本發(fā)明涉及一種自動免疫熒光標記技術(shù)，特別是一種用于自動免疫熒光標記的便攜式微流控裝置及其使用方法，該裝置尤其適用于構(gòu)建實時現(xiàn)場分析檢測系統(tǒng)，并應(yīng)用于特殊環(huán)境。

背景技術(shù)：

免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence)是指將免疫學方法(抗原、抗體特異性結(jié)合)與熒光標記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細胞內(nèi)分布的方法，它是根據(jù)抗原、抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光基團，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)；利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。免疫熒光技術(shù)應(yīng)用廣泛，可以測定內(nèi)分泌激素、蛋白質(zhì)、多肽、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、細胞因子、細胞表面抗原、腫瘤標志物、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì)。免疫熒光標記一般涉及多步反應(yīng)、清洗過程，常規(guī)方法往往需要專業(yè)人員在實驗室中進行，不僅耗時費力，難以自動化和便攜化，而且精度偏低、重復(fù)性較差；自動化工作站則成本偏高、體積偏大，不適合現(xiàn)場應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明設(shè)計一種用于自動免疫熒光標記的便攜式微流控裝置，該裝置尤其適用于構(gòu)建實時現(xiàn)場分析檢測裝置，并可應(yīng)用于特殊環(huán)境。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開一種用于自動免疫熒光標記的便攜式微流控裝置，其技術(shù)方案包括免疫磁珠三維混合模塊和免疫磁珠自動控制模塊，二者共同完成基于微流控芯片的自動免疫熒光標記過程。其中：

所述的免疫磁珠三維混合模塊：包括相對應(yīng)的兩個平行設(shè)置的圓板，和垂直貫穿于兩個圓板的轉(zhuǎn)軸，所述轉(zhuǎn)軸于圓板上偏離圓心的位置穿過；所述圓板上分別設(shè)置有若干磁體；所述磁體在每個圓板上均勻排布，并且所述磁體在垂直位置上相互交錯；

所述的免疫磁珠自動控制模塊，由微流控芯片位置控制組件和永磁鐵位置控制組件構(gòu)成。

對于上文所述的用于自動免疫熒光標記的便攜式微流控裝置中，所述磁體設(shè)置于圓板中，在每個圓板上沿邊緣均勻排布，且在垂直位置上相互交錯。

對于上文所述的用于自動免疫熒光標記的便攜式微流控裝置中，還包括與轉(zhuǎn)軸配合的驅(qū)動電機和轉(zhuǎn)軸底座。

對于上文所述的用于自動免疫熒光標記的便攜式微流控裝置中，所述的微流控芯片位置控制組件中還包括用于固定微流控芯片的夾子和位置控制步進電機。

對于上文所述的用于自動免疫熒光標記的便攜式微流控裝置中，所述的永磁鐵位置控制組件中包括永磁鐵、永磁鐵底座和位置控制步進電機。

本發(fā)明的另一方面在于保護上文所述裝置的使用方法，其包括以下步驟：

①在微流控芯片混合池中加入免疫磁珠和樣品，試劑池加入相應(yīng)試劑，間隔池中加入間隔試劑；

②啟動免疫磁珠三維混合模塊，通過驅(qū)動轉(zhuǎn)軸帶動兩個圓板旋轉(zhuǎn)，使嵌合于圓板中的磁體產(chǎn)生周期性的三維磁場，從而驅(qū)動微流控芯片混合池中的免疫磁珠進行三維運動，實現(xiàn)高效混合；

③步驟②完成后，免疫磁珠三維混合模塊關(guān)閉，微流控芯片位置控制組件啟動，將微流控芯片沿水平方向移動至永磁鐵位置控制組件上方并遠離混合磁場區(qū)域；

④步驟③完成后，永磁鐵位置控制組件啟動，并在微流控芯片下方水平移動，通過控制永磁鐵的移動，帶動微流控芯片中的免疫磁珠順次通過混合池、間隔池和試劑池。完成自動清洗和免疫熒光標記過程。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1、本發(fā)明采用免疫磁珠作為樣品高效混合及操控的載體，以微流控芯片及便攜式磁場控制裝置作為自動免疫熒光標記的操作平臺，該裝置具有自動化、便攜化、低成本、易進一步集成等優(yōu)點，可用于實時現(xiàn)場分析檢測。

2、本發(fā)明通過微流控技術(shù)和機電一體化設(shè)備的方法，使整個免疫熒光標記過程可以在室溫條件下進行，且全程快速、高效，無需專業(yè)人員操作，顯著提高該免疫熒光標記方法的實用性。

附圖說明

圖1是用于自動免疫熒光標記的便攜式微流控裝置結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2免疫磁珠三維混合模塊結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3是微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4免疫磁珠三維混合原理示意圖；

圖5微流控芯片位置控制組件結(jié)構(gòu)側(cè)視圖；

圖6永磁鐵位置控制組件結(jié)構(gòu)側(cè)視圖；

圖7經(jīng)輻射和自動免疫熒光標記后CD4淋巴細胞的輻射劑量-效應(yīng)關(guān)系；

圖中：1、免疫磁珠三維混合模塊，11、上圓板，12、上圓板磁體；13、下圓板，14、下圓板磁體，15、轉(zhuǎn)軸，16、驅(qū)動電機，17、轉(zhuǎn)軸底座，2、微流控芯片位置控制組件，21、微流控芯片夾，22、微流控芯片位置控制步進電機，3、永磁鐵位置控制組件，31、永磁鐵，32、永磁鐵位置控制步進電機，33、永磁鐵底座，4、微流控芯片。

具體實施方式

下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。本發(fā)明所述裝置的示意圖中，結(jié)構(gòu)尺寸均未標注，主要體現(xiàn)本裝置的結(jié)構(gòu)構(gòu)造，實際生產(chǎn)使用過程中，可以根據(jù)需要調(diào)整結(jié)構(gòu)比例和尺寸。

實施例1

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步描述。圖1示出了本發(fā)明的整體結(jié)構(gòu)框圖，圖2免疫磁珠三維混合模塊結(jié)構(gòu)示意圖；由圖可見，本發(fā)明由免疫磁珠三維混合模塊1和免疫磁珠自動控制模塊組成，其中，所述的免疫磁珠自動控制模塊，由微流控芯片位置控制組件2和永磁鐵位置控制組件3構(gòu)成。此外，本裝置使用過程中還有微流控芯片4。

其中，本發(fā)明所述免疫磁珠三維混合模塊由上圓板11、下圓板13、上圓板磁鐵12、下圓板磁鐵14、轉(zhuǎn)軸15、驅(qū)動電機16、轉(zhuǎn)軸底座17和微流控芯片4組成。具體的，圓板11和圓板13相對應(yīng)的水平平行設(shè)置，轉(zhuǎn)軸15垂直貫穿于兩個圓板，所述轉(zhuǎn)軸15于圓板上偏離圓心的位置穿過；圓板通過轉(zhuǎn)軸15由驅(qū)動電機16驅(qū)動；此微流控芯片中，用于混合免疫磁珠的混合池在本發(fā)明所述裝置的磁場混合區(qū)域之內(nèi)即可。雙層圓板的直徑為40mm，厚度為3mm，偏心距為3mm，圓板上各包括形狀相同、對稱分布的5個磁鐵槽；磁鐵槽直徑5mm、高度6mm，安放直徑5mm、高為6mm的釹鐵硼永磁鐵。本發(fā)明實施例中所使用的微流控芯片，其混合池位于微流控芯片的一端，為封閉結(jié)構(gòu)，形狀、長度和深度不限，所述圓板11和圓板13上分別設(shè)置有5個磁體；所述磁體在每個圓板上均勻排布，并且上圓板磁鐵12、和下圓板磁鐵14在垂直位置上相互交錯；

所述的微流控芯片位置控制組件2包括用于固定微流控芯片的微流控芯片夾21和控制微流控芯片位置的滑臺步進電機22；

所述永磁鐵位置控制組件3中還包括永磁鐵31、永磁鐵位置控制步進電機32和永磁鐵底座33。

實施例2

本實施例中所述的微流控芯片由常規(guī)方法制備：由底板層、通道層和加樣孔層三塊塑料(如PMMA)基片組成，采用雕刻機切割不同厚度的塑料板材和雙面膠，按順序進行組裝，將組裝好的芯片進行加熱加壓處理(如65℃，30min)，即得到可用的微流控芯片。

圖3為微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖，其中A為組裝圖；B為拆分圖；其由上、中、下三層結(jié)構(gòu)組成，中間層含有1個混合池和5個試劑池，分別加入樣品、免疫磁珠以及免疫熒光標記所需各種試劑(如清洗緩沖液、熒光標記試劑等)；試劑池之間為間隔池，其中加入間隔液以分隔相鄰液池中不同的試劑。

由圖3可知，利用本發(fā)明所述裝置進行自動免疫熒光標記的方法，包括以下步驟：

A、微流控芯片準備。在微流控芯片樣品池(左邊第一個液池)中加入免疫磁珠和樣品，其他液池加入相應(yīng)試劑，最后在所有間隔池中加入間隔試劑；

B、將準備好的微流控芯片固定在微流控芯片夾上，啟動免疫磁珠三維混合模塊1，通過驅(qū)動轉(zhuǎn)軸15帶動兩個圓板旋轉(zhuǎn)，使嵌合于圓板中的磁體產(chǎn)生周期性的三維磁場，從而驅(qū)動微流控芯片混合池中的免疫磁珠進行三維運動，實現(xiàn)免疫磁珠與樣品中抗原分子的高效混合；混合池在圓板間的磁場區(qū)域中完成混合后，在微流控芯片位置控制組件2控制下水平移動離開混合磁場區(qū)域，進入永磁鐵自動控制區(qū)域，兩種磁場的距離足夠遠，不會產(chǎn)生相互干擾。

C、基于微流控芯片的自動免疫熒光標記。微流控芯片位置控制組件2啟動，將微流控芯片沿水平方向移動至永磁鐵位置控制組件3上方后，永磁鐵位置控制組件3啟動，并在微流控芯片下方水平移動，通過控制永磁鐵31的移動，帶動微流控芯片中的免疫磁珠順次通過混合池、間隔池和試劑池。完成自動清洗和免疫熒光標記過程。

以下結(jié)合圖4示意圖，詳述免疫磁珠三維混合原理：

將裝有樣品與免疫磁珠的微流控芯片的混合池放置于本發(fā)明所述免疫磁珠三維混合模塊的上圓板11、下圓板13之間的磁場區(qū)域中，啟動驅(qū)動電機16后，上圓板11、下圓板13同時繞轉(zhuǎn)軸15開始轉(zhuǎn)動，當轉(zhuǎn)動圓板時，位于兩層圓板之間的微流控芯片4混合池內(nèi)產(chǎn)生周期性漸變的三維磁場，使混合池內(nèi)的磁珠做三維S型運動，進而實現(xiàn)免疫磁珠與樣品(如細胞)的高效、快速混合，顯著提高磁珠與細胞的結(jié)合率。經(jīng)過1/2個周期，免疫磁珠從樣品池一端沿著空間S型運動至樣品池另一端(見圖4，a-f)，其運動軌跡如圖4(g、h)所示。

圖5和圖6分別為微流控芯片位置控制組件2和永磁鐵位置控制組件3示意圖。

設(shè)定程序，當樣品與免疫磁珠充分混合后，啟動圖5中的微流控芯片位置控制組件2，微流控芯片4自動從免疫磁珠三維混合模塊1處移至指定位置，隨后啟動永磁鐵位置控制步進電機32，按預(yù)定程序移動永磁鐵31，從而控制免疫磁珠依次經(jīng)過不同的液池、并與相應(yīng)的試劑充分混合，完成自動清洗和免疫熒光標記過程。

實施例3

采用本發(fā)明的裝置對接受不同劑量紫外輻射的人體CD4淋巴細胞進行自動免疫熒光標記，在微流控芯片左端樣品池中加入輻照后的細胞和包被抗體的磁珠；在第二～第六個液池中分別加入細胞固定液、PBS緩沖液、破膜液(內(nèi)含熒光標記抗體)、沖洗液和免疫磁珠解離溶液；最后在各間隔池加入間隔試劑。按既定程序即可完成免疫磁珠與細胞的高效混合及細胞的自動免疫熒光標記過程，全程在室溫下進行且無需專業(yè)人員操作，圖7為處理后CD4淋巴細胞的輻射劑量-效應(yīng)關(guān)系，表明在實驗范圍內(nèi)顯示良好的線性關(guān)系。