本發(fā)明涉及植物環(huán)肽檢測(cè)領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種利用薄層層析快速檢測(cè)植物環(huán)肽的方法。

背景技術(shù)：

環(huán)肽(cyclotides)是20世紀(jì)90年代中期發(fā)現(xiàn)的一類大環(huán)寡肽類化合物，是指由約28～37個(gè)氨基酸殘基通過(guò)酰胺鍵首尾連接形成的大環(huán)肽類基因產(chǎn)物，主要來(lái)源于微生物、植物和哺乳動(dòng)物。植物是環(huán)肽的一個(gè)最重要來(lái)源，目前已從植物中發(fā)現(xiàn)了100余個(gè)環(huán)肽。目前僅從堇菜科(Violaceae)、茜草科(Rub-iaceae)和葫蘆科(Cucurbitaceae)等三個(gè)科的植物中發(fā)現(xiàn)植物環(huán)肽的存在。

植物環(huán)肽分子中6個(gè)保守的半胱氨酸殘基Ⅰ～Ⅳ、Ⅱ～Ⅴ、Ⅲ～Ⅵ形成二硫鍵，且不在同一平面上，其中Ⅲ～Ⅵ鍵穿過(guò)Ⅰ～Ⅳ鍵、Ⅱ～Ⅴ鍵與環(huán)狀骨架形成的環(huán)，將整個(gè)分子分成6個(gè)環(huán)，其中環(huán)1與環(huán)4形成內(nèi)嵌環(huán)部分，在氨基酸組成和數(shù)量上最為保守，而第三對(duì)二硫鍵則穿過(guò)這一內(nèi)環(huán)形成其特征性的結(jié)構(gòu)—環(huán)胱氨酸結(jié)(cyclic cystine knot，CCK)。環(huán)2、環(huán)3、環(huán)5、環(huán)6暴露在分子外部，連接在結(jié)的外側(cè)。獨(dú)特的CCK結(jié)構(gòu)使其分子中親水性基團(tuán)處于分子的內(nèi)部，而疏水性基團(tuán)處于分子的表面，從而降低整個(gè)分子表面的極性，在有機(jī)溶劑中不易變性，有著類似于其他有機(jī)小分子的性質(zhì)。氫鍵、環(huán)狀骨架及交錯(cuò)的二硫鍵構(gòu)成的硫核使植物環(huán)蛋白具有緊湊清晰的三維結(jié)構(gòu)，因此可看作是一類微蛋白。與通常的直鏈肽相比，它具有抗常規(guī)的高溫、酸降解和蛋白酶解的特性，是一個(gè)非常穩(wěn)定而獨(dú)特的植物多肽家族，其穩(wěn)定性來(lái)源于其環(huán)狀骨架和胱氨酸結(jié)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。

目前，國(guó)外報(bào)道的提取分離方法多是在生物活性或質(zhì)譜跟蹤下進(jìn)行的，例如，Claeson等于1998提出富積分離植物環(huán)肽的實(shí)驗(yàn)方法，該方法適用于小樣品量的脫脂后以含水乙醇冷浸提取的植物環(huán)肽。國(guó)內(nèi)，以中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所周俊院士和譚寧華研究員為首的研究團(tuán)組對(duì)在此基礎(chǔ)上，配合改進(jìn)的環(huán)肽茚三酮薄層顯色新方法和改進(jìn)的環(huán)蛋白考馬斯亮藍(lán)G-250薄層顯色新方法，發(fā)展了一種新的植物環(huán)蛋白大樣品量的提取分離方法。該方法可以在國(guó)內(nèi)普通的植物化學(xué)實(shí)驗(yàn)條件下除去大量非植物環(huán)蛋白類成分，有利于植物環(huán)蛋白的快速提取分離富集，但是采用該方法對(duì)環(huán)肽進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，需要至少三塊薄層板的平行試驗(yàn)才能得出是否可能含有環(huán)肽的檢測(cè)結(jié)果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問(wèn)題，并提供至少后面將說(shuō)明的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種利用薄層層析快速檢測(cè)植物環(huán)肽的方法，該方法只用一塊薄層板即可判斷樣品中是否含有植物環(huán)肽，可用于普通植物化學(xué)實(shí)驗(yàn)條件下植物環(huán)肽的快速檢測(cè)。

為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種利用薄層層析快速檢測(cè)植物環(huán)肽的方法，包括如下步驟：

步驟一、將待檢測(cè)樣品干燥粉碎后，用乙醇浸提3次，合并3次提取的上清液并減壓濃縮，得濃縮液；

步驟二、將所述濃縮液依次用正己烷、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，然后將所得正丁醇相減壓濃縮至膏狀再用蒸餾水重懸，得提取液；正己烷、乙酸乙酯分別用于對(duì)濃縮液進(jìn)行脫脂和除雜，正丁醇用于萃取濃縮液中的植物環(huán)肽；

步驟三、取10mL所述提取液，向其加入二硫蘇糖醇，使二硫蘇糖醇的終濃度為40-60mmol/L，靜置30min，得點(diǎn)樣液；二硫蘇糖醇用于破壞植物環(huán)肽中的二硫鍵，使其分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，以利于后期顯色；

步驟四、將所述點(diǎn)樣液用毛細(xì)管以長(zhǎng)條狀點(diǎn)樣方式點(diǎn)于薄層板底端1cm處，點(diǎn)樣后將所述薄層板用展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)，直至點(diǎn)樣液展開(kāi)前沿至所述薄層板頂端1cm處時(shí)，停止展開(kāi)；

步驟五、將所述薄層板取出放置，待所述展開(kāi)劑完全揮發(fā)后，用三角噴瓶將顯色劑均勻噴于所述薄層板上，觀察顯色結(jié)果，如發(fā)現(xiàn)有黑色的條帶出現(xiàn)則可判斷所述待檢測(cè)樣品中可能含有植物環(huán)肽，其中，

所述顯色劑由醋酸鉛、氫氧化鈉和水制成，且所述顯色劑中醋酸鉛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5-1％、氫氧化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-10％、余量為水。

優(yōu)選的是，所述的利用薄層層析快速檢測(cè)植物環(huán)肽的方法，所述步驟一中，將待檢測(cè)樣品低溫干燥后粉碎，過(guò)40目篩，低溫干燥溫度不超過(guò)50℃；所述乙醇浸提條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為50％、料液比為1:10、提取溫度為25-30℃、提取時(shí)間為12h，提取結(jié)束后經(jīng)5000rpm離心10-20min，收集上清液，所得沉淀再按前述方法重復(fù)浸提2次；合并3次提取的上清液并減壓濃縮至原體積的1/3，得濃縮液。

優(yōu)選的是，所述的利用薄層層析快速檢測(cè)植物環(huán)肽的方法，所述步驟二中，將所述濃縮液先用等體積的正己烷進(jìn)行萃取，萃取次數(shù)為3次；正己烷萃取后所得水相再用等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取次數(shù)為3次；最后將乙酸乙酯萃取后所得水相用等體積的正丁醇進(jìn)行萃取，萃取次數(shù)為3次，合并3次萃取所得正丁醇相并減壓濃縮至膏狀再用蒸餾水重懸，得提取液。

優(yōu)選的是，所述的利用薄層層析快速檢測(cè)植物環(huán)肽的方法，所述步驟三中，所述二硫蘇糖醇的終濃度為50mmol/L。

優(yōu)選的是，所述的利用薄層層析快速檢測(cè)植物環(huán)肽的方法，所述步驟四中，所述薄層板為制備型薄層層析硅膠板，點(diǎn)樣量為100uL。

優(yōu)選的是，所述的利用薄層層析快速檢測(cè)植物環(huán)肽的方法，所述步驟四中，所述展開(kāi)劑由正丁醇、醋酸和水按照體積比3:1:1的比例配制而成。

優(yōu)選的是，所述的利用薄層層析快速檢測(cè)植物環(huán)肽的方法，所述步驟五中，所述顯色劑中醋酸鉛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8％、氫氧化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8％、余量為水。

本發(fā)明的有益效果是操作簡(jiǎn)單、快速，需要的樣品量和耗材少，具有很好的通用性，該方法可作為植物中是否含有植物環(huán)肽的初步判斷，也可作為植物環(huán)肽提取純化過(guò)程中的監(jiān)測(cè)跟蹤方法。

本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過(guò)下面的說(shuō)明體現(xiàn)，部分還將通過(guò)對(duì)本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說(shuō)明書(shū)文字能夠據(jù)以實(shí)施。

需要說(shuō)明的是，下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法，所述試劑和材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1：

待檢測(cè)樣品：天山堇菜(Viola tianshanica Maxim.)，屬堇菜科，其已被報(bào)道含有植物環(huán)肽。

檢測(cè)步驟為：

步驟一、將天山堇菜于40℃下干燥粉碎后過(guò)40目篩，取20g天山堇菜粉，采用體積分?jǐn)?shù)為50％的乙醇在25℃下浸提，料液比為1:10、提取時(shí)間為12h，提取結(jié)束后經(jīng)5000rpm離心10min，收集上清液，所得沉淀再按前述方法重復(fù)浸提2次；合并3次提取的上清液并減壓濃縮至原體積的1/3，得濃縮液；

步驟二、將所述濃縮液先用等體積的正己烷進(jìn)行萃取，萃取次數(shù)為3次；正己烷萃取后所得水相再用等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取次數(shù)為3次；最后將乙酸乙酯萃取后所得水相用等體積的正丁醇進(jìn)行萃取，萃取次數(shù)為3次，合并3次萃取所得正丁醇相并減壓濃縮至膏狀再用10mL蒸餾水重懸，得提取液；

步驟三、取10mL所述提取液，向其加入二硫蘇糖醇，使二硫蘇糖醇的終濃度為40mmol/L，靜置30min，得點(diǎn)樣液；

步驟四、將所述點(diǎn)樣液用毛細(xì)管以長(zhǎng)條狀點(diǎn)樣方式點(diǎn)于制備型薄層層析硅膠板底端1cm處，點(diǎn)樣量為100uL，點(diǎn)樣后將所述制備型薄層層析硅膠板用展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)，直至點(diǎn)樣液展開(kāi)前沿至所述制備型薄層層析硅膠板頂端1cm處時(shí)，停止展開(kāi)，所述展開(kāi)劑由正丁醇、醋酸和水按照體積比3:1:1的比例配制而成；

步驟五、將所述制備型薄層層析硅膠板取出放置，待所述展開(kāi)劑完全揮發(fā)后，用三角噴瓶將顯色劑均勻噴于所述制備型薄層層析硅膠板上，所述顯色劑由醋酸鉛、氫氧化鈉和水制成，且所述顯色劑中醋酸鉛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％、氫氧化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％、余量為水。

顯色后觀察，發(fā)現(xiàn)硅膠板上有黑色條帶出現(xiàn)，說(shuō)明天山堇菜中可能含有植物環(huán)肽，與已報(bào)道結(jié)果相符。

實(shí)施例2：

待檢測(cè)樣品：木鱉子(Momordica cochinchinensis)，屬葫蘆科，其已被報(bào)道含有植物環(huán)肽。

檢測(cè)步驟為：

步驟一、將木鱉子于50℃下干燥粉碎后過(guò)40目篩，取20g木鱉子粉，采用體積分?jǐn)?shù)為50％的乙醇在28℃下浸提，料液比為1:10、提取時(shí)間為12h，提取結(jié)束后經(jīng)5000rpm離心15min，收集上清液，所得沉淀再按前述方法重復(fù)浸提2次；合并3次提取的上清液并減壓濃縮至原體積的1/3，得濃縮液；

步驟二、將所述濃縮液先用等體積的正己烷進(jìn)行萃取，萃取次數(shù)為3次；正己烷萃取后所得水相再用等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取次數(shù)為3次；最后將乙酸乙酯萃取后所得水相用等體積的正丁醇進(jìn)行萃取，萃取次數(shù)為3次，合并3次萃取所得正丁醇相并減壓濃縮至膏狀再用10mL蒸餾水重懸，得提取液；

步驟三、取10mL所述提取液，向其加入二硫蘇糖醇，使二硫蘇糖醇的終濃度為50mmol/L，靜置30min，得點(diǎn)樣液；

步驟四、將所述點(diǎn)樣液用毛細(xì)管以長(zhǎng)條狀點(diǎn)樣方式點(diǎn)于制備型薄層層析硅膠板底端1cm處，點(diǎn)樣量為100uL，點(diǎn)樣后將所述制備型薄層層析硅膠板用展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)，直至點(diǎn)樣液展開(kāi)前沿至所述制備型薄層層析硅膠板頂端1cm處時(shí)，停止展開(kāi)，所述展開(kāi)劑由正丁醇、醋酸和水按照體積比3:1:1的比例配制而成；

步驟五、將所述制備型薄層層析硅膠板取出放置，待所述展開(kāi)劑完全揮發(fā)后，用三角噴瓶將顯色劑均勻噴于所述制備型薄層層析硅膠板上，所述顯色劑由醋酸鉛、氫氧化鈉和水制成，且所述顯色劑中醋酸鉛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8％、氫氧化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8％、余量為水；

顯色后觀察，發(fā)現(xiàn)硅膠板上有黑色條帶出現(xiàn)，說(shuō)明木鱉子中可能含有植物環(huán)肽，與已報(bào)道結(jié)果相符。

實(shí)施例3：

待檢測(cè)樣品：紫花地丁(Viola yedoensis)，屬堇菜科，其已被報(bào)道含有植物環(huán)肽。

檢測(cè)步驟為：

步驟一、將紫花地丁于40℃下干燥粉碎后過(guò)40目篩，取20g紫花地丁粉，采用體積分?jǐn)?shù)為50％的乙醇在30℃下浸提，料液比為1:10、提取時(shí)間為12h，提取結(jié)束后經(jīng)5000rpm離心20min，收集上清液，所得沉淀再按前述方法重復(fù)浸提2次；合并3次提取的上清液并減壓濃縮至原體積的1/3，得濃縮液；

步驟二、將所述濃縮液先用等體積的正己烷進(jìn)行萃取，萃取次數(shù)為3次；正己烷萃取后所得水相再用等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取次數(shù)為3次；最后將乙酸乙酯萃取后所得水相用等體積的正丁醇進(jìn)行萃取，萃取次數(shù)為3次，合并3次萃取所得正丁醇相并減壓濃縮至膏狀再用10mL蒸餾水重懸，得提取液；

步驟三、取10mL所述提取液，向其加入二硫蘇糖醇，使二硫蘇糖醇的終濃度為60mmol/L，靜置30min，得點(diǎn)樣液；

步驟四、將所述點(diǎn)樣液用毛細(xì)管以長(zhǎng)條狀點(diǎn)樣方式點(diǎn)于制備型薄層層析硅膠板底端1cm處，點(diǎn)樣量為100uL，點(diǎn)樣后將所述制備型薄層層析硅膠板用展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)，直至點(diǎn)樣液展開(kāi)前沿至所述制備型薄層層析硅膠板頂端1cm處時(shí)，停止展開(kāi)，所述展開(kāi)劑由正丁醇、醋酸和水按照體積比3:1:1的比例配制而成；

步驟五、將所述制備型薄層層析硅膠板取出放置，待所述展開(kāi)劑完全揮發(fā)后，用三角噴瓶將顯色劑均勻噴于所述制備型薄層層析硅膠板上，所述顯色劑由醋酸鉛、氫氧化鈉和水制成，且所述顯色劑中醋酸鉛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％、氫氧化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％、余量為水；

顯色后觀察，發(fā)現(xiàn)硅膠板上有黑色條帶出現(xiàn)，說(shuō)明紫花地丁中可能含有植物環(huán)肽，與已報(bào)道結(jié)果相符。

對(duì)比例1：

待檢測(cè)樣品：天山堇菜(Viola tianshanica Maxim.)，屬堇菜科，其已被報(bào)道含有植物環(huán)肽；水。

檢測(cè)步驟同實(shí)施例2，本對(duì)比例以天山堇菜為實(shí)驗(yàn)組，水為對(duì)照組，對(duì)照組中以20g水替代實(shí)驗(yàn)組中的天山堇菜粉，其余檢測(cè)步驟與實(shí)驗(yàn)組一致。顯色后觀察，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的硅膠板上有黑色條帶出現(xiàn)，而對(duì)照組中的硅膠板無(wú)黑色條帶出現(xiàn)，說(shuō)明本發(fā)明的方法可作為植物中是否含有植物環(huán)肽的初步判斷。

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開(kāi)如上，但其并不僅僅限于說(shuō)明書(shū)和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)。