本發(fā)明涉及一種定量測定試劑盒，特別涉及一種血清碘定量測定試劑盒，屬于應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域中的定量檢測類產(chǎn)品。

背景技術(shù)：

目前，尋求檢測個體碘營養(yǎng)水平的人群日益增多，臨床上暫時采用的方法是評價一次隨意尿樣來檢測碘水平，但尿碘只能反映體內(nèi)碘的排出量，并不能代表被甲狀腺利用的具有生物活性的碘離子水平，血清碘濃度才能真實地反映機體的碘營養(yǎng)狀況。

目前，文獻中描述的血清碘定量測定方法有很多，如溫和酸消化法測血清總碘含量(胡梅，澤仁擁西等，中國地方病學(xué)雜志.2000，19(1)：71-72.)，該方法利用硝酸和氯酸于110℃-115℃消化血清2.5h，然后利用碘對砷鈰氧化還原反應(yīng)的催化作用，通過測定反應(yīng)體系中吸光度值的變化，利用碘濃度與吸光度值的對數(shù)呈線性關(guān)系求出碘含量；氯酸法用于血清碘測定的方法學(xué)研究(王欣，劉源，孫曉軍等，中國衛(wèi)生檢驗雜志.2006，16(8)：916-918.)，該方法利用氯酸先于100℃預(yù)熱10min后升溫至130℃消化血清1h,后利用碘對砷鈰氧化還原反應(yīng)的催化作用，通過測定反應(yīng)體系中吸光度值的變化，利用碘濃度與吸光度值的對數(shù)呈線性關(guān)系求出碘含量；ICP-MS分析人血清中微量元素(沈雅珍,徐子剛,華偉民等，廣東微量元素科學(xué)，1996，3(6)：51-55.)，該方法采用多元素內(nèi)標(biāo)法校正基體效應(yīng)引起的誤差,加入內(nèi)標(biāo)元素Sc、In，分別校正質(zhì)量數(shù)<100和100～180的元素測定，并對一些元素選取其同位素峰測定，以避開多原子離子等的質(zhì)譜干擾，樣品制備為血清樣2ml，加入內(nèi)標(biāo)元素，用1％稀硝酸稀釋至5ml，其中包括血清碘測定。目前，國內(nèi)外有部分大醫(yī)院采用ICP-MS方法測定血清碘含量。

這些方法存在以下問題：

(1)溫和酸法消化血清需要用到硝酸，硝酸消化后的分解產(chǎn)物對下一步測定存在一定的干擾。

(2)溫和酸法、氯酸法測血清碘均需用到氯酸，但是氯酸配制過程較為復(fù)雜、易受到污染，如果不嚴(yán)格按照方法配制，氯酸濃度可能達不到要求，并且存放過程易分解，而且氯酸配制過程對于實驗人員的健康有損害。

(3)前述兩種方法在配制亞砷酸溶液時所需有毒試劑三氧化二砷較多。

(4)ICP-MS法測血清碘所需實驗儀器較為昂貴，實驗操作及數(shù)據(jù)分析需相關(guān)專業(yè)技術(shù)人員進行，難于在基層推廣應(yīng)用；血清用量較大，一般為0.5-2ml。

本項目組自主研制了一種新的血清中碘的酸消化定量測定方法，該方法具有易于操作、檢測數(shù)據(jù)可信度高、穩(wěn)定性好、污染低、血清用量少等優(yōu)點。鑒于市場上沒有血清碘定量檢測的相關(guān)產(chǎn)品，本項目組在自主研制的血清碘定量測定方法的基礎(chǔ)上，研發(fā)了一種血清碘定量測定試劑盒。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有問題，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了一種用于測定血清中碘含量的試劑盒。本發(fā)明的目的在于通過該試劑盒，對血清進行消化，然后利用碘對砷鈰氧化還原反應(yīng)的催化作用,通過測定反應(yīng)體系中Ce⁴⁺吸光度值的變化，利用碘濃度與吸光度值的對數(shù)呈線性關(guān)系計算碘含量，克服了現(xiàn)有血清碘定量測定方法試劑配制復(fù)雜、易污染、易分解、危險性試劑用量多、實驗儀器昂貴、所需血清量較多的缺點。

為了達到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)手段為：

一種血清碘定量測定的試劑盒，其特征在于，包括以下組分：100μg/mL的碘標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液、70％～72％的高氯酸(消解液R₁)、2.0mol/L氯酸鈉溶液(消解液R₂)、0.025mol/L的亞砷酸溶液(還原劑R₃)及Ce⁴⁺濃度為0.025mol/L的硫酸鈰銨溶液(氧化劑R₄)。

所述的血清碘定量測定的試劑盒，其特征在于，該試劑盒用于檢測人體或動物體血清中碘含量。

所述的血清碘定量測定的試劑盒，其特征在于，該試劑盒用于血清碘含量測定的方法為：

(1)采集不少于2mL血液，室溫靜置0.5h，于3000r/min離心10min，分離出血清，嚴(yán)密封口，保存；

(2)利用100μg/mL的碘標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液制備不同濃度的碘標(biāo)準(zhǔn)使用系列溶液；

(3)取0.1mL不同濃度的碘標(biāo)準(zhǔn)使用系列溶液及血清樣于玻璃試管，各管分別加入70％～72％的高氯酸和2.0mol/L氯酸鈉溶液，混勻后，置于消化控溫加熱裝置中，消化，冷卻至室溫；

(4)向各管分別加入0.025mol/L的亞砷酸溶液，充分混勻后，靜置15min，使其溫度達到平衡；

(5)秒表計時，依序每管間隔相同時間，向各管分別加入Ce⁴⁺濃度為0.025mol/L的硫酸鈰銨溶液，立即混勻；

(6)待標(biāo)準(zhǔn)系列中碘濃度最高的管的吸光度值達到0.10左右，依序每管間隔相同時間，于400nm波長下，以純水作參比，測定各管吸光度值；

(7)以碘濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值的對數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(8)用最小二乘法進行線性回歸，得回歸方程。

所述的血清碘定量測定的試劑盒，其特征在于，步驟(3)中，消化控溫加熱裝置溫度為130℃±2℃；步驟(5)及步驟(6)中間隔的時間為20～30s。

本試劑盒應(yīng)用過程中所涉及的化學(xué)方程式如下：

消化階段：

加入亞砷酸溶液：

IO₃^-+3AsO₃^3-→I^-+3AsO₄^3-

加入硫酸鈰銨溶液：

本發(fā)明所用高氯酸為直接購買的試劑，氯酸鈉溶液配制簡單，存放時間較長并較為穩(wěn)定；測定過程所需亞砷酸溶液及硫酸鈰銨溶液濃度相對現(xiàn)有技術(shù)均有較大程度降低，減少了對環(huán)境的污染以及對實驗人員的危害；檢測所需血清量較少；檢測結(jié)果準(zhǔn)確度較高；適合大批量血清樣品的檢測。

本試劑盒的研發(fā)，滿足了臨床上個體碘營養(yǎng)評價以及疾病預(yù)防控制部門中血清碘定量測定的需求，為進一步制定血清碘正常值標(biāo)準(zhǔn)提供定量測定基礎(chǔ)，進而解決碘缺乏病防治的重要問題，逐步實現(xiàn)因地制宜、分類指導(dǎo)、科學(xué)補碘的防治策略，助力實現(xiàn)因人而異、知情選擇的補碘方式。同時，本試劑盒也可以用于科研工作中動物血清碘含量的檢測，為科研工作中有關(guān)血清碘定量檢測提供便捷的方法。因此，本產(chǎn)品的研發(fā)具有較大的社會效益。

附圖說明

圖1為本發(fā)明血清中碘定量測定試劑盒的示意圖。

圖2為本發(fā)明標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，橫坐標(biāo)為碘的濃度(μg/L)，縱坐標(biāo)為吸光度值的對數(shù)。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

本產(chǎn)品試劑配制用純水符合GB/T 6682中二級水規(guī)格。

實施例1一種血清碘定量測定的試劑盒制備

1、100μg/mL的碘標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制

準(zhǔn)確稱取經(jīng)105～110℃烘干至恒重的碘酸鉀0.1686g于燒杯中，用純水溶解后定量轉(zhuǎn)移入1000mL容量瓶中，用純水定容至刻度，避光保存。

應(yīng)用碘標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在檢測時有較好的線性關(guān)系及吸光度值范圍，能夠滿足人體及動物血清碘含量的檢測。

2、70％～72％的高氯酸(消解液R₁)及2.0mol/L氯酸鈉溶液(消解液R₂)的配制

2.1消解液選擇

血清與其他樣品相比，其基底成分復(fù)雜，無機離子含量廣泛，蛋白質(zhì)含量高。因此消解液的選擇對產(chǎn)品的研發(fā)尤為重要。通過查閱有關(guān)文獻及相關(guān)知識，本項目組人員試驗了多種消解液，包括過硫酸銨和硫酸鋅、鹽酸與雙氧水和過硫酸銨、硝酸和雙氧水、硝酸和高氯酸、氯酸鈉和鹽酸、氯酸鈉和硫酸、氯酸鈉與硫酸和氯化鈉、氯酸鈉與硫酸和硫酸鋅、氯酸鈉與高氯酸和硫酸鋅、氯酸鈉與硝酸和硫酸鋅、氯酸鈉和高氯酸等10余種組合消化劑。

經(jīng)過對各種試劑的濃度及用量、消化溫度及時間的綜合調(diào)整，以消化得到清亮無色溶液為消化終點，對整個消解過程進行探究。發(fā)現(xiàn)采用70～72％的高氯酸(消解液R₁)0.5ml、2.0mol/L的氯酸鈉溶液(消解液R₂)0.6ml于130℃條件下對血清進行消化2h，得到的消化效果最好。

2.2消解液配制

消解液R₁(高氯酸)：直接購買，70％～72％，優(yōu)級純；

消解液R₂(氯酸鈉溶液)[c(NaClO₃)＝2.0mol/L]：稱取106.5g分析純的氯酸鈉，加入450mL純水溶解，再加純水稀釋至500mL，避光保存。

3、0.025mol/L的亞砷酸溶液(還原劑R₃)及0.025mol/L的硫酸鈰銨溶液(氧化劑R₃)的配制

3.1還原劑與氧化劑的選擇

還原劑(亞砷酸溶液)、氧化劑(硫酸鈰銨溶液)的濃度及用量將影響所檢測血清碘含量的準(zhǔn)確性，對實驗人員危害和環(huán)境污染的大小。因此對亞砷酸、硫酸鈰銨溶液濃度及用量的要求是既要減少三氧化二砷的用量，又要得出較好的檢測結(jié)果。在其他條件相同的情況下，砷鈰催化反應(yīng)的程度受反應(yīng)溫度和時間的影響，溫度太高，使反應(yīng)速度過快而影響結(jié)果的準(zhǔn)確度；溫度過低，反應(yīng)速度又太慢，使檢測效率降低。

在15℃～30℃的穩(wěn)定溫度下，經(jīng)過對亞砷酸、硫酸鈰銨溶液濃度及用量的調(diào)整，得出：還原劑R₃(亞砷酸溶液)3.0ml，氧化劑R₄(硫酸鈰銨溶液)0.6ml，待標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中300μg/L濃度試管吸光度值達到0.10左右時，400nm波長處測定。該反應(yīng)體系滿足要求。

3.2還原劑R₃與氧化劑R₄的配制

還原劑R₃(亞砷酸溶液)[c(H₃AsO₃)＝0.025mol/L]：稱取2.5g分析純的三氧化二砷、3.0g分析純的氫氧化鈉于1L的燒杯中，加純水約30mL攪拌至全部溶解，向燒杯中加純水約500mL，并加入40.0g優(yōu)級純的氯化鈉，攪拌至完全溶解，再緩慢加入200mL硫酸溶液(2.5mol/L)，至室溫后用純水稀釋至1L，儲于棕色瓶，避光保存。加入氯化鈉的目的在于，使測定體系有較高濃度的Cl^-，以掩蓋和抑制血清樣中Cl^-及其量的變異，包括樣品管血清基體成分氯化物鹽量與標(biāo)準(zhǔn)管之間的差異，對測定結(jié)果的影響，保障血清碘定量測定的準(zhǔn)確度和精密度

硫酸溶液[c(H₂SO₄)＝2.5mol/L]：取140mL優(yōu)級純濃硫酸緩慢加入到700mL純水中，邊加邊攪拌，冷卻后用純水稀釋至1L。

氧化劑R₄(硫酸鈰銨溶液)[c(Ce⁴⁺)＝0.025mol/L]：稱取14.9g分析純的硫酸鈰銨[Ce(NH₄)₄(SO₄)₄]或16.7g四水合硫酸鈰銨[Ce(NH₄)₄(SO₄)₄·4H₂O]溶于700mL已經(jīng)配置好的2.5mol/L硫酸溶液，用純水稀釋至1L，儲于棕色瓶，避光保存。

制備所得試劑盒如圖1所示。

實施例2實驗儀器與設(shè)備

1、恒溫消解儀(控溫點精度130℃±2℃，孔間溫差≤1℃)

2、分光光度計

3、玻璃試管：15mm×100mm或15mm×120mm

4、秒表

實施例3試劑盒性能指標(biāo)考察

依據(jù)《GB/T 210.5-2008職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)制定指南第5部分：生物材料中化學(xué)物質(zhì)的測定方法》對本發(fā)明的血清中碘的定量測定的試劑盒的方法特性進行測定，測定結(jié)果如下：

1.制備如實施例1所述的試劑盒。

2.樣品采集和保存

使用一次性真空采血管采集不少于2mL血液，室溫靜置0.5h后，于3000r/min離心10min,分離出血清置于具塞聚乙烯塑料管中，嚴(yán)密封口以防水分蒸發(fā)。在室溫(20℃)下可保存7天，在4℃下可保存2個月，密封后冷凍(-20℃)至少可保存3個月。血液樣品或血清樣品在現(xiàn)場采集、運輸和保存過程中應(yīng)避免與加碘物品接觸。

3.標(biāo)準(zhǔn)使用系列溶液的配制

3.1碘標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(10μg/mL)：吸取10.00mL碘標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液置于100mL容量瓶中，用純水定容至刻度，此溶液1mL含碘10mg。儲于具塞嚴(yán)密的棕色瓶，可保存1個月。

3.2碘標(biāo)準(zhǔn)使用系列溶液(0μg/L～300μg/L)：吸取碘標(biāo)準(zhǔn)中間溶液0，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00mL分別置于100mL容量瓶中，用純水定容至刻度，此標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的碘濃度分別為0，50，100，150，200，250，300μg/L。于400nm波長下，用1cm比色杯，以純水作參比，測定各管的吸光度值A(chǔ)。

4.標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍及相關(guān)性

本方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為碘標(biāo)準(zhǔn)液的濃度(μg/L)，縱坐標(biāo)為吸光度A的對數(shù)，線性范圍為0～300μg/L，在此范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線連續(xù)平行測定6次，分別計算每條曲線各點測得的平均吸光度、變異系數(shù)及相關(guān)系數(shù)，最終制得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定結(jié)果見表1及圖1。

表1標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍及相關(guān)性

5.檢出限

根據(jù)國際理論化學(xué)與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(IUPAC)的規(guī)定，用式C_L＝C_D+3σ計算檢出限，以空白值測定不少于10次所得的σ值，乘以3倍得出檢出限。本方法取樣量0.10ml，重復(fù)檢測空白管的吸光度值(n＝10)，檢出限為4.7μg/L。

6.精密度

在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，測定低、中、高3種碘濃度的血清樣品，每次測定3個平行樣，重復(fù)測定6次，其變異系數(shù)均<5％，符合生物樣品的測定要求。測定結(jié)果見表2。

表2血清中碘的測定精密度實驗結(jié)果

7.準(zhǔn)確度

對低、中、高3種濃度的血清進行加標(biāo)回收實驗，每次測定3個平行樣求平均值，重復(fù)測定3次，平均回收率分別為96.2％、98.9％、98.5％，其中，回收率＝(加標(biāo)樣品測定值-樣品測定值)/加標(biāo)量*100％，回收率范圍94.5％～101.5％，總平均回收率97.9％，符合生物樣品的測定要求。測定結(jié)果見表3。

表3血清中碘的測定加碘標(biāo)回收率實驗結(jié)果

8.干擾實驗

分別在100μg/L、200μg/L碘標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入不同濃度的碘干擾物質(zhì)進行干擾實驗。結(jié)果為，1L中分別含有11g/L NaCl，1.5g/L HPO₄^2-，700mg/L KNO₃，200mg/L Ca²⁺、365mg/L Mg²⁺、2mg/L F^-、2mg/L Fe²⁺、2mg/L Zn²⁺、2mg/L Cu²⁺、0.05mg/L Hg²⁺、2g/L甘氨酸、10g/L葡萄糖、3g/L尿素、30mg/L抗壞血酸、100g/L蛋白時，均不干擾測定，表明本方法具有較強的抗干擾能力。

9.試劑穩(wěn)定性

9.1取同一批次生產(chǎn)的“血清碘定量檢測試劑盒”6盒，于常溫保存；

9.2每個月取一盒本產(chǎn)品，對近期(7天內(nèi))采集的血清進行測定，同時進行方法特性實驗驗證；

9.3結(jié)果顯示：常溫保存6個月內(nèi)檢測血清碘結(jié)果準(zhǔn)確且方法特性測定實驗數(shù)據(jù)一致并符合《GB/T 210.5-2008職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)制定指南第5部分：生物材料中化學(xué)物質(zhì)的測定方法》中的測定要求。

實施例4試劑盒用于血清中碘含量定量測定

1.制備如實施例1所述的試劑盒。

2.樣品采集和保存

使用一次性真空采血管采集不少于2mL血液，室溫靜置0.5h后，于3000r/min離心10min,分離出血清置于具塞聚乙烯塑料管中，嚴(yán)密封口以防水分蒸發(fā)。在室溫(20℃)下可保存7天，在4℃下可保存2個月，密封后冷凍(-20℃)至少可保存3個月。血液樣品或血清樣品在現(xiàn)場采集、運輸和保存過程中應(yīng)避免與加碘物品接觸。

3.標(biāo)準(zhǔn)使用系列溶液的配制

3.1碘標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(10μg/mL)：吸取10.00mL碘標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液置于100mL容量瓶中，用純水定容至刻度，此溶液1mL含碘10mg。儲于具塞嚴(yán)密的棕色瓶，可保存1個月。

3.2碘標(biāo)準(zhǔn)使用系列溶液(0μg/L～300μg/L)：吸取碘標(biāo)準(zhǔn)中間溶液0，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00mL分別置于100mL容量瓶中，用純水定容至刻度，此標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的碘濃度分別為0，50，100，150，200，250，300μg/L。

4.血清碘含量的檢測分析步驟

4.1分別取0.10mL碘標(biāo)準(zhǔn)使用系列溶液及血清樣(如果血清樣的碘濃度超過標(biāo)準(zhǔn)曲線的碘濃度范圍，則純水稀釋后取樣)各置于玻璃試管中，各管加入0.5mL消解液R₁、0.6mL消解液R₂，混勻后置于130℃的消化控溫加熱裝置中，消化120min，取下冷卻至室溫。以下分析4.2～4.4，可在15℃～30℃之間一個穩(wěn)定的溫度環(huán)境下(室溫或控溫)進行，要求溫度波動不超過±0.3℃。

4.2各管加入3.0mL還原劑R₃，充分混勻后放置15min，使其溫度達到平衡，將標(biāo)準(zhǔn)系列管按碘濃度由高至低順序排列。

4.3秒表計時，依順序每管間隔30s向各管準(zhǔn)確加入0.60mL氧化劑R₄，立即混勻。

4.4待第一管(即標(biāo)準(zhǔn)系列中加300μg/L碘濃度管)的吸光度值達到0.10左右時，依順序每管間隔同樣時間30s于400nm波長下，用1cm比色杯，以純水作參比，測定各管的吸光度值。

4.5標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以碘濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值對數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

5.結(jié)果計算

5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線法：

以測得的血清樣品管的吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得所測樣品的碘濃度C，再按(5.3)計算血清中的碘濃度。

5.2回歸方程法：

碘質(zhì)量濃度C(μg/L)與吸光度值A(chǔ)的對數(shù)值成線性關(guān)系：見式(1)，按式(1)求出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，將樣品管的吸光度值代入式(1)，求出所測樣品中碘質(zhì)量濃度，再按(5.3)式(2)計算血清中碘的質(zhì)量濃度。

C＝a+b lgA(或C＝a+b lnA)……………(1)

式中：

C—碘標(biāo)準(zhǔn)使用系列溶液(或所測樣品)中碘的質(zhì)量濃度，單位為微克每升(μg/L)；

A—碘標(biāo)準(zhǔn)使用系列溶液(或所測樣品)測定的吸光度值；

a—標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的截距；

b—標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的斜率。

5.3血清中碘濃度：

按式(2)計算：

ρ(I)＝C×K………………………………………(2)

式中：

ρ(I)—血清中碘濃度，單位為微克每升(μg/L)；

C—由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的或由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算得的所測樣品中碘濃度，單

位為微克每升(μg/L)；

K—血清樣稀釋倍數(shù)。

血清樣品檢測時，按照4.5進行標(biāo)準(zhǔn)曲線作圖，如圖2所示，碘質(zhì)量濃度C(μg/L)與吸光度值A(chǔ)的對數(shù)值的線性方程為：C＝53.307-264.43lgA。采集185例人體血清樣品，利用如實施例1所述的試劑盒采用上述使用方法進行檢測，依照5.1或5.2所示的計算方法，檢測結(jié)果為：血清碘含量范圍為36～97μg/L，與世界衛(wèi)生組織、美國梅奧醫(yī)學(xué)中心和奎斯特診斷公司三家國際知名實驗室提供的電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定的碘代謝指標(biāo)的參考值范圍基本一致，實驗結(jié)果見表4。

表4電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定的血清碘國際參考范圍

上述實施例僅用于說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何本領(lǐng)域技術(shù)人員在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行的修飾或改變，仍由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。