政府支持申明

本發(fā)明由美國政府支持通過國家癌癥研究所(National Cancer Institute)的基金第1U54CA119367號以及國家科學基金會(National Science Foundation)的基金第ECCS-0801385-000號完成。所述政府在本發(fā)明中享有特定權(quán)益。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種定量地測定分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)的方法。

背景技術(shù)：

生物過程決定于第一和第二分子的分子對之間的分子相互作用。這些分子相互作用的實例包括核酸雜交相互作用、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-核酸相互作用、酶-底物相互作用以及受體-配體相互作用，例如，抗體-抗原相互作用和受體-激動劑或拮抗劑相互作用。

對DNA雜交、抗原-抗體結(jié)合以及DNA-蛋白質(zhì)相互作用的基于親和性的感應均已表明在基礎(chǔ)科研、臨床診斷、生物分子工程和藥物設計中發(fā)揮重要作用。隨著該領(lǐng)域進展狀況，對用于測定分子身份和反應細節(jié)的精確、敏感、高通量和迅速的方法的需求在分析方法的演化中造成持續(xù)的壓力。為滿足這些迫切需要，研究者已經(jīng)轉(zhuǎn)向于分子標記物以期改善對稀少分子檢測的敏感度。然而，這些標記物可能會改變擴散以及空間排布現(xiàn)象。此外，高通量或速度的要求通常不允許經(jīng)典的平衡方法的使用，因而詳細了解反應動力學、擴散現(xiàn)象以及表面固定化的含義對于獲取有意義的反應參數(shù)而言變得至關(guān)重要。

當評價給定分子相互作用的動力學時，多種定量動力學參數(shù)可能成為目標。一種目標定量動力學參數(shù)是結(jié)合速率常數(shù)。結(jié)合速率常數(shù)(即，k_a、k_on)是描述兩種分子在平衡中的結(jié)合親和性的數(shù)學常數(shù)，諸如抗體和抗原的結(jié)合親和性。另一種目標定量動力學參數(shù)是解離速率常數(shù)(即，k_d、k_off)。所述解離速率常數(shù)是描述較大物體可逆地分離(解離)成為較小組分的傾向的數(shù)學常數(shù)，如當受體/配體復合體解離成為其組分分子的時候。第三種目標動力學參數(shù)是擴散速率常數(shù)k_M，該常數(shù)是描述標記的分子向傳感器進行擴散的速率的數(shù)學常數(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

提供了對分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)進行定量地測定的方法。本方法的實施方案的方面包括：制備磁性傳感器裝置，所述磁性傳感器裝置包含與分析混合物接觸的磁性傳感器，所述分析混合物包含磁性標記的分子以產(chǎn)生可檢測的分子結(jié)合相互作用；從所述磁性傳感器中獲取實時信號；以及由所述實時信號定量地確定所述分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)。還提供了被配置為用于所述方法的系統(tǒng)和試劑盒。

本發(fā)明的方面包括定量測定分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)的方法。所述方法包括：制備磁性傳感器裝置，所述磁性傳感器裝置包括與分析混合物接觸的磁性傳感器，所述分析混合物具有磁性標記的分子以產(chǎn)生可檢測的分子結(jié)合相互作用；從所述磁性傳感器中獲取實時信號；以及由所述實時信號定量地確定所述分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)。

在某些實施方案中，所述結(jié)合動力學參數(shù)是結(jié)合速率常數(shù)(k_a)。在一些情況下，所述結(jié)合動力學參數(shù)是解離速率常數(shù)(k_d)。在某些情況下，所述結(jié)合動力學參數(shù)是擴散限制速率常數(shù)(k_M)。在某些實施方案中，結(jié)合動力學參數(shù)為結(jié)合速率常數(shù)(k_a)、解離速率常數(shù)(k_d)和擴散限制速率常數(shù)(k_M)中的至少一種。

在某些實施方案中，所述磁性傳感器包括與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合的分子，并且所述接觸包括將所述磁性標記的分子涂覆于所述磁性傳感器。

在某些實施方案中，所述磁性傳感器包括捕獲探針，所述捕獲探針特異地結(jié)合于與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合的分子，并且所述接觸包括將與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合的分子和所述磁性標記的分子相繼地涂覆于所述磁性傳感器。

在一些情況下，所述磁性傳感器包括捕獲探針，所述捕獲探針特異地結(jié)合于與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合的分子，并且所述接觸包括制備具有與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合的分子和所述磁性標記的分子的反應混合物，并且隨后將所述反應混合物涂覆于所述磁性傳感器。

在某些實施方案中，所述磁性傳感器是自旋閥傳感器。在一些情況下，所述磁性傳感器是磁性隧道結(jié)傳感器。

在某些情況下，所述分子結(jié)合相互作用是諸如核酸雜交相互作用、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、受體-配體相互作用、酶-底物相互作用或蛋白質(zhì)-核酸相互作用的結(jié)合相互作用。

在一些情況下，定量測定的步驟包括用擬合算法處理所述實時信號。在某些情況下，所述擬合算法是二室擬合算法(two-compartment fitting algorithm)。在一些實施方案中，所述二室擬合算法包括主體區(qū)室(bulk compartment)和表面區(qū)室(surface compartment)。

本發(fā)明的方面還包括定量測定兩種或更多種不同分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)的方法，其中各個不同分子結(jié)合相互作用包括不同磁性標記的分子。所述方法包括：制備包括兩個或更多個不同的磁性傳感器的磁性傳感器裝置，各個磁性傳感器接觸具有磁性標記的分子的分析混合物從而產(chǎn)生兩種或更多種不同的分子結(jié)合相互作用；從各個磁性傳感器中獲取實時信號；以及從所述實時信號中定量測定針對所述兩種或更多種不同的分子結(jié)合相互作用中的每種的結(jié)合動力學參數(shù)。

在某些實施方案中，所述結(jié)合動力學參數(shù)是結(jié)合速率常數(shù)(k_a)。在一些情況下，所述結(jié)合動力學參數(shù)是解離速率常數(shù)(k_d)。在某些情況下，所述結(jié)合動力學參數(shù)是擴散限制速率常數(shù)(k_M)。在某些實施方案中，結(jié)合動力學參數(shù)是結(jié)合速率常數(shù)(k_a)、解離速率常數(shù)(k_d)和擴散限制速率常數(shù)(k_M)中的至少一種。

在某些實施方案中，所述結(jié)合相互作用是諸如核酸雜交相互作用、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、受體-配體相互作用、酶-底物相互作用或蛋白質(zhì)-核酸相互作用的結(jié)合相互作用。

本發(fā)明的方面還包括磁性傳感器裝置。所述磁性傳感器裝置包括：磁性傳感器，所述磁性傳感器被配置為檢測磁性標記的分子；以及處理器，所述處理器被配置為從所述磁性傳感器中獲取實時信號和由所述實時信號定量地確定分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)。

在某些實施方案中，所述結(jié)合動力學參數(shù)是結(jié)合速率常數(shù)(k_a)。在一些情況下，所述結(jié)合動力學參數(shù)是解離速率常數(shù)(k_d)。在某些情況下，所述結(jié)合動力學參數(shù)是擴散限制速率常數(shù)(k_M)。在某些實施方案中，結(jié)合動力學參數(shù)是結(jié)合速率常數(shù)(k_a)、解離速率常數(shù)(k_d)和擴散限制速率常數(shù)(k_M)中的至少一種。

在某些情況下，所述磁性傳感器是自旋閥傳感器。在一些情況下，所述磁性傳感器是磁性隧道結(jié)傳感器。

在某些實施方案中，所述磁性傳感器包括兩個或更多個感應區(qū)。在一些情況下，所述磁性傳感器包括四個或更多個感應區(qū)。在一些情況下，所述感應區(qū)以串聯(lián)和并聯(lián)的方式連接。

在某些情況下，所述裝置包括兩個或更多個不同的磁性傳感器。在一些情況下，所述裝置包括100個或更多個不同的磁性傳感器。在一些情況下，所述裝置包括1000個或更多個不同的磁性傳感器。

在某些實施方案中，所述裝置還包括所述磁性標記的分子和與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合的分子。

本發(fā)明的方面還包括試劑盒，該試劑盒包括：(a)磁性標記物；以及(b)以下物質(zhì)中的至少一種：(i)計算機可讀的媒介，其上儲存有計算機程序，當計算機執(zhí)行該程序時，該程序操控計算機由獲自磁性傳感器的實時信號定量地確定分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)；以及(ii)具有用于獲得所述計算機程序的地址的物理基板。

附圖說明

圖1(a)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的使用與磁性傳感器結(jié)合的捕獲抗體、與所述捕獲抗體結(jié)合的分析物和與磁性標簽連接的檢測抗體進行的夾心分析法的示意圖。圖1(b)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的使用與磁性傳感器結(jié)合的捕獲DNA、與所述捕獲DNA結(jié)合的靶DNA和與磁性標簽連接的檢測DNA進行的DNA夾心分析法的示意圖。

圖2提供了根據(jù)本發(fā)明實施方案的二室反應擴散模型的示意圖。標記的抗體通過運輸過程移向傳感器表面并且隨后通過結(jié)合流動(conjugation flux)進行結(jié)合和釋放。

圖3示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的鏈霉親和素-生物素結(jié)合相互作用的(a)和EpCAM抗體對EpCAM抗原的(b)的動力學模型與實時結(jié)合數(shù)據(jù)之間的比較圖。一旦所述模型與所述結(jié)合數(shù)據(jù)進行了擬合，由所述擬合計算所述結(jié)合速率常數(shù)、解離速率常數(shù)和擴散限制速率常數(shù)。圖3(c)和3(d)所示的實時結(jié)合曲線示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的以平行實驗進行的CEA抗體對CEA抗原的結(jié)合動力學監(jiān)測從而比較磁性納米傳感器與表面等離子體共振(SPR)系統(tǒng)。所述GMR生物傳感器具有5.0×10⁴M^-1s^-1的k_a計算值以及4.4×10^-4s^-1的k_d計算值，而SPR實驗產(chǎn)生了4.44×10⁴M^-1s^-1的k_a以及1.17×10^-4s^-1的k_d。

圖4(a)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的抗體-抗原結(jié)合(并非按比例繪制)的示意圖。在左側(cè)，用磁性標簽標記的抗體在濃度為C_s的溶液中靠近所述GMR傳感器表面。當未結(jié)合時，擴散磁性標記的抗體距離所述GMR傳感器過遠以致不能被檢測到。在所述傳感器表面的是抗原，其以n_max的初始表面濃度被固定。正如右側(cè)所描述，一旦所述磁性標記的抗體與所述抗原結(jié)合，來自所述磁性標簽的磁場就被下方的基于接近度的GMR傳感器檢出。所述捕獲的抗體-抗原復合體以n表示。圖4(b)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的按比例繪制的磁性標記的抗體的示意圖。所述磁性標簽包括包埋于葡聚糖聚合物內(nèi)的若干個氧化鐵核并且其隨后使用抗體或受體進行功能化。圖4(c)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的包括1,008個磁性傳感器的1mm²芯片的照片。圖4(d)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的經(jīng)完全加工的芯片的光學顯微照片和掃描電子顯微鏡(SEM)圖像。1,008個GMR生物傳感器被分成16個亞陣列，并且各亞陣列占90μm×90μm的面積。

圖5(a)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的通過方程M.6中的分析模型(虛線)所預測的抗-EpCAM抗體對表面固定化的EpCAM抗原的結(jié)合曲線圖以及所測得的實驗數(shù)據(jù)(實線)的結(jié)合曲線圖，其中EpCAM蛋白的表面濃度以2×的系列稀釋度從5阿摩爾(n_max)被稀釋至20仄摩爾(zeptomole)(n_max/256)。本實驗中的全部曲線對通過所述模型所預測曲線的擬合誤差為R²＝0.98。圖5(b)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的分析模型所預測的(虛線)MNP-抗-EpCAM抗體對固定化于所述傳感器表面的833仄摩爾(n_max/6)的EpCAM抗原的結(jié)合曲線圖以及所測得的實驗數(shù)據(jù)(實線)的結(jié)合曲線圖，其中MNP-抗-EpCAM蛋白的溶液濃度為未經(jīng)稀釋、2×稀釋和8×稀釋。全部曲線對通過所述模型的擬合誤差為R²＝0.96。y-軸以百萬分比(ppm)顯示了對初始MR進行歸一化的MR變化。

圖6(a)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的在12組重復傳感器上的抗CEA抗體對抗原的多元動力學分析以及在3組重復傳感器上的抗VEGF抗體對抗原的多重動力學分析圖。圖6(b)示出了監(jiān)測生物素對鏈霉親和素結(jié)合動力學的25組重復傳感器示圖。圖6(c)示出了SPR圖并且圖6(d)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的基于磁性納米傳感器的平臺的結(jié)果圖，當在平行實驗中對CEA抗體結(jié)合CEA抗原進行監(jiān)測時所述圖提供了類似的實時結(jié)合曲線。

圖7示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的每傳感器的磁性標簽數(shù)量隨時間變化的圖。獲得了各個加載團塊的SEM圖像(示于圖7右側(cè))用以對所述實驗中結(jié)合的MNP數(shù)量與所述模型預測的數(shù)量進行比較。

圖8示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的不同固定化抗原加載量隨時間的傳感器信號圖。

圖9(a)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的針對表位分布和交叉反應因素的選擇性蛋白質(zhì)定向的示意圖。圖9(b)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的用抗-EGFR捕獲抗體(作為對照)功能化的抗-EGFR Ab傳感器的圖，其可捕獲EGFR并且當所述抗EGFR抗體-MNP復合體結(jié)合之時被檢出。圖9(c)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的證實了被監(jiān)測的動力學與結(jié)合EGFR的抗-EGFR抗體-MNP復合體相關(guān)的圖。y-軸以百萬分比(ppm)顯示了對初始MR進行歸一化的MR變化。

圖10示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的使用高密度GMR傳感器陣列產(chǎn)生的2D空間內(nèi)不同時間下蛋白質(zhì)擴散動力學的可視化效果。y-軸單位以百萬分比(ppm)顯示了對初始MR進行歸一化的MR變化。

圖11(a)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的用于監(jiān)測穿過使用磁性傳感器組的芯片陣列的蛋白質(zhì)擴散動力學的實驗裝置照片。在圖11(a)中，使用捕獲抗體將四個四傳感器組選擇性地固定于CEA。在圖11(a)中被圈示的各個傳感器組對應于圖11(b)內(nèi)圖中的匹配曲線。在將所述未反應捕獲抗體洗去之后，將以MNP標簽進行標記的檢測抗體在反應孔內(nèi)進行孵育。圖11(b)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的信號隨時間的變化圖。在向左上角的孔加入可溶的CEA抗原時，有可能在空間和時間上將CEA蛋白經(jīng)過所述孔的移動可視化。

圖12示出了包含并聯(lián)和串聯(lián)的72組傳感器條GMR傳感器結(jié)構(gòu)的光學顯微圖像。圖12中的插圖示出了GME傳感器的一個磁性傳感器條的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像，其上具有多個結(jié)合的磁性納米顆粒標簽。

圖13示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的描述方程M.6中各項貢獻的對數(shù)圖，方程M.6是結(jié)合于所述傳感器表面的磁性標記抗體數(shù)量的函數(shù)。

圖14示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的由Langmuir吸附模型所預測的(虛線)和實驗測得的(實線)抗-EpCAM抗體對表面固定化的EpCAM抗原的結(jié)合曲線圖。

具體實施方式

提供了對分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)進行定量地測定的方法。本方法的實施方案的方面包括：制備磁性傳感器裝置，所述磁性傳感器包含與分析混合物進行接觸的磁性傳感器，所述分析混合物包含磁性標記的分子以產(chǎn)生可檢測的分子結(jié)合相互作用；從所述磁性傳感器中獲取實時信號；以及由所述實時信號定量地確定所述分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參。還提供了被配制為用于所述方法的系統(tǒng)和試劑盒。

在對本發(fā)明進行更為詳盡的描述之前，應當了解本發(fā)明并不限于所描述的特定實施方案，因此本發(fā)明當然可以變化。還應了解，本文所使用的術(shù)語僅出于描述特定實施方案的目的并且并非意在進行限定，因為本發(fā)明的范圍應僅由所附的權(quán)利要求進行限定。

在提供數(shù)值范圍的情況下，應當了解本發(fā)明涵蓋了處于所述范圍的上限和下限之間的各中間數(shù)值以及該規(guī)定范圍中的任意所述或中間數(shù)值，除非上下文進行清楚地另行指明否則下限精確到十分位。這些較小范圍的上限和下限可被獨立地包含于所述較小范圍內(nèi)并且亦被涵蓋于本發(fā)明之內(nèi)，除在規(guī)定范圍被明確排除的任何范圍限制。在所規(guī)定范圍包含這些范圍限制的之一或全部的情況下，不包括這些被包含的范圍限制之一或全部的范圍也包含于本發(fā)明之內(nèi)。

特定范圍限制在本文中以數(shù)值方式給出，其前具有術(shù)語“約”。本文所使用的術(shù)語“約”在本文中被用于為其后的精確數(shù)字以及接近或近似所述術(shù)語之后的數(shù)字的數(shù)字提供文字上的支持。在確定數(shù)字是否接近或近似明確提及的數(shù)字時，所述接近或近似的未提及數(shù)字可以是在其所處的上下文中提供了所述明確提及的數(shù)字的實質(zhì)等價物的實質(zhì)等效數(shù)字。

除非另行定義，否則本文所使用的全部技術(shù)和科學術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所通常理解的含義。盡管與本文所述類似或等價的任意方法和材料也可被用于本發(fā)明的實施或測試，在此描述了代表性的說明性方法和材料。

本說明所引用的全部出版物和專利以引用的方式并入本文，正如各個出版物或?qū)＠惶囟ㄇ覀€別地表明通過引用的方式并入，并且其以引用的方式并入本文用以公開和描述與所述出版物通過引用而進行關(guān)聯(lián)的方法和/或材料。任意出版物的引用是對所述出版物在本申報日期之前的公開內(nèi)容的引用并且不應解釋為承認本發(fā)明無權(quán)通過以在先發(fā)明的方式從而先于這些出版物。此外，所提供的出版的日期可與實際出版日期不同，所述實際出版日期可能需要進行獨立證實。

應當認識到，本文以及所附的權(quán)利要求書中所使用單數(shù)形式的“一個”、“一種”和“所述”包含了復數(shù)個指示物，除非上下文明確地另行指明。進一步應認識到，所述權(quán)利要求書可被撰寫為排除任意可選的要素。同樣地，本申明意在用作為與權(quán)利要求要素有關(guān)的諸如“唯獨”、“僅”等等這些排它性術(shù)語的使用或“否定”限定的使用的前提基礎(chǔ)。

應當了解，出于明了澄清的目的而在不同獨立實施方案內(nèi)所描述的本發(fā)明的特定特征也可以結(jié)合形式提供于單一實施方案之中。反過來，出于簡要的目的而在單一實施方案內(nèi)所描述本發(fā)明的多種特征也可以分別提供或以任何適當?shù)姆纸M進行提供。所述實施方案的所有組合被明確地包含于本發(fā)明內(nèi)并且在本文公開的方式正如各自每一組合被單獨和明確地進行公開，其程度使這些組合包含了可操作的加工和/或裝置/系統(tǒng)/試劑盒。此外，描述這些可變因素的實施方案中所列的所有亞組合也被本發(fā)明明確地包含并且在本文公開的方式正如各自每一化學群體亞組合被單獨和明確地在本文中被公開。

正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員在閱讀本發(fā)明后所明了，本文所描述和說明的各個單獨實施方案具有分立的組分和特征，其在不脫離本發(fā)明的范圍或精神的情況下可容易地同任意其它多個實施方案的特征進行拆分和組合。任何提及的方法均可以所提及的事件為順序或以邏輯上可行的任何其它順序進行實施。

為進一步描述本發(fā)明的實施方案，首先將對本方法的實施方案的方面進行更為詳盡的描述。隨后討論了可用于實施本發(fā)明的方法的系統(tǒng)和試劑盒的實施方案。

方法

根據(jù)上文所總結(jié)，本發(fā)明的實施方案涉及對目標分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)進行定量測定的方法。在某些實施方案中，所述目標結(jié)合相互作用是第一種和第二種分子之間的相互作用，例如第一種和第二種生物分子之間的相互作用。例如，所述第一種和第二種分子之一可以是磁性標記的分子，并且所述第一種和第二種分子之一可以是與所述磁性標記分子特異性結(jié)合的分子。“定量測定”意指以數(shù)量方式例如以數(shù)值的方式表達目標結(jié)合動力學參數(shù)?！敖Y(jié)合動力學參數(shù)”意指可測量的結(jié)合動力學因子，其至少部分地定義給定分子相互作用并且可被用于定義其行為。目標結(jié)合動力學參數(shù)包括但不限于，結(jié)合速率常數(shù)(即，k_a、k_on)、解離速率常數(shù)(即，k_d、k_off)、擴散限制速率常數(shù)(即，k_M)、活化能(即，E_A)、傳輸參數(shù)如擴散率，等等。

根據(jù)上文所總結(jié)，本發(fā)明的方法可包含下列步驟：

制備與包含磁性標記的分子的分析混合物進行接觸的磁性傳感器裝置；

從磁性傳感器裝置中獲取實時信號；并且

由所述實時信號定量地確定分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)。

這些步驟均各自進行更為詳盡地描述。

制備與包含磁性標記的分子的分析混合物進行接觸的磁性傳感器裝置

所述方法的方面包括制備與包含磁性標記的分子的分析混合物進行接觸的磁性傳感器裝置。所述方法包括，制備磁性傳感器與包含目標結(jié)合相互作用的構(gòu)件分子(即，所述目標結(jié)合相互作用的結(jié)合對構(gòu)件)和磁性標記物的組合物(如，分析混合物)接觸的裝置或結(jié)構(gòu)，其中所述磁性標記物可以是所述目標結(jié)合相互作用的構(gòu)件分子之一的部分或結(jié)構(gòu)域，或是不同分子的組分，如，與所述目標結(jié)合相互作用的兩種構(gòu)件分子之一特異結(jié)合的第三種分子。在與所述磁性傳感器進行接觸的組合物或分析混合物中，所述磁性標記物可以與所述結(jié)合對構(gòu)件之一穩(wěn)定地結(jié)合例如共價或非共價結(jié)合以產(chǎn)生磁性標記的分子。如將下文進一步所描述的，例如在所述結(jié)合對構(gòu)件彼此何時接觸方面和或所述磁性傳感器方面、與裝置相關(guān)的所述結(jié)合對構(gòu)件的配置方面，制備與包含磁性標記的分子的分析混合物進行接觸的磁性傳感器裝置的步驟可包含多種不同的過程亞組合。

結(jié)合對

根據(jù)本文所述的方法，用于進行定量動力學分析的給定結(jié)合相互作用可由分子的結(jié)合對組成，諸如第一種和第二種生物分子。分子結(jié)合對可根據(jù)所述目標結(jié)合相互作用而廣為變動。目標結(jié)合相互作用包括所述結(jié)合對分子之間的任意相互作用，其中所述結(jié)合相互作用以所述分子結(jié)合對在所述結(jié)合相互作用的環(huán)境條件下所具有的特異性而進行。目標結(jié)合相互作用的實例包括但不限于：核酸雜交相互作用、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-核酸相互作用、酶-底物相互作用以及受體-配體相互作用如抗體-抗原相互作用和受體-激動劑或拮抗劑相互作用。

具有目標分子結(jié)合相互作用的分子的實例包括但不限于：生物聚合物和小分子，所述小分子可以是有機或無機小分子?！吧锞酆衔铩笔且环N或多種類型的重復單元的聚合物。生物聚合物可見于生物系統(tǒng)中(盡管它們可以通過合成而制備)并且可包含肽、聚核苷酸和多糖，以及這樣一些化合物，其包含氨基酸類似物或非氨基酸基團，或核苷酸類似物或非核苷酸基團或由以上這些所構(gòu)成。同樣，生物聚合物包括常規(guī)骨架被非天然存在的或合成的骨架所取代的聚核苷酸，并且包括一個或多個常規(guī)堿基被能夠參與沃森－克里克(Watson-Crick)型氫鍵相互作用的基團(天然的或合成的)所取代的核酸(或合成的或天然存在的類似物)。例如，“生物聚合物”可包括DNA(包括cDNA)、RNA、寡核苷酸和PNA以及根據(jù)美國專利第5,948,902號及其引用參考中的描述其它聚核苷酸?！吧飭误w”指能夠與相同的或其它生物單體連接以形成生物聚合物的單一單元(例如，具有兩個連接基團的單一氨基酸或核苷酸，所述連接基團中的一個或兩個可具有可去除的保護基團)。

本文所使用的術(shù)語“肽”在本文中指通過一個氨基酸的α-羧基基團與另一個基團的α-氨基基團之間的酰胺形成而產(chǎn)生的任意聚合物化合物。所述術(shù)語“寡肽”在本文中指具有少于約10個至20個殘基即氨基酸單體單元的肽。本文所使用的術(shù)語“多肽”在本文中指具有多于約10個至20個殘基的肽。本文使用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”指具有多于約50個殘基的特定序列的多肽并且包括D和L形式、經(jīng)修飾的形式等等。本文所使用的術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用。

本文所使用的術(shù)語“核酸”在本文中指由核苷酸構(gòu)成的聚合物，所述核苷酸的例子如脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或可與天然存在的核酸以序列特異性的方式雜交的合成制備的化合物(如，美國專利第5,948,902號及其引用參考中所述的PNA)，所述雜交方式類似于兩種天然存在的核酸的雜交，例如，可參與沃森－克里克堿基配對相互作用。核酸可為任意長度，如2個堿基或更長、10個堿基或更長、100個堿基或更長、500個堿基或更長、1000個堿基或更長，包括10,000個堿基或更長。本文使用的術(shù)語“聚核苷酸”指由長度一般多于約100個核苷酸的核苷酸單體構(gòu)成的單鏈或雙鏈聚合物。聚核苷酸包含單鏈或多鏈結(jié)構(gòu)，其中所述鏈中的一個或多個可以完全或可以不完全與另一個對齊。本文所使用的術(shù)語“核糖核酸”和“RNA”在本文中指由核糖核苷酸構(gòu)成的聚合物。本文所使用的術(shù)語“脫氧核糖核酸”和“DNA”在本文中指由脫氧核糖核苷酸構(gòu)成的聚合物。本文所使用的術(shù)語“寡核苷酸”在本文中表示單鏈核苷酸多聚體，其長約10個至約200個核苷酸，諸如長約25個至約175個核苷酸，包括長約50個至約160個核苷酸，如長度為150個核苷酸。

在一些情況下，所述分子結(jié)合對是配體和受體，其中給定的受體或配體可以是或可以不是生物聚合物。本文所使用的術(shù)語“配體”在本文中指能夠與目標化合物共價地或以其它化學方式進行結(jié)合的部分。配體可以是天然存在的或人造的。配體的實例包括但不限于，細胞膜受體的激動劑和拮抗劑、毒素和毒液、病毒表位、激素、阿片劑、甾體類、肽、酶底物、輔因子、藥物、血凝素、糖類、寡核苷酸、核酸、寡糖、蛋白質(zhì)等等。

本文所使用的術(shù)語“受體”在本文中指對配體具有親和性的部分。受體可以是天然存在的或人造的。它們可以其未改變的狀態(tài)或作為與其它物種的聚集體形式被使用。受體可共價地或非共價地、直接地或通過特異性結(jié)合物質(zhì)連接于結(jié)合構(gòu)件。受體的實例包括但不限于，抗體、細胞膜受體、與特異性抗原決定基具有反應性的單克隆抗體和抗血清、病毒、細胞、藥物、聚核苷酸、核酸、肽、輔因子、血凝素、糖類、多糖、細胞膜、細胞器等等。受體在本領(lǐng)域中有時被稱為抗配體。在本文使用術(shù)語受體時在含義上無差別。當兩個分子通過分子識別進行結(jié)合以形成復合體時，形成了“配體受體對”。

磁性傳感器裝置

目標磁性傳感器裝置是響應于與所述傳感器表面結(jié)合的磁性標記而產(chǎn)生電信號的裝置。目標磁性傳感器裝置包括但不限于磁阻傳感器裝置，包括巨磁阻(GMR)裝置。目標GMR裝置包括但不限于自旋閥檢測器，以及磁性隧道結(jié)(MTJ)檢測器。

自旋閥檢測器

在一些情況下，所述磁性傳感器是自旋閥檢測器。自旋閥檢測器是由非磁性層如銅間隔開的兩個鐵磁層的金屬多層薄膜結(jié)構(gòu)。一個鐵磁層稱為扎層，其磁化被釘扎于固定方向，而另一鐵磁層被稱為自由層，其磁化可在外加磁場下自由轉(zhuǎn)動。自旋閥的電阻取決于所述自由層的磁化對于所述扎層的磁化的相對取向。當所述兩個磁化方向平行時，所述電阻最低，當反向平行時，所述電阻最高。電阻的相對變化被稱為磁阻(MR)比率。在一些情況下，自旋閥的MR比率可在小磁場例如約100Oe中達到高于約10％。因此，自旋閥可以用作檢測結(jié)合于所述傳感器表面的磁性標記的分子的感應元件。

在某些實施方案中，自旋閥磁阻(MR)比率為約1％至約20％，諸如約3％至約15％，包括約5％至約12％。因此，在某些實施方案中，自旋閥可以以窄帶寬(即，約1Hz或更低)或使用鎖定檢測(lock-in detection)對約10nm大小的單一磁性標記物進行檢測。在這些情況下，通過狹化所述噪音帶寬甚至可為單納米顆粒檢測獲得充分的信噪比(SNR)。

自旋閥檢測器可使用面內(nèi)模式實施(參見，例如Li等,J.Appl.Phys.,93卷(10):7557(2003))。在其它實施方案中，當在所述檢測系統(tǒng)中可檢測到AC擾動場(tickling field)導致的電磁干擾(EMI)時可使用垂直模式。所述EMI信號傾向于以所述AC擾動場的頻率f為中心，因此其可通過在頻率2f下進行的鎖定檢測而基本被消除或降低。此外，在一些情況下，可以使用2橋電路(2-bridge circuit)來基本去除殘余EMI?？梢允褂镁哂刑幱趦蓚€不同頻率下的AC調(diào)制傳感電流和AC擾動場的其它信號采集和處理方法(例如S-J Han,H.Yu,B.Murmann,N.Pourmand和S.X.Wang,IEEE International Solid-State Circuits Conference(ISSCC)Dig.Tech.Papers,San Francisco Marriott,CA,USA，2007年2月11-15)。

在某些實施方案中，除所述自旋閥自身的幾何特征和偏置磁場之外，來自所述自旋閥檢測器的由所述磁性標記物所引起的信號還依賴于所述磁性標記物和所述自旋閥的自由層之間的距離。由單磁性標記物產(chǎn)生的檢測器電壓信號隨著所述顆粒中心與所述自旋閥自由層的中平面之間的距離的增加而降低。

在某些實施方案中，自旋閥的自由層位于扎層的頂部從而為磁性標記物的檢測提供便利，這是因為來自磁性顆粒的感應磁場隨著所述傳感器和該顆粒之間的距離而單調(diào)遞減。對包括保護所述自旋閥的保護層的厚度在內(nèi)的所述磁性標記物和所述自由層的頂面之間距離的最小化可以為磁性顆粒的檢測提供便利。

在某些實施方案中，自旋閥傳感器可以包括在一個或多個檢測器表面上的鈍化層。在一些實施方案中，檢測器結(jié)合了鈍化薄(例如，60nm或更薄，諸如50nm或更薄，包括40nm或更薄、30nm或更薄、20nm或更薄或者10nm或更薄)層(例如，在檢測器被用于具有50nm或更低的平均直徑的磁性納米顆粒標簽的實施方案中)。在某些實施方案中，可使用較大的微米尺度的磁性顆粒。在一些情況下，適用于本文公開的檢測器的鈍化薄層可具有介于約1nm與約10nm之間的厚度，諸如介于約1nm與約5nm之間的厚度，包括介于約1nm與約3nm之間的厚度。在某些實施方案中，適用于本文公開的檢測器的鈍化薄層可具有介于約10nm與約50nm之間的厚度，諸如介于約20nm與約40nm之間的厚度，包括介于約25nm與約35nm之間的厚度。鈍化層可包括但不限于，Ta、Au或它們的氧化物、它們的組合，等等。

涉及自旋閥檢測器及它們的應用的方案的進一步細節(jié)被提供于美國專利公開號第2005/0100930號和第2009/0104707號；其公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。

磁性隧道結(jié)檢測器

在某些實施方案中，所述磁性傳感器是磁性隧道結(jié)(MTJ)檢測器。MTJ檢測器以類似于自旋閥檢測器的方式構(gòu)建，區(qū)別在于磁性間隔層被替換成絕緣層(如，絕緣隧道阻擋層)如氧化鋁或MgO，通過該絕緣層所述感應電流垂直于薄膜平面流動。兩鐵磁電極之間的電子隧穿由兩鐵磁電極的相對磁化控制，即在其平行之時隧穿電流高并且在其反向平行時隧穿電流低。在某些實施方案中，MTJ檢測器包含底電極、布置在隧道阻擋層任一側(cè)的磁性多層以及頂電極。在一些情況下，MTJ檢測器具有超過200％的磁阻比率(S.Ikeda,J.Hayakawa,Y.M.Lee,F.Matsukura,Y.Ohno,T.Hanyu和H.Ohno,IEEE Transactions on Electron Devices,卷54,第5期,991-1001(2007))和大裝置磁阻，其產(chǎn)生了較高的輸出電壓信號。

在某些實施方案中，MTJ檢測器具有雙層頂電極。第一層可以是金屬層(如，金層)，其中該層可在某些情況下具有60nm或更低的厚度，諸如50nm或更低，包括40nm或更低、30nm或更低、20nm或更低或者10nm或更低。第二層可以是導電金屬，例如銅、鋁、鈀、鈀合金、鈀氧化物、鉑、鉑合金、鉑氧化物、釕、釕合金、氧化釕、銀、銀合金、銀氧化物、錫、錫合金、錫氧化物、鈦、鈦合金、鈦氧化物、這些物質(zhì)的組合，等等。在一些情況下，第二層的孔略小于MTJ的大小。在某些實施方案中，所述傳感器被配置為在使用期間使結(jié)合的磁性標記物與所述自由磁性層的頂表面之間的距離介于5nm與100nm之間，諸如介于5nm與50nm之間，包括介于5nm與30nm之間，諸如介于5nm與20nm之間，包括介于5nm與10nm之間。在一些情況下，這種布置為降低或基本防止頂電極中的電流聚集提供便利(參見，例如van de Veerdonk,R.J.M.等,Appl.Phys.Lett.,71:2839(1997))，該現(xiàn)象可在僅使用薄金電極的情況下出現(xiàn)。

除所述感應電流垂直于所述薄膜平面流動之外，MTJ檢測器可與自旋閥檢測器類似地運行，以所述外加調(diào)制場的面內(nèi)模式或垂直模式均可。根據(jù)上文涉及自旋閥檢測器的討論，在某些實施方案中，外加調(diào)制場的垂直模式可被用于降低EMI，并且類似地，薄鈍化層也適用于MTJ檢測器。此外，MTJ檢測器上的薄金第一頂電極還可為電導、鈍化以及特定生物分子探針的吸附提供便利。

在某些實施方案中，在相同的檢測器寬度和顆粒-檢測器距離下，MTJ檢測器可給出比自旋閥檢測器更大的信號。例如，對于具有0.2μm乘0.2μm結(jié)面積和1kOhm-μm²的電阻-面積乘積，以250％的MR在250mV的偏壓和H_b＝35Oe，H_t＝100Oe rms下運行的MTJ檢測器，來自直徑11nm的中心距離所述自由層面心為35nm的單Co納米顆粒的電壓信號可為約200μV。在一些情況下，該電壓比類似大小的自旋閥檢測器的電壓高出一個或更多的數(shù)量級。

涉及MTJ檢測器及它們的應用的方案的進一步細節(jié)被提供于美國專利公開號第2005/0100930號和第2009/0104707號；其公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。

磁性傳感器裝置設置

磁性傳感器裝置可具有多種不同的設置，例如對傳感器的設置，無論傳感器被設置用于分批還是穿流應用等等。同樣，提供所述裝置的磁性傳感器以與目標分子結(jié)合相互作用的結(jié)合構(gòu)件和磁性標記物的混合物任何設置均可被使用。因此，磁性傳感器裝置的設置可包括但不限于：井設置(其中所述傳感器與諸如井這樣的液體盛容結(jié)構(gòu)的底部或壁連接)；穿流設置，例如，其中所述傳感器與具有流體輸入和輸出的液流池(flow cell)的壁連接；等等。

在某些實施方案中，本發(fā)明的磁性傳感器裝置包含基板表面，其在所述基板表面上顯示兩種或更多種不同磁性傳感器。在某些實施方案中，所述磁性傳感器包含具有磁性傳感器陣列的基板表面。

“陣列”包含可尋址區(qū)域例如空間可尋址區(qū)域的任何二維或基本上二維(以及三維)的布置。當在所述陣列上具有定位于特定預設位置(即，地址)的多個傳感器時，陣列是“可尋址的”。陣列特征(即，傳感器)可通過中間間隔而隔離。任意給定的基板可攜帶設置于所述基板前表面的一個、兩個、四個或更多個陣列。根據(jù)用途，任何或全部所述陣列可感應相同或彼此不同的目標并且各陣列可包含多個不同的磁性傳感器。陣列可包含一個或多個，包括兩個或更多個、四個或更多個、8個或更多個、10個或更多個、50個或更多個，或者100個或更多個、1000個或更多個、10,000個或更多個或者100,000個或更多個磁性傳感器。例如，64個磁性傳感器可被布置到8×8的陣列中。在某些實施方案中，所述磁性傳感器可被布置到陣列中，所述陣列具有10cm²或更小的面積，或者5cm²或更小的面積，例如1cm²或更小的面積，包括50mm²或更小的面積、20mm²或更小的面積，諸如10mm²或更小的面積，或者甚至更小的面積。例如，磁性傳感器可具有介于10μm×10μm與200μm×200μm之間的面積，包括100μm×100μm或更低的面積，諸如90μm×910μm或更低，例如50μm×50μm或更低。

在某些實施方案中，磁性傳感器可包括多個線性磁阻段。例如，磁性傳感器可包括4個或更多個，例如8個或更多個，包括12個或更多個，或者16個或更多個，例如32個或更多個，例如64個或更多個，或者72個或更多個，或者128個或更多個線性磁阻段。所述磁阻段可各自寬度為1000nm或更低，例如寬度為750nm或更低，或者寬度為500nm或更低，例如寬度為250nm或更低。在一些情況下，所述磁阻段可各自厚度為50nm或更低，例如厚度為40nm或更低，包括厚度為30nm或更低，或者厚度為20nm或更低，例如厚度為10nm或更低。所述磁阻段可各自長度為1000nm或更低，或者長度為750nm或更低，或者長度為500nm或更低，或者長度為250nm或更低，例如長度為100nm或更低，或者長度為50nm或更低。

所述磁阻段可以串聯(lián)方式連在一起，或者所述磁阻段可以并聯(lián)方式連在一起。在一些情況下，所述磁阻段以串聯(lián)和并聯(lián)的方式連接。在這些情況下，兩個或更多個磁阻段可以并聯(lián)方式連在一起，并且兩組或更多組這些并聯(lián)連接的磁阻段可以串聯(lián)方式連在一起。圖12中示出了包含以串聯(lián)和并聯(lián)方式連接的磁阻段的磁性傳感器的實例。

在某些實施方案中，給定裝置的磁性傳感器中的至少一些或全部具有在與傳感器表面穩(wěn)定結(jié)合的結(jié)合對構(gòu)件。所述結(jié)合對構(gòu)件可根據(jù)所實施的特定分析的性質(zhì)而有所不同。同樣，所述結(jié)合對構(gòu)件可以是與目標分子結(jié)合相互作用中的分子特異性地結(jié)合的捕獲探針，或是參與目標分子結(jié)合相互作用的分子，例如與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合的分子?！胺€(wěn)定結(jié)合”指的是在應用條件下所述結(jié)合對構(gòu)件和傳感器表面以超過瞬時的時間保持相對于彼此的空間位置，所述應用條件的例子如所述分析條件。同樣，所述結(jié)合對構(gòu)件和傳感器表面可非共價或共價地彼此穩(wěn)定結(jié)合。非共價結(jié)合的實例包括非特異性吸附、基于靜電(如，離子、離子對相互作用)、疏水相互作用、氫鍵相互作用的結(jié)合、通過與所述支持物表面共價連接的特異性結(jié)合對構(gòu)件所進行的特異性結(jié)合，等等。共價結(jié)合的實例包括結(jié)合對構(gòu)件與存在于所述傳感器表面的官能團如-OH之間所形成的共價鍵，其中所述官能團可以是天然存在的或是作為被引入的連接群體中的一員而存在。因此，所述結(jié)合對構(gòu)件可被吸附、物理吸附、化學吸附或共價連接于所述磁性傳感器表面。

在給定裝置包含兩個或更多個磁性傳感器的情況下，各傳感器可具有與其表面結(jié)合的相同或不同的結(jié)合對構(gòu)件。因此，這些裝置的傳感器表面可存在與所述磁性標記的分子結(jié)合的不同的捕獲探針或分子，從而使各個磁性傳感器特異性地結(jié)合于不同的分子。這類裝置還可包含不具有任何結(jié)合對構(gòu)件的傳感器(例如，在這些空白傳感器可作為參比或?qū)φ针娦盘杹碓吹那闆r下)。

在多傳感器裝置中，所述磁性傳感器之間可存在不攜帶任何分析物特異性探針的區(qū)域。當這些傳感器間區(qū)域存在時，其可具有各種大小和設置。在一些情況下，這些傳感器間區(qū)域可被配置為降低或防止不同傳感器間的流體運動，例如在所述傳感器間區(qū)域包含疏水材料和/或流體屏障(諸如屏壁)的情況下。

在某些實施方案中，所述裝置的基板，例如可攜帶不同傳感器的一個或多個陣列的基板，一般被成形為矩形固體(盡管可能是其它形狀)，其長度為1mm或更大和150mm或更小，諸如1mm或更大和100mm或更小，例如50mm或更小、10mm或更小；寬度為1mm或更大和150mm或更小，諸如100mm或更小，包括50mm或更小，或者10mm或更?。灰约昂穸葹?.01mm或更大和5.0mm或更小，例如0.1mm或更大和2mm或更小，包括0.2mm或更大和1.5mm或更小，例如0.5mm或更大和1.5mm或更小。

可存在電子通訊元件，例如導電體，其被配置為將傳感器與“芯片外”組件電耦接，所述“芯片外”組件諸如裝置組件，例如處理器、顯示器，等等。

根據(jù)下文更為詳盡的描述，給定的磁性傳感器裝置除如上文所述的傳感器結(jié)構(gòu)(如，陣列)外可包含多種組件。另外的裝置組件可包括但不限于，信號處理組件、數(shù)據(jù)顯示組件(如，圖形用戶界面)；數(shù)據(jù)輸入和輸出裝置、電源、流體處理組件等等。

磁性標記物

在所述方法的實施方案中，可使用任意便利的磁性標記物。磁性標記物是在與磁性傳感器充分結(jié)合時可通過所述磁性傳感器檢測出并且導致所述磁性傳感器輸出信號的標記部分。在標記物的中心與所述傳感器的表面之間的距離為200nm或更近，諸如100nm或更近，包括50nm或更近的情況下，目標磁性標記物可充分地結(jié)合于磁性傳感器。

在某些實施方案中，所述磁性標記物是納米顆粒。在特定實施方案的實施中有用的納米顆粒是磁性(如，鐵磁性)膠體材料和顆粒。所述磁性納米顆?？梢允浅槾鸥叽啪卮判约{米顆粒，或者包含兩層或更多層反鐵磁性偶聯(lián)的高磁矩鐵磁物的合成反鐵磁納米顆粒。這兩種類型的納米顆粒均在缺乏磁場的情況下表現(xiàn)出“非磁性”并且基本不聚團。根據(jù)某些實施方案，適用的可磁化納米顆粒包含一種或多種材料，例如但不限于，順磁、超順磁、鐵磁和亞鐵磁材料，以及它們的組合。

在某些實施方案中，所述磁性納米顆粒(本文亦稱為磁性標簽)具有低殘磁以使其在溶液中不聚團。具有低殘磁的磁性納米顆粒的實例包括超順磁顆粒和反鐵磁顆粒。在某些情況下，所述磁性標簽在約100Oe的磁場下具有可檢測的磁矩。在一些情況下，所述磁性標簽的大小與所述靶生物分子的大小是可比較的，從而使所述磁性標簽不干擾目標分子間的結(jié)合相互作用。在某些實施方案中，所述磁性標簽在形狀上是基本均一的并且在生物環(huán)境中具有化學穩(wěn)定性，其可輔助它們在分析條件下的應用。在一些情況下，所述磁性標簽是生物相容的，即水可溶并且經(jīng)功能化從而使它們易于結(jié)合于目標生物分子，例如特異性結(jié)合于靶分析物的受體。

在某些實施方案中，所述磁性納米顆粒是高磁矩磁性納米顆粒，諸如Co、Fe或CoFe納米晶體，其在室溫下可以是超順磁的。所述磁性納米顆?？赏ㄟ^化學方法進行制備，例如但不限于，適當溶液中的鹽還原或化合物分解。這些磁性納米顆粒的實例包括但不限于S.Sun和C.B.Murray,J.Appl.Phys.,85:4325(1999)；C.B.Murray等,MRS Bulletin,26:985(2001)；以及S.Sun,H.Zeng,D.B.Robinson,S.Raoux,P.M.Rice,S.X.Wang和G.Li,J.Am.Chem.Soc.,126,273-279(2004)所描述的納米顆粒。在某些實施方案中，所述磁性納米顆?？梢允芸氐拇笮?如，約5-12nm)被合成，具有單分散性并且使用油酸進行穩(wěn)定化。適用于本文的磁性納米顆粒包括但不限于，Co、Co合金、鐵氧體、氮化鈷、氧化鈷、Co-Pd、Co-Pt、鐵、鐵合金、Fe-Au、Fe-Cr、Fe-N、Fe₃O₄、Fe-Pd、Fe-Pt、Fe-Zr-Nb-B、Mn-N、Nd-Fe-B、Nd-Fe-B-Nb-Cu、Ni、Ni合金，等等。在一些實施方案中，金薄層被鍍在磁性核芯之上，或者聚L-賴氨酸包埋的玻璃表面可被連接于磁性核芯。適當?shù)募{米顆?？少徸?，例如Nanoprobes,Inc.(Northbrook,IL)和Reade Advanced Materials(Providence,RI)。

在一些情況下，磁性納米標簽可通過物理方法而不是化學方法來制備(參見，例如W.Hu,R.J.Wilson,A.Koh,A.Fu,A.Z.Faranesh,C.M.Earhart,S.J.Osterfeld,S.-J.Han,L.Xu,S.Guccione,R.Sinclair和S.X.Wang,Advanced Materials,20,1479–1483(2008))，并且其適用于對待檢測的所述靶生物分子進行標記。所述磁性標簽可包含兩個或更多個鐵磁層，諸如Fe_xCo_1-x，其中x介于0.5與0.7之間，或者如基于Fe_xCo_1-x的合金。在一些情況下，F(xiàn)e_xCo_1-x具有24.5k高斯的飽和磁化。這些鐵磁層可被非磁性間隔層所隔離，所述非磁性間隔層諸如Ru、Cr、Au或其合金。在某些情況下，所述間隔層包含以反鐵磁方式耦接的鐵磁層，從而使所產(chǎn)生的顆粒的凈殘磁為零或接近于零。在某些實施方案中，所述反鐵磁結(jié)合可通過RKKY交換相互作用(參見，例如S.S.P.Parkin等,Phys.Rev.Lett.,64(19):2304(1990))和靜磁相互作用(J.C.Slonczewski等,IEEE Trans.Magn.,24(3):2045(1988))而實現(xiàn)。在一些情況下，所述反鐵磁耦合強度使得所述顆?？杀?00Oe的外部磁場飽和(所有層的磁化變成平行)。在一些情況下，所述反鐵磁耦合強度依賴于所述間隔層的層厚和合金組成。

在某些實施方案中，為促進所述納米顆粒的生物偶聯(lián)，金覆蓋(或功能類似物或等同材料的覆蓋)被層疊于反鐵磁材料層之上從而使所述納米顆?？梢酝ㄟ^金-巰基或其它便利的連接而被偶聯(lián)于生物分子。表面活性劑可被用于所述納米顆粒，從而使所述納米顆?？梢猿蔀樗苄缘?。就化學穩(wěn)定性而言，所述納米顆粒的邊緣還可以用Au或其它惰性層鈍化。

任何便利的方案均可被用于制備本文所述的納米顆粒。例如，所述納米顆粒的層可包括沉積在具有基本光滑表面的基板或釋放層上的納米尺度的鐵磁層和間隔層。在一些情況下，通過壓印(imprinting)、蝕刻、自組裝等等可形成遮蔽層(mask layer)。隨后，可將所述遮蔽層和其它的不需要的層去除并完全清除掉。隨后可去除所述釋放層，升出為所述遮蔽層的負像(negative image)的納米顆粒。所述顆?？呻S后與表面活性劑和生物分子接觸。在一些情況下，所述基板可在完全清除和進行化學機械拋光(CMP)后重復使用。

在其它的實施方案中，所述納米顆?？梢允褂孟麥p制備法(substractive fabrication method)進行制備。在該情況下，所述層被直接沉積在釋放層之上并隨后沉積遮蔽層。通過所述遮蔽層蝕刻所述層并且最終從所述基板上釋放。這些納米顆粒產(chǎn)生于所述遮蔽層的正像(positive image)，其與在所述添加制備法中情況相反。

在某些實施方案中，適用于本發(fā)明的磁性納米顆粒的大小與目標分子結(jié)合相互作用的生物分子的大小是可比較的，從而使所述納米顆粒不干擾目標結(jié)合相互作用。因此，在一些實施方案中所述磁性納米顆粒的大小為亞微米尺度，例如介于5nm與250nm之間(平均直徑)，諸如介于5nm與150nm之間，包括介于5nm與20nm之間。例如，具有5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm和300nm的平均直徑的磁性納米顆粒以及具有介于這些數(shù)值任意二者之間的平均直徑的納米顆粒適用于本文。此外，除球形外，適用于本文的磁性納米顆?？梢员怀尚螢槠瑺?、棒狀、線圈、纖維等等。

在一些實施方案中，所述磁性標記物具膠體穩(wěn)定性，例如，納米顆粒組合物可以穩(wěn)定膠體的形式存在。膠體穩(wěn)定指的是所述納米顆粒被均勻分散于溶液之中從而使所述納米顆?；静痪蹐F。在某些實施方案中，為防止聚簇，所述納米顆粒在零外加場下可不具有凈磁矩(或具極小磁矩)。所有大小的反鐵磁顆粒在零場下均可具零磁矩。與之相反，對于鐵磁顆粒，其大小可低于“超順磁極限”，其在某些情況下是約20nm或更低，諸如約15nm或更低，包括約10nm或更低。

在某些實施方案中，可使用大晶圓(wafer)和標準真空薄膜沉積工藝而大量制備所述合成納米顆粒。例如，使用6英寸晶圓，假定各顆粒在所述晶圓上占據(jù)60nm乘60nm的方形的情況下，可在約5×10¹²顆粒每次運行的速度下制備30-nm直徑的納米顆粒。

在一些情況下，給定的目標結(jié)合相互作用的分子和磁性標記物被穩(wěn)定地結(jié)合于彼此?！胺€(wěn)定結(jié)合”指的是在應用條件如分析條件下所述生物分子和磁性標記物以超過瞬時的時間保持將相對于彼此的空間位置。同樣，所述生物分子和磁性標記物可非共價或共價地彼此穩(wěn)定結(jié)合。非共價結(jié)合的實例包括非特異性吸附、基于靜電(如，離子、離子對相互作用)、疏水相互作用、氫鍵相互作用的結(jié)合、通過與所述支持物表面共價連接的特異性結(jié)合對構(gòu)件所進行的特異性結(jié)合，等等。共價結(jié)合的實例包括所述生物分子與存在于所述標記物表面的功能基團如-OH之間所形成的共價鍵，其中所述功能基團可以是天然存在的或是以引入的連接基團的構(gòu)件的形式存在。

分析混合物制備

可使用任意數(shù)量的不同方案制造包含與分析混合物接觸的磁性傳感器的磁性傳感器裝置，所述分析混合物包含磁性標記的分子。例如，與所述磁性標記的分子特異性結(jié)合的第一種分子可被結(jié)合于所述傳感器表面的捕獲探針，并且隨后與磁性標記的分子(如，可被磁性標記的第二種分子)接觸。在這些情況下的方法可包括提供具有磁性傳感器的磁性傳感器裝置，所述磁性傳感器展示出與所述第一種分子特異結(jié)合的捕獲探針，所述第一種分析還與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合；并且隨后使所述磁性傳感器與所述第一種分子和所述磁性標記的分子接觸。所述接觸可包含依次地向所述磁性傳感器涂覆第一種分子，所述第一種分子與表面結(jié)合并且能夠與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合，并且隨后涂覆所述磁性標記的分子。

或者，可以在與傳感器接觸之前將與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合的第一種分子和所述磁性標記的分子合并以形成復合體，并且可使所產(chǎn)生的復合體與所述傳感器上的捕獲探針結(jié)合(如，在所述第一種分子和所述捕獲探針之間的結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學是研究目標的情況下)。在這些情況下，所述接觸包含制備反應混合物，所述混合物包含與所述磁性標記的分子特異性結(jié)合的第一種分子以及所述磁性標記的分子，并且隨后將所述反應混合物涂覆于所述磁性傳感器。

在另一個實施方案中，與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合的第一種分子被首先定位于所述傳感器上，并且隨后與磁性標記的第二種分子接觸。在這些情況下，所述方法包括提供具有磁性傳感器的磁性傳感器裝置，所述磁性傳感器展示出所述第一種分子(無中間捕獲探針)，并且隨后使所述磁性傳感器與磁性標記的分子接觸。

圖1(a)和1(b)提供了可分別被應用于對抗體/分析物相互作用和核酸雜交相互作用的結(jié)合動力學分析的分析方案的示意圖。在圖1(a)中，所用的方案是夾心分析方案，該方案中與GMR傳感器表面穩(wěn)定結(jié)合的捕獲抗體被結(jié)合于分析物，所述分析物隨后被結(jié)合于與磁性標簽相連接的檢測抗體。在圖1(b)中，所用的方案是DNA夾心分析，該方案中捕獲DNA被結(jié)合于GMR傳感器表面，靶DNA與所述捕獲DNA雜交，并且結(jié)合于磁性標簽的檢測DNA與所述靶DNA雜交。在制備根據(jù)圖1(a)和1(b)所示的方案的裝置中，所關(guān)注的可以是所述捕獲結(jié)合構(gòu)件(如，捕獲抗體或捕獲DNA)和所述靶構(gòu)件(如，分析物或靶DNA)之間的相互作用的結(jié)合動力學。在這些實施方案中，所述靶和標記的構(gòu)件被首先在結(jié)合條件下彼此接觸，并且所產(chǎn)生的復合體與所述傳感器表面接觸。或者，在制備根據(jù)圖1(a)和1(b)所示的方案的裝置中，所關(guān)注的可以是標記的結(jié)合構(gòu)件(如，標記的抗體或標記的DNA)和所述靶構(gòu)件(如，分析物或靶DNA)之間的相互作用的結(jié)合動力學。在這些實施方案中，所述靶和捕獲構(gòu)件首先在結(jié)合條件下彼此接觸，并且所產(chǎn)生的結(jié)合于傳感器表面的復合體與標記的構(gòu)件接觸。

上述接觸(包括涂覆)步驟在可發(fā)生目標結(jié)合相互作用的條件下進行。盡管接觸的溫度可有所變化，但在一些情況下所述溫度在1℃至95℃的范圍，諸如5℃至60℃的范圍，并且包括20℃至40℃的范圍。所述分析的各種組分可存在與水性介質(zhì)中，所述介質(zhì)可包含或不包含其它的組分，諸如鹽、緩沖劑，等等。在一些情況下，接觸在嚴苛條件下進行。嚴苛條件特征可在于比所述探針靶二聯(lián)體的融解溫度低15℃至35℃如20℃至30℃的溫度范圍，所述融解溫度取決于多種參數(shù)，例如，溫度、緩沖組合物、探針和靶的大小、探針和靶的濃度，等等。同樣地，所述雜交的溫度可在約55℃至70℃的范圍，通常在約60℃至68℃的范圍。在變性劑存在的情況下，所述溫度可在約35℃至約45℃的范圍，通常在37℃至42℃的范圍。嚴苛雜交條件特征可在于存在雜交緩沖液，其中所述緩沖液特征在于以下的特征中的一個或多個：(a)具有高鹽濃度，如3至6×SSC(或具有類似濃度的其它鹽類)；(b)去污劑的存在，諸如SDS(0.1至20％)、Triton×100(0.01至1％)、monidet NP40(0.01至5％)等等；(c)其它添加劑，如EDTA(如，0.1至1μM)、四甲基氯化銨；(d)加速劑，如PEG、硫酸葡聚糖(5至10％)、CTAB、SDS等等；(e)變性劑，如甲酰胺、脲等；等等。嚴苛條件是在其中嚴苛性與上文所述的特定條件至少相同的條件。

與傳感器表面接觸的樣品可以是簡單樣品或復雜樣品。“單樣品”指的是包含所述結(jié)合相互作用的一個或多個構(gòu)件的樣品并且除所述溶劑之外的其它分子種類即使有也是少數(shù)的。“復雜樣品”指的是包含目標結(jié)合相互作用的一個或多個構(gòu)件并且還包含眾多不感興趣的不同蛋白質(zhì)或其它分子的樣品。在某些實施方案中，所述復雜樣品是血樣，其為血液或其級分，例如血清。在某些實施方案中，所述復雜樣品是血清樣品。在某些實施方案中，在本發(fā)明的方法中進行分析的復雜樣品是包含10種或更多種，諸如20種或更多種，包括100種或更多種，例如10³種或更多種、10⁴種或更多種(諸如15,000種；20,000種甚或25,000種或更多)相區(qū)分的(即，不同的)分子實體的復合樣品，所述分子實體在分子結(jié)構(gòu)方面相互不同。

從所述磁性傳感器中獲取實時信號

在制備包含與分析混合物(所述分析混合物包含目標結(jié)合相互作用的結(jié)合構(gòu)件和磁性標記物，例如根據(jù)上文所述)接觸的磁性傳感器的裝置之后，所述方法的方面包括通過所述磁性傳感器獲取實時信號。同樣地，某些實施方案包括通過所述裝置獲取實時信號。因此，可觀測到與目標結(jié)合相互作用的發(fā)生相關(guān)聯(lián)的信號的實時演化。所述實時信號由給定的目標時間期間所獲得的兩個或更多個數(shù)據(jù)點組成，其中在某些實施方案中所獲得的信號是在給定的目標時間期間連續(xù)地獲得的數(shù)據(jù)點的連續(xù)集合(例如，以軌跡的形式)。目標時間期間可變動，其在一些情況下在1秒至10小時的范圍，諸如在10秒至1小時的范圍并且包括1分鐘至15分鐘的范圍。所述信號中的數(shù)據(jù)點的數(shù)量也可變動，其中在一些情況下，數(shù)據(jù)點的數(shù)量足以在所述實時信號的時間段上提供數(shù)據(jù)的連續(xù)延伸(continuous stretch)。

在一些實施方案中，當所述分析系統(tǒng)處于所述“濕”條件下時觀測所述信號，即，在包含分析成分(例如，所述結(jié)合構(gòu)件和磁性標記物)的溶液仍處于與所述傳感器表面的接觸的情況下。由此，無須洗去全部非結(jié)合或無關(guān)分子。該“濕”檢測是可行的，這是因為所述磁性標簽納米顆粒(例如，如本文它處所述的具有150nm或更小的直徑)所產(chǎn)生的磁場隨著與所述納米顆粒的距離的增加而迅速降低。因此，與所捕獲的結(jié)合構(gòu)件結(jié)合的標記物的傳感器處的磁場超過了來自溶液中的未結(jié)合的磁性標記物的磁場，所述非結(jié)合磁性標記物不僅與所述檢測器的距離較遠而且處于布朗運動之中。本文所使用的術(shù)語“鄰近檢測”指的是所結(jié)合的納米顆粒的傳感器的主導性。根據(jù)所述“鄰近檢測”設計，處于所述傳感器表面的特異結(jié)合的磁性標記的偶聯(lián)物可在不洗去溶液中的非特異磁性納米標簽的情況下被定量。

對于給定的目標結(jié)合相互作用，分析可包含獲得單結(jié)合對構(gòu)件濃度或多個結(jié)合對濃度的實時信號，諸如2個或更多個、3個或更多個、5個或更多個、10個或更多個、100個或更多個、甚或1,000個或更多個不同的濃度。根據(jù)需要，給定的分析可使具有相同捕獲探針濃度的相同傳感器與多個不同的結(jié)合對構(gòu)件濃度接觸，或以相反的方式進行接觸，或以捕獲探針和結(jié)合對構(gòu)件的不同濃度組合進行接觸。

通過所述實時信號定量確定結(jié)合動力學參數(shù)

根據(jù)上文所總結(jié)，在獲得所述實時信號之后，所述方法可包括通過所述實時信號定量確定分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)。換言之，所述實時信號被用于定量確定所述目標結(jié)合動力學參數(shù)，從而目標結(jié)合動力學參數(shù)獲得自所述實時信號。

在一些情況下，所述目標結(jié)合動力學參數(shù)通過使用擬合算法處理所述實時信號而進行定量確定。擬合算法指的是一套法則，其通過將方程與實時信號或獲自給定分析信號擬合，所述給定分析例如上文所述分析，從而確定目標結(jié)合動力學參數(shù)?？墒褂萌我獗憷臄M合算法。

在一些實施方案中，二室模型被用于擬合所述實時數(shù)據(jù)。所關(guān)注的二室模型假定溶液中的磁性標記的結(jié)合分子通過傳輸過程(擴散或流動)接近表面結(jié)合的結(jié)合配對物如被捕獲的第一種生物分子，并且隨后通過結(jié)合和解離的化學過程與表面結(jié)合的結(jié)合配對物結(jié)合。在這些情況下，模型中的二室是主體區(qū)室和表面區(qū)室。圖2提供了一些實施方案中使用的二室反應-擴散模型的示意圖，其中標記的分子(以標記的抗體演示)通過傳輸過程向所述傳感器表面移動并且隨后通過結(jié)合流動而結(jié)合和釋放。在一些情況下，磁性標記分子的濃度被假定在各個區(qū)室中是均一的并且僅僅處于所述表面區(qū)室(C_s)中的磁性標記的分子將與所述傳感器表面的結(jié)合位點反應并且處于所述主體區(qū)室(C₀)中的磁性標記的分子將向所述表面進行擴散。在一些情況下，所使用的二室模型并不假定發(fā)生“快速混合”。

該系統(tǒng)的支配方程寫作：

$\frac{{\mathrm{dC}}_s}{dt}=k_M(C_0-C_s)-k_a{C}_s(B_{max}-B)+k_{d}B---\left(1\right)$

$\frac{dB}{dt}=k_a{C}_s(B_{\max }-B)-k_{d}B---\left(2\right)$

其邊界條件為：

C_s|_t＝0＝C₀ (3)

B|_t＝0＝0 (4)

其中B是傳感器表面上所結(jié)合的第一/第二生物分子偶聯(lián)物的濃度，B_max是初始有效受體濃度，k_a(＝k_on)是結(jié)合速率常數(shù)，k_d(＝k_off)是解離速率常數(shù)，并且k_M是擴散限制的速率常數(shù)。由于對此常微分方程組無解析解，因此使用了數(shù)值擬合算法。

上述第一個方程被用于描述所述表面區(qū)室中標記的第二種分子的濃度C_s。該方程假定標記的第二種分子通過來自所述主體區(qū)室的擴散向所述表面區(qū)室的入流減去第二種分子通過與所述受體的結(jié)合和解離的凈出流等于C_s增加的速度。在這些實施方案中擴散是唯一的物質(zhì)傳輸機制，其中在結(jié)合過程期間整個體系被靜置。

第二個方式被用于描述傳感器表面結(jié)合的第一/第二生物分子偶聯(lián)物濃度B。該方程假定標記的第二種生物分子通過結(jié)合而產(chǎn)生的入流減去解離等于B增加的速度。

最后，所述實時信號被假定與B成正比，即

V＝gB，V_max＝gB_max. (5)

存在五個未知參數(shù)，其將是擬合參數(shù)k_a、k_d、k_M、g和V_max。在這五個擬合參數(shù)中，k_a、k_d、k_M和g被假定對于在一個分析中具有相同捕獲、第一和第二生物分子的所有傳感器是相同的，并且因此被稱為全局擬合參數(shù)；V_max對于各個傳感器是不同的，這是因為表面結(jié)合的結(jié)合配對物如固定化于所述傳感器表面的捕獲分子、第一種生物分子的濃度是難以被精確地控制的。即使在所有傳感器均位于相同的芯片并且受到相同處理的分析中，在B_max中都會存在某些差別，并且因此在V_max中會存在某些差別。

在一些情況下，所述二室模型是描述于D.Myszka等,Anal.Biochem.(1998)265:326-330中的二室模型的修正，例如其中所述模型被修改以適合于上述參數(shù)。

在需要的情況下，固定化的結(jié)合配對物的濃度可在不同傳感器中被特意地變動，因此可獲得并分析具有不同形狀的信號曲線，例如，在被稱為全局分析或全局擬合的方案中進行。在這些情況下，所述二室結(jié)合模型(如，根據(jù)上文所述的模型)被同時擬合于使用不同分析物濃度C(和/或不同水平的表面衍生化B_max)而獲得的多種實時信號。本領(lǐng)域中被稱為“全局擬合”并且基于所述實時數(shù)據(jù)，這種全局擬合確定了單全局k_a或k_d是否將提供對全部數(shù)據(jù)的良好擬合。完成的擬合的結(jié)果可以圖形的方式被提供給以操作人員(operator)，其將所擬合的曲線重疊于所述原始實時數(shù)據(jù)曲線之上進行顯示。

在需要的情況下，所述擬合的接近度還可通過卡方(X²)值的方式給出，其為一種標準的統(tǒng)計學度量。在一些情況下，當所述卡方值與實驗中的噪音處于相同的量級之下被認為給出了良好的擬合?？杀环Q為R²的測定系數(shù)，也可被用作為擬合良好度的指標。R²可被如下定義：如果所述信號曲線為s_i并且所述擬合曲線為f_i,i＝1，2，……n，當信號曲線中具有n個點時，則

$R^2=1-\frac{{\mathrm{SS}}_{err}}{{\mathrm{SS}}_{tot}}---\left(6\right)$

其中是所述擬合的方差之和，并且是所述信號的總變差(total variations)。

如果存在來自一個分析的N條信號曲線，則各個信號曲線將具有R²值，應對1-R²的平均值進行最小化以獲得對全部N條曲線的最佳擬合。

在一些情況下，還可提供“殘差圖”，所述殘差圖給出了所述實驗數(shù)據(jù)偏離被擬合的曲線的程度的圖示，其顯示了各條曲線的實驗和擬合數(shù)據(jù)之間的差異。操作人員可隨后確定所述擬合是否足夠有效。如果不夠有效，則可排除表現(xiàn)出最差擬合的實時信號并且使用消減的實時信號集合重新運行所述擬合程序?？芍貜驮摮绦蛑敝了鰯M合達到滿意程度。

所關(guān)注的另一種擬合算法包括特異性擬合算法，其公開于下文的實驗部分。

在需要的情況下，以上定量測定方案可在被配置為執(zhí)行上述方案的軟件和/或硬件的輔助下進行。

多元分析

本發(fā)明方面包括使用同一傳感器對兩種或更多種不同的結(jié)合相互作用進行的多元分析。“多元分析”指的是不同組結(jié)合分子之間的兩種或更多種不同結(jié)合相互作用被定量分析，其中結(jié)合分子和/或磁性標記的分子彼此不同，例如區(qū)別于不同的序列。在一些情況下，所述組數(shù)量是2個或更多個，諸如4個或更多個、6個或更多個、8個或更多個等等，多達20個或更多個，例如50個或更多個，包括100個或更多個或者1000個或更多個不同組。同樣地，在一些情況下，所述磁性傳感器裝置可包含兩種或更多種不同的磁性傳感器，諸如2種或更多種、4種或更多種、6種或更多種、8種或更多種等等，多達20種或更多種，例如50種或更多種，包括100種或更多種或者1000種或更多種不同的磁性傳感器，各傳感器特異地檢測不同的結(jié)合相互作用。在某些實施方案中，所關(guān)注的是2至1000種不同結(jié)合相互作用的多元分析，諸如2至50種，或者2至20種不同的結(jié)合相互作用。因此，在這些實施方案中，所述磁性傳感器裝置可包含2至1000個不同的磁性傳感器，諸如4至1000個不同的磁性傳感器，其各自特異地分析不同的結(jié)合相互作用。在其它情況下，所述磁性傳感器裝置可包含20個或更少的不同磁性傳感器，諸如10個或更少，包括4個或更少的不同磁性傳感器，其各自特異地分析不同的結(jié)合相互作用。

裝置和系統(tǒng)

本發(fā)明的方面進一步包括磁性傳感器裝置和系統(tǒng)，其被配置為對目標分子結(jié)合相互作用的一種或多種結(jié)合動力學參數(shù)進行定量測定。所述裝置和系統(tǒng)一般包括磁性傳感器；以及定量分析模塊(如，處理器)，所述定量分析模塊被配置為從所述磁性傳感器中接收實時信號并由所述實時信號定量地確定分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)。這兩個組件可作為單一裝置被整合進入同一產(chǎn)品中，或分置入兩個或更多個不同裝置中(如，作為系統(tǒng))，其中所述兩個或更多個不同裝置彼此進行通訊，例如，通過有線或無線通訊協(xié)議。

因此，本發(fā)明的方面進一步包括系統(tǒng)，例如，基于計算機的系統(tǒng)，其被配置為定量評價根據(jù)上文所述的結(jié)合相互作用?！盎谟嬎銠C的系統(tǒng)”指的是被用于分析本發(fā)明的信息的硬件裝置、軟件裝置和數(shù)據(jù)存儲裝置。所述基于計算機的系統(tǒng)的實施方案的最低硬件包括中央處理器(CPU)(如，處理器)、輸入裝置、輸出裝置和數(shù)據(jù)存儲裝置。任意一種當前存在的基于計算機的系統(tǒng)均可適用于本文公布的實施方案。所述數(shù)據(jù)存儲裝置可包括任意產(chǎn)品，其包含如上所述的本發(fā)明信息的記錄品，或者可訪問這種產(chǎn)品的存儲器訪問裝置。

在計算機可讀介質(zhì)上“記錄”數(shù)據(jù)、編程或其它信息是指使用本領(lǐng)域已知的任何方法存儲信息的過程。根據(jù)所使用的訪問所存儲的信息的裝置，可選用任意便利的數(shù)據(jù)存儲結(jié)構(gòu)。多種數(shù)據(jù)處理器程序和格式可被用于存儲，例如，文字處理文本文件，數(shù)據(jù)庫格式，等等。

“處理器”指的是執(zhí)行其所需的功能的任何硬件和/或軟件組合。例如，本文的任何處理器可以是可編程的數(shù)字微處理器，諸如以電子控制器、大型機、服務器或個人計算機(例如，桌面或便攜式)形式可用的微處理器。在所述處理器是可編程的情況下，適當?shù)某绦蚩蓮倪h程位置通訊給所述處理器，或者以計算機程序產(chǎn)品的形式預先存儲(所述計算機程序產(chǎn)品諸如便攜式或固定化的計算機可讀存儲介質(zhì)，無論是基于磁性、光學或固態(tài)裝置均可)。例如，磁性介質(zhì)或光盤可攜帶所述程序，并且可通過在對應的站點與各處理器進行通訊的適當?shù)淖x取器讀取。

本系統(tǒng)的實施方案可包含下列組件：(a)通訊模塊，所述通訊模塊例如通過用戶計算機或工作站為所述系統(tǒng)與一位或多位用戶之間的信息傳遞提供便利；以及(b)處理模塊，所述處理模塊用于執(zhí)行包括在所公開的定量分析方法中的一個或多個任務。

在某些實施方案中，描述了包含計算機可用介質(zhì)的計算機程序產(chǎn)品，所述介質(zhì)具有存儲于其中的控制邏輯(control logic)(計算機軟件程序，包括程序代碼)。當被所述計算機的處理器執(zhí)行的時候，所述控制邏輯使所述處理器執(zhí)行本文所述的功能。在其它的實施方案中，某些功能主要在使用例如硬件狀態(tài)機的硬件中實施。為執(zhí)行本文所述功能的硬件狀態(tài)機的實施可通過使用任何便利的方法和工藝而實現(xiàn)。

除所述傳感器裝置和定量分析模塊之外，本發(fā)明的系統(tǒng)和裝置還可包含大量的其它組件，諸如數(shù)據(jù)輸出裝置如監(jiān)視器、打印機和/或揚聲器，數(shù)據(jù)輸入裝置如交互端口、鍵盤等等，液體處理組件，電源等等。

用途

本方法、系統(tǒng)和試劑盒在需要定量測定目標結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)的多種不同應用中顯現(xiàn)用途。在某些實施方案中，所述結(jié)合相互作用例如但不限于，核酸雜交、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(例如在下文實驗部分中被更為詳盡地描述的相互作用)、受體-配體相互作用、酶-底物相互作用、蛋白質(zhì)-核酸相互作用，等等。

在一些情況下，本方法、系統(tǒng)和試劑盒在需要實時觀測分子結(jié)合相互作用的藥物開發(fā)方案中展現(xiàn)用途。例如，藥物開發(fā)方案可使用本方法、系統(tǒng)和試劑盒來實時監(jiān)測抗體與抗原之間的分子結(jié)合相互作用、或核酸之間的雜交相互作用、或蛋白質(zhì)之間的結(jié)合相互作用、或受體與配體之間的結(jié)合相互作用、或酶與底物之間的結(jié)合相互作用、或蛋白質(zhì)與核酸之間的結(jié)合相互作用，等等。例如，CEA和VEGF是腫瘤標記物并且抗VEGF抗體藥物如貝伐單抗(bevacizumab)(阿瓦斯汀(Avastin)；Genentech/Roche)是有效的抗癌癥藥物。另一個實例為抗EpCAM抗體，其被制劑化成為化療藥物依決洛單抗(edrecolomab)。對諸如此類的結(jié)合相互作用的監(jiān)測可為其它基于抗體的藥物的開發(fā)提供便利。

本方法、系統(tǒng)和試劑盒還在對包含在復雜樣品中的結(jié)合對之間的分子結(jié)合相互作用的分析中展現(xiàn)用途。在一些情況下，所述復雜樣品可被直接分析而不將目標結(jié)合分子與其它可能處于所述樣品中的非感興趣的蛋白質(zhì)或分子進行分離。在某些情況下，非感興趣的蛋白質(zhì)或分子的非特異性結(jié)合以及未結(jié)合的磁性納米顆粒在本方法、系統(tǒng)和試劑盒中基本不產(chǎn)生可檢測的信號。因此，本方法、系統(tǒng)和試劑盒在可能使用復雜樣品并且在對于目標結(jié)合相互作用的檢測無需洗滌所述傳感器的情況下可實時監(jiān)測目標結(jié)合相互作用而的分析方案中展現(xiàn)用途。

本文公開的實時結(jié)合分析和動力學模型可在諸如表位定位的應用中展現(xiàn)用途。例如，所述GMR傳感器陣列具有以高度并行方式實施表位定位的能力。使用捕獲抗體，可將抗原選擇性地固定化于所述傳感器表面上的特定分子內(nèi)結(jié)構(gòu)之中。所述被捕獲抗原上暴露的表位的動力學相互作用可以針對多種受體或抗體的親和性而被探測。例如，表皮生長因子受體(EGFR)能夠結(jié)合EGF自身以及包含EGF樣重復的蛋白質(zhì)如EpCAM。通過使用不同的單克隆抗體捕獲具有EGF樣重復的蛋白質(zhì)以及對EGFR與這些定向蛋白質(zhì)的結(jié)合進行的檢測，可測定表位定位以評價EGFR對于包含EGF樣重復的多種配體的親和性。使用GMR傳感器以探測暴露出的表位具有從使用特定靶進行的藥物相互作用的大規(guī)模篩選直至對蛋白質(zhì)組中的特定目標結(jié)構(gòu)域進行的平行篩選的應用。

本方法、系統(tǒng)和試劑盒還在對分子結(jié)合相互作用的空間上和時間上的監(jiān)測中展現(xiàn)用途。例如，本方法、系統(tǒng)和試劑盒可被用于通過細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分泌蛋白質(zhì)組(secretome)分析而監(jiān)測定位化的細胞-細胞通訊。通過監(jiān)測細胞內(nèi)蛋白質(zhì)分泌在空間和時間上的擴散，可測定細胞-細胞通訊的機制。

本方法、系統(tǒng)和試劑盒還在了解參與細胞生物學中的信號轉(zhuǎn)導的受體-配體結(jié)合相互作用以及在完整蛋白質(zhì)組中對特定目標化合物進行特征化的基礎(chǔ)研究中展現(xiàn)用途。此外，對于臨床醫(yī)學的應用范圍之廣可從定向蛋白質(zhì)估測研究中的大規(guī)模篩選直至檢測藥物中靶(on-target)和離靶(off-target)交叉反應結(jié)合動力學。

計算機相關(guān)實施方案

特定實施方案的方面進一步包括多種計算機相關(guān)的實施方案。具體地，可使用計算機實施先前部分中所描述數(shù)據(jù)分析方法。因此，實施方案提供了基于計算機的系統(tǒng)以對使用上文方法所產(chǎn)生的分析數(shù)據(jù)進行分析，從而提供目標結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)的定量測定。

在某些實施方案中，所述方法以“程序”的形式被編碼到計算機可讀的介質(zhì)中，其中本文所使用的術(shù)語“計算機可讀的介質(zhì)”指的是任何存儲或轉(zhuǎn)移介質(zhì)，其參與對計算機提供用于執(zhí)行和/或處理的指令和/或數(shù)據(jù)。存儲介質(zhì)的實例包括軟盤、磁帶、CD-ROM、DVD、Blu-Ray、硬盤驅(qū)動器、ROM或集成電路、磁光盤或者計算機可讀卡如PCMICA卡或閃存卡，等等，無論這些裝置屬于所述計算機內(nèi)置或者外置均可。包含信息的文件可被“存儲”于計算機可讀介質(zhì)中，其中“存儲”指的是記錄信息從而使其在隨后的時間可為計算機所訪問和檢索。所需介質(zhì)是非瞬時的介質(zhì)，即，所述程序被關(guān)聯(lián)以實體結(jié)構(gòu)的實體介質(zhì)，例如被記錄于其上。非瞬時介質(zhì)并不包含通過無線協(xié)議進行轉(zhuǎn)送的電子線號。

對于計算機可讀介質(zhì)，“永久性存儲器”指的是處于永久狀態(tài)的存儲器。永久性存儲器不會由于對計算機或處理器的供電終止而消除。計算機硬盤驅(qū)動器、CD-ROM、Blu-Ray、軟盤和DVD是永久性存儲器的全部實例。隨機存取存儲器(RAM)是非永久性存儲器的一個實例。永久性存儲器中的文件是可編輯和重寫入的。

試劑盒

還提供了用于實施上述方法的一個或多個實施方案的試劑盒。本試劑盒可變動并且可包含多種裝置和試劑。目標試劑和裝置包括本文針對磁性傳感器裝置或其組件(諸如，磁性傳感器陣列或芯片)、磁性納米顆粒、結(jié)合試劑、緩沖液等等所描述的試劑和裝置。

在一些情況下，所述試劑盒至少包含在所述方法(如，上文所述的方法)中使用的試劑；以及存儲有計算機程序的計算機可讀介質(zhì)，其中所述計算機程序當加載進入計算機時操作所述計算機由獲自磁性傳感器的實時信號定量地確定第一種和第二種分子之間的結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)；以及具有用于獲得所述計算機程序的地址的物理基板。

除以上組件之外，本試劑盒可進一步包含實施本方法的說明。這些說明可以各種形式存在于在本試劑盒中，所述試劑盒中可存在一種或多種所述形式。這些說明可存在的一種形式是在合適的介質(zhì)或基板上的印刷信息，例如，印有所述信息的紙件，處于所述試劑盒的包裝之中或在包裝插頁上等等。另一種方式為其上記錄有所述信息的計算機可讀介質(zhì)，例如，磁盤、CD、DVD、Blu-Ray等等?？纱嬖诘牧硪环N方式為網(wǎng)站地址，其可被用于通過國際互聯(lián)網(wǎng)在遠程站點獲取所述信息。本試劑盒中可存在任何便利的方式。

下列實施例通過說明的方式而非限制的方式提供。

實驗

I.結(jié)合動力學測定

A.材料與方法

描述于Osterfield等,Proc.Nat’l Acad.Sci USA(2008)150:20637-206340以及Xu等,Biosens.Bioelectron(2008)24:99-103的巨磁阻(GMR)傳感器陣列被用于以下一般方案：

1.表面功能化：傳感器表面被功能化以提供結(jié)合對構(gòu)件在所述傳感器表面的穩(wěn)定結(jié)合，結(jié)合對構(gòu)件的實例如，捕獲抗體、第一種生物分子，等等。諸如聚乙烯亞胺(PEI)這樣的陽離子聚合物可被用于通過物理吸附將帶電的抗體非特異性結(jié)合于所述傳感器表面。或者，可利用所述抗體上的自由氨基或自由巰基基團使用共價化學反應。涉及用于寡核苷酸的穩(wěn)定結(jié)合的表面功能化的另外細節(jié)提供于Xu等,Biosens.Bioelectron(2008)24:99-103并且對于抗體的穩(wěn)定結(jié)合的表面功能化的另外細節(jié)提供于Osterfield等,Proc.Nat'l Acad.Sci USA(2008)150:20637-206340。目標結(jié)合對構(gòu)件隨后被接觸所述傳感器表面用以將所述結(jié)合構(gòu)件穩(wěn)定地結(jié)合于所述傳感器表面。

2.在進行表面功能化和結(jié)合對結(jié)合之后，對所述傳感器表面進行封閉以防止所述分析期間的非特異性結(jié)合。為封閉所述表面，包含1％BSA的PBS的封閉緩沖液被加入反應孔內(nèi)一小時?？捎玫钠渌忾]方案被描述于Xu等,Biosens.Bioelectron(2008)24:99-103以及Osterfield等,Proc.Nat'l Acad.Sci USA(2008)150:20637-206340。

3.在封閉之后，使所述傳感器表面與第一種目標生物分子的溶液如所述第一種生物分子的純化溶液或包含所述第一種生物分子的復合樣品接觸。對于本步驟，使用包含～1nL-100μL溶液的反應孔并且根據(jù)應用孵育時間在5分鐘至2小時的范圍。

4.在孵育之后，使包含經(jīng)目標標簽(如，磁性納米顆粒)進行預標記的第二種生物分子的溶液與所述傳感器表面接觸。

5.隨后，檢測所述第二種生物分子與所述第一種生物分子的結(jié)合動力學并且用于根據(jù)結(jié)合軌跡而計算結(jié)合速率常數(shù)。

B.結(jié)果與討論

來自GMR生物傳感器的實時數(shù)據(jù)被用于計算生物素-鏈霉親和素相互作用的結(jié)合和解離速度(圖3(a))。生物素化雙鏈DNA被固定于所述傳感器表面并且經(jīng)鏈霉親和素標記的磁性標簽被加入所述系統(tǒng)。結(jié)合速度經(jīng)計算為4.45×10⁶M^-1s^-1，擬合誤差為3.2％并且k_M為4.4×10^-4s^-1。當使用BIAcore 3000表面等離子共振(SPR)儀器時進行了相同的生物素-鏈霉親和素結(jié)合實驗并且測得結(jié)合速度為5.5×10⁶M^-1s^-1，接近于所述GMR傳感器分析。

隨后，論證了使用GMR傳感器陣列進行抗體抗原結(jié)合動力學研究的能力(圖2)。使用EpCAM蛋白在五至十組重復傳感器上以100μg/mL和10μg/mL的濃度對所述陣列中的傳感器進行功能化。使用該模型可以模擬經(jīng)磁性標記的抗體與多種濃度的固定化抗原的結(jié)合過程。通過擬合數(shù)據(jù)(圖3(b))，根據(jù)測定，對于選定的EpCAM抗體-抗原相互作用k_a為2.93×10⁵M^-1s^-1，k_d為2.83×10^-3s^-1，總擬合誤差為3.4％并且k_M為4.2×10^-4s^-1。

進行了類似的實時實驗以對高親和性CEA抗原-抗體結(jié)合動力學進行定量。1μg/mL和10μg/mL CEA被固定于所述GMR傳感器表面并且通過SPR分析對20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL和1.2μg/mL進行測試。在各個平臺上監(jiān)測了結(jié)合和解離速率常數(shù)并對結(jié)果進行比較(圖3(c)和3(d))。再一次，GMR傳感器陣列和SPR產(chǎn)生了類似的動力學速率常數(shù)。對于所述GMR生物傳感器，k_a被測定為5.0×10⁴M^-1s^-1并且k_d為4.4×10^-4s^-1，而SPR實驗產(chǎn)生了4.44×10⁴M^-1s^-1的k_a和1.17×10^-4s^-1的k_d。因此，這些結(jié)果顯示磁響應性生物傳感器可被用于精確測量結(jié)合速率常數(shù)。

II.用于抗體開發(fā)和藥物篩選的蛋白質(zhì)相互作用高通量分析和動力學模型

A.材料與方法

1.傳感器

本實驗中所使用的巨磁阻(GMR)傳感器具有以下類型的底部自旋閥結(jié)構(gòu)：Si/Ta(5)/晶種層/IrMn(8)/CoFe(2)/Ru/(0.8)/CoFe(2)/Cu(2.3)/CoFe(1.5)/Ta(3)，括號內(nèi)所有數(shù)字單位為納米。各個芯片均包含GMR傳感器陣列，所述陣列通過300nm厚的Ta/Au/Ta導線(lead)被連接于周邊結(jié)合墊(peripheral bonding pad)。為保護所述傳感器和導線免于腐蝕，通過離子束濺射法沉積兩個鈍化層：首先，SiO₂(10nm)/Si₃N₄(20nm)/SiO₂(10nm)的薄鈍化層被沉積于所有的傳感器和導線之上，僅暴露結(jié)合墊區(qū)域；其次，SiO₂(100nm)/Si₃N₄(150nm)/SiO₂(100nm)的厚保護層被沉積于參比傳感器和導線之上，暴露出活性傳感器和結(jié)合墊區(qū)域。在圖案化之后的磁阻比率約為12％。所述自旋閥的釘扎方向(pinning direction)在平面內(nèi)并且垂直于所述傳感器條。通過形狀各向異性將所述自由層的易磁化軸設定為平行于所述傳感器條。這種結(jié)構(gòu)允許所述GMR傳感器在其MR轉(zhuǎn)移曲線的最為敏感區(qū)域工作。

由于所述GMR效應，所述傳感器的電阻隨兩個磁性層的磁化取向而變化，所述兩個磁性層由銅間隔層進行分隔：

$R\left(\mathrm{\θ}\right)=R_0-\frac{1}{2}{\mathrm{\δR}}_{max}cos\mathrm{\θ}---\left(M.1\right)$

此處，R₀是零磁場下的電阻，δR_max是最大電阻變化并且θ是所述兩磁性層之間的磁化方向間夾角。在所述底部自旋閥結(jié)構(gòu)中，底部磁性層(扎層)的磁化被釘扎于固定方向，而頂磁性層(自由層)的磁場取向能夠隨外部磁場自由轉(zhuǎn)動。因此，所述磁性標記物的雜散場(stray field)可改變所述自由層的磁化并且因此改變所述傳感器的電阻。

2.磁性標記物

所述磁性標記物獲自Miltenyi Biotech Inc.，其稱為“MACS”顆粒。各MACS顆粒是10nm的Fe₂O₃納米顆粒的團簇，其通過葡聚糖基質(zhì)相互結(jié)合。由于Fe₂O₃納米顆粒的細小尺寸，MACS顆粒具超順磁性，其總體直徑為50nm并且包含10％的磁性物質(zhì)(重量/重量)。使用對應的要研究的分析物對MACS顆粒進行功能化，如對于EpCAM(CEA，VEGF)實驗，使用EpCam(CEA，VEGF)抗體對MACS顆粒進行功能化；對于生物素-鏈霉親和素實驗，使用鏈霉親和素對MACS顆粒進行功能化。

3.表面化學

首先使用丙酮、甲醇和異丙醇洗滌所述傳感器表面。隨后，所述傳感器被暴露于氧等離子體三分鐘。將2％(w/v)的聚烯丙基胺去離子水溶液涂覆于所述傳感器5分鐘。根據(jù)需要可使用其它溶液，例如但不限于，包括酐類、聚羧酸烯丙酯等在內(nèi)的溶液。隨后使用去離子水洗滌芯片并且在150℃下烘烤45分鐘。對于羧化表面，隨后在室溫下將10％(w/v)的EDC溶液和10％(w/v)的NHS溶液加至所述傳感器表面1小時。捕獲蛋白(EpCAM(來自RD Systems的960-EP-050)、CEA(來自RD Systems的4128-CM-050)或VEGF(來自RD Systems的293-VE165))，或捕獲抗體(EpCAM的抗體(來自Abcam的ab20160或來自R&D的960)、CEA(來自BiosPacific的5910)或VEGF(來自Abcam的ab69479))以360皮升的液滴通過機器人加至各個傳感器上三次(總體積1鈉升)。為監(jiān)測重現(xiàn)性，使用相同的捕獲蛋白對隨機分布于所述GMR傳感器陣列中的3至8個傳感器進行孵育。以類似的方式使用1mg/mL的BSA或非互補性抗體(一般為500μg/mL的抗生存素(survivin)抗體(H00000332-P01，來自Novus Biologicals,LLC))對對照傳感器進行固定化。使用1mg/mL的BSA的PBS溶液對所述傳感器陣列的整個表面進行30分鐘的封閉。

4.動力學分析

或者，所述動力學分析可如下進行建模：

在使用適當?shù)牟东@蛋白對所述傳感器表面進行功能化之后，將GMR傳感器陣列置于測試器(test station)內(nèi)并進行實時監(jiān)測。洗去BSA封閉緩沖劑并將50μL的磁性標記的檢測抗體溶液(根據(jù)上文制備)加至反應孔內(nèi)。在磁性標記的檢測抗體與對應蛋白質(zhì)結(jié)合的時間里對所述GMR傳感器陣列進行監(jiān)測?？呻S后對各個蛋白質(zhì)所特有的結(jié)合曲線進行作圖并且可測定結(jié)合速率常數(shù)。所述分析進行5分鐘。

5.模型和擬合

兩分子相互作用以產(chǎn)生一種產(chǎn)物的過程可歸納為：

其中C_S是溶液中處于所述表面附近的反應物濃度，L是處于所述表面上的配體或受體濃度，n是所述相互作用的產(chǎn)物的表面濃度。在簡單模型中，假定所述反應物中的至少一種是過量。但是，在本文所述的模型中，處于所述傳感器表面上的反應物受體并未受到補充。因此，L與n之和應等于L的原始濃度。

對于模型[L]₀＝[n_max]，其中n_max受限于緊密堆積的MNP的最大濃度而非處于所述表面的分析物的最大濃度。使用GMR生物傳感器陣列監(jiān)測在給定的時間與其目標結(jié)合的磁性標記的抗體數(shù)量n(t)。為對該相互作用的結(jié)合速率常數(shù)進行定量，通過假定反應物在體積V內(nèi)和反應傳感器表面A內(nèi)保持質(zhì)量不變來導出分析模型。下文方程M1.1表達了所述溶液中被標記的抗體的變化速度，而方程M1.2表達了所述標記的抗體對所述傳感器表面的結(jié)合速度：

$V\frac{{\mathrm{dC}}_S}{ht}=-{\mathrm{Ak}}_{on}{C}_S(n_{max}-n)+{\mathrm{Ak}}_{off}n---\left(M1.1\right)$

$A\frac{dn}{dt}={\mathrm{Ak}}_{on}{C}_S(n_{max}-n)-{\mathrm{Ak}}_{off}n---\left(M1.2\right)$

其中C_s是所述傳感器表面的磁性標簽化的抗體的濃度，C₀是磁性標簽化抗體的本體濃度(bulk concentration)，n_max是所述傳感器表面單位面積內(nèi)的潛在結(jié)合位點的最大摩爾數(shù)，并且n是已經(jīng)形成在所述傳感器上的被結(jié)合的MNP-抗體-抗原復合體的表面濃度。V是所述傳感器上的溶液體積，A是反應面積(在這種情況下是各傳感器的表面積)。此外，k_on是結(jié)合速率常數(shù)，k_off是解離速率常數(shù)。

該方程組可通過假定k_off為零而進行簡化，這是因為抗體-抗原解離在本實驗的時間尺度內(nèi)可忽略不計。因此，通過將簡化的方程M1.1和M1.2相加，所述守恒表達式如下：

$V\frac{{\mathrm{dC}}_S}{dt}+A\frac{dn}{dt}=0---\left(M1.3\right)$

假設邊界條件為t＝0、n＝0和C_s＝C₀，得C_s＝C₀-nA/V，因此

$\frac{dn}{dt}=k_{on}(C_0-n*\frac{A}{V})(n_{max}-n)---\left(M1.4\right)$

括號內(nèi)的項分別表示本體反應物和有效表面位點的消耗。該方程具有方程M1.5的解析解，其精確地對觀察所得的結(jié)合動力學建立了模型。

$n=C_0\frac{V}{A}\[\frac{1-e^{-k_{on}(A/V)\left(C_0\right(V/A)-n_{\max })t}}{\frac{C_{0}V}{n_{\max }A}-e^{-k_{on}(A/V)\left(C_0\right(V/A)-n_{\max })t}}\]---\left(M1.5\right)$

C_s是傳感器表面的磁性標簽化的抗體的濃度，C₀是磁性標簽化抗體的本體濃度(bulk concentration)，n_max是單位面積內(nèi)的表面結(jié)合位點的最大摩爾數(shù)，并且n是已經(jīng)形成在傳感器上的被結(jié)合的MNP-抗體-抗原復合體的表面濃度。V是傳感器上的溶液體積，并且A是所述反應面積(在這種情況下是各傳感器的表面積)。所述溶液具有V/A的比率，其被認為特征性擴散高度。超過該特征化高度之上的溶液中的任何物質(zhì)應不會在所述實驗的時間范圍內(nèi)結(jié)合所述傳感器。此外，k_on是結(jié)合速率常數(shù)，k_off是解離速率常數(shù)。

由于在體積和表面的動力學均被討論，不同的維度；因此n和n_max被表達為摩爾/cm²，而C_s和C_o被表達為摩爾/cm³。通過以體積乘以所述溶液速度和以面積乘以所述表面速度，可在各個方程中以相同的單位表示結(jié)合速率常數(shù)(單位時間的摩爾數(shù))。

存在四種擬合參數(shù)k_on、C₀、n_max和V/A(其為所述溶液的反應部分的有效厚度)。其中，k_on和V/A是“全局擬合參數(shù)(global fitting parameter)”，其對于來自相同受體-分析物組對的所有的信號曲線是相同的；而n_max和C₀是“局部擬合參數(shù)(local fitting parameter)”，其對于不同的信號曲線會有所不同，這是因為分析物的表面濃度或抗體-MNP復合體的溶液濃度在所有實驗中可能不是均勻的。

當C₀V/A>＞n_max時，所述分析模型化簡至所述Langmuir模型。

$n=n_{\max }(1-e^{-k_{on}{C}_{0}t})---\left(M1.6\right)$

當假定在本實驗的時間尺度內(nèi)k_off可忽略不計時，該方程匹配所述Langmuir模型的解。上述方程與下文所述的方程M.25相同。

6.擬合誤差

擬合誤差如下進行定義：如果從一個芯片上測量了N個信號曲線，并且曲線j具有n_j個數(shù)據(jù)點，并且如果設D_i,j為曲線j中的第i個數(shù)據(jù)點，并且設S_i,j為模擬曲線j的第i個數(shù)據(jù)點，則對于信號曲線j的擬合誤差為

$E_j=\sqrt{\underset{i=1}{\overset{n_j}{\Σ}}{\left(\frac{S_{i,j}-D_{i,j}}{D_{\max ,j}}\right)}^2}---\left(M.2\right)$

其中D_max,j是信號曲線的最大信號。通過該方式，將傳感器陣列中的各個實驗結(jié)合曲線與由該模型所預測的結(jié)合曲線進行了比較。隨后對該誤差進行最小化以獲得最佳擬合并計算k_on。絕對誤差通過所述信號曲線的最大信號進行計量，因此所述擬合誤差是信號水平的百分比。因此，大信號曲線的基于百分比的相對擬合誤差與小信號曲線類似?？倲M合誤差為：

$E=\sqrt{\underset{j=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}{E}_j^2}---\left(M.3\right)$

該總擬合誤差在本文所提供的動力學數(shù)據(jù)的擬合中進行最小化。

7.傳統(tǒng)的二室模型

溶液中的配體與表面上的捕獲劑的結(jié)合動力學可以?；癁槎曳磻?。這使反應和傳輸動力學均得以被并入模型，其中所述表面區(qū)室中的可溶配體與所述表面通過結(jié)合和解離的化學過程進行反應(參見圖2)，并且通過來自本體區(qū)室的擴散、流動和對流(convection)而逐步受到補充。在各區(qū)室之中，所述濃度被假定在空間內(nèi)是均一的，但是可隨時間而變化。本體區(qū)室中的配體濃度C₀被假定為恒定不變，而處于表面區(qū)室中的配體濃度C_s由于所述結(jié)合反應而被消耗,但是通過本體中的配體的擴散和表面結(jié)合復合體的解離而得到補充。該二室反應可被如下描述：

$C_0\stackrel{k_M}{\→}{C}_s---\left(M.4\right)$

其中C_S和C₀是處于所述表面區(qū)室和本體區(qū)室中的磁性標簽化抗體的溶液濃度，R是固定化于所述表面的配體和受體的表面濃度(即，有效結(jié)合位點的表面密度)，n是結(jié)合的MNP-抗體-抗原復合體的表面濃度，k_M是擴散限制速率常數(shù)，k_on和k_off分別是結(jié)合和解離速率常數(shù)。C_S和n的凈反應速度可通過以下方程組合進行定義：

$V\frac{{\mathrm{dC}}_S}{dt}={\mathrm{Vk}}_M(C_0-C_S)-{\mathrm{Ak}}_{om}{C}_{S}R+{\mathrm{Ak}}_{off}n---\left(M.6\right)$

$\frac{dn}{dt}=k_{on}{C}_{S}R-k_{off}n---\left(M.7\right)$

由于在體積中和表面上均進行了動力學分析，因此R、n和n_max被表達為摩爾m^-2，而C_S和C₀被表達為摩爾m^-3。通過以表面區(qū)室體積V乘以溶液速度，并且以傳感器的面積A乘以表面速度，各個方程可以以相同的單位進行表示(摩爾/s)。處于時間t＝0的起始條件為C_S＝C₀和n＝0。在釋放測量中，所有反應物被洗去，所以C₀＝0。

數(shù)值解法可被用于解方程M.6。表面等離子共振(SPR)的實驗設置限制了所述二室模型的簡化。使用SPR，所述可溶配體是非標記的(其導致快速擴散)并且其以高流速被引入所述反應表面。因此，所述物質(zhì)傳輸限制的速率常數(shù)k_M可在所觀測到的動力學相互作用中發(fā)揮主要作用。

8.具有解析解的經(jīng)修正的二室模型

與SPR儀器運行呈對比，單孔GMR傳感器系統(tǒng)的實施方案利用了標記物以增強分子結(jié)合事件的信號并且在測量中無人為的流動(deliberate flow)。所述標記物的大小(如，46nm)和流動的缺乏顯著地降低了所述可溶配體在本體區(qū)室和表面區(qū)室之間擴散和對流的速度。如果擴散速度顯著地低于反應速度，傳統(tǒng)的二室模型有可能被化簡成為可進行解析求解的修正形式。

為驗證這一假設，使用數(shù)值解法對方程M.6和M.7進行求解以擬合EpCAM的實時結(jié)合數(shù)據(jù)(示于圖5(a))。我們的磁性標記抗體所得的k_M為約1.0×10^-4s^-1。因此，根據(jù)圖13所示以及下段的解釋，可對結(jié)合速度、解離速度(假設k_off對于大多數(shù)抗體處于1.0×10^-6s^-1的數(shù)量級)和擴散速度的貢獻進行作圖以確立方程M.6中各個組分的相對重要性。

通過速度方程M.6，所述方程右側(cè)各項被作為表面結(jié)合的EpCAM抗體-抗原復合體的數(shù)量n的函數(shù)進行作圖(圖13)。根據(jù)150個表面結(jié)合的MNP產(chǎn)生1ppm的MR信號的關(guān)系將歸一化的MR信號(單位是ppm)轉(zhuǎn)化成為n(單位是摩爾/μm²)(參見圖7)。在整個結(jié)合反應過程中，所述結(jié)合速度項與所述解離速度和擴散速度項相比均保持高出幾個數(shù)量級。因此，所述磁性納米顆粒標記物大到足夠顯著地減緩所述磁性標記的抗體向所述表面區(qū)室中的擴散。這暗示可溶抗體-MNP進入所述表面區(qū)室的再生過程可忽略不計(即，k_M～0)。此外，圖13顯示在這些結(jié)合實驗中對k_off可忽略不計的假設是有效的。但是，正如下文即將表明，k_off在釋放動力學的測量中并非可忽略不計。

圖13示出了描述方程M.6中各項貢獻的對數(shù)圖，該方程是結(jié)合于所述傳感器表面的磁性標記抗體數(shù)量的函數(shù)。圖5(a)中所示的EpCAM結(jié)合實驗數(shù)據(jù)被用于對該圖的k_on、k_off和k_M進行數(shù)值計算。x-軸表示在結(jié)合反應過程中結(jié)合于所述傳感器表面的磁性標記的抗體的表面濃度(圖中n值來自于實際實驗數(shù)據(jù))。在n＝0時所述實驗開始，并且在n～120摩爾/μm²時信號接近達到飽和或所述結(jié)合實驗結(jié)束。在整個結(jié)合反應過程中，所述結(jié)合速度項與所述解離速度和擴散速度項相比均保持高出幾個數(shù)量級。因此，對k_off可忽略不計的假設是有效的(因為k_off曲線遠低于k_on曲線)。此外，所述磁性納米顆粒標記物大到足以僅僅允許磁性標記的抗體向所述反應區(qū)室的緩慢擴散(因為所述k_M曲線遠遠低于所述k_on曲線)。這暗示可溶抗體-MNP進入所述表面區(qū)室的遞送可忽略不計(即，k_M約為零)。

由于所述表面區(qū)室中的MNP抗體并而受到來自主體區(qū)室的緩慢擴散的充分補充，因此質(zhì)量平衡需要處于所述表面的溶液中未反應抗體-MNP濃度C_S等于初始濃度C₀減去產(chǎn)物形成所消耗的量nA與體積V的商，如：

$C_S=C_0-n\frac{A}{V}---\left(M.8\right)$

類似地，質(zhì)量平衡需要自由結(jié)合位點的表面濃度R等于其初始表面濃度R₀與MNP-抗體-抗原復合體形成中所消耗的量之差。R₀的量級必須略低于處于所述表面之上的緊密堆積的MNP的最大濃度，從而避免“親合力效應(avidity effect)”，在該效應中一個MNP與多個抗原結(jié)合。因此，R₀被替代為抗原的最大沉積表面濃度n_max，如下所示：

R＝R₀-n＝n_max-n (M.9)

因此，方程M.7化簡為：

$\frac{dn}{dt}=k_{on}(C_0-n\frac{A}{V})(n_{\max }-n)---\left(M.10\right)$

此處括號內(nèi)的兩項分別代表標簽化抗體在所述表面區(qū)室中的消耗以及有效表面結(jié)合位點的降低。方程M.7在此具有以下的分析解：

$n=n_{\max }\[\frac{1-e^{-k_{on}(C_0-n_{max}A/V)t}}{1-\frac{n_{\max }A}{C_{0}V}{e}^{-k_{on}(C_0-n_{\max }A/V)t}}\]---\left(M.11\right)$

眾多可進行分析求解的動力學模型需要所述相互作用中的反應物之一保持過量以產(chǎn)生分析解。但是，根據(jù)方程M.11中的模型，兩種反應物在所述結(jié)合過程中可被顯著地耗盡。該模型的靈活性實現(xiàn)了更為一般化的實驗組合在不違背嚴格反應條件的情況下的實施。此外，多數(shù)動力學模型需要所述系統(tǒng)達到平衡以測定結(jié)合速率常數(shù)。但是，使用本文所示的模型，不是必須達到平衡并且所述結(jié)合速率常數(shù)可在5分鐘或更短時間內(nèi)被測定，其遠在飽和之前。

所述分析模型中存在五個參數(shù)，k_on、C₀、n_max、V和A。在其中，k_on、V和A對于所有曲線被固定為相同值，而在分析物表面濃度或抗體-MNP復合體的溶液濃度被改變的情況下n_max和C₀會有所不同。

9.分析模型可化簡為Langmuir吸附

當C₀V/A>＞n_max時，對應于所述表面區(qū)室中可忽略的反應物損耗，方程M.10化簡為：

$\frac{dn}{dt}=k_{on}{C}_0(n_{\max }-n)---\left(M.12\right)$

并且該分析模型化簡為Langmuir模型。因此，方程M.11化簡為：

$n=n_{\max }(1-e^{-k_{on}{C}_{0}t})---\left(M.13\right)$

結(jié)合k_off可忽略不計的附加假設，該結(jié)果符合Langmuir結(jié)合動力學。我們的結(jié)合數(shù)據(jù)與Langmuir模型之間的比較示于圖14。分析模型的這一化簡形式方程M.13與下文所導出(方程M.14-25)并示于方程M.25中的Langmuir等溫線相同。

圖14示出了根據(jù)Langmuir吸附模型所預測的(虛線)和實驗測得的(實線)抗EpCAM抗體對表面固定化的EpCAM抗原的結(jié)合曲線。以2×的系列稀釋度將EpCAM蛋白的表面覆蓋從5阿摩爾(對應于n_max)稀釋降至19.5仄摩爾(對應于n_max/256)。根據(jù)所述疊置圖，所述Langmuir吸附模型并未充分描述所述GMR傳感器對于測試的濃度組所觀察到的實時結(jié)合動力學。因此，產(chǎn)生了新的模型從而對觀察到的所述結(jié)合動力學進行更好地描述。本文所示的分析模型包含用于解釋信號的快速開始和較緩慢持續(xù)升高的附加項。

所述Langmuir等溫線在固定的溫度下使固體表面的分子覆蓋或吸附關(guān)聯(lián)于所述表面上方的介質(zhì)濃度?？赏ㄟ^考慮表面配體L、懸浮于所述介質(zhì)中的標記分子C以及吸附分子復合體CL而導出所述Langmuir方程，隨后所述吸附過程可被表示為

所述結(jié)合速度R_a和解離速度R_d分別為，

R_a＝k_on[C][L] (M.15)

R_d＝k_off[CL] (M.16)

其中k_on和k_off是結(jié)合速率常數(shù)和解離速率常數(shù)，并且方括號表示濃度。

如果總有效配體濃度為[L_max]，并且吸附分子的歸一化表面覆蓋為θ，則

[L]+[CL]＝[L_max] (M.17)

θ＝[CL]/[L_max] (M.18)

因此，[L]如下：

[L]＝(1-θ)[L_max] (M.19)

將方程M.19和M.18分別代入方程M.15和M.16，可得如下：

R_a＝k_on(1-θ)[L_max][C] (M.20)

R_d＝k_offθ[L_max] (M.21)

假定k_off在本實驗的時間尺度內(nèi)可忽略不計，并對R_a求解，得出：

$R_a=\frac{d\[CL\]}{dt}=k_{on}(1-\mathrm{\θ})\[L_{max}\]\[C\]---\left(M.22\right)$

$\frac{d\[CL\]}{dt}=k_{on}(\[L_{max}\]-\[CL\])\[C\]---\left(M.23\right)$

$\∫\frac{d\[CL\]}{\[L_{\max }\]-\[CL\]}=\∫k_{on}\[C\]dt---\left(M.24\right)$

假定[C]不依賴于于時間并且[L_max]不依賴于[CL]，并且通過分部積分進行求解，其解如下：

$\[CL\]=\[L_{\max }\](1-e^{-k_{on}\[C\]t})---\left(M.25\right)$

10.釋放動力學模型：

抗體以極高的親和性結(jié)合其目標。因此，所述解離速率常數(shù)一般較小，其需要更長的時間(如，分鐘)以觀測到這種釋放現(xiàn)象。此外，由于抗體的活動性，使用競爭抑制來監(jiān)測釋放動力學。通過在溶液中置入高濃度的目標，可觀測到所述釋放動力學更為精確的測量。

抗體釋放速度的速度方程可如下列出：

$\frac{dn}{dt}=-k_{off}n---\left(M.27\right)$

因此，加入所述釋放溶液之后在時間t的表面結(jié)合MNP-抗體濃度為：

n_Release(t)＝n_{max e}-k_offt (M.28)

其中是n₀為傳感器表面的初始吸附MNP-抗體濃度。

B.結(jié)果與討論

提供了測量結(jié)合動力學方法，所述方法使用可各自獨立尋址的磁性響應的納米傳感器同時地監(jiān)測多種不同蛋白質(zhì)的動力學，所述不同蛋白質(zhì)與固定化于傳感器表面的標靶結(jié)合。這些磁性納米傳感器被成功地擴展至每1mm²芯片面積超過1,000個傳感器。展示了分析物的表位分布并且對溶液中的蛋白質(zhì)擴散的空間動力學進行了可視化。結(jié)合這些實驗，可產(chǎn)生對標記的蛋白質(zhì)與表面固定化的蛋白質(zhì)的實時結(jié)合進行精確描述的分析動力學模型。所述分析模型與使用表面等離子共振進行的類似實驗以及來自文獻的數(shù)據(jù)具有緊密的一致性。該模型可以20仄摩爾(20×10^-21)或更低溶質(zhì)的敏感度應用于抗體-抗原結(jié)合。

1.GMR傳感器

使用磁性納米顆粒(MNP)對可溶配體進行預標記以監(jiān)測配體與固定于所述傳感器表面的抗原的復合體的實時結(jié)合動力學(圖4(a))。在所述復合體被捕獲的實時過程中，來自所述抗體-MNP復合體的磁場誘導其下的GMR傳感器的電阻變化。由于所述GMR傳感器陣列的快速實時讀出，所述結(jié)合動力學被監(jiān)測并且定量以測定結(jié)合速率常數(shù)。

根據(jù)TEM分析所測定，對目標蛋白質(zhì)或抗體進行標記的MNP是包埋于葡聚糖聚合物中的12個10nm的氧化鐵核(圖4(b))。整個納米顆粒平均直徑46±13nm(根據(jù)動態(tài)光散射測量的數(shù)值)。根據(jù)斯托克斯-愛因斯坦關(guān)系(Stokes-Einstein relation)，這些顆粒具有約8.56×10^-12m²s^-1的平動擴散系數(shù)。所述MNP具有-11mV的電動電位。這些顆粒是超順磁性的并且是膠體穩(wěn)定的，因此它們在所述反應期間并不聚集或沉淀。此外，所述GMR傳感器以來自所述磁性標簽的偶極場的基于接近度的檢測器的形式運行；因此僅檢測傳感器表面的150nm以內(nèi)的標簽。因此，未結(jié)合的MNP標簽在缺乏結(jié)合的情況下貢獻可忽略的信號。僅僅被結(jié)合的磁性標記的抗體可被其下的GMR傳感器測出，這使得這種MNP-GMR納米傳感器可用于實時動力學分析。

GMR傳感器陣列被制造成在1mm²芯片表面積上有1,008個傳感器(圖4(c))。所計算出的特征密度為每cm²超過100,000個GMR傳感器。所述傳感器陣列被設計為亞陣列組的形式，其中各亞陣列占據(jù)90μm×90μm的面積(圖4(d))。所述傳感器陣列適配于自動點樣儀(robotic spotters)。亞陣列中的各個傳感器通過行列解碼器經(jīng)由使用VLSI技術(shù)制造的共享6-位控制總線進行可各自獨立地尋址。所述GMR傳感器陣列允許蛋白質(zhì)結(jié)合動力學的平行多元監(jiān)測。

圖12中示出了所述GMR傳感器的另一個實施方案。在圖12中，12個延伸的線性磁性傳感器段被以并聯(lián)的方式連接在一起，并且6組這樣的并聯(lián)段被以串聯(lián)的方連接在一起，其給出了具有總計72個磁性傳感器段的磁性傳感器。所述磁性傳感器為100μm×100μm。各個磁性傳感器段為750nm寬，20nm厚和100μm長。圖12中的插圖示出了與磁性傳感器段結(jié)合的納米顆粒的SEM圖像。

2.結(jié)合動力學模型：

根據(jù)上文描述，產(chǎn)生了能夠擬合實施結(jié)合動力學數(shù)據(jù)從而使技術(shù)人員能夠計算結(jié)合速率常數(shù)(k_on)和解離速率常數(shù)(k_off)的分析模型。

所述結(jié)合反應是二步過程，其中本體溶液中的抗體首先通過擴散和流動接近被表面捕獲的抗原，并且隨后通過結(jié)合與解離的化學過程與表面結(jié)合的標靶結(jié)合或從其上逃逸。如果本體體溶液中的抗體濃度在空間上是均一的，則

$C_S=C_0-n\frac{A}{V}---\left(1\right)$

其中C_s是位于所述傳感器表面的磁性標記的抗體的濃度，C₀是磁性標簽化的抗體的初始本體濃度，并且n是被結(jié)合的MNP-抗體-抗原復合體的表面濃度。V是參與所述結(jié)合反應之中的傳感器上的溶液體積，A是所述反應面積(在本情況下是一個傳感器的表面積)。根據(jù)簡單動力學，所述表面反應被描述如下：

$\frac{dn}{dt}=k_{on}(C_0-n\frac{A}{V})(n_{max}-n)-k_{off}n---\left(2\right)$

括號內(nèi)的兩項分別對應本體反應物和有效的表面位點，n_max是傳感器表面的潛在結(jié)合位點的濃度，k_on是結(jié)合反應的結(jié)合速率常數(shù)，并且k_off是結(jié)合反應的解離速率常數(shù)。在討論體積和表面濃度之時，n和n_max被表達為摩爾m^-2，而C_s和C₀被表達為摩爾m^-3。注意n_max由緊密堆積的MNP最大濃度限定，而不是由表面上的分析物的最大濃度限定。因此，為排除與MNP在所述傳感器表面的聚集相關(guān)的空間效應，受測的最高分析物表面濃度至多為緊密堆積的抗體-MNP復合體表面濃度的十分之一。

該方程可通過假定k_off為零而進行簡化，這是因為抗體-抗原解離在本實驗的時間尺度內(nèi)可忽略不計。方程2在此具有以下的分析解：

$n=n_{\max }\[\frac{1-e^{-k_{on}(C_0-n_{max}A/V)t}}{1-\frac{n_{\max }A}{C_{0}V}{e}^{-k_{on}(C_0-n_{\max }A/V)t}}\]---\left(3\right)$

如果C₀V>＞n_maxA，這暗示超過有效表面位點的過量溶液分子，則所述動力學遵循Langmuir吸附。然而，當不處于該情況之時，所述溶液的反應物被顯著消耗，尤其是接近所述傳感器表面，因此反應速度將由于后續(xù)反應物在反應前需要進行跨宏觀距離(～V/A)的擴散而被減緩(特別是對于標記的分子)。通過定義參與所述結(jié)合反應的流體厚度，即可用于結(jié)合所述表面的溶液區(qū)室，而將這一特征擴散距離V/A計入該動力學模型之中。超過所述特征V/A高度的任何溶質(zhì)在相關(guān)時間范圍內(nèi)可能未在所述結(jié)合反應中有所貢獻。

C.實驗結(jié)果

為檢驗該解析解，使用上述模型測定了上皮細胞粘附分子(EpCAM)抗體-抗原結(jié)合動力學并將所述實驗結(jié)果與文獻進行了比較。

結(jié)合于傳感器的分子的改變濃度

在圖5所示的第一組實驗中，進行了MNP標記的抗EpCAM抗體與表面結(jié)合的EpCAM蛋白質(zhì)的結(jié)合分析。所述模型中的是C₀、n_max和V/A是根據(jù)尺寸和濃度所確定的固定值，并且通過以所述動力學模型所預測的結(jié)合曲線對實驗數(shù)據(jù)進行的最佳擬合來確定k_on。進行了固定濃度的MNP-抗EpCAM抗體對改變濃度的表面結(jié)合EpCAM蛋白的結(jié)合分析。使用二倍稀釋以制備一系列的傳感器表面；其起始于5阿摩爾EpCAM蛋白的加載量(例如，結(jié)合于所述傳感器表面并且具功能的蛋白質(zhì)的量)并且進行依次稀釋低至20仄摩爾。在結(jié)合曲線間變化的唯一參數(shù)是n_max，所有其它參數(shù)都是不變的。當使這一參數(shù)在所述模型中變化時，各實驗結(jié)合曲線被精確地擬合(圖5(a))。所述參數(shù)的數(shù)值為(未經(jīng)稀釋)n_max＝9.5×10^-10mol m^-2，C₀＝6.8×10^-7M，A＝5.4×10^-9m²以及V＝5.5×10^-12m³。因此，k_on＝2.5×10⁴M^-1s^-1對所述數(shù)據(jù)進行了最佳擬合。本實驗中的全部曲線對通過所述模型所預測的曲線的擬合誤差為R²＝0.98。此外，在將所述MNP-抗體溶液洗去并用抗原加載緩沖液替換之后，通過將隨后的數(shù)據(jù)對基本指數(shù)衰減模型進行擬合而計算解離速率常數(shù)，n_Release(t)＝n_maxe^-koff(t)，其中n₀是結(jié)合MNP在洗滌時的表面濃度。因此，所述抗EpCAM抗體-抗原解離速率常數(shù)k_off被測定為2.0×10^-6s^-1。這證實了上文對于k_off與k_on相比較時可忽略不計的假設。

分析混合物中的改變濃度的分析物

在圖5(b)所示的第二組實驗中，使用833仄摩爾的EpCAM蛋白的恒定加載量((圖5a)所使用的最大量的1/6)對各個傳感器進行固定化。涂覆于所述傳感器的抗體-MNP復合體的濃度在未稀釋、兩倍稀釋和八倍稀釋的抗體-MNP復合體溶液之間變動(對應于所述模型中的C₀、C₀/2和C₀/8)。由于無論C₀被改變還是n_max被改變，抗體-抗原相互作用均保持相同，描述以上相互作用的速率常數(shù)在這些實驗中保持相同。在對模型的擬合之中，獲得了2.5×10⁴M^-1s^-1的相同k_on，這支持了所述分析模型的有效性。全部曲線對通過所述模型的擬合誤差為R²＝0.96。這些結(jié)果處于文獻所報道的正常范圍之內(nèi)，這證實了所述動力學模型對于預測結(jié)合的有效性以及所產(chǎn)生的結(jié)果的精確度(參見表1)

為對MNP-抗癌胚抗原(CEA)抗體與CEA的結(jié)合動力學，MNP-抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抗體與VEGF的結(jié)合動力學，以及MNP-鏈霉親和素與生物素的結(jié)合動力學進行定量而進行了類似的實時實驗(圖6(a)和6(d))。對于抗-CEA抗體，在GMR傳感器和SPR儀器上均使用相同的試劑對結(jié)合和解離速率常數(shù)進行了監(jiān)測并對結(jié)果進行了比較(圖6(c)和6(d))。

圖6(a)所示為在12組重復傳感器上的抗CEA抗體對抗原的多元動力學分析以及在3組重復傳感器上的抗VEGF抗體對抗原的多種動力學分析圖。CEA抗體-抗原的k_on為3.3×10⁴M^-1s^-1，其平均擬合誤差為2.8％，并且VEGF抗體-抗原的k_on為1.6×10⁴M^-1s^-1，其平均擬合誤差為8.2％。圖6(b)示出了監(jiān)測生物素對鏈霉親和素的結(jié)合動力學的25組重復傳感器示圖。k_on為4.67×10⁶M^-1s^-1，其平均擬合誤差為1.6％。還是用競爭生物素分析監(jiān)測了釋放動力學。圖6(c)示出了SPR圖并且圖6(d)示出了基于磁納米傳感器的平臺，當在平行實驗中監(jiān)測CEA抗體與CEA抗原結(jié)合的動力學時所述平臺提供了類似的實時結(jié)合曲線。GMR生物傳感器提供了5.0×10⁴M^-1s^-1的k_on以及4.4×10^-4s^-1的k_off，而SPR實驗產(chǎn)生了5.2×10⁴M^-1s^-1的k_on以及3.03×10^-4s^-1的k_off。SPR的動態(tài)范圍低于兩個數(shù)量級，而所述GMR傳感器具有4個數(shù)量級或更大的動態(tài)范圍。GMR傳感器的動態(tài)范圍可使用更高的溶質(zhì)濃度而進一步提高。在圖6(d)中，所述結(jié)合曲線的最初1000秒被用于獲得根據(jù)所述分析模型的k_on值。

所述GMR傳感器陣列和SPR測量產(chǎn)生了相互一致的動力學速率常數(shù)并且一致于文獻所報道的數(shù)值(表1)，這表明當使用本文給出的分析模型之時所述MNP標記對于所測得的速率常數(shù)基本無影響。

表1

表1示出了當使用所述GMR傳感器陣列和SPR之時，對生物素與鏈霉親和素結(jié)合的結(jié)合速率常數(shù)、EpCAM抗原與EpCAM抗體的結(jié)合速率常數(shù)、CEA抗原與CEA抗體的結(jié)合速率常數(shù)以及VEGF抗原與VEGF抗體的結(jié)合速率常數(shù)的比較。對于SPR和GMR傳感器實驗均使用了相同的抗體對。動力學分析的兩種方法均與文獻相一致。

與傳感器結(jié)合的磁性標簽數(shù)量的定量

掃描電子顯微鏡(SEM)證實，所述分析系統(tǒng)能夠?qū)Ω鱾€傳感器之上所捕獲的蛋白質(zhì)數(shù)量進行定量。因此，通過將所述GMR信號對結(jié)合于所述傳感器表面的磁性標簽的絕對數(shù)量進行校準而獲得了所結(jié)合的蛋白質(zhì)的量和每MNP所產(chǎn)生的信號。例如，在三至八組重復傳感器上，EpCAM蛋白從2.5阿摩爾開始被以兩倍的降幅進行系列稀釋直至78仄摩爾。向全部傳感器添加20倍稀釋度的MNP-抗體復合體并監(jiān)測所述結(jié)合動力學。在20分鐘的孵育時間之后，洗去磁性標記的抗體的溶液以終止所述結(jié)合反應，在該點通過SEM對具有各個表面濃度的傳感器進行成像(圖7)。通過對所述實時實驗數(shù)據(jù)進行歸一化并且將其對所述模型進行擬合，以對所述初始MR(ΔMR/MR₀)進行歸一化的MR形式測得的傳感器信號被轉(zhuǎn)換成為與各傳感器結(jié)合的磁性標簽的數(shù)量。例如，使用2.5阿摩爾的EpCAM蛋白進行功能化的傳感器在所述實驗時間內(nèi)捕獲了192,000個磁性標簽。SEM成像顯示所述實驗結(jié)果符合所述動力學模型。因此，所述動力學模型可被用于對各傳感器所結(jié)合的標簽數(shù)量以及給定反應期間結(jié)合的蛋白質(zhì)數(shù)量進行定量。

使用該模型，每150個MNP產(chǎn)生1ppm的信號。所述傳感器的檢測下限(LOD)約為20ppm(通過經(jīng)非互補抗體包埋的傳感器的平均背景信號加上兩倍標準差所定義)。因此，可檢測0.6顆粒/μm²或者更低。

此外，所述模型能夠解釋所述傳感器表面將在何時發(fā)生飽和。隨著提高分析物的加載量以使蛋白質(zhì)的表面濃度接近所述傳感器表面的最大MACS濃度，可在所述信號中觀察到飽和。該飽和在5阿摩爾或更高的加載量下發(fā)生。所述加載量通過將已知濃度和體積的蛋白質(zhì)沉積于所述傳感器表面而進行計算。在洗去所述未反應蛋白質(zhì)之后，使用納米顆粒對結(jié)合蛋白質(zhì)的量進行標記。通過掃描電子顯微鏡對具活性的并且被結(jié)合的蛋白質(zhì)的數(shù)量進行定量。在5阿摩爾或更高的加載量下，納米顆粒間的空間效應變得明顯。在全部實驗中使用了5阿摩爾或更低的加載量。當在傳感器表面沉積低蛋白質(zhì)濃度時，所述傳感器表面的結(jié)合蛋白質(zhì)的距離將超過1個MNP直徑，由此防止了各個納米顆粒結(jié)合超過一個抗原。例如，在所檢測的最高加載量5阿摩爾下，所述傳感器表面的平均距離約為60nm。由于所述MNP直徑僅為46nm，單一MNP結(jié)合極不可能同時結(jié)合超過一個被結(jié)合蛋白。因此，親合力(例如，兩個或更多個分子之間的多重結(jié)合相互作用的組合強度)基本可忽略不計。例如，當在傳感器表面沉積10阿摩爾蛋白質(zhì)時，實驗中顯現(xiàn)當與5阿摩爾和更低量的信號相比所述傳感器表面接近飽和(圖8)。通過所述模型，10阿摩爾的加載量據(jù)描述相當于n_max等于1.95×10^-9mol m^-2。當將所述模型預測的這一飽和值與所述傳感器的物理限制和緊密堆積的MNP幾何形狀進行比較時，這些數(shù)據(jù)緊密吻合。單層中受限于MNP大小的蛋白質(zhì)最大表面濃度為1.0×10^-9摩爾m^-2。

表位定位

使用本文所述的實時結(jié)合分析和動力學模型進行表位定位實驗。將一組不同的抗EpCAM單克隆抗體固定于所述GMR傳感器。使用抗EGFR抗體進行功能化的傳感器作為內(nèi)部對照被包含在內(nèi)。隨后將EpCAM加入溶液中并且對以獨特的結(jié)構(gòu)在各個捕獲抗體上被捕獲。隨后加入EGFR蛋白。如果所述捕獲的EpCAM暴露出EGF樣重復，則EGFR能夠進行結(jié)合。然而，如果所述捕獲的EpCAM蛋白以遮蔽所述EGF樣重復的方式取向，則EGFR不能進行結(jié)合(圖9(a))。

圖9(b)顯示，抗EpCAM抗體#1結(jié)合EpCAM蛋白以暴露所述EGF樣結(jié)構(gòu)域；然而，EpCAM-抗-EpCAM抗體#2復合體遮藏了所述EGF樣結(jié)構(gòu)域。使用特異于EpCAM的獨特表位的單克隆抗EpCAM抗體對抗EpCAM Ab#1傳感器和抗EpCAM Ab#2傳感器進行功能化。當EpCAM結(jié)合抗EpCAM抗體#1時，EGF樣結(jié)構(gòu)域被暴露并且抗EGFR抗體-MNP復合體能夠進行結(jié)合。然而，當被捕獲的EpCAM蛋白結(jié)合于抗EpCAM抗體#2時，EGF樣結(jié)構(gòu)域未被暴露并且不發(fā)生結(jié)合。

當將所述抗EGFR抗體-MNP復合體與由EpCAM或由EGFR捕獲抗體所捕獲的EGFR蛋白的結(jié)合曲線進行歸一化時，所述歸一化結(jié)合曲線顯示結(jié)合的動力學相同(圖9(c))。即使各個傳感器上的大分子結(jié)構(gòu)配制有所不同，所述動力學相互作用仍然相同。在圖9(c)中所述結(jié)合曲線被歸一化。由于兩曲線遵循相同的結(jié)合軌跡，這兩個實驗所涉及的動力學相互作用相同。

分子結(jié)合相互作用的空間和時間監(jiān)測

使用所述實時結(jié)合分析進行的另一個實驗是在空間(由于所述陣列結(jié)構(gòu)的高密度)和時間(由于迅速和實時的讀出)上對蛋白質(zhì)結(jié)合事件進行監(jiān)測。單克隆抗CEA捕獲抗體被結(jié)合于傳感器陣列。在遞送所述CEA抗原蛋白質(zhì)之前，將溶液中以抗CEA抗體標記的磁性標簽在所述傳感器陣列之上進行孵育。將CEA抗原注入所述陣列，并且當?shù)拇判詷擞浀臋z測抗原與被捕獲的CEA抗原蛋白質(zhì)結(jié)合時，對CEA抗原在所述陣列上的擴散進行監(jiān)測。CEA抗原蛋白與所述傳感器表面的結(jié)合以及隨后磁性標記的抗體的結(jié)合沿著空間分布的傳感器產(chǎn)生MR信號的變化。通過觀測所述MNP-抗-CEA抗體與所述結(jié)合于傳感器的CEA抗原的結(jié)合動力學而對CEA抗原與所述傳感器的結(jié)合進行了可視化(圖10和圖11(a)和11(b))。對四個四磁性傳感器組檢測了所述信號隨時間的變化(圖11(a)和11(b))。以高空間和時間分辨率對蛋白質(zhì)結(jié)合事件、蛋白質(zhì)擴散和蛋白質(zhì)動力學進行了分析?？赏ㄟ^使用蛋白質(zhì)擴散模型擬合不同傳感器位點的MR信號的時間過程而產(chǎn)生傳輸參數(shù)，諸如被注入蛋白質(zhì)的擴散率。

實驗結(jié)果顯示，本文公開的實時磁性傳感器裝置是用于檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的高通量、高敏感度、實時的結(jié)合分析。以上產(chǎn)生的動力學模型提供了參與標記蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的主要過程的分析模型。所述實時分析結(jié)合分析和分析模型被用于測量蛋白質(zhì)結(jié)合速率常數(shù)以及對結(jié)合于給定傳感器的蛋白質(zhì)數(shù)量進行精確定量。還進行了蛋白質(zhì)表位定位實驗和蛋白質(zhì)擴散實驗。

盡管通過說明和實施例已經(jīng)對前述發(fā)明進行了以明確和了解為目的的一定細節(jié)的描述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過本發(fā)明的指導易于了解，在不背離由附屬權(quán)利要求書精神和范圍的前提下可以作出特定改變和修改。

因此，前文僅僅是對本發(fā)明的原理的說明。應當了解，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應能夠設計多種裝置，盡管未在本文明確描述或展示，所述裝置具體實施了本發(fā)明的原理并且被包含于本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)。此外，本文描述的全部實施例和和條件性語言主要意在用于幫助讀者理解本發(fā)明的原理以及發(fā)明人在現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)上作出的構(gòu)思，并且不應解釋為對具體描述的實施例和條件的限制。進一步，描述本發(fā)明原理、方面和實施方案的本文全部申明及其具體的實施例被用于涵蓋其結(jié)構(gòu)上的和功能上的等價物。此外，這些等價物被預期包含當前已知的等價物和未來所開發(fā)出的等價物，即，被開發(fā)的實施相同功能的任意元件，無論其結(jié)構(gòu)如何。因此，本發(fā)明的范圍并不意在受限于本文所展示和描述的示例性的實施方案。更確切而言，本發(fā)明的范圍和精神由附屬權(quán)利要求書所具體規(guī)定。