本發(fā)明涉及分析化學(xué)與電化學(xué)發(fā)光傳感器分析領(lǐng)域，具體涉及一種基于金納米-石墨烯復(fù)合材料和適配體的檢測(cè)凝血酶的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器以及制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

凝血酶主要是指凝血級(jí)聯(lián)效應(yīng)蛋白酶。它主要進(jìn)行循環(huán)纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維白體，然后聚合成纖維蛋白，即血栓纖維素。人類的凝血酶主要用于在出現(xiàn)外傷時(shí)幫助凝血。檢測(cè)在血液中的凝血酶含量的必要性不僅是為了那些遭受凝血功能異常疾病的病人，也是為了檢驗(yàn)治療藥物在外科手術(shù)和血栓疾病的處理的效果。因此，靈敏的、準(zhǔn)確的凝血酶檢測(cè)方法在疾病預(yù)防中是關(guān)鍵和有用的。

適配體是一些天然的單鏈DNA或者RNA。他們折疊成二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，使凝血酶能夠以非常高效和特異性地結(jié)合一些目標(biāo)分子（小分子、核酸、蛋白質(zhì)或者整個(gè)細(xì)胞）。適配體通常通過(guò)系統(tǒng)的演化指數(shù)富集配體（SELEX）。與傳統(tǒng)的識(shí)別元素——抗體相比，適配體有許多獨(dú)特的特點(diǎn)例如最小的免疫原性、合成方便、容易化學(xué)修飾、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定有柔性。這些特點(diǎn)使適配體成為了發(fā)展適配體為基礎(chǔ)的分析方法的一種理想的候選者。這些方法包括電化學(xué)發(fā)光法（ECL），電化學(xué)法，熒光法以及比色法。到目前為止，有兩種凝血酶適配體已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，一種是TBA1能夠結(jié)合凝血酶的纖維蛋白原位點(diǎn)，結(jié)合常數(shù)Kd在100 nM左右。另一種是TBA2更好的結(jié)合凝血酶（Kd=0.5 nM）。

與其他方法相比，電化學(xué)發(fā)光法結(jié)合了電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光法的優(yōu)點(diǎn)，例如低的背景信號(hào)，容易控制和低的檢測(cè)限。結(jié)合電化學(xué)發(fā)光的有點(diǎn)和適配體的特異性的特點(diǎn)，適配體電化學(xué)發(fā)光傳感器已經(jīng)變成了一種重要的有前景的檢測(cè)方法。由于Ru(bpy)₃²⁺/TprA體系出色的穩(wěn)定性和很高的發(fā)光效率，Ru(bpy)₃²⁺/TprA體系得到了很好的研究。尤其在基于提高Ru(bpy)₃²⁺/TprA體系發(fā)光性能方面做了深入的研究。納米材料比如碳納米管、石墨烯、金納米以及納米復(fù)合材料用來(lái)放大電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的應(yīng)用已經(jīng)在電化學(xué)發(fā)光傳感器中的得到了廣泛的應(yīng)用。最近石墨烯已經(jīng)以石墨烯為基礎(chǔ)的納米復(fù)合材料在構(gòu)建電子元件中得到了廣泛的重視，像在激光發(fā)射、太陽(yáng)能電池。這些電子元件大多都需要一些輕薄以及電子傳導(dǎo)效率高的材料。石墨烯是一種單原子層厚的石墨材料，而且石墨烯-金屬?gòu)?fù)合材料擁有出色的物理化學(xué)性質(zhì)比如大的比表面積、可控的電子性質(zhì)。這些性質(zhì)讓石墨烯-金屬?gòu)?fù)合材料在構(gòu)建電化學(xué)發(fā)光傳感器中已經(jīng)成為了有前景的電極材料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種電化學(xué)發(fā)光夾心生物傳感器及其制備與應(yīng)用以解決目前對(duì)凝血酶的檢測(cè)設(shè)備和處理過(guò)程復(fù)雜、價(jià)格昂貴、靈敏度不高等問(wèn)題。

一種電化學(xué)發(fā)光夾心生物傳感器的制備方法，主要包括以下步驟：

（S1）采用恒電位法制備金納米-石墨烯修飾的玻碳電極；

（S2）采用檸檬酸還原氯金酸法制備AuNPs；

（S3）用Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS標(biāo)記TBA2并溶解于PBS溶液中，得到Ru-TBA2信標(biāo)；

（S4）將步驟（S3）所得Ru-TBA2信標(biāo)用TCEP（磷酸三氯乙酯）和pH為5.2的醋酸鹽緩沖溶液預(yù)處理1 h以斷開(kāi)巰基之間形成的雙硫鍵；

（S5）將步驟（S2）所得AuNPs加入用NaOH處理過(guò)的玻璃瓶中，再加入步驟（S4）所得Ru-TBA2，在室溫遮光下培育16 h后加入pH為8.2 的Tris-醋酸鹽緩沖溶液和NaCl，繼續(xù)在溫室遮光下培育24 h；離心除去多余的Ru-TBA2；把得到的Ru-TBA2-AuNPs溶解到PBS緩沖溶液中；

（S6）將所述步驟（S1）所得到金納米-石墨烯修飾的玻碳電極浸入含有巰基修飾的TBA1溶液中培育2～8 h，然后在含有凝血酶溶液中培育20 min；最后在步驟（S5）所得Ru-TBA2-AuNPs中培育20 min。

金納米-石墨烯復(fù)合材料，既有石墨烯具有的良好性質(zhì)，獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其具有優(yōu)異的電學(xué)、熱學(xué)、力學(xué)以及化學(xué)性質(zhì)，而且在金納米的相互作用下，這些性質(zhì)有明顯的增強(qiáng)。而且金納米能夠提供巰基修飾DNA分子修飾的位點(diǎn)。在本發(fā)明中，電極表面的金納米和巰基修飾的適配體TBA1通過(guò)Au-S化學(xué)鍵結(jié)合可以有效的固定適配體TBA1。另一方面金納米-石墨烯復(fù)合材料可以大大增大電極的電子傳導(dǎo)效率，這樣就可以增大電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的響應(yīng)。

Ru(bpy)₃²⁺是一種穩(wěn)定的、發(fā)光效率非常高的發(fā)光試劑，由于其分子量和分子空間體積較酶等標(biāo)記小很多，且不影響核酸的特異性和雜交活性，使得Ru(bpy)₃²⁺在分子水平上對(duì)核酸進(jìn)行標(biāo)記而成為可能。再加上Ru(bpy)₃²⁺可在電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中進(jìn)行再生循環(huán)反應(yīng)，使得一個(gè)標(biāo)記物在每一個(gè)檢測(cè)周期中會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量的光子，因而分析靈敏度很高。在本發(fā)明的方法中利用Ru(bpy)₃²⁺標(biāo)記TBA2不僅不會(huì)影響適配體TBA2與凝血酶的結(jié)合，而且還還能增強(qiáng)檢測(cè)反應(yīng)的靈敏度。在本發(fā)明中，在溶液中，利用金納米顆粒連接修飾有Ru(bpy)₃²⁺的TBA2，由于一個(gè)金納米顆?？梢赃B接很多數(shù)量的TBA2分子從而形成一種放射狀的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)源（Ru-TBA2-AuNPs），那當(dāng)體系中出現(xiàn)少量的凝血酶時(shí)，就會(huì)引入大量的發(fā)光試劑，這樣進(jìn)一步對(duì)電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的響應(yīng)進(jìn)行了放大。

通過(guò)本發(fā)明制備的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器，由于Ru(bpy)₃²⁺標(biāo)記在適配體TBA2上，進(jìn)而TBA2與金納米形成Ru-TBA2-AuNPs的信號(hào)大分子。適配體TBA1通過(guò)Au-S化學(xué)鍵連接在修飾有金納米-石墨烯的電極表面。當(dāng)體系中出現(xiàn)凝血霉時(shí)，凝血酶就會(huì)和TBA1和TBA2結(jié)合，從而把Ru-TBA2-AuNPs引入到電極表面，通過(guò)電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的增強(qiáng)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)凝血酶的定量檢測(cè)。

生物分子需要一定的電解質(zhì)環(huán)境，氯化鈉主要提供電解質(zhì)環(huán)境。

進(jìn)一步的，所述巰基修飾的TBA1序列為5’-SH-(CH₂)₆-TTTTTGGTTGGTGTGGTTGG-3’；所述Ru-TBA2信標(biāo)的序列為5’-SH-(CH₂)₆-TTTTTTTTTTTTTTTAGTCCGTAGGGCAGGTGGGGGG TGACTT-(CH₂)₆-NH₂-3’。

進(jìn)一步的，所述檸檬酸還原氯金酸法制備AuNPs主要包括：取氯金酸溶液于容器中加熱至沸騰，然后快速加入檸檬酸鈉；繼續(xù)加熱并不停的攪拌直到溶液的顏色由黃色變成紅色，再不停的攪拌溶液冷卻到室溫，儲(chǔ)存在4 °C下備用。

進(jìn)一步的，所述恒電位法制備金納米-石墨烯修飾的玻碳電極主要包括： 采用氧化石墨烯和氯金酸，在電位為-1.1 V下恒電位沉積到玻碳電極600～1000 s。使用玻碳電極前先將玻碳電極用α-A1₂O₃拋光粉拋光；洗滌，分別在去離子水和乙醇中超聲10 min。

進(jìn)一步的，所述Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS的合成主要包括以下步驟：

（S11）將Ru(bpy)₂Cl₂、碳酸氫鈉和2,2’-聯(lián)吡啶-4,4’-二羧酸混合均勻，加入乙醇-水溶液中加熱回流后冷卻過(guò)濾制備Ru(bpy)₂(dcbpy)(PF₆)₂；

（S12）再將N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺攪拌混合后加入DMF溶液使其充分溶解后加入Ru(bpy)₂(dcbpy)(PF₆)₂中合成Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS。

進(jìn)一步的，步驟（S5）制備所得Ru-TBA2-AuNPs的濃度為2～8 μM；步驟（S2）制備得到的AuNPs粒徑為6-10 nm。Ru-TBA2-AuNPs如果濃度太低，在電極表面引入的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)源太少，影響電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的響應(yīng)，如過(guò)太多，會(huì)增加傳感器表面的空間位阻，也不利于信號(hào)源的引入。

進(jìn)一步的，所述PBS緩沖溶液的PH值為7.4。

一種上述制備方法得到的電化學(xué)發(fā)光夾心生物傳感器。

一種上述電化學(xué)發(fā)光夾心生物傳感器的應(yīng)用，主要用于凝血酶的檢測(cè)。由于凝血酶能夠特異性的結(jié)合適配體TBA1和TBA2，所以在凝血霉出現(xiàn)的情況下，發(fā)光試劑Ru-TBA2-AuNPs就會(huì)被引入到電極表面，從而引起電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的增強(qiáng)，根據(jù)電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的增強(qiáng)程度實(shí)現(xiàn)對(duì)凝血酶的定量檢測(cè)。電化學(xué)發(fā)光生物傳感器對(duì)凝血酶的檢測(cè)限為6.3 pM。

進(jìn)一步的，所述凝血酶的檢測(cè)主要包括以下步驟：

（S21）將所述電化學(xué)發(fā)光夾心生物傳感器浸入到待測(cè)凝血酶溶液中20～40 min，然后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗電極；

（S22）將所述電化學(xué)發(fā)光夾心生物傳感器浸入到1～10μM的Ru-TBA2-AuNPs中20～40 min，然后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗電極；

（S23）將所述電化學(xué)發(fā)光生物傳感器作為工作電極在三電極系統(tǒng)中，以0.05～0.1 M三正丙胺溶液作為檢測(cè)溶液進(jìn)行電化學(xué)及電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的檢測(cè)凝血酶的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器具有如下優(yōu)點(diǎn)：1）具有良好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、對(duì)凝血酶具有很高的特異性，不易受到檢測(cè)樣品中其他物質(zhì)的干擾；2）利用金納米-石墨烯復(fù)合材料對(duì)電子傳導(dǎo)效率的提高，促進(jìn)電化學(xué)發(fā)光引號(hào)的響應(yīng)，以及大信號(hào)源Ru-TBA2-AuNPs的引入對(duì)電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的放大，從而極大地增大了本發(fā)明傳感器的靈敏度；3）操作簡(jiǎn)單方便，能夠快速準(zhǔn)確檢測(cè)樣品中凝血酶的含量。本發(fā)明的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器在檢測(cè)血液中的凝血酶含量體現(xiàn)了良好的性能，因此對(duì)凝血類藥物的研發(fā)有一定的幫助。

附圖說(shuō)明

圖1為發(fā)明的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器用于檢測(cè)凝血酶的實(shí)驗(yàn)原理圖；

圖2為發(fā)明的玻碳電極在不同階段在5 mM鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀中的循環(huán)伏安圖；

圖3為發(fā)明的玻碳電極在不同階段的電化學(xué)阻抗；

圖4為發(fā)明的生物傳感器在凝血酶中發(fā)光強(qiáng)度與Au-TBA2-AuNPs培育時(shí)間的關(guān)系曲；

圖5為發(fā)明的生物傳感器的發(fā)光強(qiáng)度與在不同濃度凝血酶0.01nM(a)、 0.05nM(b)、 0.1 nM(c)中培育時(shí)間的關(guān)系曲線；

圖6為金納米-石墨烯的形貌圖；

圖7為發(fā)明的生物傳感器檢測(cè)不同濃度的凝血酶的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)響應(yīng)，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與凝血酶濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖8發(fā)明的生物傳感器檢測(cè)凝血酶的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)半個(gè)月前后的變化；

圖9為本發(fā)明的生物傳感器抗干擾性圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

一種檢測(cè)凝血酶的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的制備方法，如圖1所示，主要包括以下步驟：

（1）玻碳電極預(yù)處理：玻碳電極經(jīng)0.05μm的α-A1₂O₃拋光粉拋光后，用去離子水沖洗干凈，并分別在去離子水和乙醇中超聲10 min。采用三電極系統(tǒng)檢測(cè)，工作電極為玻碳電極，對(duì)電極為鉑絲電極，參比電極為Ag/AgCl電極，在0.5 M硫酸中，設(shè)置電壓為-0.2～1.6 V，對(duì)玻碳電極進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，檢測(cè)完畢后，用去離子水沖洗電極，吹干電極表面，備用。

（2）金納米-石墨烯修飾玻碳電極的制備：在濃度為0.6 mg mL^-1的氧化石墨烯和25 mM的氯金酸，在電位為-1.1 V下恒電位沉積600 s。其中氧化石墨是根據(jù)改進(jìn)的Hummers理論由鱗片石墨制備。制備得到的金納米-石墨烯的形貌圖如圖6所示，從圖6中可以看出有許多金納米顆粒分布在石墨烯表面，而且金納米顆粒大小均勻，說(shuō)明得到的復(fù)合材料結(jié)構(gòu)均勻。

（3）發(fā)光信標(biāo)Ru-TBA2-AuNPs溶液的制備：

1）金納米顆粒和合成（AuNPs）

AuNPs是通過(guò)用檸檬酸還原氯金酸的方法得到的。具體如下，取50 mL 1～5 mM 的氯金酸溶液于錐形瓶中加熱沸騰，然后5 mL 30～40 mM 的檸檬酸鈉快速的加入到溶液中。溶液繼續(xù)加熱沸騰并不停的攪拌，溶液的顏色由黃色變成紅色。不停的攪拌溶液冷卻到室溫，這樣就得到了AuNPs膠體溶液，儲(chǔ)存在4 °C下備用。

2）Ru-TBA2的合成

① Ru(bpy)₂(dcbpy)(PF₆)₂的合成：稱取0.16 g即0.328 mM的 Ru(bpy)₂Cl₂、0.16 g碳酸氫鈉和0.12 g即0.492 mM 的2,2’-聯(lián)吡啶-4,4’-二羧酸均勻混合，加入10 mL體積比為4:1的乙醇-水溶液后加熱回流4h；回流反應(yīng)完成后，冰浴冷卻7h，冷卻過(guò)程中，采用1 M鹽酸溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至4.4以促進(jìn)反應(yīng)產(chǎn)生橘紅色的結(jié)晶沉淀析出；將充分結(jié)晶后的反應(yīng)液進(jìn)行過(guò)濾，得到的結(jié)晶用甲醇再次溶解后進(jìn)行過(guò)濾以除去不溶雜質(zhì)，得到透亮的橘紅色濾液；將14 mL的六氟磷酸鈉（NaPF₆）（2 g）溶液加入到橘紅色濾液中，冰浴冷卻7h，保證產(chǎn)物能夠完全沉淀析出；采用微孔膜過(guò)濾所得的沉淀物，并對(duì)其進(jìn)行真空干燥，最終得到的紅色粉末狀固體即為Ru(bpy)₂(dcbpy)(PF₆)₂。

②Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS的合成：將0.46 g即2.22 mM的 N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）和0.238 g即2.08 mM N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）攪拌混合，在冰浴條件下加入3 mL DMF溶液使其充分溶解；將溶解液攪拌加入到1 ml含有0.38 g Ru(bpy)₂(dcbpy)(PF₆)₂的DMF溶液中，繼續(xù)常溫條件下攪拌5h以最終制備得到具有活性羧基官能團(tuán)Ru(bpy)2(dcbpy)NHS DMF溶液；取少量產(chǎn)物溶液加入到0.10 M的PBS溶液中進(jìn)行紫外光譜表征，根據(jù)其在279 nm和453 nm處出現(xiàn)特征峰及前期實(shí)驗(yàn)工作，換算估計(jì)濃度為6.02 × 10^-4 M。

③單鏈B-DNA釕配合物標(biāo)記： Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS可以被直接用來(lái)標(biāo)記3’端胺基化的TBA2（其適配體TBA2: 5’-SH-(CH₂)₆-TTTTTTTTTTTTTTTAGTCCGTAGGGCAGGTGGGGGG TGACTT-(CH₂)₆-NH₂-3‘）。首先，取200μL溶解Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS的PBS溶液，加入至含有200μL TBA2溶液（1OD）的5 mL的離心管中，恒溫25℃條件下避光低速震蕩12h；震蕩完成后，將100 μL 3 M的醋酸鈉溶液和2mL冰無(wú)水乙醇加入至反應(yīng)體系終止反應(yīng)，在-20℃條件下靜置12h；靜置完成后，反應(yīng)混合物在12000 r/min轉(zhuǎn)速下低溫離心30 min，小心去除上清液，再用70%的冰無(wú)水乙醇漂洗沉淀物2次，每次漂洗完后離心10 min，最終洗去未被DNA結(jié)合的Ru(bpy)₂(dcbpy)NHS；冷凍干燥后的反應(yīng)沉淀物即為三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記后的電化學(xué)發(fā)光信標(biāo)Ru-TBA2。

3）Ru-TBA2-AuNPs的合成

Ru-TBA2-AuNPs的合成，9 μL 1 mM的Ru-TBA2用1.5 μL 10 mM的TCEP和1 μL 500 mM pH=5.2的醋酸鹽緩沖溶液預(yù)處理1 h以斷開(kāi)巰基之間形成的雙硫鍵。然后3 mL的AuNPs加入到用NaOH處理過(guò)的玻璃瓶中，然后把上述Ru-TBA2加入到玻璃瓶中，在室溫遮光下培育16 h。30 μL 500 mM的pH=8.2 Tris-醋酸鹽緩沖溶液和300 μL 1 M的NaCl緩慢地加入到體系中，混合液在溫室遮光下繼續(xù)培育24 h。在室溫下16000 r/min離心25 min除去多余的Ru-TBA2。最后取4.035 μg Ru-TBA2-AuNPs溶解到200 μL 0.1 M pH=7.4 的PBS緩沖溶液中配制成2μM的Ru-TBA2-AunNPS溶液，儲(chǔ)存在4 °C 下備用。

（4）生物傳感器的構(gòu)建

①把修飾有金納米-石墨烯復(fù)合材料的玻碳電極浸入到20 μL的含有巰基修飾的TBA1溶液2 h。

②然后把電極在含有凝血酶溶液中培育20 min。

③在把上述電極浸泡在含有20 μL 2μM的Ru-TBA2-AuNPs中培育20 min。

本實(shí)施例為了研究本發(fā)明的修飾玻碳電極生物傳感器檢測(cè)凝血的電極反應(yīng)性質(zhì)、機(jī)理和電極過(guò)程動(dòng)力學(xué)參數(shù)。預(yù)處理后的玻碳電極在進(jìn)行修飾前，采用三電極系統(tǒng)循環(huán)伏安法進(jìn)行測(cè)試。

檢測(cè)方法主要包括以下步驟：

（1）即將工作電極為預(yù)處理后的玻碳電極，對(duì)電極為鉑絲電極，參比電極為Ag/AgCl電極的三電極系統(tǒng)，在0.5 M 硫酸中，對(duì)玻碳電極進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，其中設(shè)置電壓為-0.2～1.6 V，檢測(cè)完畢后，用去離子水沖洗玻碳電極，吹干玻碳電極表面，備用。

（2）將所述電極在凝血酶和Ru-TBA2-AuNPs中浸泡20 min，然后分別用磷酸鹽緩沖溶液沖洗電極。

（3）將制備完成的修飾電極放入0.05 M三正丙胺溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，其中其中電壓范圍是0.2～1.25 V，掃描速率是100 mV?s^-1，光電倍增管高壓設(shè)置為-800 V

實(shí)施例2

一種檢測(cè)凝血酶的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

（1）玻碳電極預(yù)處理：玻碳電極經(jīng)0.05μm的α-A1₂O₃拋光粉拋光后，用去離子水沖洗干凈，并分別在去離子水和乙醇中超聲10 min。采用三電極系統(tǒng)檢測(cè)，工作電極為玻碳電極，對(duì)電極為鉑絲電極，參比電極為Ag/AgCl電極，在0.5 M硫酸中，設(shè)置電壓為-0.2～1.6 V，對(duì)玻碳電極進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，檢測(cè)完畢后，用去離子水沖洗電極，吹干電極表面，備用。

（2）金納米-石墨烯修飾玻碳電極的制備：在濃度為0.8 mg mL^-1的氧化石墨烯和55 mM的氯金酸，在電位為-1.1 V下恒電位沉積1000 s。其中氧化石墨是根據(jù)改進(jìn)的Hummers理論由鱗片石墨制備。制備得到的金納米-石墨烯的形貌圖如圖6所示，從圖6中可以看出有許多金納米顆粒分布在石墨烯表面，而且金納米顆粒大小均勻，說(shuō)明得到的復(fù)合材料結(jié)構(gòu)均勻。

（3）發(fā)光信標(biāo)Ru-TBA2-AuNPs溶液的制備：Ru-TBA2-AuNPs的制備過(guò)程同實(shí)施例1，取16.14 μg的Ru-TBA2-AuNPs沖洗溶解于200 μL的PBS溶液中，配制成濃度為8 μM的Ru-TBA2-AuNPs溶液。并于4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

（4）生物傳感器的構(gòu)建

①把修飾有金納米-石墨烯復(fù)合材料的玻碳電極浸入到20 μL的含有巰基修飾的TBA1溶液8 h。

②然后把電極在含有凝血酶溶液中培育40 min。

③在把上述電極浸泡在含有20 μL 8μM的Ru-TBA2-AuNPs中培育40 min。

本實(shí)施例為了研究本發(fā)明的修飾玻碳電極生物傳感器檢測(cè)凝血的電極反應(yīng)性質(zhì)、機(jī)理和電極過(guò)程動(dòng)力學(xué)參數(shù)。預(yù)處理后的玻碳電極在進(jìn)行修飾前，采用三電極系統(tǒng)循環(huán)伏安法進(jìn)行測(cè)試。

檢測(cè)方法主要包括以下步驟：

（1）即將工作電極為預(yù)處理后的玻碳電極，對(duì)電極為鉑絲電極，參比電極為Ag/AgCl電極的三電極系統(tǒng)，在0.5 M 硫酸中，對(duì)玻碳電極進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，其中設(shè)置電壓為-0.2～1.6 V，檢測(cè)完畢后，用去離子水沖洗玻碳電極，吹干玻碳電極表面，備用。

（2）將所述電極在凝血酶和Ru-TBA2-AuNPs中浸泡40 min，然后分別用磷酸鹽緩沖溶液沖洗電極。

（3）將制備完成的修飾電極放入0.1M三正丙胺溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，其中其中電壓范圍是0.2～1.25 V，掃描速率是100 mV?s^-1，光電倍增管高壓設(shè)置為-800 V。

實(shí)施例3

1、循環(huán)伏安測(cè)試對(duì)比

將5個(gè)按照實(shí)施例1或2處理得到的玻碳電極分別做以下處理a為裸電極、b修飾有金納米-石墨烯復(fù)合材料的電極、c修飾有TBA1、d引入凝血酶、e引入TBA2-Ru –AuNPs。再把a(bǔ)、b、c、d、e在5 mM鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀中的循環(huán)伏安測(cè)試，測(cè)試結(jié)果如圖2所示，只有當(dāng)金納米-石墨烯復(fù)合材料修飾電極后，電流有明顯的增加，說(shuō)明本發(fā)明的復(fù)合材料具有很好的導(dǎo)電性能。

2、電化學(xué)阻抗測(cè)試對(duì)比

將5個(gè)按照實(shí)施例1或2處理得到玻碳電極分別做以下處理a為裸電極、b修飾有金納米-石墨烯復(fù)合材料的電極、c修飾有TBA1、d引入凝血酶、e引入TBA2-Ru –AuNPs。再把a(bǔ)、b、c、d、e進(jìn)行阻抗測(cè)試，測(cè)試結(jié)果如圖3所示阻抗譜圖，從圖中可以看出當(dāng)金納米-石墨烯修飾電極后阻抗有明顯的減小進(jìn)一步說(shuō)明復(fù)合材料有很好的導(dǎo)電性能。

3、Au-TBA2-AuNPs中培育時(shí)間的的研究

將按照實(shí)施例1或2得到的金納米-石墨烯修飾的玻碳電極浸入含有巰基修飾的TBA1溶液中培育2～8 h，然后在含有凝血酶溶液中培育20 min。最后在按照本實(shí)施例1或2得到的Ru-TBA2-AuNPs中培育不同的時(shí)間，如圖4所示，a、b和c分別為濃度為0.01nM、 0.05nM和0.1 nM的濃度的凝血酶在Ru-TBA2-AuNPS中培育不同時(shí)間的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的變化，從圖中可以看出隨著時(shí)間的增加電化學(xué)發(fā)光信號(hào)不斷增加，在20 min達(dá)到穩(wěn)定，說(shuō)明在Ru-TBA2-AuNPS中最佳培育時(shí)間為20 min。

4、凝血酶中培育時(shí)間的的研究

將按照實(shí)施例1或2得到的金納米-石墨烯修飾的玻碳電極浸入含有巰基修飾的TBA1溶液中培育2～8 h，然后在含有凝血酶溶液中培育不同時(shí)間。最后在按照本實(shí)施例1或2得到的Ru-TBA2-AuNPs中培育20min，如圖5所示， a、b和c分別為濃度為0.01nM、 0.05nM和0.1 nM的凝血酶在不同培育時(shí)間中電化學(xué)發(fā)光信號(hào)變化曲線，從圖5中可以看出隨著時(shí)間的增加電化學(xué)發(fā)光信號(hào)不斷增加，在30 min時(shí)達(dá)到穩(wěn)定，說(shuō)明在凝血酶中最佳培育時(shí)間為30 min。

5、凝血酶中濃度對(duì)電化學(xué)發(fā)光信號(hào)響應(yīng)的影響

將a-g的濃度分別為0.01 nM、0.05 nM、 0.1 nM、0.5 nM、1 nM、5 nM和10 nM的凝血酶按照實(shí)施例1或者實(shí)施例2的方法進(jìn)行檢測(cè)，如圖7所示，對(duì)不同濃度的凝血酶的電化學(xué)響應(yīng)強(qiáng)度和凝血酶濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，而且線性關(guān)系很好。

6、傳感器穩(wěn)定性測(cè)試

如圖8所示，a為半個(gè)月前的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，b為半個(gè)月的發(fā)光信號(hào)，從圖中可以看出半個(gè)月前后信號(hào)變化不大，說(shuō)明傳感器很穩(wěn)定。

7、選擇性的測(cè)試

為了探究傳感器對(duì)其他物質(zhì)的抗干擾性，對(duì)其他常見(jiàn)的物質(zhì)牛血清蛋白、溶菌酶、人血清蛋白、免疫球蛋白、胰島素、胰蛋白酶、組氨酸進(jìn)行平行干擾實(shí)驗(yàn)。從圖9中可以看出，傳感器對(duì)凝血酶有強(qiáng)烈的信號(hào)響應(yīng)，對(duì)其他干擾物質(zhì)幾乎沒(méi)有信號(hào)響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本實(shí)施例制備的傳感器具有良好的抗干擾性能，具有良好的凝血酶識(shí)別特異性。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已， 并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明， 對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)， 其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改， 或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)， 所作的任何修改、 等同替換、 改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 汕頭大學(xué)

<120> 一種電化學(xué)發(fā)光夾心生物傳感器及制備與應(yīng)用

<130> 2016

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

shchtttttg gttggtgtgg ttgg 24

<210> 2

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (50)..(50)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 2

shchtttttt ttttttttta gtccgtaggg caggtggggg gtgacttchn h 51