本發(fā)明涉及利用生物敏感標志物檢測水體污染，更具體地說，本發(fā)明涉及一種利用魚的GPX活性檢測水體污染程度的方法。
背景技術(shù)：
隨著城鎮(zhèn)化和工農(nóng)業(yè)的迅猛發(fā)展，水體污染日益加劇。水域中的水體污染物也各有不同，有的為單一污染物，也有多種污染物混合污染。對于未知水域中，不管是單一污染物的污染，還是多種污染物的污染，怎樣獲悉水體是否被污染，甚至知道其污染程度，并能直觀判斷該水域的污染對生物的危害已達到何種程度。對于水體中受到重金屬或菲一種或兩種污染時，用化學方法可以定性、定量檢測到污染，但是無法檢測其危害性和危害程度以及污染程度的準確性。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。
本發(fā)明還有一個目的就是提供一種利用魚的GPX活性檢測水體污染程度的方法，本方法利用魚的GPX作為敏感生物標記物，可敏感地監(jiān)測多氯聯(lián)苯污染的污染程度和危害程度，還可以敏感檢測菲(Phe)等多環(huán)芳烴污染的污染程度和危害程度，為水體生態(tài)環(huán)境監(jiān)測、毒理診斷、調(diào)控和防治提供準確、快速的科學方法。
為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其他優(yōu)點，提供了一種利用魚的GPX活性檢測水體污染程度的方法。本檢測方法為獲取需要檢測的水域中的魚，并采用所述魚的GPX作為敏感生物標記物。其中，GPX為谷胱甘肽過氧化物酶的簡寫。
優(yōu)選的是，所述魚的GPX活性與水體中菲的濃度呈負相關(guān)。
優(yōu)選的是，所述魚的GPX活性與水體中多氯聯(lián)苯的濃度呈負相關(guān)。
優(yōu)選的是，建立魚的GPX活性與污染物濃度關(guān)系的標準曲線，然后將待檢測水域中的同種同大小的魚的GPX活性與所述標準曲線比對，得到待檢測水域中水體污染物濃度。
優(yōu)選的是，所述標準曲線為魚的GPX活性與菲濃度關(guān)系的曲線，或者魚的GPX活性與多氯聯(lián)苯濃度關(guān)系的曲線。
優(yōu)選的是，所述魚的GPX活性測定包括如下步驟：
步驟一、待測樣本處理：制備全魚勻漿，然后離心分層，取上層清液為待測樣本；
步驟二、待測樣本蛋白濃度的測定：分別將等量的雙蒸水、蛋白標準品和待測樣本加入1、2、3號管中，并分別向各管加入等量的考馬斯亮藍顯色劑，分別混勻，靜置，預熱，用分光光度計并用雙蒸水調(diào)零后，于1cm光徑，在波長595nm處，測定1、2、3號管中物質(zhì)的光密度(OD)，分別記為1號OD值，2號OD值，3號OD值，然后代入如下公式計算得待測樣本蛋白濃度：
步驟三、酶促反應：使用谷胱甘肽過氧化物酶測定試劑盒進行測定，分別在對照管和測定管中加入0.2mL濃度為1mmol/L的谷胱甘肽(GSH)，只在測定管中加入0.2mL待測樣本，然后將所述對照管和測定管置于37℃水浴預溫5分鐘后，分別各加入試劑一應用液0.1mL，于37℃反應2.5-5分鐘，再分別各加入試劑二應用液2mL，只在對照管中加入待測樣本0.2mL，然后分別混勻，用冷凍離心機，1000g，4℃，離心10分鐘，分別取上清液稀釋n倍作顯示反應；
步驟四、顯色反應：在空白管中加入1mL濃度為1mmol/L的GSH,在標準管中加入1mL濃度為20umol/L的GSH標準品應用液，在對照管中是其稀釋n倍的上清液1mL，在測定管中是其稀釋n倍的上清液1mL，然后分別在空白管、標準管、對照管和測定管中各加入試劑三應用液1mL，試劑四應用液0.25mL和試劑五應用液0.05mL，然后分別混勻，室溫靜置5-10分鐘，于412nm處，用1cm光環(huán)比色杯和雙蒸水調(diào)零后，測各管OD值，分別記為空白管OD值，標準管OD值，對照管OD值和測定管OD值，然后代入如下公式計算得魚的谷胱甘肽過氧化物酶活性：
優(yōu)選的是，所述步驟一中全魚勻漿為全魚與濃度0.65％的魚用生理鹽水按質(zhì)量比為1:9配置，且所述離心分層用冷凍離心機，11028g，4℃，離心10min。
優(yōu)選的是，所述步驟二中等量的雙蒸水、蛋白標準品和待測樣本均為0.05ml，蛋白標準品的濃度為0.563g/L，分別加入考馬斯亮藍顯色劑的量均為3ml，靜置10min；所述步驟三中反應時間為2.5分鐘，稀釋倍數(shù)n＝5；所述步驟四中室溫靜置10分鐘。
優(yōu)選的是，所述魚為海水青鳉或淡水青鳉。
本發(fā)明至少包括以下有益效果：本發(fā)明以水域中魚的GPX作為敏感生物標記物，通過對比GPX活性就可以檢測出水體是否受到污染，不但檢測準確和敏感，而且直觀反映該水域的污染對生物的危害程度。特別是魚的GPX活性與水體中菲或多氯聯(lián)苯的一種或一種以上的濃度均呈負相關(guān)，所以檢測到魚的GPX活性越低，其的水域受污染的程度越大，并且明示受到菲或多氯聯(lián)苯的一種或一種以上的污染。通過建立魚的GPX活性與菲濃度關(guān)系的曲線，或者魚的GPX活性與多氯聯(lián)苯濃度關(guān)系的曲線，可以將待檢測水域中與建立標準曲線同種同大小的魚的GPX活性比對，獲得水域中菲或多氯聯(lián)苯濃度或綜合污染濃度值，并且能反映出目前的污染程度對生物是否在安全范圍或受到危害。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領域技術(shù)人員參照說明書能夠據(jù)以實施。
實施例1
本方案利用魚的GPX活性檢測水體污染程度的方法，獲取需要檢測的水域中的魚，并采用所述魚的GPX作為敏感生物標記物，通過檢測魚的GPX活性，然后比對同類同大小的魚的GPX活性與某污染物濃度關(guān)系的標準曲線，就可以檢測出水體是否受到某污染物的污染，不但檢測準確，且敏感度高，而且能直觀反映該水域的某污染物的污染程度及其對生物的危害程度。
實施例2
本方案利用魚的GPX活性檢測水體污染程度的方法，獲取需要檢測的水域中的魚，并采用所述魚的GPX作為敏感生物標記物，根據(jù)魚的GPX活性與水體中菲(Phe)等多環(huán)芳烴的濃度呈負相關(guān)，通過測定魚的GPX活性，然后比對同類同大小的魚的GPX活性與菲濃度關(guān)系的標準曲線，如果檢測樣本魚的GPX活性比正常情況下的同類同大小的魚的GPX活性低，則判斷水域受到菲的污染；如果比正常情況下的同類同大小的魚的GPX活性越低，則判斷水域的菲污染越嚴重，甚至可判斷是否達到危害水體生物的程度。
實施例3
本方案利用魚的GPX活性檢測水體污染程度的方法，獲取需要檢測的水域中的魚，并采用所述魚的GPX作為敏感生物標記物，根據(jù)魚的GPX活性與水體中多氯聯(lián)苯的濃度呈負相關(guān)，通過測定魚的GPX活性，然后比對與建立標準曲線的魚同類同大小的魚的GPX活性與多氯聯(lián)苯濃度關(guān)系的標準曲線，如果檢測樣本魚的GPX活性比正常情況下的同類同大小的魚的GPX活性低，則判斷水域受到多氯聯(lián)苯的污染；如果比正常情況下的同類同大小的魚的GPX活性越低，則判斷水域的多氯聯(lián)苯污染越嚴重，甚至可判斷是否達到危害水體生物的程度。
實施例4
本方案利用魚的GPX活性檢測水體污染程度的方法，獲取需要檢測的水域中的魚，并采用所述魚的GPX作為敏感生物標記物。首先通過實驗建立魚的GPX活性與某污染物濃度關(guān)系的標準曲線，然后將待檢測水域中的同種同大小的魚的GPX活性與所述標準曲線比對，得到待檢測水域中某污染物的濃度。
通過實驗建立魚的GPX活性與菲(Phe)濃度關(guān)系的標準曲線如下：
本實驗的檢測樣本以海水青鳉為例，分5組，每組3個平行進行養(yǎng)魚實驗，實驗結(jié)束每個平行取3尾魚樣品測定，每組測定3x3＝9個數(shù)據(jù)，將每組9個數(shù)據(jù)數(shù)理統(tǒng)計后得到每組魚的GPX活性大小。各組菲濃度分別為0、250、500、750、1000μg/L，養(yǎng)殖條件是鹽度30±2，水溫為28±2℃，pH為8.10，溶氧量≥6.10mg/L，光暗比為14h:10h，各組實驗操作均相同。每天三次投喂飼料，總投喂量為投喂時魚體濕重的5％。每天仔細觀察和記錄仔稚魚活動、攝食、畸形、死亡等，并跟蹤檢測水體和魚體菲的變化，7天后隨機采集魚樣品，分別稱重，存于-80℃冰箱中(暫存待測)用于分子、基因、生理、毒理和生化測定。測定并經(jīng)數(shù)理統(tǒng)計的各組GPX活性分別是：85.870、52.804、35.697、28.583、11.334U/mgprot。海水青鳉的GPX活性與水體中菲(Phe)的濃度呈負相關(guān)，然后根據(jù)實驗結(jié)果繪制標準曲線。
通過實驗建立魚的GPX與多氯聯(lián)苯(PCB)濃度關(guān)系的標準曲線如下：
本實驗的檢測樣本以海水青鳉為例，分6組，每組3個平行進行養(yǎng)魚實驗，實驗結(jié)束每個平行取3尾魚樣品測定，每組測定3x3＝9個數(shù)據(jù)，將每組9個數(shù)據(jù)數(shù)理統(tǒng)計后得到每組魚的GPX活性大小。各組多氯聯(lián)苯濃度分別為0、50、100、150、200、250μg/L，養(yǎng)殖條件是鹽度30±2，水溫為28±2℃，pH為8.10，溶氧量≥6.10mg/L，光暗比為14h:10h，各組實驗操作均相同。每天三次投喂飼料，總投喂量為投喂時魚體濕重的5％。每天仔細觀察和記錄仔稚魚活動、攝食、畸形、死亡等，并跟蹤檢測水體和魚體多氯聯(lián)苯的變化，7天后隨機采集魚樣品，分別稱重，存于-80℃冰箱中(便于長期有效保存)用于分子、基因、生理、毒理和生化測定。測定并經(jīng)數(shù)理統(tǒng)計的各組GPX活性分別是：79.405、63.073、59.506、50.728、37.959、38.203U/mgprot。海水青鳉的GPX與水體中多氯聯(lián)苯(PCB)的濃度呈負相關(guān)，然后根據(jù)實驗結(jié)果繪制標準曲線。
測定待測水域中的海水青鳉的GPX活性的具體步驟如下：
步驟一、待測樣本處理：制備全魚勻漿，然后離心分層，取上層清液為待測樣本；
步驟二、待測樣本蛋白濃度的測定：分別將等量的雙蒸水、蛋白標準品和待測樣本加入1、2、3號管中，并分別向各管加入等量的考馬斯亮藍顯色劑，分別混勻，靜置，預熱，用分光光度計并用雙蒸水調(diào)零后，于1cm光徑，在波長595nm處，測定1、2、3號管中物質(zhì)的光密度(OD)，分別記為1號OD值，2號OD值，3號OD值，然后代入如下公式計算得待測樣本蛋白濃度：
步驟三、酶促反應：使用谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)測定試劑盒進行測定，分別在對照管和測定管中加入0.2mL濃度為1mmol/L的谷胱甘肽(GSH)，只在測定管中加入0.2mL待測樣本，然后將所述對照管和測定管置于37℃水浴預溫5分鐘后分別各加入試劑一應用液0.1mL，于37℃反應時間5分鐘，再分別各加入試劑二應用液2mL，只在對照管中加入待測樣本0.2mL，然后分別混勻，用冷凍離心機，1000g，4℃，離心10分鐘，分別取上清液稀釋5倍作顯示反應；
步驟四、顯色反應：在空白管中加入1mL濃度為1mmol/L的GSH,在標準管中加入1mL濃度為20umol/L的GSH標準品應用液，在對照管中是其稀釋n倍的上清液1mL，在測定管中是其稀釋5倍的上清液1mL，然后分別在空白管、標準管、對照管和測定管中各加入試劑三應用液1mL，試劑四應用液0.25mL和試劑五應用液0.05mL，然后分別混勻，室溫靜置5分鐘，于412nm處，用1cm光環(huán)比色杯和雙蒸水調(diào)零后，測各管OD值，分別記為空白管OD值，標準管OD值，對照管OD值和測定管OD值，然后代入如下公式計算得魚的GPX活性：
然后將計算得海水青鳉的GPX活性大小與標準曲線比對，不但可以知道水體是否受到污染，而且從標準曲線中可以知道水體中菲濃度的大小或多氯聯(lián)苯濃度大小或綜合污染的大小，更能知道水體對生物體危害程度。
實施例5
利用實驗可以建立任何水體任何魚種的魚的GPX活性與多氯聯(lián)苯濃度關(guān)系的標準曲線，或者建立不同種類的魚的GPX活性與菲濃度的標準曲線，然后取待測水域中的魚做樣本，只要做樣本的魚與建立標準曲線的魚是同類同大小的即可進行比對。
測定待測水域中的魚的GPX活性具體步驟如下：
步驟一、待測樣本處理：取與建立標準曲線用魚一樣和大小相當?shù)聂~制備全魚勻漿，全魚勻漿為全魚與0.65％濃度的魚用生理鹽水按質(zhì)量比為1:9配置，然后用冷凍離心機，11028g，4℃，離心10min分層，取上層清液為待測樣本；
步驟二、待測樣本蛋白濃度的測定：分別將等量的雙蒸水、蛋白標準品和待測樣本加入1、2、3號管中，并分別向各管加入等量的考馬斯亮藍顯色劑，分別混勻，靜置，預熱，用分光光度計并用雙蒸水調(diào)零后，于1cm光徑，在波長595nm處，測定1、2、3號管中物質(zhì)的光密度(OD)，分別記為1號OD值，2號OD值，3號OD值，然后代入如下公式計算得待測樣本蛋白濃度：
步驟三、酶促反應：使用谷胱甘肽過氧化物酶測定試劑盒進行測定，分別在對照管和測定管中加入0.2mL濃度為1mmol/L的GSH，只在測定管中加入0.2mL待測樣本，然后將所述對照管和測定管置于37℃水浴預溫5分鐘后分別各加入試劑一應用液0.1mL，于37℃反應4分鐘，再分別各加入試劑二應用液2mL，只在對照管中加入待測樣本0.2mL，然后分別混勻，用冷凍離心機，1000g，4℃，離心10分鐘，分別取上清液稀釋4倍作顯示反應；
步驟四、顯色反應：在空白管中加入1mL濃度為1mmol/L的GSH,在標準管中加入1mL濃度為20umol/L的GSH標準品應用液，在對照管中是其稀釋n倍的上清液1mL，在測定管中是其稀釋4倍的上清液1mL，然后分別在空白管、標準管、對照管和測定管中各加入試劑三應用液1mL，試劑四應用液0.25mL和試劑五應用液0.05mL，然后分別混勻，室溫靜置10分鐘，于412nm處，用1cm光環(huán)比色杯和雙蒸水調(diào)零后，測各管OD值，分別記為空白管OD值，標準管OD值，對照管OD值和測定管OD值，然后代入如下公式計算得魚的谷胱甘肽過氧化物酶活性：
將計算得魚的GPX活性大小與標準曲線比對，不但可以知道水體是否受污染，而且從標準曲線中可以知道水體中多氯聯(lián)苯濃度或菲濃度的大小或綜合污染的大小，更能知道水體對生物體危害程度。
實施例6
利用實驗建立20日齡的淡水青鳉的GPX活性與多氯聯(lián)苯濃度關(guān)系的標準曲線和GPX活性與菲濃度的標準曲線，然后取待測水域中的魚做樣本，只要取得樣本的魚與建立標準曲線的魚是同類同大小的即可進行比對。
取得待測水域中20日齡的淡水青鳉做樣本，然后測定待測水域中的該魚的GPX活性具體步驟如下：
步驟一、待測樣本處理：取與建立標準曲線用魚一樣和大小相當?shù)聂~制備全魚勻漿，全魚勻漿為全魚與0.65％濃度的魚用生理鹽水按質(zhì)量比為1:9配置，然后用冷凍離心機，11028g，4℃，離心10min分層，取上層清液為待測樣本；
步驟二、待測樣本蛋白濃度的測定：分別將雙蒸水、濃度為0.563g/L的蛋白標準品和待測樣本各0.05ml加入1、2、3號管中，并分別向各管加入考馬斯亮藍顯色劑3ml，分別混勻，靜置10min，預熱到35℃，預熱待用分光光度計并用雙蒸水調(diào)零后，于1cm光徑，波長595nm處，測定1、2、3號管中溶液的光密度，分別記為1號OD值，2號OD值，3號OD值，然后代入如下公式計算得待測樣本蛋白濃度：
步驟三、酶促反應：使用GPX測定試劑盒進行測定，分別在對照管和測定管中加入0.2mL濃度為1mmol/L的GSH，只在測定管中加入0.2mL待測樣本，然后將所述對照管和測定管置于37℃水浴預溫5分鐘后分別各加入試劑一應用液0.1mL，于37℃反應2.5分鐘，再分別各加入試劑二應用液2mL，只在對照管中加入待測樣本0.2mL，然后分別混勻，用相對離心力為1225g，離心10分鐘，分別取上清液稀釋5倍作顯示反應；
步驟四、顯色反應：在空白管中加入1mL濃度為1mmol/L的GSH,在標準管中加入1mL濃度為20umol/L的GSH標準品應用液，在對照管中是其稀釋n倍的上清液1mL，在測定管中是其稀釋5倍的上清液1mL，然后分別在空白管、標準管、對照管和測定管中各加入試劑三應用液1mL，試劑四應用液0.25mL和試劑五應用液0.05mL，然后分別混勻，室溫靜置5分鐘，于412nm處，用1cm光環(huán)比色杯和雙蒸水調(diào)零后，測各管OD值，分別記為空白管OD值，標準管OD值，對照管OD值和測定管OD值，然后代入如下公式計算得魚的GPX活性為45.500U/mgprot：
將計算得魚的GPX活性大小與GPX活性與菲濃度的標準曲線，以及GPX活性與多氯聯(lián)苯濃度的標準曲線分別比對，得到待測水域的菲濃度為194μg/L，多氯聯(lián)苯濃度為173μg/L，這樣既可以知道水體已受到污染，而且從標準曲線中可以知道水體中菲或多氯聯(lián)苯濃度的大小，更能知道水體對生物體危害程度。
盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列應用范例，它完全適用于各種適合本發(fā)明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地改作他用，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的實施例。