本發(fā)明屬于高原腦水腫的生物標(biāo)志物，具體涉及脂多糖在檢測哺乳動物高原腦水腫中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

急性高原病主要包括急性高山病、高原肺水腫和高原腦水腫，其中急性高山病發(fā)病率最高，影響范圍最廣，其發(fā)病與低氧血癥引起的水鈉潴留和腦血管通透增高導(dǎo)致腦水腫，顱內(nèi)壓增高等有關(guān)，其中腦血管通透性增加，血管收縮舒張失衡是急性高原病的重要機(jī)制，此類疾病發(fā)展迅猛、極易導(dǎo)致擴(kuò)大的炎癥反應(yīng)、死亡率高，嚴(yán)重危及急進(jìn)高原人群的健康。因此，尋找高原腦水腫的生物標(biāo)志物對于此類疾病的預(yù)測和預(yù)警具有十分重要的意義。

研究發(fā)現(xiàn)：炎癥介質(zhì)是血管通透性增加,血管收縮舒張失衡的重要調(diào)節(jié)因素。機(jī)體的炎癥狀態(tài)是急性高原病的重要誘發(fā)因素，但目前關(guān)于其具體機(jī)制仍不清楚。低氧可影響和啟動炎癥免疫反應(yīng)，模擬急性高原暴露可引起健康志愿者外周血白細(xì)胞升高，血清中IL-6顯著升高；低氧性肺動脈高壓小鼠肺血管周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺組織中炎癥因子(IL-1β、IL-6、MCP-1等)表達(dá)顯著增高；肺血管組織中ICAM-1、VCAM-1和E-selectin等細(xì)胞粘附分子表達(dá)也顯著增多；缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞ICAM1、整合素家族等細(xì)胞粘附分子表達(dá)上調(diào)。由此可見，炎癥是影響高原病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是大腸桿菌細(xì)胞壁上的主要成分，也是其主要的致病成分，與腦水腫的發(fā)生密切相關(guān)。LPS為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分，釋放入血后被稱為內(nèi)毒素，可與動物體內(nèi)CD14/TLR4/MD2受體結(jié)合，對血腦屏障功能的破壞具有重要作用，短時間內(nèi)可引發(fā)強(qiáng)烈的外周和腦部炎癥反應(yīng)。同時，革蘭氏陰性細(xì)菌感染產(chǎn)生的內(nèi)毒素造成機(jī)體組織細(xì)胞損害和功能障礙，對腸黏膜的屏障功能造成破壞，黏膜通透性增加，導(dǎo)致細(xì)菌易位。此外，LPS注射可導(dǎo)致腦內(nèi)IL-1β和TNF-α在mRNA和蛋白水平均明顯升高，出現(xiàn)意識障礙及抑郁樣行為，因此常被用為腦內(nèi)炎癥因子升高的模型。

因此，通過血漿內(nèi)毒素的定量測定，能較早地預(yù)示患者體內(nèi)存在相應(yīng)的病原菌感染，連續(xù)檢測還能反映病程的發(fā)展及預(yù)后并評估臨床療效，可作為哺乳動物高原腦水腫的生物標(biāo)記分子，用于高原腦水腫發(fā)生的預(yù)測和預(yù)警。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測哺乳動物高原腦水腫的生物標(biāo)志物脂多糖及其應(yīng)用

脂多糖(LPS)的用途，用于檢測哺乳動物高原腦水腫的生物標(biāo)志物。

所述脂多糖在哺乳動物血漿中的含量，當(dāng)血漿中LPS的含量超過0.5EU/ml時，哺乳動物腦組織含水量增加，判定為高原腦水腫癥狀。

所述哺乳動物為鼠，人，狗，貓，羊，?；蚵?。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的實驗結(jié)果證明血漿LPS的含量增加與高原腦水腫的發(fā)生有明顯的相關(guān)性。脂多糖可以作為高原腦水腫的發(fā)生檢測的標(biāo)志物，其靈敏性和準(zhǔn)確性均能達(dá)到檢測的要求。

附圖說明

圖1是正常小鼠與高原腦水腫小鼠血漿LPS含量柱形圖；每組n＝20,**p＜0.01。

圖2是血漿中LPS含量增加后，高原低氧小鼠腦含水量柱形圖，每組n＝20，**p＜0.01。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明的具體實施方式進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實施方式的限制。

取雄性C57BL/6小鼠100只，其中50只小鼠放入低壓低氧艙進(jìn)行高原低氧處理(模擬海拔高度6,000m)，6小時后取血漿和腦組織進(jìn)行小鼠血漿內(nèi)毒素含量及腦組織含水量測定及的測定，小鼠血漿內(nèi)毒素采用廈門鱟試劑實驗試劑廠生產(chǎn)的鱟試劑進(jìn)行檢測。

1)血漿內(nèi)毒素含量的檢測參照試劑盒說明書進(jìn)行操作，步驟為：

1.細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

標(biāo)準(zhǔn)曲線所采用的內(nèi)毒素溶度為0.1，0.25，0.5，1.0EU/ml。稀釋方法如下：取細(xì)菌內(nèi)毒素工作品1支，按細(xì)菌內(nèi)毒素工作品使用說明書稀釋為10EU/ml的內(nèi)毒素溶液，在稀釋為1EU/ml，以1EU/ml的內(nèi)毒素溶液為母液稀釋成0.1，0.25，0.5EU/ml的濃度梯度，配制好的標(biāo)準(zhǔn)液在4小時內(nèi)用完。2.陰性對照為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水

鱟試劑：按照示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于鱟試劑中，輕輕震蕩使其完全溶解，10min內(nèi)用完。

顯色基質(zhì)：按照標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于顯色基質(zhì)中，輕輕振搖使其完全溶解，在4℃條件下貯存8h內(nèi)用完。

偶氮化試劑1：按標(biāo)示量加反應(yīng)終止劑鹽酸于偶氮化試劑1中，

偶氮化試劑2：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于偶氮化試劑2中，

偶氮化試劑3：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于偶氮化試劑3中，

偶氮化試劑溶液可于4℃環(huán)境中貯存1周。

2.具體操作過程

a)取無熱原試管，加入100ul細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液以及待測樣品，待測樣品為正常小鼠血漿及高原腦水腫小鼠血漿，再加入100ul鱟試劑溶液，混勻，37℃溫育60分鐘

b)溫育結(jié)束,加入100ul顯色基質(zhì)溶液，混勻，37℃溫育6分鐘

c)溫育結(jié)束，加入500ul偶氮化試劑1溶液，混勻

d)加入500ul偶氮化試劑2溶液，混勻

e)加入500ul偶氮化試劑3溶液，混勻，靜置5min，于545nm波長處讀取吸光度值。

f)數(shù)據(jù)處理：建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y＝bX+a，r≥0.980，根據(jù)曲線計算內(nèi)毒素含量。

結(jié)果如圖1所示，高原低氧小鼠血漿LPS含量顯著高于正常小鼠，血漿中LPS含量可作為小鼠高原腦水腫發(fā)生的標(biāo)志物，該檢測方法簡單適用。

2)小鼠腦組織含水量的測定

每組取20只鼠于高原低氧后處死,即刻取腦組織用電子天平稱重(濕重,精確到0.1mg),然后置于100℃恒溫箱烘烤24h后稱重(干重)。按Blliot公式計算,腦組織含水量＝(濕重-干重)/濕重×100％。

根據(jù)多次試驗確定，當(dāng)血漿中LPS的含量超過0.5EU/ml時，哺乳動物腦組織含水量增加(如圖1所示)，判定為高原腦水腫癥狀。

以上公開的僅為本發(fā)明的具體實施例，但是，本發(fā)明并非局限于此，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員能思之的變化都應(yīng)落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。