本發(fā)明涉及一種檢測(cè)試劑盒，特別涉及一種定量檢測(cè)人源化PD-L1抗體的試劑盒，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人源化PD-L1抗體能夠與部分腫瘤表面PD-L1位點(diǎn)結(jié)合，阻斷T細(xì)胞表面PD-1與腫瘤PD-L1結(jié)合，從而解除腫瘤細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞免疫抑制作用，增強(qiáng)T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞能力。現(xiàn)CUSABIO公司已經(jīng)研發(fā)出夠檢測(cè)PD-L1濃度的Humman Programmed Death Ligand-1(PD-L1/CD274)ELISA試劑盒，并且其敏感性已經(jīng)達(dá)到了3.9pg/mL，但隨著人們對(duì)腫瘤治療的研究，更多的研究人員從事了PD-L1抗體的開(kāi)發(fā)與研制，現(xiàn)急需一種能夠檢測(cè)PD-L1抗體的方法來(lái)評(píng)估細(xì)胞表達(dá)的能力，本發(fā)明采用間接ELISA原理，以PD-L1蛋白為包被蛋白捕獲樣本中人源化PD-L1抗體，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中人源化PD-L1抗體的濃度。在本發(fā)明之前，尚未見(jiàn)定量檢測(cè)人源化PD-L1抗體試劑盒的相關(guān)報(bào)道，也未發(fā)現(xiàn)定量檢測(cè)人源化PD-L1抗體試劑盒在科研與生產(chǎn)中應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為探尋現(xiàn)階段對(duì)人源化PD-L1抗體含量檢測(cè)的快捷方法，方便從事相關(guān)研究人員對(duì)其濃度的測(cè)定，本發(fā)明提供了一種采用PD-L1蛋白包被ELISA板，以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體為標(biāo)記物，放大樣本中人源化PD-L1抗體信號(hào)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本OD值間接得出樣品中人源化PD-L1抗體的濃度。
本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案是：一種測(cè)定人源化PD-L1抗體濃度的ELISA試劑盒，包括加樣板、洗滌濃縮液、標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液、酶標(biāo)抗體、酶標(biāo)抗體稀釋液、底物顯色液、終止液。
上述的ELISA試劑盒，其中各種試液的組成及制備方法如下：
加樣板的制作：用0.05M碳酸鹽緩沖液將人PD-L1蛋白稀釋成0.25ug/mL濃度，ELISA板中每孔加入100uL后加蓋置于4℃環(huán)境中包被14h；將洗滌液加入到加樣孔孔中，每孔300uL，洗滌3次，每次5分鐘；稱(chēng)取適量BSA(牛血清白蛋白)用洗滌液配成5％的封閉液，加入到加樣孔中，每孔300uL，加蓋后置于37℃封閉2小時(shí)；洗滌液洗滌，每孔300uL，每次5分鐘，洗3次；甩去洗滌液，室溫晾干后裝入鋁箔袋放入干燥劑后真空包裝，4℃保存。
洗滌濃縮液為：NaCl 4g、KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.99g、KH2PO4 0.24g定容至100mL，加入500uL吐溫-20，混勻分裝入瓶，每瓶20mL，4℃保存。
樣本稀釋液為：0.01M pH值7.2的PBS緩沖液，配方如下：稱(chēng)取NaCl 4g、KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.99g、KH2PO4 0.24g溶解于800mL蒸餾水中，用鹽酸/氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.2后定容至1L，加入500uL吐溫-20，混勻，分裝入瓶，每瓶30mL。
標(biāo)準(zhǔn)品為:人源化PD-L1抗體凍干粉配方及凍干方法，配方：50g/L BSA、PD-L1抗體250ug/L，分裝至小管中，每管1mL，冷凍后真空干燥，擰緊蓋子，4℃保存。
酶標(biāo)抗體稀釋液配方為：：用0.01M pH值為7.2～7.4PBS配制2％的BSA溶液，吸取12mL至酶標(biāo)抗體稀釋液瓶中，蓋蓋密封，4℃保存。
酶標(biāo)抗體來(lái)源：購(gòu)買(mǎi)自Solarbio公司的羊抗人IgG-HRP(貨號(hào)SE101)，吸取4uL加入到酶標(biāo)抗體瓶中，加入100uL酶標(biāo)抗體稀釋液混勻，蓋蓋密封，4℃保存。
底物顯色液為購(gòu)自Solarbio的TMB底物顯色液(貨號(hào)：PR1200)，分裝至棕色瓶?jī)?nèi)，每瓶10mL，4℃避光保存。
終止液為2M硫酸溶液，配方如下，量取500mL蒸餾水至燒杯中，量取108.7mL濃硫酸(18M)，沿壁緩慢倒入水中，邊倒邊攪拌，量取200mL蒸餾水沖洗濃硫酸量杯，洗滌液緩慢導(dǎo)入硫酸溶液中，再用100mL蒸餾水洗滌一次，洗滌液倒入硫酸溶液中，冷卻至室溫后，倒入容量瓶，定容至1000mL，分裝到小瓶?jī)?nèi)，每瓶6mL，室溫保存。
根據(jù)上述的方法制備得到的ELISA試劑盒，使用方法如下：
1)將洗滌濃縮液瓶中加入180mL的蒸餾水混勻；標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉中加入1mL樣品稀釋液，并作倍比稀釋S1～S7，S8為樣品稀釋液；酶標(biāo)抗體用酶標(biāo)抗體稀釋液進(jìn)行120倍稀釋?zhuān)?℃避光保存。
2)打開(kāi)加樣板包裝，取出加樣板；
3)將待測(cè)樣品及標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液加入到加樣孔中，每孔100uL，設(shè)置1～2平行對(duì)照，密封后置于37℃溫箱中孵育1h。
4)甩去液體，每孔加入300uL洗滌液，作用5min，重復(fù)3次；
5)甩去液體，每孔加入100uL酶標(biāo)二抗液，密封后置于37℃孵育1h。
6)甩去液體，洗滌，步驟如4)；
7)每孔加入100uLTMB底物顯色液，密封后置于37℃溫箱顯色15～30分鐘；
8)每孔加入50uL硫酸終止液，5min中內(nèi)用酶標(biāo)儀讀取OD450nm值；
9)計(jì)算平均數(shù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品OD450nm值帶入方程，求出濃度。
本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明ELISA試劑盒采用純凈PD-L1蛋白作為包被抗原，確保樣品中人源化PD-L1抗體能夠與包被蛋白發(fā)生特異性的結(jié)合，從而進(jìn)一步被酶標(biāo)抗體補(bǔ)獲，在這個(gè)過(guò)程中經(jīng)歷了兩次抗原抗體結(jié)合的過(guò)程，大大提高了檢測(cè)的特異性；參照標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋測(cè)定的OD450nm值-濃度曲線，可以計(jì)算出樣本內(nèi)人源化PD-L1抗體濃度，方便研究人員對(duì)細(xì)胞表達(dá)人源化PD-L1抗體水平進(jìn)行評(píng)定。
附圖說(shuō)明
圖1為細(xì)胞上清中PD-L1抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)特定的具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書(shū)所揭露內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的具體特點(diǎn)與功效。在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的專(zhuān)利保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案，還應(yīng)理解實(shí)施例中出現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)品OD450nm時(shí)，應(yīng)理解，由于顯色時(shí)間的差異，標(biāo)準(zhǔn)品OD450nm值會(huì)有浮動(dòng)，但不影響繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及對(duì)樣本的測(cè)定。
【實(shí)施例1】抗原包被板的制備
(1)使用包被液對(duì)PD-L1蛋白進(jìn)行溶解，包被液為：PD-L1蛋白0.25ug/L、Na2CO3 1.59g/L、NaHCO3 2.93g/L，pH值9.6。
(2)在酶標(biāo)板孔中加入包被溶液，每孔100uL，自封袋密封后置于4℃作用14h。
(3)甩去包被溶液，使用洗滌液進(jìn)行洗滌，洗滌液為：
NaCL 8.0g/L、KCL0.2g/L、Na2HPO4·12H2O 2.9g/L、KH2PO4 0.2/L、Tween-20 500uL/L，pH值＝7.4，洗滌方法為：每孔加入300uL洗滌液，室溫靜置5min，甩去后每孔再次加入300uL洗滌液，重復(fù)3次。
(4)使用封閉液進(jìn)行封閉，封閉液為：BSA 50g/L，NaCL 8.0g/L、KCL0.2g/L、Na2HPO4·12H2O 2.9g/L、KH2PO4 0.2/L、Tween-20 500uL/L，pH值7.4，封閉方法為：每孔加入封閉液300uL，密封后置于37℃溫箱中作用2h。
(5)洗滌，方法如(3)，拍干后同干燥劑一起真空封閉入鋁箔袋。4℃保存。
【實(shí)施例2】細(xì)胞轉(zhuǎn)染上清的測(cè)定
將人源化PD-L1抗體輕、重鏈基因重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，制備人源化PD-L1抗體上清液，加入到孔中，每孔100uL，設(shè)置兩個(gè)個(gè)平行孔，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品S1～S7,濃度為250ng/mL、125ng/mL……3.90625ng/mL，S8為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，加入到孔中，每孔100uL，設(shè)置一個(gè)平行，采用常規(guī)ELISA步驟，封閉及洗滌過(guò)程液體為300uL，顯色20分鐘，OD450nm值如表1：
表1標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液及樣品OD450nm值
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出細(xì)胞上清中PD-L1抗體濃度為81.584ng/mL。