本發(fā)明涉及一種透明質(zhì)酸的測(cè)定試劑及其制備方法，屬于生化手段測(cè)試
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)現(xiàn)有9000萬(wàn)的乙肝患者和感染者，部分患者在數(shù)年或數(shù)十年的慢性病程中由慢性肝炎發(fā)展至肝硬化，在這個(gè)過(guò)程中，肝纖維化是肝病進(jìn)展的重要階段，是許多慢性肝病的共同病理過(guò)程，是向肝硬化甚至原發(fā)性肝癌發(fā)展的一個(gè)中間環(huán)節(jié)，肝纖維化的早期治療可以逆轉(zhuǎn)或抑制其發(fā)展。因此，及早發(fā)現(xiàn)肝纖維化對(duì)于及時(shí)治療、阻斷和逆轉(zhuǎn)肝纖維化發(fā)生和發(fā)展，防止肝硬化發(fā)生具有十分重要的意義。乙型與丙型病毒性肝炎是引起肝纖維化最常見(jiàn)的病因。肝纖維化(1iverfibrosis)是肝細(xì)胞損傷后的一種異常修復(fù)過(guò)程，其實(shí)質(zhì)是肝細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成和降解失衡，ECM在肝內(nèi)過(guò)度沉積。肝纖維化發(fā)生時(shí)，肝臟沉積的纖維結(jié)締組織包括細(xì)胞成分和細(xì)胞外間質(zhì)兩大部分。細(xì)胞外間質(zhì)有膠原、非膠原性糖蛋白、蛋白多糖，三者統(tǒng)稱(chēng)為細(xì)胞外基質(zhì)。肝纖維化發(fā)展過(guò)程中，ECM合成量增多，分解減少。它是各種慢性肝病的共同轉(zhuǎn)歸，最終發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌。通過(guò)肝穿刺對(duì)肝組織進(jìn)行活檢仍是目前判斷肝纖維化程度的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但它具有創(chuàng)傷性，且由于肝硬化在全肝中的不均一性，穿刺活檢也有其局限性。目前臨床上應(yīng)用最為廣泛的血清學(xué)指標(biāo)是與肝細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的直接指標(biāo)和反映炎癥活動(dòng)的間接指標(biāo)。直接指標(biāo)包括透明質(zhì)酸(HA)、III型前膠原氨基端肽(PIIINP)、IV型膠原(CIV)、層粘連蛋白(LN)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及其抑制劑(TIMPs)等。間接指標(biāo)包括血小板計(jì)數(shù)(PLT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、α2-巨球蛋白(α2M)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、觸珠蛋白(HP)、總膽紅素(TBIL)、載脂蛋白A1(APOAl)等，但這些指標(biāo)對(duì)肝纖維化診斷的特異性、敏感性、準(zhǔn)確性、陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)值尚不能完全真實(shí)地反映肝纖維化的實(shí)際狀況。目前的臨床研究表明，在眾多的纖維化生化指標(biāo)中，HA是最敏感和特異的，HA與病理診斷之間有良好的相關(guān)性(R>0.79)，診斷的敏感性為75-90％，特異性為59％，診斷界值為30-60μg/ml。透明質(zhì)酸(HA)是一種非硫化粘多糖(分子量10-6道爾頓)，存在于組織、體液等細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中。HA是ECM的主要成分之一，正常情況下由間質(zhì)細(xì)胞合成，參與組織重建、擴(kuò)增組織間隙、炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生等過(guò)程。在組織中，HA以其凝膠性質(zhì)，行使某些正常生理功能，如保持軟骨的完整性、滲透壓平衡和水的動(dòng)態(tài)平衡等。腹膜間皮細(xì)胞是腹腔內(nèi)HA的主要來(lái)源，故HA是腹腔間皮細(xì)胞的功能性標(biāo)志之一。己知在肝硬化、肺纖維化、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及惡性間皮瘤等患者的血清中，可檢測(cè)到顯著增高的HA。HA主要由組織中成纖維細(xì)胞合成，可較準(zhǔn)確靈敏地反映肝內(nèi)已生成的纖維量及肝細(xì)胞受損、炎癥活動(dòng)狀況。有研究認(rèn)為HA是反映肝纖維化最具價(jià)值的血清學(xué)標(biāo)志物。血清HA在急肝、慢遷肝時(shí)輕度升高，慢活去肝時(shí)顯著升高，肝硬化時(shí)極度升高，國(guó)內(nèi)張魯榕等首先用RIA測(cè)定方法對(duì)254例肝病患者HA水平進(jìn)行測(cè)定也證實(shí)了這點(diǎn)。HA水平與血清膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、y-球蛋白呈正相關(guān)；與血清白蛋白、凝血酶原時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，故是反映肝損害嚴(yán)重程度、判斷有無(wú)活動(dòng)性肝纖維化的定量指標(biāo)，且有助于慢遷肝與慢活肝的鑒別診斷和評(píng)估肝病發(fā)展趨勢(shì)和判斷藥效。另有研究顯示，血清HA診斷肝硬化的陰性預(yù)測(cè)值(99％)明顯高于陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(30％)，因而對(duì)排除肝硬化具有較好的應(yīng)用價(jià)值。由于血清學(xué)指標(biāo)具有安全、快速、可重復(fù)的優(yōu)點(diǎn)，因此，近年來(lái)利用血清學(xué)標(biāo)志物來(lái)監(jiān)測(cè)慢性肝病肝纖維化試劑開(kāi)始應(yīng)用，尤其是在隨訪療效方面發(fā)揮替代肝穿刺活檢作用。目前檢測(cè)血清中HA含量多采用以HA結(jié)合蛋白(HABP)為主要試劑的放射免疫法(RIA)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)。這兩種方法都較為準(zhǔn)確可靠，但放射免疫法(RIA)具有一定的放射性污染，不利于檢測(cè)的大規(guī)模開(kāi)展；酶聯(lián)免疫法(ELISA)對(duì)實(shí)驗(yàn)要求較高，實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，并且需要配備酶標(biāo)儀，對(duì)于基層醫(yī)院較難普及?；诖?，做出本申請(qǐng)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有透明質(zhì)酸在測(cè)試過(guò)程中存在的上述缺陷，本發(fā)明具有安全、快速、可重復(fù)的特點(diǎn)，可避免不必要的肝臟穿刺。該產(chǎn)品具有檢測(cè)精度好、測(cè)定時(shí)間短、程序簡(jiǎn)便、易于自動(dòng)測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)，能夠利用普通醫(yī)院現(xiàn)有的自動(dòng)生化儀測(cè)定，減少樣品間的人為誤差。為肝纖維化普查提供快速有效的診斷方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：一種透明質(zhì)酸測(cè)定試劑，包括R1試劑、R2試劑和透明質(zhì)酸校準(zhǔn)品，其中R1試劑組成成分：Tris緩沖液50mmol/L(指Tris緩沖液在R1試劑中的終濃度)、透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白0.1mg/L(指透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白在R1試劑中的終濃度)、牛血清白蛋白0.1％(體積百分比)、疊氮鈉0.1％(體積百分比)；R2試劑組成成分：透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白特異性抗體包被膠乳0.2％(體積百分比)、牛血清蛋白0.5％(體積百分比)、疊氮化鈉0.09％(體積百分比)；透明質(zhì)酸標(biāo)準(zhǔn)品組成成分：透明質(zhì)酸、磷酸鹽緩沖液50mmol/L(指磷酸鹽緩沖液在透明質(zhì)酸標(biāo)準(zhǔn)品中的終濃度)、疊氮鈉0.1％(體積百分比)。同時(shí)，本發(fā)明還提供了一種具有上述特征透明質(zhì)酸測(cè)定試劑的制備方法，包括如下步驟：(1)R1試劑配制：向純化水中加入Tris，攪拌至完全溶解；加入透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白，攪拌至溶解；加入牛血清蛋白，攪拌至完全溶解，添加疊氮鈉，攪拌至完全溶解，繼續(xù)攪拌后定容；(2)R2試劑配制：向純化水中加入牛血清蛋白，攪拌至完全溶解；加入疊氮鈉，攪拌至完全溶解；加入透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白特異性抗體包被膠乳，攪拌至完全溶解，繼續(xù)攪拌后定容；(3)透明質(zhì)酸標(biāo)準(zhǔn)品配制：向純化水中加入透明質(zhì)酸，攪拌至完全溶解；加入磷酸氫二鉀，攪拌至完全溶解；加入磷酸二氫鉀，攪拌至完全溶解；加入疊氮鈉，攪拌至完全溶解；繼續(xù)攪拌后定容；(4)對(duì)上述制備的R1試劑、R2試劑及透明質(zhì)酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行靈敏度、線性范圍、精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行測(cè)定。其中上述工序中，攪拌速度均為300-500轉(zhuǎn)/分。本發(fā)明的工作原理如下：血清樣品中的透明質(zhì)酸能與試劑盒中的透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白結(jié)合，結(jié)合后的產(chǎn)物與試劑中的含有anti-HABP抗體的膠乳顆粒發(fā)生反應(yīng)，采用比濁法，使用光學(xué)監(jiān)測(cè)儀器測(cè)定反應(yīng)液吸光度值。反應(yīng)液的混濁程度與血清中含有的透明質(zhì)酸的含量呈正比，濁度越大，透明質(zhì)酸的含量越高。(1)靈敏度評(píng)價(jià)試驗(yàn)根據(jù)GB/T26124-2011《臨床化學(xué)體外診斷試劑(盒)》中對(duì)“分析靈敏度”檢測(cè)的要求，以試劑盒在規(guī)定參數(shù)下對(duì)分析靈敏度評(píng)價(jià)用樣本進(jìn)行檢測(cè)產(chǎn)生的吸光度改變，換算為n單位的吸光度的差值(ΔA)作為分析靈敏度。分析靈敏度評(píng)價(jià)試驗(yàn)對(duì)分析靈敏度評(píng)價(jià)用樣本重復(fù)測(cè)定20次。評(píng)估結(jié)果：分析靈敏度89ng/ml吸光度變化率(ΔA/min)≥0.002ABS/min。(2)線性范圍評(píng)價(jià)試驗(yàn)根據(jù)GB/T26124-2011《臨床化學(xué)體外診斷試劑(盒)》和《體外診斷試劑分析性能評(píng)估指導(dǎo)原則——線性范圍(征求意見(jiàn)稿)》中的建議，對(duì)試劑線性范圍進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，在待驗(yàn)證線性范圍內(nèi)選擇5個(gè)濃度水平，每個(gè)濃度水平重復(fù)測(cè)定3次。評(píng)估結(jié)果：在線性范圍(0-750ng/ml)內(nèi)，線性回歸的相關(guān)系數(shù)r≥0.990。當(dāng)濃度≤50ng/ml時(shí)，絕對(duì)偏差≤5ng/ml；當(dāng)濃度＞50ng/ml時(shí)，相對(duì)偏差應(yīng)不大于10％。(3)精密度評(píng)價(jià)試驗(yàn)精密度評(píng)價(jià)包括重復(fù)性和批間差，且至少評(píng)估二個(gè)濃度水平樣本的精密度，其中有一個(gè)濃度在醫(yī)學(xué)決定水平左右。因此，重復(fù)性評(píng)價(jià)采用在重復(fù)性條件下，用二個(gè)濃度水平的控制物質(zhì)(其中一個(gè)濃度接近醫(yī)學(xué)決定水平)測(cè)試，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)試10次；批間差評(píng)價(jià)采用二個(gè)濃度水平的控制物質(zhì)(其中一個(gè)濃度接近醫(yī)學(xué)決定水平)分別測(cè)試3個(gè)不同批號(hào)的試劑盒，每個(gè)批號(hào)測(cè)試3次。評(píng)估結(jié)果：變異系數(shù)CV≤10％,相對(duì)偏差R≤10％。(4)準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)試驗(yàn)用不少于40個(gè)在檢測(cè)濃度范圍內(nèi)的不同濃度的人源樣品，以指定的分析系統(tǒng)作為比對(duì)方法，每份樣品按待測(cè)試劑操作方法及比對(duì)方法分別檢測(cè)。用線性回歸方法計(jì)算兩組結(jié)果的相關(guān)系數(shù)(r)及每個(gè)濃度點(diǎn)的相對(duì)偏差。評(píng)估結(jié)果：相關(guān)系數(shù)r≥0.975,相對(duì)偏差B≤10％。本發(fā)明利用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法測(cè)定透明質(zhì)酸的方法，其優(yōu)點(diǎn)是：1.檢測(cè)速度快：一個(gè)反應(yīng)時(shí)間只需要十分鐘，節(jié)省了病人結(jié)果等待時(shí)間；2.通用性強(qiáng)：能夠使用醫(yī)院現(xiàn)有的自動(dòng)生化儀進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)需額外投入新設(shè)備；3.樣本量消耗少：采用本產(chǎn)品測(cè)試，只需要6微升血清樣品。本發(fā)明可廣泛的應(yīng)用于肝硬化的早期診斷，為肝纖維化血清體檢普查提供有效的診斷方法，也為肝硬化的早期診斷提供新的診斷途徑。具有較好的市場(chǎng)前景和社會(huì)效益。具體實(shí)施方式本實(shí)施例所用主要試劑：Tris緩沖液50mmol/L、透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白0.1mg/L、牛血清白蛋白0.1％、透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白特異性抗體包被膠乳0.2％、牛血清蛋白0.5％、磷酸鹽緩沖液50mmol/L、疊氮鈉，均購(gòu)自Enzymaker公司。(1)R1試劑的配制①將700ml純化水加入到適當(dāng)容器中。②開(kāi)啟電動(dòng)攪拌器，攪拌速度均為450轉(zhuǎn)/分。③稱(chēng)取100gTris加入上述純化水中，攪拌至完全溶解。④稱(chēng)取2mg透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。⑤量取7.2ml牛血清蛋白加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。⑥稱(chēng)取2.4g疊氮鈉加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。⑦攪拌十分鐘以上。⑧定容至800ml。(2)R2試劑的配制①將300ml純化水加入到適當(dāng)容器中。②開(kāi)啟電動(dòng)攪拌器，攪拌速度均為450轉(zhuǎn)/分。③量取7.2ml血清蛋白加入上述純化水中，攪拌至完全溶解。④稱(chēng)取2.4g疊氮鈉加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。⑤稱(chēng)取2.4g透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白特異性抗體包被膠乳加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。⑥攪拌十分鐘以上。⑦定容至400ml。(3)標(biāo)準(zhǔn)品的配制①將200ml純化水加入到適當(dāng)容器中。②開(kāi)啟電動(dòng)攪拌器，攪拌速度均為450轉(zhuǎn)/分。③稱(chēng)取3g透明質(zhì)酸加入上述純化水中，攪拌至完全溶解。④稱(chēng)取54.5g磷酸氫二鉀加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。⑤稱(chēng)取45.4g磷酸二氫鉀加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。⑥稱(chēng)取1.2g疊氮鈉加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。⑦攪拌十分鐘以上。⑧定容至300ml。(4)試劑檢驗(yàn)①儀器配置:儀器使用日立7100全自動(dòng)生化分析儀。測(cè)定參數(shù)嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)在儀器中設(shè)定，基本測(cè)定參數(shù)如下：方法：兩點(diǎn)終點(diǎn)法；反應(yīng)方向：遞增；波長(zhǎng)：700nm(主波長(zhǎng))；溫度：37℃。比色杯光徑：1cm；R1試劑:165μl,R2試劑:83μl，樣品：6μl。第一測(cè)光點(diǎn)：在R2試劑加入后1分鐘讀取；第二測(cè)光點(diǎn)：在R2試劑加入后5分鐘讀取。②試劑外觀檢查：目測(cè)檢查。③裝量檢查：用通用量具測(cè)量。④試劑空白測(cè)定:用蒸餾水或去離子水作為空白樣品測(cè)試試劑盒，在測(cè)試主波長(zhǎng)下，記錄測(cè)試啟動(dòng)時(shí)吸光度(A1試劑)和約5分鐘后的吸光度(A2試劑)，A2即為工作試劑的空白吸光度。⑤線性范圍測(cè)定:取接近線性范圍上限的高值樣本用生理鹽水倍比稀釋配制成不同濃度梯度的樣本系列。以H值與稀釋比例計(jì)算出預(yù)期值。稀釋方法參照表1所示(根據(jù)高值的大小可相應(yīng)調(diào)整稀釋梯度)。表1樣本稀釋表實(shí)施例12345生理鹽水(ml)00.50.50.50.5高值標(biāo)本H(ml)10.50.50.50.5稀釋比例原倍1/21/41/81/16表中：實(shí)施例1樣本的濃度為已知定值CH，實(shí)施例2-5樣本濃度按公式：樣本濃度＝CH×稀釋比例，計(jì)算作為預(yù)期值，將稀釋好的樣本系列充分混勻，在校正后的測(cè)定系統(tǒng)上按從低值到高值順序平行測(cè)定2次，均值作為對(duì)應(yīng)實(shí)施例樣本實(shí)測(cè)值(如2次測(cè)定結(jié)果有明顯偏差應(yīng)剔除重測(cè))。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：以預(yù)期值為橫坐標(biāo)，樣本實(shí)測(cè)值為縱坐標(biāo)作圖及直線回歸分析，確定線性區(qū)間計(jì)算出直線方程y＝a+bx及相關(guān)系數(shù)，當(dāng)相關(guān)系數(shù)r≥0.990時(shí)為線性良好。數(shù)據(jù)分析處理采用MicrosoftExcel軟件。相關(guān)公式如下：b=nΣXiYi-ΣXi·ΣYinΣXi2-(ΣXi)2...(1)]]>|a|=|ΣYi-bΣXin...(2)]]>r=nΣXiYi-ΣXi·ΣYi[n·ΣXi-(ΣXi)][nΣYi-(ΣYi)]...(3)]]>式中，C：濃度；V：容積；b：回歸線的斜率；∣a∣：回歸線截距的絕對(duì)值；r：相關(guān)系數(shù)；Xi：各管預(yù)期值；Yi：各管測(cè)定值；i：1、2、3.……、n；n：測(cè)定樣本數(shù)。⑥精密度測(cè)定:a.重復(fù)性測(cè)定:用臨床標(biāo)本或質(zhì)控血清測(cè)試試劑盒，重復(fù)測(cè)試10次，計(jì)算測(cè)量值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(s)。按如下公式計(jì)算變異系數(shù)(CV)。與變異系數(shù)CV(％)X‾=ΣX1/n...(4)]]>CV=Σ(X‾-Xi)(X‾)2(n-1)...(5)]]>式中：——待測(cè)血清樣本的均值；Xi——測(cè)定血清樣本的測(cè)定結(jié)果；n——測(cè)定次數(shù)CV——變異系數(shù)b.批間差測(cè)定取三個(gè)批號(hào)送檢試劑，每個(gè)批號(hào)取3瓶，分別測(cè)定1份臨床樣本或質(zhì)控血清，可選用羅氏質(zhì)控品，分別計(jì)算9份試劑測(cè)定均值和每個(gè)批號(hào)3份試劑的測(cè)定均值并用MicrosoftExcel軟件統(tǒng)計(jì)三個(gè)批號(hào)試劑測(cè)定的變異系數(shù)。相關(guān)公式如下:式中：——中的最大值；——中的最小值；——總均值。⑦準(zhǔn)確性測(cè)定:取校準(zhǔn)品(有證參考物質(zhì)，CRM)對(duì)試劑盒進(jìn)行測(cè)試，重復(fù)檢測(cè)3次，取測(cè)試結(jié)果均值(M)，按公式(7)計(jì)算相對(duì)偏差(B)。相對(duì)偏差(B)＝(M-T)/T×100％……………………………………………(7)式中：T——有證參考物質(zhì)(CRM)標(biāo)示值；M——樣品測(cè)定結(jié)果均值。⑧分析靈敏度:用已知濃度或活性的樣品測(cè)試試劑盒，記錄在試劑盒規(guī)定參數(shù)下產(chǎn)生的吸光度改變，換算為n單位的吸光度差值(ΔA)。(5)試劑測(cè)定結(jié)果：線性范圍：在線性范圍(0-750ng/ml)內(nèi)，線性回歸的相關(guān)系數(shù)r≥0.990。當(dāng)濃度≤50ng/ml時(shí)，絕對(duì)偏差≤5ng/ml；當(dāng)濃度＞50ng/ml時(shí)，相對(duì)偏差應(yīng)不大于10％。準(zhǔn)確度：相關(guān)系數(shù)r≥0.975,相對(duì)偏差≤15％。測(cè)量精密度：變異系數(shù)CV≤10％,相對(duì)偏差R≤10％?？瞻孜舛龋嚎瞻孜舛?A)≤2.5(在溫度37℃；波長(zhǎng)700nm；比色皿光徑1.0cm)分析靈敏度：試劑盒測(cè)試89ng/ml被測(cè)物時(shí)，吸光度差值(ΔA)≥0.002ABS。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3