本發(fā)明涉及食品領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及牛奶中舒巴坦的檢測方法。
背景技術(shù)：
：隨著奶牛飼養(yǎng)業(yè)的發(fā)展，抗生素在預(yù)防和治療奶牛疾病方面得到廣泛的應(yīng)用。然而，奶牛體內(nèi)的抗生素會隨著乳腺流入牛乳中，牛乳中殘留的抗生素會對人體健康造成不利影響。因而，目前我國對牛乳中的抗生素殘留限量作了明確規(guī)定。但是，有些不良商家利用β-內(nèi)酰胺酶能夠分解抗生素的特征，向牛奶中加入β-內(nèi)酰胺酶，以掩蓋和縱容抗生素的濫用，此外，食用含有β-內(nèi)酰胺酶的牛奶后，會使人攝入的抗生素的藥效降低，無法實現(xiàn)治療疾病的效果。因此，衛(wèi)生部公布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單》中明確提到了β-內(nèi)酰胺酶。然而，目前對牛乳中抗生素及β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法仍有待研究。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：發(fā)明人在對已檢測出不含β-內(nèi)酰胺酶的牛奶進行檢測時意外地發(fā)現(xiàn)，該牛奶并非不含β-內(nèi)酰胺酶，而是β-內(nèi)酰胺酶被名為“舒巴坦”的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑抑制了酶活，進而無法被檢出。有鑒于此，發(fā)明人深入研究發(fā)現(xiàn)，基于現(xiàn)有的測定抗生素的方法，可以通過測定牛奶中是否存在抗生素，從而能夠推斷出是否存在β-內(nèi)酰胺酶，進一步可以推測是否存在舒巴坦藥物。為此，本發(fā)明提出了一種牛奶中舒巴坦的檢測方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：(1)分別對抗生素陽性對照組、β-內(nèi)酰胺酶陽性對照組及樣品組中的抗生素進行檢測，其中，所述抗生素陽性對照組是通過將不含抗生素、β-內(nèi)酰胺酶及舒巴坦的牛奶與抗生素進行混合所得到的；所述β-內(nèi)酰胺酶陽性對照組是通過將不含抗生素、β-內(nèi)酰胺酶及舒巴坦的牛奶、抗生素及β-內(nèi)酰胺酶進行混合所得到的；所述樣品組是將待測牛奶、抗生素及β-內(nèi)酰胺酶進行混合所得到的；(2)基于下列標(biāo)準(zhǔn)，對所述待測牛奶中舒巴坦進行定性判定：1)所述抗生素陽性對照組中檢出抗生素、所述β-內(nèi)酰胺酶陽性對照組中未檢出抗生素且所述樣品組中檢出抗生素，則所述待測牛奶中含有舒巴坦；2)所述抗生素陽性對照組中檢出抗生素、所述β-內(nèi)酰胺酶陽性對照組中未檢出抗生素且所述樣品組中未檢出抗生素，則所述待測牛奶中不含有舒巴坦；3)所述抗生素陽性對照組中未檢出抗生素，則檢測結(jié)果無效；以及4)所述抗生素陽性對照組中檢出抗生素且所述β-內(nèi)酰胺酶陽性對照組中檢測出抗生素，則檢測結(jié)果無效。由此，根據(jù)本發(fā)明的牛奶中舒巴坦的檢測方法能夠準(zhǔn)確地檢測出牛奶中是否存在舒巴坦，且操作簡便。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，舒巴坦能夠抑制β-內(nèi)酰胺酶活性且β-內(nèi)酰胺酶能夠分解抗生素，通過向待測牛奶中加入抗生素和β-內(nèi)酰胺酶，然后對抗生素進行檢測，進而反向推斷出牛奶中是否存在舒巴坦。具體地，若未檢測出牛奶中存在抗生素，則說明牛奶中存在β-內(nèi)酰胺酶，進而表明牛奶中不含舒巴坦。反之，若檢測出牛奶中存在抗生素，則說明牛奶中不含β-內(nèi)酰胺酶，進而表明牛奶中存在舒巴坦。進一步地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，為了驗證加入的抗生素和β-內(nèi)酰胺酶均有活性(藥效)，需要以僅含抗生素以及同時含有抗生素和β-內(nèi)酰胺酶作為對照組，對抗生素進行測定。具體地，向已知不含抗生素、β-內(nèi)酰胺酶以及舒巴坦的牛奶中添加抗生素，作為抗生素陽性對照組，向已知不含抗生素、β-內(nèi)酰胺酶以及舒巴坦的牛奶中添加抗生素及β-內(nèi)酰胺酶，作為β-內(nèi)酰胺酶陽性對照組，分別測定兩種對照組中是否存在抗生素。若檢測出抗生素陽性對照組中存在抗生素，則證明抗生素藥效正常，實驗結(jié)果有效，反之則無藥效，實驗結(jié)果無效。若測定出β-內(nèi)酰胺酶陽性對照組中存在抗生素，且測定出抗生素陽性對照組中存在抗生素，則證明β-內(nèi)酰胺酶失活，反之，若檢測出β-內(nèi)酰胺酶陽性對照組中無抗生素，且檢測出抗生素陽性對照組中存在抗生素，則β-內(nèi)酰胺酶活性正常。由此，能夠保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。需要說明的是，對抗生素檢測的方法不作嚴(yán)格限定，只要能夠有效地檢測抗生素是否存在即可。具體地，可以采用試劑盒或抑菌圈等方法對抗生素進行檢測。在實際檢測過程中，可以根據(jù)需要確定抗生素陽性對照組、β-內(nèi)酰胺酶陽性對照組及樣品組中混合的抗生素濃度，本申請不作嚴(yán)格限定，只要濃度足以達到已知檢測抗生素方法的檢出限即可。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，所述混合所得到的混合液中抗生素的終濃度為4～6μg/L。若濃度過高，容易導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺酶無法完全對其進行分解，從而出現(xiàn)舒巴坦假陽性。還需要說明的是，本發(fā)明對抗生素的種類不作嚴(yán)格限定，只要能夠被β-內(nèi)酰胺酶分解即可。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗生素包括青霉素、青霉素鈉、氨芐西林。在實際檢測過程中，可以根據(jù)需要確定β-內(nèi)酰胺酶陽性對照組及樣品組中混合的β-內(nèi)酰胺酶濃度，本申請不作嚴(yán)格限定。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，在所述β-內(nèi)酰胺酶陽性對照組及樣品組中，所述混合所得到的混合液中β-內(nèi)酰胺酶的終濃度為3～4U/mL。若濃度過高，容易導(dǎo)致待測牛奶中的舒巴坦無法完全抑制其活性，從而出現(xiàn)舒巴坦假陰性。需要說明的是，針對β-內(nèi)酰胺酶陽性對照組和樣品組中，混合液中抗生素的終濃度是指存在于混合液中，且未開始被β-內(nèi)酰胺酶分解的抗生素的濃度，若待測牛奶中含有抗生素，則終濃度不含該部分抗生素。同理地，對于β-內(nèi)酰胺酶的終濃度的解釋，在此不再贅述。根據(jù)本發(fā)明的實施例，在所述抗生素陽性對照組和β-內(nèi)酰胺酶陽性對照組中，所述牛奶為純牛奶或復(fù)原乳，優(yōu)選復(fù)原乳。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，所述復(fù)原乳是通過將恒天然奶粉溶解于水中所得到的。發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，新西蘭恒天然公司生產(chǎn)的奶粉雜質(zhì)較少，干擾較低。根據(jù)本發(fā)明的實施例，檢出限為5mg/L。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，舒巴坦最低檢測濃度(即檢出限)為5mg/mL，低于檢出限時，無法完全抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性，從而為舒巴坦假陰性。另外，本發(fā)明提出了另一種牛奶中舒巴坦的檢測方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：取1mL不含抗生素、β-內(nèi)酰胺酶及舒巴坦的復(fù)原乳，加入1mg/L青霉素鈉溶液6μL，使青霉素鈉終濃度為6μg/L，混勻，作為抗生素陽性對照組；取1mL不含抗生素、β-內(nèi)酰胺酶及舒巴坦的復(fù)原乳，分別加入青霉素鈉溶液和β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使青霉素鈉終濃度為6μg/L，β-內(nèi)酰胺酶終濃度為4U/mL，作為β-內(nèi)酰胺酶陽性對照組；取1mL待測牛奶，分別加入青霉素鈉溶液和β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使青霉素鈉終濃度為6μg/L，β-內(nèi)酰胺酶終濃度為4U/mL，作為樣品組；分別將所述抗生素陽性對照組、β-內(nèi)酰胺酶陽性對照組及樣品組置于40℃±1℃水浴箱中孵育1小時20分鐘；利用抗生素檢測試劑盒分別對孵育后的所述抗生素陽性對照組、β-內(nèi)酰胺酶陽性對照組及樣品組中的抗生素進行檢測，基于下列標(biāo)準(zhǔn)，對所述待測牛奶中舒巴坦進行定性判定：所述抗生素陽性對照組中檢出抗生素、所述β-內(nèi)酰胺酶陽性對照組中未檢出抗生素且所述樣品組中檢出抗生素，則所述待測牛奶中含有舒巴坦；所述抗生素陽性對照組中檢出抗生素、所述β-內(nèi)酰胺酶陽性對照組中未檢出抗生素且所述樣品組中未檢出抗生素，則所述待測牛奶中不含有舒巴坦；所述抗生素陽性對照組中未檢出抗生素，則檢測結(jié)果無效；以及所述抗生素陽性對照組中檢出抗生素且所述β-內(nèi)酰胺酶陽性對照組中檢測出抗生素，則檢測結(jié)果無效。由此，根據(jù)本發(fā)明的牛奶中舒巴坦的檢測方法能夠準(zhǔn)確地檢測出牛奶中是否存在舒巴坦，且操作簡便。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。具體實施方式下面詳細描述本發(fā)明的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例1在該實施例中，按照下列方法對牛奶中舒巴坦進行檢測：1、試劑及溶液西班牙ECLIPSE50(簡稱E50)抗生素檢測試劑盒，青霉素鈉標(biāo)準(zhǔn)品，β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)，濃度為446萬U/mL)，舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品，復(fù)原乳：通過將恒天然奶粉溶解于水中所得到的，不含抗生素、β-內(nèi)酰胺酶及舒巴坦。2、設(shè)備儀器漩渦混合儀，恒溫水浴箱(40℃±1℃)，抗生素檢測所需的孵育器(65℃±1℃)，移液器(10uL、100uL和1mL)，離心管(1.5mL、2mL和15mL)。3、操作步驟(1)取1mL復(fù)原乳，加入1mg/L青霉素鈉溶液6μL，終濃度為6μg/L，漩渦混勻，作為抗生素陽性對照組；(2)取1mL復(fù)原乳，分別加入青霉素鈉溶液和β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使青霉素鈉終濃度為6μg/L，β-內(nèi)酰胺酶終濃度為4U/mL，作為β-內(nèi)酰胺酶陽性對照組；(3)取1mL待檢牛奶，分別加入青霉素鈉溶液和β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使青霉素鈉終濃度為6μg/L，β-內(nèi)酰胺酶終濃度為4U/mL，作為樣品組；(4)分別將抗生素陽性對照組、β-內(nèi)酰胺酶陽性對照組及樣品組置于40℃±1℃水浴箱中孵育1小時20分鐘；(5)用E50抗生素檢測試劑盒檢測孵育后的抗生素陽性對照組、β-內(nèi)酰胺酶陽性對照組及樣品組中的是否存在抗生素。要求抗生素陽性對照組的抗生素結(jié)果為陽性，β-內(nèi)酰胺酶陽性對照組的抗生素檢測結(jié)果為陰性以證明所加入的青霉素鈉及β-內(nèi)酰胺酶有效，否則必須重做。表1給出了E50結(jié)果判斷表。其中紫色代表抗生素檢測結(jié)果陽性，黃色代表抗生素檢測結(jié)果陰性?？梢钥闯觯迷摲椒軌蛴行У卮_定待測牛奶中是否含有舒巴坦。表1E50結(jié)果判斷表檢測樣品E50抗生素結(jié)果β-內(nèi)酰胺酶結(jié)果舒巴坦結(jié)果抗生素陽性對照組紫色陽性(+)陰性(-)/β-內(nèi)酰胺酶陽性對照組黃色陰性(-)陽性(+)/待檢樣黃色陰性(-)陽性(+)陰性(-)待檢樣紫色陽性(+)陰性(-)陽性(+)注：陰性表示不存在或濃度低于方法檢出限，陽性表示存在且濃度不低于方法檢出限。實施例2準(zhǔn)確性檢測具體操作：(1)取三份新西蘭復(fù)原乳，分別加入1mg/L、5mg/L及10mg/L舒巴坦，得到加標(biāo)樣品1、加標(biāo)樣品2和加標(biāo)樣品3，取兩份復(fù)原乳，分別加入10mg/L及100mg/L舒巴坦，得到加標(biāo)樣品4和加標(biāo)樣品5；(2)分別按照實施例1的方法對復(fù)原乳及加標(biāo)樣品1～3中舒巴坦進行2次平行檢測；(3)分別按照實施例1的方法對加標(biāo)樣品4和5中舒巴坦進行2次平行檢測，區(qū)別在于，不含步驟(1)～(3)，直接將加標(biāo)樣品4和5進行孵育處理。結(jié)果如表2所示。由加標(biāo)樣品1～3可以看出，當(dāng)舒巴坦?jié)舛葹?mg/L時，β-內(nèi)酰胺酶并未完全被抑制，結(jié)果出現(xiàn)假陰性，舒巴坦未被檢出。當(dāng)舒巴坦?jié)舛葹?mg/L時，能夠抑制β-內(nèi)酰胺酶活性，進而能夠檢出舒巴坦。由此，本發(fā)明方法的舒巴坦檢出限為5mg/L。由加標(biāo)樣品4和5可以看出，分別向牛奶樣本中單獨加入舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品10mg/L、100mg/L，抗生素檢測結(jié)果為陰性，說明所添加的舒巴坦?jié)舛炔⒉荒軐?dǎo)致試劑顯示陽性，證明舒巴坦是因為抑制了β-內(nèi)酰胺酶的活性而使得試劑顯示陽性，進而表明檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。表2準(zhǔn)確性驗證實施例3穩(wěn)定性驗證具體步驟：(1)選取20個不同批次的不含舒巴坦的牛奶樣品，向10個不同批次的牛奶中各加入10mg/L的舒巴坦，記作樣品1～10；另外10個不同批次的牛奶不添加舒巴坦，記作樣品11～20；(2)按照實施例1的方法分別對樣品1～20中舒巴坦進行檢測。結(jié)果如表3所示?？梢钥闯觯景l(fā)明的方法能夠準(zhǔn)確地檢測出舒巴坦是否存在，且穩(wěn)定性較好。表3穩(wěn)定性驗證下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的方案進行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結(jié)合和組合。盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。當(dāng)前第1頁1 2 3