本發(fā)明涉及蔗糖酶活性的測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

蔗糖酶廣泛存在于所有土壤中，它是表征土壤生物活性重要的酶。蔗糖酶(β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC3.2.1.26)是一種水解酶。它能催化非還原性雙糖(蔗糖)的1，2-糖苷鍵裂解，將蔗糖水解為等量的葡萄糖和果糖。蔗糖酶主要是將碳水化合物水解產(chǎn)生的糖類(lèi)進(jìn)一步分解形成單糖，從而為微生物的繁殖提供營(yíng)養(yǎng)，常用蔗糖酶活性表征土壤的熟化程度和肥力水平。

測(cè)定土壤蔗糖酶活性的方法-比色法，是目前比較常用的測(cè)定土壤蔗糖酶活性的方法。該方法采用8％蔗糖為基質(zhì)，基質(zhì)在土壤蔗糖酶的作用下生成葡萄糖，葡萄糖和3，5-二硝基水楊酸反應(yīng)生成橙黃色的3-氨基-5硝基水楊酸，在508nm波長(zhǎng)下有最大吸光值。但是該方法存在許多的不足，蔗糖酶活性在酸性的介質(zhì)中最大，為了讓反應(yīng)在最適pH，以往常用多種緩沖液，醋酸鹽緩沖液(pH4.5-5.5)，磷酸鹽緩沖液(pH4.9-5.5)，醋酸鹽－磷酸鹽緩沖液(pH5.5)，但是緩沖液的不同會(huì)使土壤蔗糖酶活性測(cè)量的結(jié)果存在一定的差異，導(dǎo)致測(cè)定的結(jié)果不夠準(zhǔn)確。不僅如此，這些緩沖液存放的時(shí)間短，在測(cè)定過(guò)程中受試劑影響較大，導(dǎo)致比色法測(cè)定蔗糖酶活性準(zhǔn)確性較低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的要解決現(xiàn)有比色法測(cè)定蔗糖酶活性準(zhǔn)確性較低的問(wèn)題，而提供土壤蔗糖酶的測(cè)定方法。

土壤蔗糖酶的測(cè)定方法，具體是按以下步驟進(jìn)行：

一、配制顯色劑3,5-二硝基水楊酸溶液：首先向20mL～21mL 2mol/L氫氧化鈉水溶液中加入50mL～51mL去離子水，并混勻，然后加入0.49g～0.51g二硝基水楊酸，二硝基水楊酸完全溶解后再加入30.00g～30.10g酒石酸鉀鈉，最后利用去離子水定容至100mL，即得到顯色劑3,5-二硝基水楊酸溶液；

二、配制蔗糖溶液：將8.00g蔗糖溶入去離子水中，定容至100mL，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8％的蔗糖溶液；

三、配制緩沖液：緩沖液儲(chǔ)備液：將12.10g～12.14g三(羥甲基)氨基甲烷、11.60g～11.64g順丁烯二酸、14.00g～14.10g檸檬酸一水化合物和6.30g～6.34g硼酸依次溶于500mL～510mL 1mol/L的NaOH水溶液中，并利用蒸餾水定容至1000mL，緩沖液儲(chǔ)備液；取200mL～210mL緩沖液儲(chǔ)備液轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，并利用0.10mol/L～0.14mol/L HCl將200mL～210mL緩沖液儲(chǔ)備液的pH調(diào)節(jié)至6.0，再用去離子水定容至1000mL，得到緩沖液；

四、土樣培養(yǎng)：將待測(cè)土壤用孔徑為2mm的篩子過(guò)篩，稱(chēng)取過(guò)完篩的待測(cè)土壤5.01g～5.04g置于50mL三角瓶中，用膠頭滴管加入甲苯4～5滴，加入15mL步驟二得到的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8％的蔗糖溶液，加入5mL步驟三得到的緩沖液，搖勻混合物后，再用保鮮膜密封，放入已預(yù)熱的恒溫箱，在溫度為37℃～38℃下培養(yǎng)23.5h～24.5h，得到培養(yǎng)后土樣；

五、測(cè)定：將步驟四的培養(yǎng)后土樣過(guò)濾，取0.5mL～1mL濾液移入50mL容量瓶中，加入3mL步驟一得到的顯色劑3,5-二硝基水楊酸溶液，并在沸騰的水浴鍋中加熱5min～6min，然后移至自來(lái)水流下冷卻3min～4min，再利用蒸餾水稀釋定容至50mL，并在分光光度計(jì)上于波長(zhǎng)508nm處進(jìn)行比色檢測(cè)；

六、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液配制；將葡萄糖先在溫度為50～58℃條件下真空干燥至恒重，得到干燥的葡萄糖，然后取500mg干燥的葡萄糖溶于100mL蒸餾水中，即得到標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，再將標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液稀釋10倍，制成葡萄糖工作液，所述的葡萄糖工作液中葡萄糖的濃度為0.5mg/mL；

七、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：

依次稱(chēng)取0mL、1mL、2mL、3mL、4mL和5mL步驟六得到的葡萄糖工作液，分別注入6只50mL容量瓶中，用蒸餾水依次補(bǔ)齊至10mL，然后分別加3mL 3,5-二硝基水楊酸，并在沸騰水浴鍋中加熱5min，隨即將6只50mL容量瓶移至自來(lái)水流下冷卻3min，最后用蒸餾水稀釋至50mL，并在分光光度計(jì)上于波長(zhǎng)508nm處進(jìn)行比色，比色檢測(cè)后以光密度值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；

八、空白對(duì)照檢測(cè)：將待測(cè)土壤用孔徑為2mm的篩子過(guò)篩，稱(chēng)取過(guò)完篩的待測(cè)土壤5.01g～5.04g置于50mL三角瓶中，用膠頭滴管加入甲苯4～5滴，加入5mL步驟三得到的緩沖液，搖勻混合物后，再用保鮮膜密封，放入已預(yù)熱的恒溫箱，在溫度為37℃～38℃下培養(yǎng)23.5h～24.5h，得到空白對(duì)照培養(yǎng)后土樣；將空白對(duì)照培養(yǎng)后土樣過(guò)濾，取0.5mL～1mL濾液移入50mL容量瓶中，加入3mL步驟一得到的顯色劑3,5-二硝基水楊酸溶液，并在沸騰的水浴鍋中加熱5min～6min，然后移至自來(lái)水流下冷卻3min～4min，再利用蒸餾水稀釋定容至50mL，并在分光光度計(jì)上于波長(zhǎng)508nm處進(jìn)行比色檢測(cè)；

九、確定葡萄糖濃度：根據(jù)步驟七得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)依次確定步驟五中葡萄糖濃度a₁和步驟八中葡萄糖濃度a₂，a₁-a₂＝a，a為步驟五中剩余葡萄糖濃度；

十、結(jié)果計(jì)算：蔗糖酶活性以24h后1g過(guò)完篩的待測(cè)土壤中葡萄糖的質(zhì)量表示蔗糖酶活性Suc：

Suc＝a×V×n/m

式中：a為步驟五中剩余葡萄糖濃度，單位mg/mL；V為顯色液體積50mL；n為

分取倍數(shù)；m為烘干土重，單位g。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)：

通過(guò)使用改進(jìn)的通用緩沖液代替醋酸鹽緩沖液(pH4.5-5.5)，磷酸鹽緩沖液(pH4.9-5.5)，醋酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH5.5)緩沖液，培養(yǎng)溶液的次序進(jìn)行調(diào)整后，提高了蔗糖酶活性測(cè)定的準(zhǔn)確性。同時(shí)采用本發(fā)明方法與原有的普通方法多種緩沖液測(cè)定同一土壤蔗糖酶活性，本發(fā)明方法得到的值分別為102.14、107.87、109.74、115.45、95.47，標(biāo)準(zhǔn)值為106.13±7.62，原有方法采用的緩沖液測(cè)定得到值分別為253.97±20.87,144.61±23.44、141.30±26.96，本發(fā)明測(cè)定土壤蔗糖酶活性平行性好，變異系數(shù)小，方法可行性高。

具體實(shí)施方式

具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式是土壤蔗糖酶的測(cè)定方法，具體是按以下步驟進(jìn)行：

一、配制顯色劑3,5-二硝基水楊酸溶液：首先向20mL～21mL 2mol/L氫氧化鈉水溶液中加入50mL～51mL去離子水，并混勻，然后加入0.49g～0.51g二硝基水楊酸，二硝基水楊酸完全溶解后再加入30.00g～30.10g酒石酸鉀鈉，最后利用去離子水定容至100mL，即得到顯色劑3,5-二硝基水楊酸溶液；

二、配制蔗糖溶液：將8.00g蔗糖溶入去離子水中，定容至100mL，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8％的蔗糖溶液；

三、配制緩沖液：緩沖液儲(chǔ)備液：將12.10g～12.14g三(羥甲基)氨基甲烷、11.60g～11.64g順丁烯二酸、14.00g～14.10g檸檬酸一水化合物和6.30g～6.34g硼酸依次溶于500mL～510mL 1mol/L的NaOH水溶液中，并利用蒸餾水定容至1000mL，緩沖液儲(chǔ)備液；取200mL～210mL緩沖液儲(chǔ)備液轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，并利用0.10mol/L～0.14mol/L HCl將200mL～210mL緩沖液儲(chǔ)備液的pH調(diào)節(jié)至6.0，再用去離子水定容至1000mL，得到緩沖液；

四、土樣培養(yǎng)：將待測(cè)土壤用孔徑為2mm的篩子過(guò)篩，稱(chēng)取過(guò)完篩的待測(cè)土壤5.01g～5.04g置于50mL三角瓶中，用膠頭滴管加入甲苯4～5滴，加入15mL步驟二得到的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8％的蔗糖溶液，加入5mL步驟三得到的緩沖液，搖勻混合物后，再用保鮮膜密封，放入已預(yù)熱的恒溫箱，在溫度為37℃～38℃下培養(yǎng)23.5h～24.5h，得到培養(yǎng)后土樣；

五、測(cè)定：將步驟四的培養(yǎng)后土樣過(guò)濾，取0.5mL～1mL濾液移入50mL容量瓶中，加入3mL步驟一得到的顯色劑3,5-二硝基水楊酸溶液，并在沸騰的水浴鍋中加熱5min～6min，然后移至自來(lái)水流下冷卻3min～4min，再利用蒸餾水稀釋定容至50mL，并在分光光度計(jì)上于波長(zhǎng)508nm處進(jìn)行比色檢測(cè)；

六、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液配制；將葡萄糖先在溫度為50～58℃條件下真空干燥至恒重，得到干燥的葡萄糖，然后取500mg干燥的葡萄糖溶于100mL蒸餾水中，即得到標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，再將標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液稀釋10倍，制成葡萄糖工作液，所述的葡萄糖工作液中葡萄糖的濃度為0.5mg/mL；

七、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：

依次稱(chēng)取0mL、1mL、2mL、3mL、4mL和5mL步驟六得到的葡萄糖工作液，分別注入6只50mL容量瓶中，用蒸餾水依次補(bǔ)齊至10mL，然后分別加3mL 3,5-二硝基水楊酸，并在沸騰水浴鍋中加熱5min，隨即將6只50mL容量瓶移至自來(lái)水流下冷卻3min，最后用蒸餾水稀釋至50mL，并在分光光度計(jì)上于波長(zhǎng)508nm處進(jìn)行比色，比色檢測(cè)后以光密度值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；

八、空白對(duì)照檢測(cè)：將待測(cè)土壤用孔徑為2mm的篩子過(guò)篩，稱(chēng)取過(guò)完篩的待測(cè)土壤5.01g～5.04g置于50mL三角瓶中，用膠頭滴管加入甲苯4～5滴，加入5mL步驟三得到的緩沖液，搖勻混合物后，再用保鮮膜密封，放入已預(yù)熱的恒溫箱，在溫度為37℃～38℃下培養(yǎng)23.5h～24.5h，得到空白對(duì)照培養(yǎng)后土樣；將空白對(duì)照培養(yǎng)后土樣過(guò)濾，取0.5mL～1mL濾液移入50mL容量瓶中，加入3mL步驟一得到的顯色劑3,5-二硝基水楊酸溶液，并在沸騰的水浴鍋中加熱5min～6min，然后移至自來(lái)水流下冷卻3min～4min，再利用蒸餾水稀釋定容至50mL，并在分光光度計(jì)上于波長(zhǎng)508nm處進(jìn)行比色檢測(cè)；

九、確定葡萄糖濃度：根據(jù)步驟七得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)依次確定步驟五中葡萄糖濃度a₁和步驟八中葡萄糖濃度a₂，a₁-a₂＝a，a為步驟五中剩余葡萄糖濃度；

十、結(jié)果計(jì)算：蔗糖酶活性以24h后1g過(guò)完篩的待測(cè)土壤中葡萄糖的質(zhì)量表示蔗糖酶活性Suc：

Suc＝a×V×n/m

式中：a為步驟五中剩余葡萄糖濃度，單位mg/mL；V為顯色液體積50mL；n為分取倍數(shù)；m為烘干土重，單位g。

具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一的不同點(diǎn)是：步驟一中配制顯色劑3,5-二硝基水楊酸溶液：首先向20mL 2mol/L氫氧化鈉水溶液中加入50mL去離子水，并混勻，然后加入0.50g二硝基水楊酸，二硝基水楊酸完全溶解后再加入30.00g酒石酸鉀鈉，最后利用去離子水定容至100mL，即得到顯色劑3,5-二硝基水楊酸溶液。其他與具體實(shí)施方式一相同。

具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一或二之一不同點(diǎn)是：步驟三中將12.10g三(羥甲基)氨基甲烷、11.60g順丁烯二酸、14.00g檸檬酸一水化合物和6.30g硼酸依次溶于500mL 1mol/L的NaOH水溶液中，并利用蒸餾水定容至1000mL，緩沖液儲(chǔ)備液；取200mL緩沖液儲(chǔ)備液轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，并利用0.10mol/L HCl將200mL緩沖液儲(chǔ)備液的pH調(diào)節(jié)至6.0，再用去離子水定容至1000mL，得到緩沖液。其他與具體實(shí)施方式一或二相同。

具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至三之一不同點(diǎn)是：步驟四中在溫度為37.5℃下培養(yǎng)24h，得到培養(yǎng)后土樣。其他與具體實(shí)施方式一至三相同。

具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至四之一不同點(diǎn)是：步驟八中在溫度為37.5℃下培養(yǎng)24h，得到空白對(duì)照培養(yǎng)后土樣。其他與具體實(shí)施方式一至四相同。

本發(fā)明內(nèi)容不僅限于上述各實(shí)施方式的內(nèi)容，其中一個(gè)或幾個(gè)具體實(shí)施方式的組合同樣也可以實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的。

采用下述試驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明效果

實(shí)施例1：土壤蔗糖酶的測(cè)定方法，具體是按以下步驟進(jìn)行：

一、配制顯色劑3,5-二硝基水楊酸溶液：首先向20mL 2mol/L氫氧化鈉水溶液中加入50mL去離子水，并混勻，然后加入0.50g二硝基水楊酸，二硝基水楊酸完全溶解后再加入30.00g酒石酸鉀鈉，最后利用去離子水定容至100mL，即得到顯色劑3,5-二硝基水楊酸溶液；

二、配制蔗糖溶液：將8.00g蔗糖溶入去離子水中，定容至100mL，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8％的蔗糖溶液；

三、配制緩沖液：緩沖液儲(chǔ)備液：將12.10g三(羥甲基)氨基甲烷、11.60g順丁烯二酸、14.00g檸檬酸一水化合物和6.30g硼酸依次溶于500mL 1mol/L的NaOH水溶液中，并利用蒸餾水定容至1000mL，緩沖液儲(chǔ)備液；取200mL緩沖液儲(chǔ)備液轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，并利用0.10mol/L HCl將200mL緩沖液儲(chǔ)備液的pH調(diào)節(jié)至6.0，再用去離子水定容至1000mL，得到緩沖液；

四、土樣培養(yǎng)：將待測(cè)土壤用孔徑為2mm的篩子過(guò)篩，稱(chēng)取過(guò)完篩的待測(cè)土壤5.02g置于50mL三角瓶中，用膠頭滴管加入甲苯5滴，加入15mL步驟二得到的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8％的蔗糖溶液，加入5mL步驟三得到的緩沖液，搖勻混合物后，再用保鮮膜密封，放入已預(yù)熱的恒溫箱，在溫度為37.5℃下培養(yǎng)24h，得到培養(yǎng)后土樣；

五、測(cè)定：將步驟四的培養(yǎng)后土樣過(guò)濾，取1mL濾液移入50mL容量瓶中，加入3mL步驟一得到的顯色劑3,5-二硝基水楊酸溶液，并在沸騰的水浴鍋中加熱6min，然后移至自來(lái)水流下冷卻4min，再利用蒸餾水稀釋定容至50mL，并在分光光度計(jì)上于波長(zhǎng)508nm處進(jìn)行比色檢測(cè)；

六、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液配制；將葡萄糖先在溫度為55℃條件下真空干燥至恒重，得到干燥的葡萄糖，然后取500mg干燥的葡萄糖溶于100mL蒸餾水中，即得到標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，再將標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液稀釋10倍，制成葡萄糖工作液，所述的葡萄糖工作液中葡萄糖的濃度為0.5mg/mL；

七、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：

依次稱(chēng)取0mL、1mL、2mL、3mL、4mL和5mL步驟六得到的葡萄糖工作液，分別注入6只50mL容量瓶中，用蒸餾水依次補(bǔ)齊至10mL，然后分別加3mL 3,5-二硝基水楊酸，并在沸騰水浴鍋中加熱5min，隨即將6只50mL容量瓶移至自來(lái)水流下冷卻3min，最后用蒸餾水稀釋至50mL，并在分光光度計(jì)上于波長(zhǎng)508nm處進(jìn)行比色，比色檢測(cè)后以光密度值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；

八、空白對(duì)照檢測(cè)：將待測(cè)土壤用孔徑為2mm的篩子過(guò)篩，稱(chēng)取過(guò)完篩的待測(cè)土壤5.02g置于50mL三角瓶中，用膠頭滴管加入甲苯5滴，加入5mL步驟三得到的緩沖液，搖勻混合物后，再用保鮮膜密封，放入已預(yù)熱的恒溫箱，在溫度為37.5℃下培養(yǎng)24h，得到空白對(duì)照培養(yǎng)后土樣；將空白對(duì)照培養(yǎng)后土樣過(guò)濾，取1mL濾液移入50mL容量瓶中，加入3mL步驟一得到的顯色劑3,5-二硝基水楊酸溶液，并在沸騰的水浴鍋中加熱6min，然后移至自來(lái)水流下冷卻4min，再利用蒸餾水稀釋定容至50mL，并在分光光度計(jì)上于波長(zhǎng)508nm處進(jìn)行比色檢測(cè)；

九、確定葡萄糖濃度：根據(jù)步驟七得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)依次確定步驟五中葡萄糖濃度a₁和步驟八中葡萄糖濃度a₂，a₁-a₂＝a，a為步驟五中剩余葡萄糖濃度；

十、結(jié)果計(jì)算：蔗糖酶活性以24h后1g過(guò)完篩的待測(cè)土壤中葡萄糖的質(zhì)量表示蔗糖酶活性Suc：

Suc＝a×V×n/m

式中：a為步驟五中剩余葡萄糖濃度，單位mg/mL；V為顯色液體積50mL；n為分取倍數(shù)；m為烘干土重，單位g。

實(shí)施例2：對(duì)比試驗(yàn)1：

一、配制顯色劑3,5-二硝基水楊酸溶液：首先向20mL 2mol/L氫氧化鈉水溶液中加入50mL去離子水，并混勻，然后加入0.50g二硝基水楊酸，二硝基水楊酸完全溶解后再加入30.00g酒石酸鉀鈉，最后利用去離子水定容至100mL，即得到顯色劑3,5-二硝基水楊酸溶液；

二、配制蔗糖溶液：將8.00g蔗糖溶入去離子水中，定容至100mL，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8％的蔗糖溶液；

三、土樣培養(yǎng)：將待測(cè)土壤用孔徑為2mm的篩子過(guò)篩，稱(chēng)取過(guò)完篩的待測(cè)土壤5.02g置于50mL三角瓶中，用膠頭滴管加入甲苯5滴，加入15mL步驟二得到的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8％的蔗糖溶液，加入5mL緩沖液，搖勻混合物后，再用保鮮膜密封，放入已預(yù)熱的恒溫箱，在溫度為37.5℃下培養(yǎng)24h，得到培養(yǎng)后土樣；所述的緩沖液為酸鹽緩沖液，其pH為4.5～5.5；

四、測(cè)定：將步驟三的培養(yǎng)后土樣過(guò)濾，取1mL濾液移入50mL容量瓶中，加入3mL步驟一得到的顯色劑3,5-二硝基水楊酸溶液，并在沸騰的水浴鍋中加熱6min，然后移至自來(lái)水流下冷卻4min，再利用蒸餾水稀釋定容至50mL，并在分光光度計(jì)上于波長(zhǎng)508nm處進(jìn)行比色檢測(cè)；

五、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液配制；將葡萄糖先在溫度為55℃條件下真空干燥至恒重，得到干燥的葡萄糖，然后取500mg干燥的葡萄糖溶于100mL蒸餾水中，即得到標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，再將標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液稀釋10倍，制成葡萄糖工作液，所述的葡萄糖工作液中葡萄糖的濃度為0.5mg/mL；

六、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：

依次稱(chēng)取0mL、1mL、2mL、3mL、4mL和5mL步驟五得到的葡萄糖工作液，分別注入6只50mL容量瓶中，用蒸餾水依次補(bǔ)齊至10mL，然后分別加3mL 3,5-二硝基水楊酸，并在沸騰水浴鍋中加熱5min，隨即將6只50mL容量瓶移至自來(lái)水流下冷卻3min，最后用蒸餾水稀釋至50mL，并在分光光度計(jì)上于波長(zhǎng)508nm處進(jìn)行比色，比色檢測(cè)后以光密度值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；

七、空白對(duì)照檢測(cè)：將待測(cè)土壤用孔徑為2mm的篩子過(guò)篩，稱(chēng)取過(guò)完篩的待測(cè)土壤5.02g置于50mL三角瓶中，用膠頭滴管加入甲苯5滴，加入5mL緩沖液，搖勻混合物后，再用保鮮膜密封，放入已預(yù)熱的恒溫箱，在溫度為37.5℃下培養(yǎng)24h，得到空白對(duì)照培養(yǎng)后土樣；將空白對(duì)照培養(yǎng)后土樣過(guò)濾，取1mL濾液移入50mL容量瓶中，加入3mL步驟一得到的顯色劑3,5-二硝基水楊酸溶液，并在沸騰的水浴鍋中加熱6min，然后移至自來(lái)水流下冷卻4min，再利用蒸餾水稀釋定容至50mL，并在分光光度計(jì)上于波長(zhǎng)508nm處進(jìn)行比色檢測(cè)；所述的緩沖液為酸鹽緩沖液，其pH為4.5～5.5；

八、確定葡萄糖濃度：根據(jù)步驟六得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)依次確定步驟三中葡萄糖濃度a₁和步驟七中葡萄糖濃度a₂，a₁-a₂＝a，a為步驟三中剩余葡萄糖濃度；

九、結(jié)果計(jì)算：蔗糖酶活性以24h后1g過(guò)完篩的待測(cè)土壤中葡萄糖的質(zhì)量表示蔗糖酶活性Suc：

Suc＝a×V×n/m

式中：a為步驟五中剩余葡萄糖濃度，單位mg/mL；V為顯色液體積50mL；n為分取倍數(shù)；m為烘干土重，單位g。

實(shí)施例3：對(duì)比試驗(yàn)2：步驟三中所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液，其pH為4.9～5.5；步驟七中所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液，其pH為4.9～5.5。其它步驟與實(shí)施例2相同。

實(shí)施例4：對(duì)比試驗(yàn)3：步驟三中所述的緩沖液為醋酸鹽-磷酸鹽緩沖液，其pH為5.5；步驟七中所述的緩沖液為醋酸鹽-磷酸鹽緩沖液，其pH為5.5。其它步驟與實(shí)施例2相同。

按照實(shí)施例1至4方法分別對(duì)同種過(guò)完篩的待測(cè)土壤進(jìn)行檢測(cè)5次，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

表1

表1為4個(gè)實(shí)施例的有效分光比色值。其中樣品編號(hào)A為采用實(shí)施例1方法測(cè)定的5份過(guò)完篩的待測(cè)土壤蔗糖酶活性的測(cè)試結(jié)果，樣品編號(hào)B為采用實(shí)施例2的方法測(cè)定的5份過(guò)完篩的待測(cè)土壤蔗糖酶活性的測(cè)試結(jié)果，樣品編號(hào)C為采用實(shí)施例3的方法測(cè)定的5份過(guò)完篩的待測(cè)土壤蔗糖酶活性的測(cè)試結(jié)果，樣品編號(hào)D為采用實(shí)施例4的方法測(cè)定的5份過(guò)完篩的待測(cè)土壤蔗糖酶活性的測(cè)試結(jié)果。采用實(shí)施例1測(cè)定得到的土壤蛋白酶活性變異系數(shù)為0.60％，顯示出較好的準(zhǔn)確性。