本發(fā)明涉及一種測定蛋白激酶PKA的活性的方法，特別涉及一種構(gòu)建分子探針，利用比色法或電化學(xué)方法測定蛋白激酶活性的方法；屬于生物傳感技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

蛋白激酶催化蛋白磷酸化是一種非常重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)蛋白的功能。磷酸化的蛋白與眾多生理過程緊密相關(guān)，如信號傳導(dǎo)、代謝調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞凋亡等。蛋白激酶是一種磷酸轉(zhuǎn)移酶，能夠?qū)⑷姿嵯佘?ATP)上的γ-磷酸基團轉(zhuǎn)移到底物蛋白特定的酪氨酸(Tyr)、蘇氨酸(Thr)和絲氨酸(Ser)殘基上。蛋白激酶是酶家族的重要成員?；钚哉５牡鞍准っ阁w系是細(xì)胞信號傳導(dǎo)運作的核心，但當(dāng)其活性異?；蛘哌^度表達時就會引起某些蛋白磷酸化異常。人類許多疾病就和蛋白磷酸化異常密切相關(guān)，如癌癥、糖尿病及阿茲海默等。由于蛋白激酶調(diào)控著每個組織、每個器官、甚至每個細(xì)胞的生死，從而已成為早期診斷和治療這些復(fù)雜疾病的重要藥物靶點。因此，測定蛋白激酶的活性進而篩選高效的蛋白激酶抑制劑在生物醫(yī)學(xué)診斷以及酶靶藥物開發(fā)等領(lǐng)域激起了人們廣泛的興趣。

人們已經(jīng)開發(fā)出來大量檢測PKA活性的手段，比如電化學(xué)法、熒光法、表面等離子體共振法、放射性同位素標(biāo)記法和免疫法等，這些檢測手段和方法在一定程度上促進了對蛋白激酶活性研究，然而又各自具有一定的局限性。放射性元素標(biāo)記技術(shù)，檢測方法直接，靈敏度高，但存在放射性污染，不能進行組織標(biāo)記；免疫法對磷酸化識別抗體的要求較高，專一性不強，費用高。因此，開發(fā)快速、簡便、經(jīng)濟、靈敏度高且無需標(biāo)記的蛋白激酶活性檢測及高通量篩選抑制劑方法是非常必要的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是在于提供一種操作簡單、靈敏度高、成本低、且檢測用時短的通過比色法或電化學(xué)方法測定蛋白激酶PKA活性的方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種基于比色法測定蛋白激酶PKA活性的方法，包括以下步驟：

1)采用含胞嘧啶單鏈DNA作為模板和穩(wěn)定劑，以AgNO₃為原料及以NaBH₄為還原劑通過還原法，生成由納米銀分散負(fù)載在含胞嘧啶單鏈DNA上構(gòu)成的AgNCs；

2)將含AgNCs的溶液與ZrOCl₂溶液進行混合反應(yīng)，得到混合液；

3)將Mg(NO₃)₂溶液、多肽溶液、ATP溶液和PKA溶液進行混合反應(yīng)，得到酶反應(yīng)液；

4)將所述酶反應(yīng)液與所述混合液進行混合反應(yīng)，即得分子探針溶液；

5)所述分子探針溶液與銀染液混合，避光反應(yīng)，通過ImageJ2x軟件測定反應(yīng)產(chǎn)物的相應(yīng)平均灰度值；

6)采用一系列不同濃度的PKA溶液，重復(fù)3)、4)和5)步驟，得到一系列相應(yīng)的平均灰度值，建立PKA濃度與平均灰度值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

7)采用待測Hela細(xì)胞裂解液，重復(fù)3)、4)和5)步驟，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待測Hela細(xì)胞裂解液中PKA的濃度。

優(yōu)選的方案，基于比色法測定蛋白激酶PKA活性的方法，包括以下步驟：

I)在避光條件下，將16～20μL濃度為0.8～1.2mM AgNO₃溶液和28～32μL濃度為80～120μM DNA溶液混合30～60min后，加入16～20μL濃度為0.8～1.2mM NaBH₄溶液，進行還原反應(yīng)，即得AgNCs；

II)將45～55μL濃度為160～200μM的AgNCs溶液與8～12μL濃度為0.8～1.2mM ZrOCl₂溶液混合，震蕩1～2min后，靜置反應(yīng)15～25min，得到混合液；

III)將8～12μL濃度為80～120mM的Mg(NO₃)₂、8～12μL濃度為23～27μM的多肽、8～12μL濃度為40～60μM的ATP溶液和8～12μL濃度為0U/mL的PKA混合，在25～40℃條件下，反應(yīng)1～2h，得到酶反應(yīng)液；

IV)在所述混合液中加入所述酶反應(yīng)液30～50μL，震蕩1～2min，靜置反應(yīng)15～25min，即得分子探針溶液；

V)將所述分子探針溶液與80～120μL銀染液混合，避光反應(yīng)，通過ImageJ2x軟件測定反應(yīng)產(chǎn)物的相應(yīng)平均灰度值；

VI)采用濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.5U/mL的PKA溶液，重復(fù)III)、IV)和V)步驟，得到一系列相應(yīng)的平均灰度值，建立PKA濃度與平均灰度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

VII)采用待測Hela細(xì)胞裂解液，重復(fù)III)、IV)和V)步驟，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待測Hela細(xì)胞裂解液中PKA的濃度。

較優(yōu)選的方案，基于比色法測定蛋白激酶PKA活性的方法，包括以下步驟：

I)在避光條件下，將18μL濃度為1mM AgNO₃溶液和30μL濃度為100μM DNA溶液混合30～60min后，加入18μL濃度為1mM NaBH₄溶液，進行還原反應(yīng)，即得AgNCs；

II)將50μL濃度為180μM的AgNCs溶液與10μL濃度為1mM ZrOCl₂溶液混合，震蕩1～2min，靜置反應(yīng)15～25min，得到混合液；

III)將10μL濃度為100mM的Mg(NO₃)₂、10μL濃度為25μM的多肽、10μL濃度為50μM的ATP溶液和10μL濃度為0U/mL的PKA，在25～40℃條件下，反應(yīng)1～2h，得到酶反應(yīng)液；

IV)在所述混合液中加入所述酶反應(yīng)液40μL，震蕩1～2min靜置反應(yīng)15～25min，即得分子探針溶液；

V)將所述分子探針溶液與100μL銀染液混合，避光反應(yīng)，通過ImageJ2x軟件測定反應(yīng)產(chǎn)物的相應(yīng)平均灰度值；

VI)采用濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.5U/mL的PKA溶液，重復(fù)III)、IV)和V)步驟，得到一系列相應(yīng)的平均灰度值，建立PKA濃度與平均灰度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

VII)采用待測Hela細(xì)胞裂解液，重復(fù)III)、IV)和V)步驟，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待測Hela細(xì)胞裂解液中PKA的濃度。

本發(fā)明還提供了一種基于電化學(xué)法測定蛋白激酶PKA活性的方法，包括以下步驟：

a)采用含胞嘧啶單鏈DNA作為模板和穩(wěn)定劑，以AgNO₃為原料及以NaBH₄為還原劑通過還原法，生成由納米銀分散負(fù)載在含胞嘧啶單鏈DNA上構(gòu)成的AgNCs；

b)將含AgNCs的溶液與ZrOCl₂溶液進行混合反應(yīng)，得到混合液；

c)將Mg(NO₃)₂溶液、多肽溶液、ATP溶液和PKA溶液進行混合反應(yīng)，得到酶反應(yīng)液；

d)將所述酶反應(yīng)液與所述混合液進行混合反應(yīng)，即得分子探針溶液；

e)將分子探針溶液滴加在玻碳電極表面，烘干后，置于銀染液中浸泡，再通過方波伏安法檢測，得到相應(yīng)的電流信號值；

f)采用一系列不同濃度的PKA溶液，重復(fù)c)、d)和e)步驟，得到一系列相應(yīng)的電流信號值，建立PKA濃度與電流信號值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

g)采用待測Hela細(xì)胞裂解液，重復(fù)c)、d)和e)步驟，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待測Hela細(xì)胞裂解液中PKA的濃度。

優(yōu)選的方案，基于電化學(xué)法測定蛋白激酶PKA活性的方法，包括以下步驟：

i)在避光條件下，將16～20μL濃度為0.8～1.2mM AgNO₃溶液和28～32μL濃度為80～120μM DNA溶液混合均勻30～60min后，加入16～20μL濃度為0.8～1.2mM NaBH₄溶液，進行還原反應(yīng)，即得AgNCs；

ii)將23～27μL濃度為160～200μM的AgNCs與3～7μL濃度為0.8～1.2mM ZrOCl₂混合，震蕩1～2min，靜置反應(yīng)15～25min，得到混合液；

iii)將3～7μL濃度為80～120mM的Mg(NO₃)₂溶液、3～7μL濃度為23～27μM的多肽溶液、3～7μL濃度為45～55μM的ATP溶液和3～7μL濃度為0U/mL的PKA溶液混合，在25～40℃條件下，反應(yīng)1～2h，得到酶反應(yīng)液；

iv)將所述混合液與18～22μL所述酶反應(yīng)液，震蕩1～2min，靜置反應(yīng)15～25min，即得分子探針溶液。

v)將7～8μL分子探針溶液滴加在玻碳電極表面，在30～40℃溫度下，烘干后，置于銀染液中浸泡2～4min，以1M KCl作為電解質(zhì)，在-0.15～0.25V范圍內(nèi)，15HZ的頻率掃方波伏安曲線，得到相應(yīng)的電流信號值；

vi)采用濃度分別為0.01、0.05、0.2、0.4、0.6、0.75、1U/mL的PKA溶液，重復(fù)iii)、iv)和v)步驟，得到一系列相應(yīng)的電流信號值，建立PKA濃度與電流信號值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

vii)采用待測Hela細(xì)胞裂解液，重復(fù)iii)、iv)和v)步驟，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待測Hela細(xì)胞裂解液中PKA的濃度。

較優(yōu)選的方案，基于電化學(xué)法測定蛋白激酶PKA活性的方法包括以下步驟：

i)在避光條件下，將18μL濃度為1mM AgNO₃溶液和30μL濃度為100μM DNA溶液混合30～60min后，加入18μL濃度為1mM NaBH₄溶液，進行還原反應(yīng)，即得AgNCs；

ii)將25μL濃度為180μM的AgNCs與5μL濃度為1mM ZrOCl₂混合，震蕩1～2min，靜置反應(yīng)15～25min，得到混合液；

iii)將5μL濃度為100mM的Mg(NO₃)₂溶液、5μL濃度為25μM的多肽溶液、5μL濃度為50μM的ATP溶液和5μL濃度為0U/mL的PKA溶液混合，在25～40℃條件下，反應(yīng)1～2h，得到酶反應(yīng)液；

iv)將所述混合液與20μL所述酶反應(yīng)液，震蕩1～2min，靜置反應(yīng)15～25min，即得分子探針溶液。

v)將7.5μL分子探針溶液滴加在玻碳電極表面，在30～40℃溫度下，烘干后，置于銀染液中浸泡3min，以1M KCl作為電解質(zhì)，在-0.15～0.25V范圍內(nèi)，15HZ的頻率掃方波伏安曲線，得到相應(yīng)的電流信號值；

vi)采用濃度分別為0.01、0.05、0.2、0.4、0.6、0.75、1U/mL的PKA溶液，重復(fù)iii)、iv)和v)步驟，得到一系列相應(yīng)的電流信號值，建立PKA濃度與電流信號值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

vii)采用待測Hela細(xì)胞裂解液，重復(fù)iii)、iv)和v)步驟，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待測Hela細(xì)胞裂解液中PKA的濃度。

較優(yōu)選的方案，含胞嘧啶單鏈DNA序列為CCC CCC CCC CCC。

較優(yōu)選的方案，銀染液包含AgNO₃和對苯二酚。

本發(fā)明的基于比色法測定蛋白激酶PKA活性的方法，包括以下步驟：

(1)合成AgNCs：以富含胞嘧啶的單鏈DNA(CCC CCC CCC CCC，dC₁₂)同時作為模板和穩(wěn)定劑，NaBH₄還原AgNO₃合成水溶性好、熒光強度穩(wěn)定的AgNCs；首先，用12000r/min的轉(zhuǎn)速在4℃條件下將DNA離心30～60min，加127μL二次水于1OD的DNA中稀釋，使其濃度達到100μM，再用二次水配1mM AgNO₃，避光保存在4℃冰箱中備用；取18μL 1mM AgNO₃溶液和30μL 100μM DNA(其中Ag⁺:DNA＝6:1)加入到盛有34μL二次水的棕色離心管中，在室溫下震蕩30～60min，然后將18μL新配制1mM的NaBH₄(冰的二次水作為溶劑)迅速加入上述DNA和AgNO₃混合液中，使得NaBH₄迅速還原Ag⁺為AgNCs；將最終的反應(yīng)液放在4℃冰箱中避光保存3～4個小時，即合成AgNCs；

(2)優(yōu)化ATP的濃度：ATP能夠抑制銀染反應(yīng)發(fā)生，需對其濃度進行優(yōu)化；在96孔板的孔中先加入50μL上述合成的AgNCs，從左至右依次加入50μL不同濃度的ATP，使其最終濃度為2.5、5、10、20、40μM，最后再加入100μL銀染液(銀染液A：銀染液B＝1:1)；觀察變黑的時間分別為5、15、20、30、40、90min，考慮到試驗過程的時間限制選定5μM作為最佳濃度；

(3)比色法測定蛋白激酶PKA的活性，將10μL 100mM Mg(NO₃)₂、10μL 25μM多肽、10μL 50μM ATP和10μL最終濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.5U/mL的PKA于0.5mL的離心管中，在25～40℃條件下水浴1～2h，即得酶反應(yīng)液；在96孔板的孔中先加入50μL上述合成的AgNCs，再加入10μL 1mM ZrOCl₂(Zr⁴⁺最終濃度為100μM)，震蕩1～2min后反應(yīng)15～25min，再取上述酶40μL加入酶標(biāo)板中，震蕩1～2min后靜置反應(yīng)15～25min，最后加入100μL銀染液(銀染液A和銀染液B混合，現(xiàn)配現(xiàn)用)，用錫箔紙密封避光反應(yīng)，每隔1min拍照記錄銀染反應(yīng)的程度，再通過ImageJ2x軟件測定固定面積的平均灰度值；

本發(fā)明的基于電化學(xué)法測定蛋白激酶PKA活性的方法，包括以下步驟：

(1)處理電極：將直徑3mm的玻碳電極在含有0.05μm的Al₂O₃的拋光布上進行拋光，拋光后的電極用二次水沖洗，再用無水乙醇和二次水分別超聲清洗3～5分鐘，可將附著于電極表面的拋光粉清除干凈，之后用氮氣吹干；將處理好的玻碳電極、Ag/AgCl參比電極和鉑絲對電極共同放入裝有5mmol·L^-1的鐵氰化鉀溶液的反應(yīng)池內(nèi)，在-0.1～0.6V電壓下，進行循環(huán)伏安法掃描，設(shè)定掃描速度為0.1V·s^-1，電位差小于85mV，表明玻碳電極表面被處理干凈，有利于電極修飾；

(2)電化學(xué)法測定蛋白激酶PKA的活性：將5μL 100mM Mg(NO₃)₂、5μL 25μM多肽、5μL 50μM ATP和5μL最終濃度分別為0、0.01、0.05、0.2、0.4、0.6、0.75、1U/mL的PKA于0.5mL的離心管中，在25～40℃條件下水浴1～2h，即得酶反應(yīng)液；在0.5mL的離心管中加入25μL上述合成的AgNCs，再加入5μL 1mM ZrOCl₂(Zr⁴⁺最終濃度為100μM)，震蕩1～2min后靜置反應(yīng)15～25min，再取上述酶20μL加入離心管中，震蕩1～2min后再靜置反應(yīng)15～25min，得到多肽包裹的AgNCs；將銀染液A和銀染液B均稀釋10倍，分裝在兩個避光的離心管中；取7.5μL多肽包裹的AgNCs滴加在處理好的玻碳電極表面，在30～40℃的烘箱中，大約40min烘干；取30μL稀釋好的銀染液于0.5mL的離心管中，將修飾好的電極浸泡在銀染液中，3min后取出，敲掉電極表面殘留的銀染液，用擦鏡紙擦去粘在電極周圍的銀染液，以1M KCl作為電解質(zhì)，在-0.15～0.25V范圍內(nèi)，15HZ的頻率掃方波伏安曲線。

相對現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的技術(shù)帶來的有益技術(shù)效果：

本發(fā)明的技術(shù)方案充分利用PKA催化水解ATP并可以將ATP的γ磷酸根轉(zhuǎn)移到多肽底物的絲氨基酸上的原理，以單鏈DNA(dC₁₂)為模板及穩(wěn)定劑，通過還原法先制備AgNCs，再將磷酸化的多肽通過Zr⁴⁺與AgNCs的模板DNA結(jié)合在一起，形成由磷酸化的多肽包裹AgNCs的分子探針。該分子探針具有明顯的優(yōu)勢，可以用于比色法或電化學(xué)法測定蛋白激酶PKA的活性。該分子探針利用磷酸化的多肽包裹在AgNCs表面，抑制銀染反應(yīng)，通過溶液顏色深淺，測灰度值，灰度值的大小與PKA活性成負(fù)相關(guān)；同時，AgNCs在電極表面會產(chǎn)生電信號，銀染反應(yīng)促使AgNCs粒徑變大，使得信號值大大地增強，磷酸化的多肽抑制銀染反應(yīng)從而使電信號增強程度減慢。

本發(fā)明的比色法不需要昂貴的儀器，操作簡便，裸眼可直接觀察實驗結(jié)果。

本發(fā)明的電化學(xué)法簡單、靈敏、快速，且與比色法相互印證，突出了本發(fā)明方法的可靠性。

附圖說明

【圖1】為本發(fā)明構(gòu)建的分子探針用于比色法或電化學(xué)法測定蛋白激酶PKA的活性原理圖。

【圖2】為本發(fā)明從電荷角度說明磷酸化的多肽包裹在AgNCs表面直方圖。

【圖3】為本發(fā)明實例1中合成AgNCs的透射電鏡圖。

【圖4】為本發(fā)明實例3中ATP濃度優(yōu)化圖，從左至右ATP濃度分別為2.5、5、10、20、40μM。

【圖5】為本發(fā)明實施例5中不同濃度的PKA酶反應(yīng)液及單獨AgNCs與銀染液反應(yīng)25min時的可視化圖。

【圖6】為本發(fā)明實施例5中不同濃度PKA的相對灰度值標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測范圍為0.1～0.5U/mL。

【圖7】為本發(fā)明實例5中不同濃度藥物刺激Hela細(xì)胞酶反應(yīng)液與銀染液反應(yīng)10min時的可視化圖。

【圖8】為本發(fā)明實施例6中不同濃度的PKA電化學(xué)響應(yīng)信號圖。

【圖9】為本發(fā)明實施例6中不同濃度的PKA電化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測范圍為0.01U/mL～0.75U/mL。

【圖10】為本發(fā)明實例6中不同濃度藥物刺激Hela細(xì)胞酶反應(yīng)液與銀染液反應(yīng)電化學(xué)相應(yīng)信號圖。

具體實施方式

以下實施例旨在進一步說明本發(fā)明內(nèi)容，但本發(fā)明權(quán)利要求保護范圍不限于以下實施例。

實施例1

以富含胞嘧啶的單鏈DNA(CCC CCC CCC CCC，dC₁₂)同時作為模板和穩(wěn)定劑，NaBH₄還原AgNO₃合成水溶性好、熒光強度穩(wěn)定的AgNCs。首先，用12000r/min的轉(zhuǎn)速在4℃條件下將DNA離心30～60min，加127μL二次水于1OD的DNA中稀釋，使其濃度達到100μM，再用二次水配1mM AgNO₃，避光保存在4℃冰箱中備用。取18μL 1mM AgNO₃溶液和30μL100μM DNA(其中Ag⁺:DNA＝6:1)加入到盛有34μL二次水的棕色離心管中，在室溫下震蕩30～60min，然后將18μL新配制1mM的NaBH₄(冰的二次水作為溶劑)迅速加入上述DNA和AgNO₃混合液中，使得NaBH₄迅速還原Ag⁺為AgNCs。將最終的反應(yīng)液放在4℃冰箱中避光保存3～4個小時，即合成AgNCs。

實施例2

將直徑3mm的玻碳電極在含有0.05μm的Al₂O₃的拋光布上進行拋光，拋光后的電極用二次水沖洗，再用無水乙醇和二次水分別超聲清洗3～5分鐘，可將附著于電極表面的拋光粉清除干凈，之后用氮氣吹干。將處理好的玻碳電極、Ag/AgCl參比電極和鉑絲對電極共同放入裝有5mmol·L^-1的鐵氰化鉀溶液的反應(yīng)池內(nèi)，在-0.1～0.6V電壓下，進行循環(huán)伏安法掃描，設(shè)定掃描速度為0.1V·s^-1，電位差小于85mV，表明玻碳電極表面被處理干凈，蓋好電極帽放在4℃的冰箱中備用。

實施例3

ATP能夠抑制銀染反應(yīng)發(fā)生，需對其濃度進行優(yōu)化。在96孔板的孔中先加入50μL上述合成的AgNCs，從左至右依次加入50μL不同濃度的ATP，使其最終濃度為2.5、5、10、20、40μM，最后再加入100μL銀染液(銀染液A：銀染液B＝1:1)。觀察變黑的時間分別為5、15、20、30、40、90min，考慮到試驗過程的時間限制選定5μM作為最佳濃度。

實施例4

提取實際樣品(Hela細(xì)胞裂解液)中PKA：用含有胎牛血清和雙抗的1640培養(yǎng)基，在36.5～37.5℃，4.5～5.5％CO₂及濕潤的環(huán)境中培養(yǎng)Hela細(xì)胞。細(xì)胞到對數(shù)生長期時用胰蛋白酶將其消化下來，呈懸浮狀，用不同濃度比例的毛喉素(腺苷酸環(huán)化酶激活劑)和IBMX(環(huán)腺苷酸磷酸二酯酶抑制劑)來刺激Hela細(xì)胞(具體濃度見圖10內(nèi)表)，20～60min后產(chǎn)生不同濃度PKA。用細(xì)胞破碎儀將得到的Hela細(xì)胞以20kHz的頻率，在0℃下破碎30～60min，再以10000～12000r/min在4℃下離心10～30min，除去細(xì)胞器，得到的上清液即為含有PKA的Hela細(xì)胞裂解液。

實施例5

將10μL 100mM MgNO₃、10μL 25μM多肽、10μL 50μM ATP和10μL最終濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.5U/mL的PKA于0.5mL的離心管中，在25～40℃條件下水浴1～2h，即得酶反應(yīng)液。在96孔板的孔中先加入50μL上述合成的AgNCs，再加入10μL 1mM ZrOCl₂(Zr⁴⁺最終濃度為100μM)，震蕩1～2min后反應(yīng)15～25min，再取上述酶反應(yīng)液40μL加入酶標(biāo)板中，震蕩1～2min后靜置反應(yīng)15～25min，最后加入100μL銀染液(銀染液A和銀染液B混合，現(xiàn)配現(xiàn)用)，用錫箔紙密封避光反應(yīng)，每隔1min拍照記錄銀染反應(yīng)的程度，再通過ImageJ2x軟件測定固定面積的平均灰度值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，R²＝0.97856。

實際樣品中PKA活性的測定，按以上操作將不同濃度的PKA換成不同濃度藥物刺激的Hela細(xì)胞裂解液，可以看出隨著刺激藥物濃度增大，銀染反應(yīng)抑制程度隨之增大，顏色變淺。

實施例6

將5μL 100mM Mg(NO₃)₂、5μL 25μM多肽、5μL 50μM ATP和5μL最終濃度分別為0、0.01、0.05、0.2、0.4、0.6、0.75、1U/mL的PKA于0.5mL的離心管中，在25～40℃條件下水浴1～2h，即得酶反應(yīng)液。在0.5mL的離心管中加入25μL上述合成的AgNCs，再加入5μL 1mM ZrOCl₂(Zr⁴⁺最終濃度為100μM)，震蕩1～2min后靜置反應(yīng)15～25min，再取上述酶20μL加入離心管中，震蕩1～2min后再靜置反應(yīng)15～25min，得到多肽包裹的AgNCs。將銀染液A和銀染液B均稀釋10倍，分裝在兩個避光的離心管中。取7.5μL多肽包裹的AgNCs滴加在處理好的玻碳電極表面，在30～40℃的烘箱中，大約40min烘干。取30μL稀釋好的銀染液于0.5mL的離心管中，將修飾好的電極浸泡在銀染液中，3min后取出，敲掉電極表面殘留的銀染液，用擦鏡紙擦去粘在電極周圍的銀染液，以1M KCl作為電解質(zhì)，在-0.15～0.25V范圍內(nèi)，15HZ的頻率掃方波伏安曲線，做標(biāo)準(zhǔn)曲線R²＝0.98697。

實際樣品中PKA活性的測定，按以上操作將不同濃度的PKA換成不同濃度藥物刺激的Hela細(xì)胞裂解液，可以看出隨著刺激藥物濃度增大，銀染反應(yīng)抑制程度隨之增大，電化學(xué)信號強度逐漸變小。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征以及本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。