為基礎(chǔ)的發(fā)色底物法進行測定，試劑盒包含肝素衍生物、凝血酶和發(fā)色底物試劑；所述試劑在把肝素加入樣本前將其進行酶解，裂解出一個或多個不飽和雙糖而得到肝素衍生物。這種肝素衍生物仍然具有與肝素類似的和抗凝血酶結(jié)合來抑制凝血酶的能力，但是和肝素輔因子II結(jié)合來抑制凝血酶的能力卻大大降低。這樣在樣本中加入肝素衍生物而不是肝素就可以將肝素輔因子II對檢測抗凝血酶的活性的影響降到很低。但由于其采用了肝素衍生物和進口的凝血酶，且肝素衍生物需要從肝素的裂解得到，這就增加了試劑制作的成本，同時也使試劑制作的步驟變得比較繁瑣。由于該技術(shù)成本高，因此減少了試劑的用量，體積的縮小可能會引起最后在比色的過程中部分的數(shù)值不能顯示。并且該現(xiàn)有技術(shù)在全自動凝血儀上進行ATIII活性檢測時需要更改很多參數(shù)，操作不方便，結(jié)果也容易出現(xiàn)誤差。

另外，中國發(fā)明專利申請CN104714036A也公開了一種抗凝血酶III活性測定試劑盒，其也是采用了以凝血酶為基礎(chǔ)的發(fā)色底物法進行測定，但以凝血酶為基礎(chǔ)的發(fā)色底物法存在很大的缺陷。該法通過加入外源性凝血酶來分析待測血漿中抗凝血酶的活性，由于待測血漿中自然存在抗凝血酶之外的另一個凝血酶抑制劑——肝素輔助因子II(HCII)，因此該法易受待測血漿中HCII的干擾而導(dǎo)致抗凝血酶的測定不準(zhǔn)確。因為普通人群的血漿中都自然存在肝素輔助因子II，所以此法所測定的抗凝血酶活性是不準(zhǔn)確的。更值得一提的是，此法不能用于使用水蛭素(Hirudin)、阿加曲班(Argatroban)或者達比加群(Dabigatran)的人，因為這些藥物均為凝血酶的直接抑制劑，都會使抗凝血酶活性檢測結(jié)果偏高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明的目的之一是提供一種抗凝血酶活性檢測試劑，可避開待測樣本中肝素輔因子II、水蛭素、阿加曲班、達比加群等抗凝血因素的干擾，靈敏度高，穩(wěn)定性和重復(fù)性好。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：

抗凝血酶活性檢測試劑，包括試劑1和試劑2，其特征在于，試劑1為FXa的發(fā)色底物，試劑2為含有FXa和肝素的稀釋液。

抗凝血酶活性檢測試劑，包括試劑1、試劑4和試劑3，其中試劑1為FXa的發(fā)色底物，試劑4為FXa，試劑3為含有肝素的稀釋液。

優(yōu)選地，上述FXa的發(fā)色底物選自以下底物中的任一一種：

CH₃SO₂-D-Leu-Gly-Arg-p-nitroanilide·AcOH；

CH₃OCO-D-CHG-Gly-Arg-p-nitroanilide·AcOH；

CH ₃OCO-D-CHA-Gly-Arg-p-nitroanilide·AcOH；

Benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide·HCl；

Suc-Ile-Glu(γ-Piperidyl)-Gly-Arg-p-nitroanilide·HCl；

N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide·2HCl；

Boc-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide·2HCl；

Acetyl-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide·2HCl；

4-Nz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide·2HCl；

4-Mbs-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide·2HCl。

作為優(yōu)選，上述抗凝血酶活性檢測試劑還包括含有抗凝血酶的人血漿校準(zhǔn)品。該校準(zhǔn)品的制備是將正常健康人血漿收集之后混合，再經(jīng)冷凍干燥制成。然后用WHO抗凝血酶國際標(biāo)準(zhǔn)品血漿對該校準(zhǔn)品進行溯源性定值。此外，也可省略此標(biāo)準(zhǔn)品而提供標(biāo)準(zhǔn)曲線。

如上所述，由于肝素輔因子II和肝素結(jié)合后抑制凝血酶但不抑制FXa，且臨床上常使用水蛭素、阿加曲班、達比加群或其它凝血酶直接抑制劑來抑制人體內(nèi)的抗凝血酶，將影響檢測結(jié)果。

本發(fā)明是以FXa為基礎(chǔ)的發(fā)色底物法，利用抗凝血酶和肝素結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象變化，再直接和FXa結(jié)合后有效地抑制FXa的活性的特點，提供了一種抗凝血酶活性檢測試劑，以使發(fā)色底物法在抗凝血酶活性檢測方面得到更廣泛的應(yīng)用。其檢測原理為：在待測血漿中加入肝素以及過量的FXa進行孵育，再加入FXa的發(fā)色底物進行孵育。其中，肝素和待測血漿中的抗凝血酶結(jié)合，引起抗凝血酶的構(gòu)象變化后，抗凝血酶會直接和FXa結(jié)合，從而抑制FXa的活性。剩余的FXa裂解其發(fā)色底物并釋放出4-硝基苯胺，而產(chǎn)生的4-硝基苯胺的量是和樣品中抗凝血酶的活性成反比的。因此，利用測量405nm處吸光度的變化就可以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并推算出樣品中抗凝血酶的活性。

優(yōu)選地，所述肝素包括普通未分級肝素、低分子量肝素和磺達肝素。

優(yōu)選地，上述試劑1、試劑2或試劑4為相應(yīng)的溶液或凍干劑，優(yōu)選為凍干粉劑。

優(yōu)選地，上述試劑3為相應(yīng)的溶液或凍干劑，優(yōu)選為溶液。

優(yōu)選地，上述發(fā)色底物的工作濃度為0.1～4mM，優(yōu)選工作濃度為0.5～3mM，最佳工作濃度為2mM。

優(yōu)選地，上述FXa的工作濃度為0.05～3μM，優(yōu)選工作濃度為0.1～1.5μM，最佳工作濃度為0.5μM。

優(yōu)選地，上述肝素的工作濃度為0.1～5IU/ml，優(yōu)選工作濃度為0.5～3IU/ml，最佳工作濃度為2IU/ml。

工作濃度的定義：在用上述任一試劑檢測樣本活性的過程中，該試劑的凍干劑采用其復(fù)溶試劑復(fù)溶后，與稀釋樣本混合，所形成的分析混合物中各組分的濃度被定義為其工作濃度。

優(yōu)選地，試劑1由包含發(fā)色底物、緩沖劑、無機鹽、表面活性劑和防腐劑的混合試劑制成。

優(yōu)選地，試劑2由包含F(xiàn)Xa、肝素、緩沖劑、無機鹽、表面活性劑和防腐劑的混合試劑制成。

優(yōu)選地，試劑4由包含F(xiàn)Xa、緩沖劑、無機鹽、表面活性劑和防腐劑的混合試劑制成。

優(yōu)選地，試劑3由包含肝素、緩沖劑、無機鹽和防腐劑的混合試劑制成。

更優(yōu)選地，緩沖劑選自三羥甲基氨基甲烷緩沖液(以下簡稱Tris緩沖液)或硼酸緩沖液，最佳為三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris緩沖液)。

更優(yōu)選地，無機鹽選自氯化鈉或氯化鉀，最佳為氯化鈉。

更優(yōu)選地，表面活性劑選自聚乙二醇-8000或吐溫-20，最佳為聚乙二醇-8000。

更優(yōu)選地，防腐劑可選擇本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的防腐劑，如Proclin 300或疊氮鈉，最佳為疊氮鈉。

優(yōu)選地，F(xiàn)Xa選自人、牛、豬FXa中的任意一種，優(yōu)選為牛FXa。

本發(fā)明的另一目的是提供上述的抗凝血酶活性檢測試劑的制備方法，包括分別制備試劑1、試劑2、試劑4或試劑3；其中：

制備試劑1的步驟為：將發(fā)色底物溶于緩沖劑中；再加入鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至7～8；再依次加入無機鹽和表面活性劑，室溫下攪拌10分鐘。

其中，試劑1中各組分的終濃度或百分含量分別為：發(fā)色底物0.5～3mM，緩沖劑

10～50mM，無機鹽0.1～0.3M，表面活性劑0.5～1％。

制備試劑2的步驟為：依次將FXa和肝素溶于緩沖劑；加入鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至7～8；再依次加入無機鹽和表面活性劑，室溫下攪拌10分鐘。

其中，試劑2中各組分的終濃度或百分含量分別為：FXa 0.1～1.5μM，肝素0.5～3IU/ml，緩沖劑10～50mM，無機鹽0.1～0.3M，表面活性劑0.5～1％。

制備試劑4的步驟為：將FXa溶于緩沖劑；加入鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至7～8；再依次加入無機鹽和表面活性劑，室溫下攪拌10分鐘。

其中，試劑4中各組分的終濃度或百分含量分別為：FXa 0.1～1.5μM，緩沖劑10～50mM，無機鹽0.1～0.3M，表面活性劑0.5～1％。

制備試劑3的步驟為：將肝素溶于緩沖劑中；調(diào)節(jié)pH值至7～8；再加入無機鹽，室溫下攪拌10分鐘。

其中，試劑3中各組分的終濃度或百分含量分別為：肝素0.5～3IU/ml，緩沖劑10～50mM，無機鹽0.1～0.3M。

優(yōu)選地，制備方法還可包括將試劑1、試劑2或試劑4的溶液制成凍干劑的步驟，具體可參考現(xiàn)有技術(shù)中的凍干粉劑的制備工藝，以獲得穩(wěn)定性更高的試劑1、試劑2或試劑4。

此外，上述試劑1、試劑2、試劑4和試劑3中還分別加入0.2％的防腐劑，可參考現(xiàn)有技術(shù)中提及的方法加入，在此不做贅述。

本發(fā)明的另一目的是提供上述抗凝血酶活性檢測試劑的應(yīng)用，即將上述試劑作為檢測試劑用于制備檢測抗凝血酶活性的檢測試劑。

作為一種優(yōu)選方案，該檢測試劑可制備相應(yīng)的檢測試劑盒，包括盒體和裝有上述試劑的試劑瓶，試劑瓶放置于所述盒體內(nèi)。

作為一種優(yōu)選方案，上述檢測試劑盒分別包含試劑1、試劑2。該試劑盒檢測待測樣品中抗凝血酶活性時，將待測樣品與試劑2混合并孵育，再加入試劑1混合并孵育后，讀取待測樣品中發(fā)色底物的信號強度；最后通過計算信號強度并和已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線比對得到血液中抗凝血酶活性。

作為一種優(yōu)選方案，上述檢測試劑盒分別包含試劑1、試劑4或試劑3。該試劑盒檢測待測樣品中抗凝血酶活性時，將待測樣品與試劑3混合并孵育，再加入試劑4混合并孵育，再加入試劑1混合并孵育后,然后讀取待測樣品中發(fā)色底物的信號強度；最后通過計算信號強度并和已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線比對得到血液中抗凝血酶活性。

本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測抗凝血酶活性的方法，具體是通過發(fā)色底物法，將待測樣品與上述抗凝血酶活性活性檢測試劑混合并孵育后，檢測發(fā)色底物的信號強度；而產(chǎn)生的吸光度信號是和樣品中抗凝血酶的活性成反比的。最后通過計算信號強度并和標(biāo)準(zhǔn)曲線比對獲得待測樣品中抗凝血酶的活性。

上述檢測方法包括以下步驟：

步驟a，標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：根據(jù)不同抗凝血酶活性的校準(zhǔn)品及其相應(yīng)的信號強度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

步驟b，待測樣品處理：獲得待測樣品的血漿，與上述抗凝血酶活性檢測試劑混合并孵育；

步驟c，檢測待測樣品中發(fā)色底物的信號強度；

步驟d，通過計算待測樣品中信號強度并和標(biāo)準(zhǔn)曲線比對獲得待測樣品中抗凝血酶的活性。

優(yōu)選地，步驟a是采用緩沖劑將已知濃度的含有抗凝血酶的人血漿校準(zhǔn)品稀釋至四種或以上的已知濃度，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液；再根據(jù)人血漿校準(zhǔn)品中不同抗凝血酶活性與測得的相應(yīng)吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

更優(yōu)選地，步驟b中待測樣品的血漿是將新鮮抽取的靜脈血按9：1的比例與枸櫞酸抗凝液混勻后離心，分離即得待測樣品血漿。

更優(yōu)選地，步驟b中待測樣品處理的溫度為37℃，孵育溫度也為37℃。

作為一種優(yōu)選方案，步驟b的具體操作為：將待測樣品血漿與試劑2以1:24的體積比在37℃下混合并孵育2分鐘，然后加入試劑1(待測樣品血漿加試劑2與試劑1的體積比為1:1)，在37℃下混合并孵育2分鐘。

作為另一種優(yōu)選方案，步驟b的具體操作為：將待測樣品血漿與試劑3以1:24的體積比在37℃下混合并孵育2分鐘，然后加入試劑4(待測樣品血漿加試劑3與試劑4的體積比為1:1)，在37℃下混合并孵育2分鐘，最后加入試劑1(待測樣品血漿加試劑3加試劑4與試劑1的體積比為2:1),在37℃下混合并孵育2分鐘。

優(yōu)選地，上述信號為405nm下的吸光度。

更優(yōu)選地，步驟c中將待測樣品放入分光光度計中檢測吸光度，放置時間不少于5分鐘。

上述抗凝血酶活性的檢測方法應(yīng)用于自動檢測儀上(如血凝分析儀或生化分析儀)進行檢測的具體條件為：

在自動監(jiān)測儀上設(shè)定參數(shù)：反應(yīng)溫度：37℃；檢測波長：405nm；檢測方法：終點法或動態(tài)法。

應(yīng)當(dāng)注意的是，在使用不同的自動檢測儀(血凝分析儀或生化分析儀)時，具體參數(shù)應(yīng)根據(jù)儀器不同進行相應(yīng)調(diào)整。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢是：

本發(fā)明是以FXa為基礎(chǔ)的發(fā)色底物法，避免了以凝血酶為基礎(chǔ)的發(fā)色底物法中肝素輔因子II、水蛭素、阿加曲班、達比加群或者其它的凝血酶直接抑制劑帶來的影響。本發(fā)明檢測穩(wěn)定性和重復(fù)性好，具有很高的靈敏度和準(zhǔn)確度，能準(zhǔn)確反應(yīng)抗凝血酶活性，得到的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，并找到體內(nèi)抗凝血酶活性異常的患者，從而為治療提供依據(jù)。此外，本發(fā)明所使用的FXa十分穩(wěn)定，非常適合用在自動化儀器如血凝分析儀或生化分析儀上，從而實現(xiàn)自動化，患者無需進行多次檢測，有助于臨床推廣應(yīng)用，具有操作簡便，靈敏度高的特點，使用的范圍更加廣泛。因此，其應(yīng)用前景廣闊。

附圖說明

圖1為實施例1所用抗凝血酶活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖2為實施例2所用抗凝血酶活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖3為實施例3所用抗凝血酶活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖4為實施例4所用抗凝血酶活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例及對比例對本發(fā)明作進一步詳細、完整地說明。以下所用試劑或設(shè)備均為市售品種，如無特殊說明，均按照說明書操作，在此不做贅述。

以下為結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但不應(yīng)視為對本發(fā)明的限定。

1、實驗材料和試劑

Tris(三羥甲基氨基甲烷)，生物超級純，購自美國西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich，簡稱Sigma)；

鹽酸，超級純，購自Sigma；

氯化鈉，生物超級純，購自Sigma；

聚乙二醇-8000，標(biāo)準(zhǔn)級，購自Sigma；

FXa和FXa的發(fā)色底物，購自Chromogenix；

肝素，USP肝素鈉含量測定標(biāo)準(zhǔn)品，購自北京艾德豪克國際技術(shù)有限公司；

血紅蛋白，凍干粉，購自Sigma；

膽紅素，干粉，購自Sigma；

甘油三酯，標(biāo)準(zhǔn)級，購自Sigma；

肝素輔因子II，50％甘油溶液，購自Sigma；

水蛭素，凍干粉，購自Sigma；

阿加曲班，干粉，購自Sigma；

達比加群，標(biāo)準(zhǔn)級，購自Sigma。

2、試驗儀器

血凝分析儀購自STAGO；

血漿來自合作醫(yī)院。

實施例1

制備本發(fā)明提供的試劑盒一，包含試劑1，試劑4和試劑3，用于測定血液中抗凝血酶的活性。

具體為：試劑1為FXa的發(fā)色底物，其具體制備方法為：取CH₃SO₂-D-Leu-Gly-Arg-p-nitroanilide·AcOH溶于濃度為30mM的Tris緩沖液，再加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.4；再加入氯化鈉和聚乙二醇-8000，攪拌后制得試劑1，其終濃度分別為：CH₃SO₂-D-Leu-Gly-Arg-p-nitroanilide·AcOH 2mM，氯化鈉0.2M，聚乙二醇-8000 1％。

試劑4為FXa，其具體制備方法為：取FXa溶于濃度為30mM的Tris緩沖液，再加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.4；再加入氯化鈉和聚乙二醇-8000，攪拌后制得試劑4，其終濃度分別為：FXa 0.5μM，氯化鈉0.2M，聚乙二醇-8000 1％。

試劑3為含有肝素的稀釋液，其具體制備方法為：取肝素溶于濃度為30mM的Tris緩沖液，再加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.4；再加入氯化鈉，攪拌后制得試劑3，其終濃度分別為：肝素2IU/ml，氯化鈉0.2M。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：

(1)取標(biāo)準(zhǔn)液與試劑3按1:24的比例混合均勻，并孵育2分鐘，孵育和反應(yīng)的溫度均為37℃。

(2)然后取200μL上述混合物加入200μL試劑4，混合均勻，并孵育2分鐘，孵育溫度為37℃。

(3)然后加入200μL試劑1，混合均勻，放在分光光度計中在405納米波長測量吸光度5分鐘。

(4)根據(jù)抗凝血酶活性標(biāo)準(zhǔn)液梯度濃度與所對應(yīng)吸光值，采用線性方程繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，請見附圖1，其標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為y＝-0.0105x+1.5587(R²＝0.9891)。

樣品檢測：

取3份按1:24比例混合好的血漿與試劑3混合，37℃孵育2分鐘，然后取200μl混合物加入200μl試劑4，37℃孵育2分鐘，最后加入200μl試劑1，37℃反應(yīng)在405納米波長測量吸光度5分鐘。每份樣品重復(fù)測量兩次，記錄試驗結(jié)果，計算信號強度，和標(biāo)準(zhǔn)曲線比對得到抗凝血酶的活性。

檢測所得試劑盒一的特異性、靈敏度、線性范圍及穩(wěn)定性見如下實驗。

實施例2

在與實施例1相同環(huán)境下，制備本發(fā)明提供試劑盒二，包含試劑1和試劑2，用于測定血液中抗凝血酶的活性。

具體為：試劑1為FXa的發(fā)色底物，其具體制備方法為：取Suc-Ile-Glu(γ-Piperidyl)-Gly-Arg-p-nitroanilide·HCl溶于濃度為30mM的Tris緩沖液，再加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.4；再加入氯化鈉和聚乙二醇-8000，攪拌后制得試劑1，其終濃度分別為：Suc-Ile-Glu(γ-Piperidyl)-Gly-Arg-p-nitroanilide·HCl 2mM，氯化鈉0.2M，聚乙二醇-8000 1％。

試劑2為含有FXa和肝素的稀釋液，其具體制備方法為：依次取FXa和肝素溶于濃度為30mM的Tris緩沖液，加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.4；再加入氯化鈉和聚乙二醇-8000，攪拌后制得試劑2，其終濃度分別為：FXa 0.5μM，肝素2IU/ml，氯化鈉0.2M，聚乙二醇-80001％。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：

(1)取標(biāo)準(zhǔn)液與試劑2按1:24的比例混合均勻，并孵育2分鐘，孵育和反應(yīng)的溫度均為37℃。

(2)然后取200μL上述混合物加入200μL試劑2，混合均勻，放在分光光度計中在405納米波長測量吸光度5分鐘，溫度為37℃。

(3)根據(jù)抗凝血酶活性標(biāo)準(zhǔn)液梯度濃度與所對應(yīng)吸光值，采用線性方程繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，請見附圖2，其標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為y＝-0.0096x+1.4425(R²＝0.9928)。

樣品檢測：

取3份按1:24比例混合好的血漿與試劑2混合，37℃孵育2分鐘，然后取200μl混合物加入200μl試劑1，37℃反應(yīng)在405納米波長測量吸光度5分鐘。每份樣品重復(fù)測量兩次，記錄試驗結(jié)果，計算信號強度，和標(biāo)準(zhǔn)曲線比對得到抗凝血酶的活性。

檢測所得試劑盒二的特異性、靈敏度、線性范圍及穩(wěn)定性見如下實驗。

實施例3

本實施例與實施例1的差別僅在于試劑1中發(fā)色底物為CH₃O-CO-D-CHA-Gly-Arg-p-nitroanilide·AcOH。其他制備方法及檢測操作與實施例1一致。

根據(jù)抗凝血酶活性標(biāo)準(zhǔn)液梯度濃度與所對應(yīng)吸光值，采用線性方程繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，請見附圖3，其標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為y＝-0.0088x+1.3884(R²＝0.9898)。

檢測所得試劑盒三的特異性、靈敏度、線性范圍及穩(wěn)定性見如下實驗。

實施例4

本實施例與實施例2的差別僅在于試劑1中發(fā)色底物為4-Mbs-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide·2HCl。其他制備方法及檢測操作與實施例2一致。

根據(jù)抗凝血酶活性標(biāo)準(zhǔn)液梯度濃度與所對應(yīng)吸光值，采用線性方程繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，請見附圖4，其標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為y＝-0.0107x+1.6526(R²＝0.985)。

檢測所得試劑盒四的特異性、靈敏度、線性范圍及穩(wěn)定性見如下實驗。

實施例5

本實施例與實施例1的差別僅在于試劑1中發(fā)色底物為Benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide·HCl。其他制備方法及檢測操作與實施例1一致。

該試劑盒的特異性、靈敏度、線性范圍及穩(wěn)定性的檢測結(jié)果與實施例1所得數(shù)據(jù)存在理論誤差范圍的一致性。

實施例6

本實施例與實施例2的差別僅在于試劑1中發(fā)色底物為N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide·2HCl。其他制備方法及檢測操作與實施例1一致。

該試劑盒的特異性、靈敏度、線性范圍及穩(wěn)定性的檢測結(jié)果與實施例2所得數(shù)據(jù)存在理論誤差范圍的一致性。

實施例7

本實施例與實施例1的差別僅在于試劑1中發(fā)色底物為Boc-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide·2HCl。其他制備方法及檢測操作與實施例1一致。

該試劑盒的特異性、靈敏度、線性范圍及穩(wěn)定性的檢測結(jié)果與實施例1所得數(shù)據(jù)存在理論誤差范圍的一致性。

實施例8

本實施例與實施例2的差別僅在于試劑1中發(fā)色底物為Acetyl-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide·2HCl。其他制備方法及檢測操作與實施例2一致。

該試劑盒的特異性、靈敏度、線性范圍及穩(wěn)定性的檢測結(jié)果與實施例2所得數(shù)據(jù)存在理論誤差范圍的一致性。

實施例9

本實施例與實施例1的差別僅在于試劑1中發(fā)色底物為4-Nz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide·2HCl。其他制備方法及檢測操作與實施例1一致。

該試劑盒的特異性、靈敏度、線性范圍及穩(wěn)定性的檢測結(jié)果與實施例1所得數(shù)據(jù)存在理論誤差范圍的一致性。

實施例10

本實施例與實施例2的差別僅在于試劑1中發(fā)色底物為CH₃OCO-D-CHG-Gly-Arg-p-nitroanilide·AcOH。其他制備方法及檢測操作與實施例2一致。

該試劑盒的特異性、靈敏度、線性范圍及穩(wěn)定性的檢測結(jié)果與實施例2所得數(shù)據(jù)存在理論誤差范圍的一致性。

實施例11

本實施例與實施例1的差別在于：

試劑1中各組分終濃度為：發(fā)色底物0.1mM，Tris緩沖液50mM，氯化鈉0.1M，PEG-8000 0.5％；

試劑4中各組分終濃度為：FXa 0.05μM，Tris緩沖液50mM，氯化鈉0.1M，PEG-8000 0.5％；

試劑3中各組分終濃度為：肝素0.3U/mL，Tris緩沖液50mM，氯化鈉0.1M，PEG-8000 0.5％。其他制備方法及檢測操作與實施例1一致。

該試劑盒的特異性、靈敏度、線性范圍及穩(wěn)定性的檢測結(jié)果與實施例1所得數(shù)據(jù)存在理論誤差范圍的一致性。

實施例12

本實施例與實施例2的差別在于：

試劑1中各組分終濃度為：發(fā)色底物3mM，Tris緩沖液50mM，氯化鈉0.1M，PEG-8000 0.5％；

試劑2中各組分終濃度為：FXa 1.5μM，肝素0.3U/mL，Tris緩沖液50mM，氯化鈉0.1M，PEG-8000 0.5％。其他制備方法及檢測操作與實施例2一致。

該試劑盒的特異性、靈敏度、線性范圍及穩(wěn)定性的檢測結(jié)果與實施例2所得數(shù)據(jù)存在理論誤差范圍的一致性。

實施例13

本實施例與實施例1的差別在于：

試劑1中各組分終濃度為：發(fā)色底物1mM，Tris緩沖液50mM，氯化鈉0.1M，PEG-8000 0.5％；

試劑4中各組分終濃度為：FXa 2μM，Tris緩沖液50mM，氯化鈉0.1M，PEG-8000 0.5％；

試劑3中各組分終濃度為：肝素3U/mL，Tris緩沖液50mM，氯化鈉0.1M，PEG-8000 0.5％。其他制備方法及檢測操作與實施例1一致。

該試劑盒的特異性、靈敏度、線性范圍及穩(wěn)定性的檢測結(jié)果與實施例1所得數(shù)據(jù)存在理論誤差范圍的一致性。

實施例14

本實施例與實施例2的差別僅在于：

試劑1中各組分終濃度為：發(fā)色底物1mM，Tris緩沖液50mM，氯化鈉0.1M，PEG-8000 0.5％；

試劑2中各組分終濃度為：FXa 2μM，肝素3U/mL，Tris緩沖液50mM，氯化鈉0.1M，PEG-8000 0.5％。其他制備方法及檢測操作與實施例2一致。

該試劑盒的特異性、靈敏度、線性范圍及穩(wěn)定性的檢測結(jié)果與實施例1所得數(shù)據(jù)存在理論誤差范圍的一致性。

試劑盒的特異性、靈敏度、線性范圍及穩(wěn)定性的檢測

1.試劑盒特異性檢測

表1檢測抗凝血酶活性測定試劑盒特異性

結(jié)果表明：本發(fā)明提供的檢測試劑盒的特異性高，與肝素輔因子II，水蛭素，阿加曲班，達比加群等多種因子沒有交叉。

2.試劑盒靈敏度檢測以及試劑盒線性范圍檢測：405nm波長下吸光度檢測

表2檢測抗凝血酶活性測定試劑盒靈敏度

結(jié)果表明：本發(fā)明試劑盒可檢測到25％的抗凝血酶活性，該方法的檢測靈敏度至少為25％?？鼓富钚栽?％～125％時，線性≥0.98，檢測的范圍0％～125％。

3.試劑穩(wěn)定性檢測

表3檢測實施例1制得的試劑穩(wěn)定性

結(jié)果表明：本發(fā)明提供的抗凝血酶活性檢測試劑在室溫25℃時穩(wěn)定至少5天，在4℃時穩(wěn)定至少3個月。

由上述實驗結(jié)果可知，本發(fā)明利用發(fā)色底物法來檢測抗凝血酶的活性，檢測穩(wěn)定性和重復(fù)性好，具有很高的靈敏度和準(zhǔn)確度。此外，本發(fā)明還可用在自動化儀器如血凝分析儀或生化分析儀上，實現(xiàn)自動化有助于臨床推廣應(yīng)用。

最后有必要在此說明的是：以上實施例只用于對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細地說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護范圍。