本發(fā)明涉及光學(xué)超分辨顯微領(lǐng)域，尤其涉及一種基于光激活及結(jié)構(gòu)光照明的超分辨熒光顯微方法及裝置。
背景技術(shù)：
：超分辨熒光顯微成像作為一種具備納米尺度成像能力的技術(shù)，在活細(xì)胞蛋白動(dòng)力學(xué)領(lǐng)域有著不可替代的作用，是揭示生命基本活動(dòng)現(xiàn)象和規(guī)律的重要手段。但目前的超分辨技術(shù)，受限于各種原理及技術(shù)因素，在活細(xì)胞超分辨成像方面，仍顯不足。目前，比較成功的超分辨熒光顯微成像技術(shù)主要由以下幾種：?jiǎn)畏肿訜晒獬上?PALM和STORM)，受激輻射損耗顯微技術(shù)(STED)，結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)(SIM和SSIM)，熒光輻射微分超分辨顯微技術(shù)(FED)。STED技術(shù)是將一束空心光斑疊加在一個(gè)高斯光斑上，抑制了高斯光斑四周的熒光輻射，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了超分辨成像，可以在小視場(chǎng)范圍內(nèi)得到較高的時(shí)間分辨率和空間分辨率，同時(shí)具有較高的成像深度，PALM和STORM采用隨機(jī)光照明成像的方式結(jié)合光斑中心定位算法來(lái)實(shí)現(xiàn)超分辨成像。但他們的缺點(diǎn)也很明顯：需要很強(qiáng)的激發(fā)光來(lái)照明樣品。通常地球上的生物體受到的太陽(yáng)輻射在0.1W/cm2，而STED和PALM/STORM通常需要的輻射在103～108W/cm2，在這種情況下，熒光蛋白/分子很容易被漂白，產(chǎn)生大量的自由基損傷活細(xì)胞樣品。另外，超分辨成像的核心在于ON-OFF，從這個(gè)角度來(lái)看，假設(shè)熒光光子數(shù)恒定，那么SIM成像的方法則是并行度最高的，最有效地利用熒光分子所發(fā)出的光子；也正因?yàn)椴⑿卸雀撸源蟠蠼档土似渌枰恼彰鞴β?，在過(guò)去的幾年里被證明成為活細(xì)胞超分辨率成像的利器。但目前的SIM技術(shù)只能突破衍射極限兩倍，以561nm激發(fā)光，NA＝1.49物鏡為例，其橫向分辨率只能達(dá)到約100nm左右，仍顯不足。SSIM雖然可以通過(guò)增大照明光功率的辦法，將橫向分辨率提升至100nm以內(nèi)，但不可避免的帶來(lái)了光漂白的問(wèn)題，使其很難應(yīng)用于活細(xì)胞超分辨成像領(lǐng)域。因此，如何能夠?qū)崿F(xiàn)一種在不增加照明光功率的前提下，又可以達(dá)到100nm以內(nèi)甚至更高的橫向分辨率的結(jié)構(gòu)光照明超分辨顯微方法，將可以完美實(shí)現(xiàn)寬視場(chǎng)、超分辨、活細(xì)胞成像過(guò)程，具有重要的意義和應(yīng)用價(jià)值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種基于光激活及結(jié)構(gòu)光照明的超分辨熒光顯微方法及裝置，可以同時(shí)兼顧寬視場(chǎng)、超分辨、活細(xì)胞成像等需求，且橫向分辨率比傳統(tǒng)SIM和SSIM更高，很好的服務(wù)于生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：一種基于光激活及結(jié)構(gòu)光照明的超分辨熒光顯微裝置，包括：光源模塊，具有用于熒光激活的第一激光器和用于熒光激發(fā)的第二激光器，以及用于在兩激光器之間切換的選頻切換模塊；調(diào)制單元，將光源模塊輸出的光束調(diào)制為可發(fā)生干涉的兩束p偏振光和兩束s偏振光，并用于改變兩組光束的干涉相位差；二向色鏡，兩束p偏振光和兩束s偏振光在其表面形成干涉條紋，并由其反射作為照射樣品的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)照明光，所述網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)照明光具有陣列分布的亮斑和暗斑；成像單元，包括用于改變干涉條紋間距的匯聚模塊，將所述匯聚模塊出射的光束投影到樣品的顯微物鏡，以及用于對(duì)樣品受激輻射熒光成像的相機(jī)。其中，所述的選頻切換模塊為聲光可調(diào)諧濾波器，光源模塊在使用不同光源對(duì)熒光蛋白進(jìn)行激活/淬滅時(shí)，需要通過(guò)聲光可調(diào)諧濾波器進(jìn)行選頻切換，以輸出不同的激光光束。優(yōu)選的，所述的調(diào)制單元包括：位于光源模塊出射光路上的第一二分之一波片和第一偏振分束立方體；位于第一偏振分束立方體透射光路上的第二二分之一波片和第二偏振分束立方體，所述第二偏振分束立方體出射的第一p-偏振光和第一s-偏振光在所述二向色鏡的表面產(chǎn)生水平干涉條紋；位于第一偏振分束立方體反射光路上的第三二分之一波片和第三偏振分束立方體，所述第三偏振分束立方體出射的第二p-偏振光和第二s-偏振光在所述二向色鏡的表面產(chǎn)生垂直干涉條紋；所述的水平干涉條紋和垂直干涉條紋正交形成所述的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)照明光。進(jìn)一步的，所述第一s-偏振光的光路上依次設(shè)置有第一四分之一波片和第一反射鏡，穿過(guò)第一四分之一波片的第一s-偏振光由第一反射鏡反射后再次通過(guò)第一四分之一波片形成第三p-偏振光；所述的第三p-偏振光和第一p-偏振光經(jīng)第四偏振分束立方體光路重疊后在所述二向色鏡的表面產(chǎn)生水平干涉條紋；所述第二p-偏振光的光路上設(shè)置有第四二分之一波片，由第四二分之一波片出射為第三s-偏振光；所述第二s-偏振光的光路上依次設(shè)置有第二四分之一波片和第五反射鏡，穿過(guò)第二四分之一波片的第二s-偏振光經(jīng)第五反射鏡反射后再次通過(guò)第二四分之一波片形成第四p-偏振光；所述的第三s-偏振光和第四p-偏振光經(jīng)第四偏振分束立方體光路重疊后在所述二向色鏡的表面產(chǎn)生垂直干涉條紋。優(yōu)選的，所述的第一反射鏡安裝在第一壓電陶瓷上，所述的第一壓電陶瓷用于移動(dòng)第一反射鏡以改變干涉相位差；所述的第五反射鏡安裝在第二壓電陶瓷上，所述的第二壓電陶瓷用于移動(dòng)第五反射鏡以改變干涉相位差。本發(fā)明中，采用p-偏振和s-偏振光進(jìn)行干涉產(chǎn)生網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)照明光，因此干涉調(diào)制對(duì)比度作為優(yōu)選的，所述的匯聚模塊具有沿二向色鏡發(fā)射光路依次布置的鏡筒透鏡、第一四面體棱鏡和活動(dòng)安裝的第二四面體棱鏡，以使得聚焦至顯微物鏡后焦面處的四個(gè)光斑的相對(duì)位置可以調(diào)節(jié)，另外，在使用不同光源對(duì)熒光蛋白進(jìn)行激活/淬滅時(shí)，需要通過(guò)伺服電機(jī)帶動(dòng)第二四面體棱鏡在光軸向前后移動(dòng)，保持不同波長(zhǎng)光源形成的干涉網(wǎng)格重合。為以保證從第二四面體棱鏡射出的四束光的主軸均平行于z軸，優(yōu)選的，所述第一四面體棱鏡的楔角Φ為30度，所述第二四面體棱鏡的楔角Φ為24度。優(yōu)選的，所述的匯聚模塊由伺服電機(jī)驅(qū)動(dòng)并可繞光軸旋轉(zhuǎn)。同時(shí)，利用上述的超分辨熒光顯微裝置，本發(fā)明還提供了一種基于光激活及結(jié)構(gòu)光照明的超分辨熒光顯微方法，具體步驟如下：1)由第一激光器發(fā)出激活光，在二向色鏡處形成網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)激活光，并通過(guò)匯聚模塊和顯微物鏡投射到樣品上并激活熒光蛋白；2)由選頻切換模塊切換為第二激光器發(fā)出激發(fā)熒光，在二向色鏡處形成網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)激活光，并光軸向移動(dòng)第二四面體棱鏡，使得通過(guò)匯聚模塊和顯微物鏡投射到樣品并形成與激活光相同的結(jié)構(gòu)光照明，使激活的熒光蛋白發(fā)出的激發(fā)熒光，并采集熒光圖像；3)利用激發(fā)光對(duì)樣品進(jìn)行寬場(chǎng)照明，淬滅剩余的激活熒光蛋白，使得整個(gè)樣品上的熒光蛋白全部進(jìn)入暗態(tài)；4)利用第一壓電陶瓷和第二壓電陶瓷改變網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)照明光的相位，重復(fù)步驟1)～步驟3)得到不同相位下的多幅熒光圖像Dn(x)；5)驅(qū)動(dòng)匯聚模塊旋轉(zhuǎn)45°，并利用第一壓電陶瓷和第二壓電陶瓷改變網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)照明光的相位，重復(fù)步驟1)～步驟3)得到不同相位下的多幅熒光圖像6)根據(jù)被激活的熒光蛋白分布、激發(fā)光的數(shù)學(xué)模型以及所采集到的熒光圖像構(gòu)建線性方程，以此解出圖像中重疊的頻域分量；7)對(duì)重疊的頻域分量進(jìn)行重疊，得到最終的重構(gòu)圖像。在步驟2)中，激活的熒光蛋白分布為：其中，Iact(x)是激活光的空間分布，A[Iact(x)]是處于x處的熒光分子被激活光激活的相對(duì)概率；為激活光的峰值強(qiáng)度，i為虛數(shù)，為干涉對(duì)比度，或稱之為調(diào)制深度，為激活光波矢，并有λact為激活光波長(zhǎng)，NA為顯微物鏡的數(shù)值孔徑，為激活光相位；在步驟3)中，激發(fā)光的數(shù)學(xué)模型為：其中，Iexc(x)是激活光的空間分布，E[Iexc(x)]是處于x處的熒光分子被激發(fā)光激發(fā)的相對(duì)概率；為激活光的峰值強(qiáng)度，為干涉對(duì)比度，或稱之為調(diào)制深度，為激發(fā)光波矢，并有λexc為激活光波長(zhǎng)，為激發(fā)光相位；在步驟6)中，所述的線性方程為：D~(k→)=16S~(k→-2k→Abbeexc)e2iφnexc+23S~(k→-k→Abbeexc)eiφnexc+S~(k→)+23S~(k→+k→Abbeexc)e-iφnexc+16S~(k→+2k→Abbeexc)e-2φnexc·Odet(k→)]]>其中，為被測(cè)樣品的空間頻率，n＝1,2，為移頻后的被測(cè)樣品的空間頻率，即該樣品的超分辨信息；在步驟7)中，得到的重構(gòu)圖像為：D~total(k→)=S~(k→)·Σn=-22CnOAbbedet(k→+nk→Abbeexc)]]>其中，為最終重構(gòu)得到的超分辨圖像，Cn為權(quán)重系數(shù)，為系統(tǒng)的各光學(xué)傳遞函數(shù)分量。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：(1)在保持了結(jié)構(gòu)光照明顯微系統(tǒng)寬視場(chǎng)、低光毒性以及高信噪比的優(yōu)點(diǎn)的前提下，進(jìn)一步突破了現(xiàn)有結(jié)構(gòu)光照明顯微的分辨率極限，在生物活細(xì)胞成像方面的應(yīng)用潛力更大；(2)利用光激活熒光蛋白作為標(biāo)記物，避免了之前飽和輻射結(jié)構(gòu)光照明顯微系統(tǒng)導(dǎo)致的光漂白問(wèn)題；(3)網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)光照明條紋，比現(xiàn)有SIM系統(tǒng)多一個(gè)維度的結(jié)構(gòu)條紋，使得成像所需要的條紋方向改變次數(shù)少了一半，配合四面體棱鏡結(jié)構(gòu)，使得系統(tǒng)的響應(yīng)速度極大的提升，提高了拍攝速度，更加適合生物活細(xì)胞成像。附圖說(shuō)明圖1為基于光激活及結(jié)構(gòu)光照明的超分辨熒光顯微裝置的示意圖。圖2為光源模塊的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3是本發(fā)明中匯聚模塊27的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4為四面體棱鏡前后相對(duì)運(yùn)動(dòng)的示意圖。圖5為本發(fā)明中第一壓電陶瓷25在垂直方向反射光路的示意圖。圖6為本發(fā)明中第三反射鏡18在垂直方向反射光路的示意圖。圖7為本發(fā)明中由第二偏振分束立方體11為核心的垂直方向光束分路并匯聚的立體示意圖。圖8位本發(fā)明中四面體棱鏡示意圖。圖9為基于光激活及結(jié)構(gòu)光照明的超分辨熒光顯微裝置的工作流程圖。圖10(a)為初始網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)光照明在29上的效果圖。圖10(b)為旋轉(zhuǎn)45°后網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)光照明在29上的效果圖。圖11(a)為超分辨率靶圖像。圖11(b)為寬場(chǎng)顯微鏡鏡下得到的圖像分辨率。圖11(c)為現(xiàn)有SIM系統(tǒng)得到的超分辨圖像。圖11(d)為本發(fā)明專利所述系統(tǒng)得到的超分辨圖像。圖12中的(a)、(b)和(c)圖分別為寬場(chǎng)、現(xiàn)有SIM系統(tǒng)以及本發(fā)明專利的光學(xué)傳遞函數(shù)(OTF)示意圖。具體實(shí)施方式如圖1所示：一種基于光激活及結(jié)構(gòu)光照明的超分辨熒光顯微裝置，包括：光源模塊1，以及光源模塊1光路依次布置的單模光纖2、準(zhǔn)直透鏡3、第一平面反射鏡4和第二平面反射鏡5；調(diào)制單元包括第一二分之一波片6和第一偏振分束立方體7；位于第一偏振分束立方體7透射光路上的第二二分之一波片8、第二偏振分束立方體11、第一四分之一波片12、第一反射鏡15、第一壓電陶瓷25、第二反射鏡16、第三反射鏡18和第四反射鏡20；位于第一偏振分束立方體7反射光路上的第三二分之一波片9、第三偏振分束立方體10、第二四分之一波片13、第五反射鏡14、第二壓電陶瓷24、第六反射鏡17、第七反射鏡19、第八反射鏡21、第四二分之一波片22和第四偏振分束立方體23；第一二向色鏡26，由調(diào)制單元出射的兩組光束在其表面形成干涉條紋，并由其反射作為照射樣品的結(jié)構(gòu)散斑照明光，結(jié)構(gòu)散斑照明光具有陣列間隔分布的亮斑；成像單元，包含匯聚模塊27、顯微物鏡29、成像透鏡30和相機(jī)31；以及上位機(jī)32，與相機(jī)31、第二壓電陶瓷24和第一壓電陶瓷25連接，用于壓電陶瓷的觸發(fā)和圖像處理。如圖2所示，光源模塊1包括用于光激活的第一激光器1(a)和用于熒光激發(fā)的第二激光器1(b)，由第九反射鏡39、第十反射鏡41以及第二二向色鏡40將第一激光器1(a)和第二激光器1(b)發(fā)出的兩束激光傳播路徑調(diào)整重疊，并由聲光可調(diào)諧濾波器(AOTF)產(chǎn)生的聲光衍射機(jī)制，進(jìn)行選頻，最后通過(guò)第十一反射鏡44和第十二反射鏡45，將出射光耦合進(jìn)單模光纖2中。光源模塊1在使用不同光源對(duì)熒光蛋白進(jìn)行激活/淬滅時(shí)，需要通過(guò)AOTF模塊42進(jìn)行選頻切換，43位擋光板，用于遮擋0級(jí)衍射光。如圖3所示，匯聚模塊27由鏡筒透鏡35結(jié)合第一四面體棱鏡36和第二四面體棱鏡37構(gòu)成，以使得聚焦至顯微物鏡后焦面33處的四個(gè)光斑的相對(duì)位置可以調(diào)節(jié)。其中，鏡筒透鏡35為f＝200mm的消色差透鏡，第一四面體棱鏡36和第二四面體棱鏡37的楔角分別為30°和24°，見(jiàn)圖8中的φ，以保證從37射出的四束光的主軸均平行于z軸。寬場(chǎng)照明單元主要由分光鏡46和帶電動(dòng)旋轉(zhuǎn)功能的反射鏡47構(gòu)成，如圖1所示，在結(jié)構(gòu)光照明時(shí)，47旋轉(zhuǎn)至48所示虛線位置，寬場(chǎng)照明時(shí)，47回到圖1所示位置。如圖4所示，上述的第一四面體棱鏡36和第二四面體棱鏡37，在使用不同光源對(duì)熒光蛋白進(jìn)行激活/淬滅時(shí)，需要通過(guò)伺服電機(jī)帶動(dòng)第二四面體棱鏡37前后移動(dòng)，以改變488nm干涉網(wǎng)格的間距，保證其與405nm干涉網(wǎng)格重合，以保證兩束光在視場(chǎng)內(nèi)形成一組空間不變的重疊網(wǎng)格，即：且二者的相位也應(yīng)當(dāng)相等，有：式中。例如，以顯微物鏡NA＝1.49的數(shù)值孔徑，入瞳直徑10mm為例，405nm激光的干涉條紋間距為Λact＝λact/2NA＝135.9nm，488nm的干涉條紋間距為Λexc＝λexc/2NA＝163.8nm，在使用不同光源對(duì)熒光蛋白進(jìn)行激活/淬滅時(shí)，需要通過(guò)伺服電機(jī)帶動(dòng)第二四面體棱鏡37前后移動(dòng)L＝0.7/tan24°＝1.6mm，以改變405nm干涉網(wǎng)格的間距，保證其與488nm干涉網(wǎng)格重合，以保證兩束光在視場(chǎng)內(nèi)形成一組空間不變的重疊網(wǎng)格。第六反射鏡17所擺放位置應(yīng)與x軸成44°角，第五反射鏡14應(yīng)與z軸成1°角，以保證由第三偏振分束立方體10分出的兩束光左右對(duì)稱；第一反射鏡15和第二反射鏡16應(yīng)與y軸成±1°角，以保證由第二偏振分束立方體11分出的兩束光上下對(duì)稱；四束光與其中心軸各成1°角的方式傳輸并匯聚至第一二向色鏡26處。第四反射鏡20為D型反射鏡，并以上下方式放置，以保證經(jīng)第三反射鏡18反射的光束不被遮擋，同時(shí)有效的將經(jīng)第一反射鏡15反射出的光束反射至第一二向色鏡26處；第八反射鏡21為D型反射鏡，并以左右方式放置，以保證經(jīng)第七反射鏡19反射的光束不被遮擋，同時(shí)有效的將經(jīng)第五反射鏡14反射出的光束反射至第一二向色鏡26處。在本實(shí)施案例中，采用p-偏振和s-偏振光進(jìn)行干涉產(chǎn)生網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)照明光，因此干涉調(diào)制對(duì)比度在本實(shí)施案例中，第一二分之一波片6、第二二分之一波片8、第三二分之一波片9的快軸必須與入射偏振光成22.5°夾角，以使得出射的偏振光與水平面成45°角；第一四分之一波片12、第二四分之一波片13的快軸必須與入射的s-偏振光成22.5°夾角，以使得出射的偏振光變成p-偏振。第五反射鏡14應(yīng)傾斜放置，并與y-z面成一定夾角，第六反射鏡17應(yīng)與45°面成一定夾角，且二者傾斜角度應(yīng)相等，第七反射鏡19和第八反射鏡21應(yīng)成45°角，以使得兩束光在匯聚的過(guò)程中光程保持相等。第一反射鏡15應(yīng)傾斜放置，并與z-x面成一定角度，第二反射鏡16應(yīng)與z-x面成大小相同但方向相反的傾斜角度，第三反射鏡18和第四反射鏡20應(yīng)按45°角放置，以使得兩束光在匯聚的過(guò)程中光程保持相等。第三偏振分束立方體10和第二偏振分束立方體11以及相應(yīng)的反射鏡、波片構(gòu)成的子分束系統(tǒng)必須相對(duì)于第一偏振分束立方體7和第四偏振分束立方體23的連線對(duì)稱分布于兩側(cè)，以保證四束光的光程相等。第五反射鏡14、第一反射鏡15應(yīng)分別固定在第二壓電陶瓷24、第一壓電陶瓷25上，以保證系統(tǒng)可以由壓電陶瓷的步進(jìn)移動(dòng)產(chǎn)生干涉相位的改變。匯聚模塊27的前焦面與入瞳28重合，以保證四束偏振光經(jīng)過(guò)顯微物鏡29后，以平行光的方式在成像透鏡30表面匯聚，并干涉產(chǎn)生網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)照明。上述的超分辨熒光顯微裝置的具體操作過(guò)程如下：光源模塊1出射光經(jīng)過(guò)單模光纖2傳輸至準(zhǔn)直透鏡3的焦點(diǎn)處，形成準(zhǔn)直光束，通過(guò)第一平面反射鏡4、第二平面反射鏡5反射后，進(jìn)入第一第一二分之一波片6形成與水平面夾角45°偏振光束，經(jīng)由第一偏振分束立方體7分成p-偏振和s-偏振兩束平行光；p-偏振光通過(guò)第二二分之一波片8生成與水平面夾角45°偏振光束，經(jīng)由第二偏振分束立方體11分為兩束p-偏振和s-偏振兩束平行光；s-偏振光通過(guò)第三二分之一波片9生成與水平面夾角45°偏振光束，經(jīng)由第三偏振分束立方體10分為兩束p-偏振和s-偏振兩束平行光；如圖5、圖6和圖7所示，由第二偏振分束立方體11產(chǎn)生的s-偏振光經(jīng)由第一反射鏡15兩次通過(guò)第一四分之一波片12，進(jìn)而變成p-偏振光，再透射通過(guò)第二偏振分束立方體11，到達(dá)第四反射鏡20處，再由第四反射鏡20反射并透射通過(guò)第四偏振分束立方體23，直至第一二向色鏡26表面；由第二偏振分束立方體11產(chǎn)生的p-偏振光經(jīng)由第二反射鏡16、第三反射鏡18反射，透射通過(guò)第四偏振分束立方體23，到達(dá)第一二向色鏡26表面，兩束光在第一二向色鏡26表面產(chǎn)生水平干涉條紋；由第三偏振分束立方體10產(chǎn)生的s-偏振光經(jīng)由第五反射鏡14兩次通過(guò)第二四分之一波片13，進(jìn)而變成p-偏振光，再透射通過(guò)第三偏振分束立方體10，到達(dá)第八反射鏡21處，再由第八反射鏡21反射至第四二分之一波片22；由第三偏振分束立方體10產(chǎn)生的p-偏振光經(jīng)由第六反射鏡17、第七反射鏡19反射，到達(dá)第四二分之一波片22，兩束光通過(guò)第四二分之一波片22后，變成s-偏振光，再通過(guò)第四偏振分束立方體23的反射至第一二向色鏡26處，并在第一二向色鏡26表面產(chǎn)生垂直干涉條紋；進(jìn)而在第一二向色鏡26表面產(chǎn)生一幅二維正交的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)照明光；樣品受激輻射的熒光通過(guò)匯聚模塊27、第一二向色鏡26以及成像透鏡30構(gòu)成的顯微鏡系統(tǒng)成像到相機(jī)31上；通過(guò)第二壓電陶瓷24、第一壓電陶瓷25分別帶動(dòng)第五反射鏡14、第一反射鏡15移動(dòng)，改變干涉相位差，實(shí)現(xiàn)不同相位的結(jié)構(gòu)光照明，每次照明，相機(jī)31都將記錄一張寬場(chǎng)低分辨率圖像，并由上位機(jī)32記錄并保存，通過(guò)相應(yīng)的圖像重構(gòu)算法，實(shí)現(xiàn)寬場(chǎng)超分辨圖像。如圖9所示，整個(gè)超分辨顯微圖像采集及圖像重構(gòu)如下：(1)利用具有光激活性質(zhì)的熒光蛋白Skylan-NS將被測(cè)細(xì)胞進(jìn)行染色后，放置在載物臺(tái)上，通過(guò)1.0W/cm2的λact＝405nm激光激活，并由λexc＝488nm，功率100W/cm2的激光淬滅，淬滅過(guò)程，便是SCOMS收集熒光信號(hào)的過(guò)程。(2)利用聲光可調(diào)諧濾波器(AOTF)進(jìn)行選頻，使能405nm激活光；(3)利用上述系統(tǒng)在第一二向色鏡26處先產(chǎn)生一幅網(wǎng)格狀激活光，通過(guò)匯聚模塊27和顯微物鏡29構(gòu)成的成像系統(tǒng)將其映射至樣品上，激活熒光蛋白，如圖10(a)所示，被激活的熒光蛋白分布為：展開(kāi)有：其中，Iact(x)是激活光的空間分布，A[Iact(x)]是處于x處的熒光分子被激活光激活的相對(duì)概率；為激活光的峰值強(qiáng)度，為干涉對(duì)比度，或稱之為調(diào)制深度，為激活光波矢，并有λact為激活光波長(zhǎng)，NA為顯微物鏡的數(shù)值孔徑，為激活光相位；(4)將100W/cm2的488nm激發(fā)光以同樣的網(wǎng)格間距照射在激活后的熒光蛋白處，讀取激活的熒光蛋白發(fā)出的激發(fā)熒光，讀取時(shí)間為1ms，并用SCMOS記錄熒光圖像D1(x)，其激發(fā)光的數(shù)學(xué)模型為：展開(kāi)有：其中，Iexc(x)是激活光的空間分布，E[Iexc(x)]是處于x處的熒光分子被激發(fā)光激發(fā)的相對(duì)概率；為激活光的峰值強(qiáng)度，為干涉對(duì)比度，或稱之為調(diào)制深度，為激發(fā)光波矢，并有λexc為激活光波長(zhǎng)，為激發(fā)光相位；(5)反射鏡由圖1中48所示虛線位置，由電機(jī)控制旋轉(zhuǎn)45°，到達(dá)圖1所示47所示實(shí)線位置，此時(shí)，系統(tǒng)變成寬場(chǎng)488nm均勻照明光對(duì)樣品進(jìn)行照明，淬滅剩余的激活熒光蛋白，使得整個(gè)樣品上的熒光蛋白全部進(jìn)入暗態(tài)；(6)通過(guò)第二壓電陶瓷24、第一壓電陶瓷25的一次步進(jìn)Δ＝nλact/5，改變網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)光的相位n＝-2,-1,0,1,2；(7)重復(fù)(1)-(5)的過(guò)程，獲得不同相位下的多幅熒光圖像Dn(x)，其對(duì)應(yīng)的頻域圖像由傅里葉變換得到，記為(8)伺服電機(jī)38帶動(dòng)匯聚模塊27整體繞z軸旋轉(zhuǎn)45°，使網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)照明光產(chǎn)生相應(yīng)的45°旋轉(zhuǎn)，如圖10(b)所示；(9)重復(fù)(1)-(5)的過(guò)程，獲得不同相位下的多幅熒光圖像(10)在傅里葉域，整個(gè)系統(tǒng)的采集過(guò)程可用如下數(shù)學(xué)公式表述：D~(k→)=FT{A[Iact(x)]·E[Iexc(x)]}·Odet(k→)]]>其中，為拍攝到的頻域圖像，為被測(cè)樣品頻域分布函數(shù)，F(xiàn)T{}為傅里葉變換；代入過(guò)程(3)和(4)中的結(jié)構(gòu)光數(shù)學(xué)模型，所采集到的序列圖像可以構(gòu)成如下線性方程：D~(k→)=16S~(k→-2k→Abbeexc)e2iφnexc+23S~(k→-k→Abbeexc)eiφnexc+S~(k→)+23S~(k→+k→Abbeexc)e-iφnexc+16S~(k→+2k→Abbeexc)e-2φnexc·Odet(k→)]]>其中，其中，為被測(cè)樣品的空間頻率，n＝1,2，為移頻后的被測(cè)樣品的空間頻率，即該樣品的超分辨信息；重疊的頻率部分可以通過(guò)n＝-2,-1,0,1,2構(gòu)成的線性方程組來(lái)逐一解出；由上式可以看出，與現(xiàn)有SIM相比，本發(fā)明除了具備現(xiàn)有SIM方法中的基頻和一倍頻(即：超分辨信息)外，還額外增加了2倍頻成分(即：更高的超分辨信息)，因此最終圖像重構(gòu)后的分辨率將明顯優(yōu)于現(xiàn)有SIM系統(tǒng)；(11)將這些原本重疊的頻域分量進(jìn)行重疊，最終得到的重構(gòu)圖像為：其中，為最終重構(gòu)得到的超分辨圖像，Cn為權(quán)重系數(shù)，為系統(tǒng)的各光學(xué)傳遞函數(shù)分量。其中，Cn是比例系數(shù)，根據(jù)實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，一般有：C0＝1，C±1＝0.495，C±2＝0.14，總OTF可以表達(dá)為：如圖12中的(a)、(b)和(c)圖所示，可以看出，本發(fā)明顯微系統(tǒng)的OTF明顯大于現(xiàn)有SIM系統(tǒng)，因而可以收集到更多的高頻成分，從而實(shí)現(xiàn)更高的圖像分辨率。為顯示本實(shí)施案例的最終效果，采用圖11(a)為原始分辨率靶，將該目標(biāo)放置在載物臺(tái)上，重復(fù)(1)-(11)的超分辨信息采集及圖像重構(gòu)過(guò)程，最后生成超分辨圖像及其與寬場(chǎng)顯微鏡以及現(xiàn)有SIM顯微鏡所獲得圖像的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，分別如圖11(b)、11(c)以及11(d)所示，可以看出，本發(fā)明的超分辨熒光顯微方法及裝置，在沒(méi)有使用很高的激發(fā)光強(qiáng)的前提下，依然可以實(shí)現(xiàn)優(yōu)于現(xiàn)有SIM方法的圖像分辨率。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施舉例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3