本發(fā)明屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及煙草中倍半萜類化合物的測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

吸煙是億萬煙民文化生活中不可缺少的部分，更是國(guó)家和地方財(cái)稅的重要來源。雖然吸煙有害健康已得到廣泛認(rèn)可，但煙草仍然對(duì)成千上萬的消費(fèi)者有著強(qiáng)大的吸引力，除尼古丁的成癮性外，煙草中豐富的香味物質(zhì)也發(fā)揮著重要作用。

煙草中的香氣成分一直是國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)，在國(guó)外研究煙草香氣成分主要集中在上世紀(jì)70年代，瑞典學(xué)者Hlubucek J.R等采用植物化學(xué)的方法從煙草中分離到一系列的新化合物，這些研究成果在《Acta Chemica Scandinavica》、《Phytochemistry》、《Journal of Nature Product》等刊物發(fā)表了一系列的研究論文；所鑒定的化合物中就包含不少揮發(fā)性、半揮發(fā)性香氣成分?！禖hemical Reviews》還對(duì)該領(lǐng)域進(jìn)行過評(píng)述。該期間最有代表性的研究成果是1976年Lioyd.R.A等從混合烤煙煙絲精油中鑒定出12類323種化合物，其中175種是在烤煙中首次發(fā)現(xiàn)的，有132種是以前文獻(xiàn)未報(bào)道過的新化合物；該研究奠定了烤煙煙葉的香味物質(zhì)基礎(chǔ)。隨著分析儀器的發(fā)展，煙草香氣成分的研究轉(zhuǎn)移到氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析上。GC-MS具備GC的高分離效率和MS強(qiáng)大的定性和定量能力，成為了煙草香氣成分分析的有力工具并在煙草行業(yè)得到廣泛應(yīng)用。

倍半萜類化合物是一種煙草中重要的倍半萜類化合物香氣成分，廣泛存在于烤煙煙葉、白肋煙煙葉、香料煙煙葉中。該成分具有優(yōu)雅的香味，還能驅(qū)避昆蟲。它是肥皂、化妝品和香水常用的成分。準(zhǔn)確地對(duì)煙草中倍半萜類化合物進(jìn)行測(cè)定，對(duì)評(píng)價(jià)煙草質(zhì)量，識(shí)別煙草的風(fēng)格特征均具有積極作用。我們通過凝膠凈化樣品，GC-MS分析，建立了一種煙草中重要倍半萜類化合物成分倍半萜類化合物測(cè)定的方法，目前該方法還未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)到。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于第一方面提供一種煙草中倍半萜類化合物的測(cè)定方法，包括樣本采制備、凝膠柱層析凈化和GC-MS分析，具體包括以下步驟：

A、樣品提?。河糜袡C(jī)溶劑浸泡煙葉粉末，提取樣品；提取方法可選擇加熱回流提取、超聲提取、震蕩萃取、索氏提取中的一種；

B、凝膠柱層析凈化：將步驟A提取的樣品用凝膠柱層析凈化，收集含所述倍半萜類化合物的洗脫部分并進(jìn)行濃縮；

C、將步驟B經(jīng)凝膠柱層析凈化并濃縮后的樣品用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析，采用選擇離子檢測(cè)，通過和對(duì)照品峰面積比較確定所述倍半萜類化合物的含量。色譜柱為DB-5MS(60m×0.25mm i.d×0.32μm d.f)熔融石英毛細(xì)管柱；載氣及壓力：He，85KPa；進(jìn)樣口溫度：250℃；傳輸線溫度：260℃；升溫程序：50℃(5min)，3℃/min→240℃(5min)，2℃/min→250℃(30min)；進(jìn)樣量：1.0μL；分流比：1：25；電離方式：EI；離子源溫度：180℃；電離能：70eV；掃描質(zhì)量范圍：50～300amu，掃描間隔0.5s；采集模式：選擇離子(SI)模式，m/z 108、199和218。在該條件下倍半萜類化合物的色譜圖見圖-1，質(zhì)譜圖見圖-2。

優(yōu)選地，步驟A所述的有機(jī)溶劑為丙酮、乙醇或乙酸乙酯中的一種。煙葉一般粉碎到50～80目，取0.5～1.0g的樣品，用10～20mL的丙酮、乙醇或乙酸乙酯提取，提取方法為回流提取20min，或超聲提取30min，或震蕩萃取40min，或索氏提取30min。提取液濃縮到0.25～0.5mL，供后續(xù)的凝膠柱層析凈化用。

優(yōu)選地，步驟B所述的凝膠為葡聚糖凝膠或聚苯乙烯樹脂的一種。凝膠為SephadexLH-20葡聚糖凝膠或聚苯乙烯樹脂中的一種，凝膠柱的裝填規(guī)格為0.6×150mm，裝柱溶劑為丙酮、乙醇或乙酸乙酯中的一種，和上述裝柱溶劑相匹配。裝好柱后把上述濃縮好的樣品加到凝膠柱上，用丙酮、乙醇或乙酸乙酯中的一種洗脫(洗脫溶劑和裝柱溶劑相匹配)，收集10～11倍柱體積的洗脫餾分，再次濃縮到0.25～0.5mL供GC-MS分析用。

優(yōu)選地，步驟B所述的凝膠柱的柱長(zhǎng)與柱徑的比例為25:1。

優(yōu)選地，步驟B所述的收集含所述倍半萜類化合物的洗脫部分的體積為10～11倍柱體積。

優(yōu)選地，步驟C中的條件如下：色譜柱為DB-5MS熔融石英毛細(xì)管柱，其規(guī)格為60m×0.25mm i.d×0.32μm d.f；載氣及壓力：He，85KPa；進(jìn)樣口溫度：250℃；傳輸線溫度：260℃；升溫程序：50℃，5min；3℃/min→240℃，5min；2℃/min→250℃，30min；進(jìn)樣量：1.0μL；分流比：1：25；電離方式：EI；離子源溫度：180℃；電離能：70eV；掃描質(zhì)量范圍：50～300amu，掃描間隔0.5s；采集模式：選擇離子模式，m/z 108、199和218。

本發(fā)明第二方面提供所述的測(cè)定方法用于評(píng)價(jià)煙草風(fēng)格和煙草質(zhì)量的用途。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明建立了一種煙草中倍半萜類化合物香氣成分倍半萜類化合物的測(cè)定方法，方法線性范圍寬、靈敏度高，可滿足煙草中不同含量倍半萜類化合物測(cè)定的要求；而且方法回收率高、精密度好，可實(shí)現(xiàn)煙草中倍半萜類化合物含量的準(zhǔn)確測(cè)定，為煙草質(zhì)量評(píng)價(jià)和香型風(fēng)格識(shí)別提供了可靠的新方法。

2、本方法采用凝膠柱層析凈化樣品，凝膠凈化是基于體積排阻效應(yīng)原理，根據(jù)化合物分子大小不同而達(dá)到分離凈化的目的；可實(shí)現(xiàn)樣品中和倍半萜類化合物分子量有差異的共存成分的分離，樣品凈化效果好。和常用的同時(shí)蒸餾萃取法比較，本發(fā)明操作更簡(jiǎn)單，而且樣品前處理過程中待測(cè)成分損失少，分析結(jié)果的精密度和回收率均有提高。

3、倍半萜類化合物含量和感官評(píng)吸結(jié)果有明顯的相關(guān)性，倍半萜類化合物含量測(cè)定可作為煙葉質(zhì)量評(píng)價(jià)的標(biāo)志化合物。采用本發(fā)明所建立的測(cè)定方法可用于評(píng)價(jià)煙草風(fēng)格和煙草質(zhì)量的用途。

附圖說明

圖1：本發(fā)明的倍半萜類化合物的GC-MS選擇離子色譜圖；

圖2：本發(fā)明的倍半萜類化合物的質(zhì)譜圖。

圖3：本發(fā)明的倍半萜類化合物的凝膠凈化洗脫曲線；

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明要求所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明所述倍半萜類化合物的檢測(cè)方法，包括樣本制備、凝膠柱層析凈化和GC-MS分析、具體包括：

A、樣本制備：為了獲得均勻而有代表性的樣品，煙葉樣品每樣取500g，粉碎到50～80目，供隨后的分析用。樣品分析時(shí)每樣取0.5～1.0g的，由于倍半萜類化合物在丙酮、乙醇或乙酸乙酯均具有較好的溶解度，樣品提取溶劑可采用丙酮、乙醇或乙酸乙酯中的一種；用10～20mL的丙酮、乙醇或乙酸乙酯提取，采用回流提取20min可提取完全，采用超聲提取30min可提取完全，采用震蕩萃取40min可提取完全，采用索氏提取30min可提取完全，提取方法可以采用上述方法的任意一種。提取完全后，提取液濃縮到0.25～0.5mL，可供后續(xù)的凝膠柱層析凈化用。

B、凝膠柱層析凈化：凝膠凈化是基于體積排阻效應(yīng)原理，根據(jù)化合物分子大小不同而達(dá)到分離凈化的目的；由于倍半萜類化合物和煙草中共存物存在分子量差異，可通過凝膠凈化和和共存物分離而達(dá)到樣品凈化。實(shí)驗(yàn)用凝膠為Sephadex LH-20葡聚糖凝膠或聚苯乙烯樹脂中的一種，凝膠柱的裝填規(guī)格為0.6×150mm，用丙酮、乙醇或乙酸乙酯裝填對(duì)凈化效果均沒有影響，因此裝柱溶劑可選擇丙酮、乙醇或乙酸乙酯中的一種。裝好柱后把上述濃縮好的樣品加到凝膠柱上，可用洗脫劑洗脫；由于凝膠分離效果主要由柱材料決定，洗脫劑影響很小，因此，洗脫劑可用丙酮、乙醇或乙酸乙酯中的一種洗脫，倍半萜類化合物的洗脫曲線見圖-3，當(dāng)洗脫液的體積達(dá)43.5mL時(shí)倍半萜類化合物從開始出峰，45.6mL完全洗脫下，為了避免保留時(shí)間波動(dòng)而導(dǎo)致餾分損失，收集42.4mL～46.6mL之間的部分餾分，約10～11倍柱體積的洗脫餾分。所收集的餾分濃縮到0.25～0.5mL供GC-MS分析用。

C、GC-MS分析：對(duì)氣相色譜分析條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終選定色譜條件為：DB-5MS(60m×0.25mm i.d×0.32μm d.f)熔融石英毛細(xì)管柱；載氣及壓力：He，85KPa；進(jìn)樣口溫度：250℃；傳輸線溫度：260℃；升溫程序：50℃(5min)，3℃/min→240℃(5min)，2℃/min→250℃(30min)；進(jìn)樣量：1.0μL；分流比：1：25；在該條件下，倍半萜類化合物能得到很好的分離，見圖-2。

質(zhì)譜檢測(cè)采用電離方式為EI源；離子源溫度：180℃；電離能：70eV；掃描質(zhì)量范圍：50～300amu，掃描間隔0.5s；根據(jù)質(zhì)譜圖，倍半萜類化合物在m/z 108、199和218有豐度高的質(zhì)譜峰，因此采用選擇離子(SI)采集模式，選擇的離子為m/z 108、199和218。

D、方法的靈敏度、回收率和重現(xiàn)性：在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，倍半萜類化合物的在1.0～120ng/L內(nèi)具有很好的線性關(guān)系，工作曲線為A＝12.84C+3.26，相關(guān)系數(shù)為0.9994；根據(jù)信噪比S/N＝3確定倍半萜類化合物的檢測(cè)限為0.28ng/L，根據(jù)信噪比S/N＝10確定倍半萜類化合物的檢測(cè)限為1.0ng/L，豐富具有很高的靈敏度，能滿足煙草中痕量倍半萜類化合物測(cè)定的要求；采用2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL三個(gè)濃度進(jìn)行了回收率實(shí)驗(yàn)，倍半萜類化合物的回收率在94.5～103.2％之間，方法具有很好的回收率。對(duì)同一樣品進(jìn)行7次平行測(cè)定(同一天內(nèi)同一批次進(jìn)行)，倍半萜類化合物測(cè)定結(jié)果的RSD為3.3％，在不同時(shí)間內(nèi)(隔天測(cè)定因此)對(duì)樣品進(jìn)行7次平行測(cè)定，倍半萜類化合物的RSD為4.2％，說明方法均有很好的日內(nèi)和日間精密度。

E、煙草中倍半萜類化合物含量和煙草風(fēng)格、煙草品質(zhì)相關(guān)性：采用所建立的方法對(duì)于清香、濃香、中間香三種風(fēng)格的24個(gè)煙葉中倍半萜類化合物含量進(jìn)行類分析，三種煙葉中倍半萜類化合物含量為，清香>中間>香濃香，說明倍半萜類化合物含量和煙草風(fēng)格有明顯的相關(guān)性，可作為煙草風(fēng)格識(shí)別的標(biāo)志性化合物。對(duì)24種不同感官評(píng)吸結(jié)果的煙葉進(jìn)行了倍半萜類化合物測(cè)定，結(jié)果表明倍半萜類化合物含量和感官評(píng)吸結(jié)果有明顯的相關(guān)性，倍半萜類化合物含量測(cè)定可作為煙葉質(zhì)量評(píng)價(jià)的標(biāo)志化合物。

下面僅以倍半萜類化合物香氣成分倍半萜類化合物的測(cè)定對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明：

實(shí)施例1

選取烤煙煙葉，準(zhǔn)確稱取樣品1.0g，加入20mL的乙酸乙酯回流提取20min，提取液濃縮到0.5mL，添加到裝填好的凝膠柱上(材料為葡聚糖凝膠，凝膠柱的裝填規(guī)格為0.6×150mm，裝柱溶劑為乙酸乙酯)，加過樣的凝膠柱用乙酸乙酯洗脫，收集10～11倍柱體積的洗脫餾分再次濃縮到0.5mL；按選定的色譜條件和質(zhì)譜條件測(cè)定，倍半萜類化合物倍半萜類化合物的含量為6.26μg/g。

實(shí)施例2

選取香料煙煙葉，準(zhǔn)確稱取樣品0.50g，加入20mL的丙酮回流提取20min，提取液濃縮到0.5mL，添加到裝填好的凝膠柱上(材料為葡聚糖凝膠，凝膠柱的裝填規(guī)格為0.6×150mm，裝柱溶劑為丙酮)，加過樣的凝膠柱用丙酮洗脫，收集10～11倍柱體積的洗脫餾分再次濃縮到0.5mL；按選定的色譜條件和質(zhì)譜條件測(cè)定，倍半萜類化合物倍半萜類化合物的含量為11.2μg/g。

實(shí)施例3

選取樣品為白仂煙煙葉，準(zhǔn)確稱取樣品1.0g，加入20mL的乙醇回流提取20min，提取液濃縮到0.5mL，添加到裝填好的凝膠柱上(材料為葡聚糖凝膠，凝膠柱的裝填規(guī)格為0.6×150mm，裝柱溶劑為乙醇)，加過樣的凝膠柱用乙醇洗脫，收集10～11倍柱體積的洗脫餾分再次濃縮到0.5mL；按選定的色譜條件和質(zhì)譜條件測(cè)定，倍半萜類化合物倍半萜類化合物的含量為4.26μg/g。