本發(fā)明涉及凝固時(shí)間的測(cè)定方法及其裝置、凝固時(shí)間測(cè)定用試劑以及試劑盒。

背景技術(shù)：

活化部分促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)在作為抗凝固藥劑的肝素的濃度的監(jiān)測(cè)中使用(參照美國(guó)專利No.5705396)。在美國(guó)專利No.5705396中記載，在APTT測(cè)定時(shí)，如果采用含銅鹽或鋅鹽的APTT測(cè)定用試劑，則肝素的活性降低。

但是，即使在使用含有肝素的待測(cè)樣品時(shí)，也期望高靈敏度測(cè)定凝固時(shí)間。

【發(fā)明概述】

本發(fā)明的范圍僅由隨附的權(quán)利要求確定，而不受此發(fā)明概述部分的任何影響。

本發(fā)明提供以下技術(shù)方案。

(1)凝固時(shí)間的測(cè)定方法，其包括：

(A)將血液待測(cè)樣品、活化劑、磷脂和鎳離子形成化合物混合而得到樣品的工序、及

(B)將上述工序(A)中得到的樣品和鈣鹽混合而調(diào)制測(cè)定樣品，測(cè)定測(cè)定樣品的凝固時(shí)間的工序。

(2)(1)所述的方法，其中上述工序(A)包括：

(A1-1)將血液待測(cè)樣品和活化劑和磷脂混合的工序、及

(A1-2)將上述工序(A1-1)中得到的混合物和鎳離子形成化合物混合的工序。

(3)(1)或(2)所述的方法，其中上述工序(A)中得到的樣品中的上述鎳離子形成化合物的終濃度是0.1μM以上、不足10mM。

(4)(1)～(3)之任一項(xiàng)所述的方法，其中上述工序(A)中得到的樣品中的上述鎳離子形成化合物的終濃度是0.1mM以上、不足5mM。

(5)(1)～(4)之任一項(xiàng)所述的方法，其中在上述工序(B)中，將上述工序(A)中得到的樣品在指定條件下溫育后，向上述樣品混合鈣鹽。

(6)(5)所述的方法，其中上述指定條件是以30℃以上45℃以下的溫度溫育的條件。

(7)(5)所述的方法，其中上述指定條件是以36℃以上38℃以下的溫度溫育的條件。

(8)(5)～(7)之任一項(xiàng)所述的方法，其中上述指定條件是以1分鐘以上6分鐘以下的加溫時(shí)間溫育的條件。

(9)(5)～(7)之任一項(xiàng)所述的方法，其中上述指定條件是以2分鐘以上5分鐘以下的加溫時(shí)間溫育的條件。

(10)(5)所述的方法，其中上述指定條件是以36℃以上38℃以下的溫度溫育2分鐘以上5分鐘以下的條件。

(11)(1)～(10)之任一項(xiàng)所述的方法，其中上述鎳離子形成化合物是選自醋酸鎳、磷化鎳、硫化鎳、氯化鎳、硫酸鎳及安息香酸鎳的化合物。

(12)凝固時(shí)間的測(cè)定裝置，其具備：

將血液待測(cè)樣品、活化劑、磷脂、鎳離子形成化合物和鈣鹽混合而調(diào)制測(cè)定樣品的樣品調(diào)制部，

從上述樣品調(diào)制部中得到的測(cè)定樣品取得顯示伴隨凝固反應(yīng)的變化的凝固信息的檢測(cè)部，

基于由上述檢測(cè)部取得的光學(xué)信息，算出上述測(cè)定樣品的凝固時(shí)間的算出部，及

收容活化劑、磷脂、鎳離子形成化合物和鈣鹽的試劑收容部，

其中上述樣品調(diào)制部

從上述試劑收容部取得上述活化劑、上述磷脂及上述鎳離子形成化合物，將上述活化劑、上述磷脂、上述鎳離子形成化合物和血液待測(cè)樣品混合而調(diào)制樣品，

從上述試劑收容部取得上述鈣鹽，將上述鈣鹽和上述樣品混合而得到測(cè)定樣品。

(13)(12)所述的凝固時(shí)間的測(cè)定裝置，其中上述樣品調(diào)制部將上述樣品在指定條件下溫育后，向上述樣品混合鈣鹽。

(14)(13)所述的凝固時(shí)間的測(cè)定裝置，其中上述樣品調(diào)制部是，作為上述指定條件，以30℃以上45℃以下的溫度溫育。

(15)(13)或(14)所述的凝固時(shí)間的測(cè)定裝置，其中上述樣品調(diào)制部是，作為上述指定條件，以1分鐘以上6分鐘以下的加溫時(shí)間溫育。

(16)用于在(1)～(11)之任一項(xiàng)所述的凝固時(shí)間的測(cè)定方法中使用的凝固時(shí)間測(cè)定用試劑，其含有鎳離子形成化合物。

(17)(16)所述的凝固時(shí)間測(cè)定用試劑，其中上述鎳離子形成化合物是選自醋酸鎳、磷化鎳、硫化鎳、氯化鎳、硫酸鎳及安息香酸鎳的化合物。

(18)試劑盒，其含：

第1試劑容器中收容的含活化劑和磷脂的第1試劑，

第2試劑容器中收容的含鎳離子形成化合物的第2試劑，及

第3試劑容器中收容的含鈣鹽的第3試劑。

(19)(18)所述的試劑盒，其中上述試劑盒是用于在(1)～(11)之任一項(xiàng)所述的凝固時(shí)間的測(cè)定方法中使用的試劑盒。

(20)下列物質(zhì)用于制造試劑盒的用途：第1試劑容器中收容的含活化劑和磷脂的第1試劑、第2試劑容器中收容的含鎳離子形成化合物的第2試劑、及第3試劑容器中收容的含鈣鹽的第3試劑。

【發(fā)明的效果】

由本發(fā)明可提供，即使在使用含有肝素的待測(cè)樣品時(shí)，也可高靈敏度測(cè)定凝固時(shí)間的凝固時(shí)間的測(cè)定方法及其裝置、凝固時(shí)間測(cè)定用試劑以及試劑盒。

【附圖說明】

圖1是凝固時(shí)間的測(cè)定裝置的構(gòu)成圖。

圖2是顯示由測(cè)定裝置的凝固時(shí)間的測(cè)定的處理順序的流程圖。

圖3是顯示樣品的調(diào)制工序的處理順序的流程圖。

圖4是顯示樣品的調(diào)制工序的處理順序的流程圖。

圖5是顯示向樣品的鈣鹽的添加工序及光學(xué)信息的取得工序的處理順序的流程圖。

圖6是試劑盒的構(gòu)成圖。

圖7是顯示將由實(shí)施例1的測(cè)定方法測(cè)得的凝固時(shí)間與由比較例1的測(cè)定方法測(cè)得的凝固時(shí)間對(duì)比的結(jié)果的坐標(biāo)圖。

圖8是顯示在實(shí)施例2及比較例2～5中研究肝素濃度和APTT比的關(guān)系的結(jié)果的坐標(biāo)圖。

【實(shí)施方式】

【1.凝固時(shí)間的測(cè)定方法】

本實(shí)施方式涉及的凝固時(shí)間的測(cè)定方法(以下，也簡(jiǎn)稱為“測(cè)定方法”)的特征在于包括(A)將血液待測(cè)樣品、活化劑、磷脂和鎳離子形成化合物混合而得到樣品的工序、及(B)將工序(A)中得到的樣品和鈣鹽混合而調(diào)制測(cè)定樣品，測(cè)定測(cè)定樣品的凝固時(shí)間的工序。本實(shí)施方式涉及的測(cè)定方法，在工序(A)中，在得到樣品時(shí)，將血液待測(cè)樣品、活化劑、磷脂和鎳離子形成化合物混合。從而，由本實(shí)施方式中涉及的測(cè)定方法，即使在使用含有肝素的待測(cè)樣品時(shí)，也能高靈敏度測(cè)定凝固時(shí)間。

再者，在本說明書中，“樣品”是指血液待測(cè)樣品、活化劑、磷脂和鎳離子形成化合物的混合物。另外，“測(cè)定樣品”是指血液待測(cè)樣品、活化劑、磷脂、鎳離子形成化合物和鈣鹽的混合物。

作為血液待測(cè)樣品，例如，可舉出血漿等，但不特別限定。在本說明書中，“正常血漿”是指從健康者的血液得到的血漿。正常血漿也可為市售的正常血漿。作為被檢血漿，例如，可舉出從被檢者得到的血漿、從被檢者得到且含肝素的血漿等，但不特別限定。

活化劑是有使與內(nèi)源性凝固途徑相關(guān)的接觸因子活化的作用的物質(zhì)即可。作為接觸因子，例如，可舉出前激肽釋放酶、高分子激肽原、第XII因子、第XI因子等，但不特別限定。作為活化劑，例如，可舉出鞣花酸化合物、氧化硅、高嶺土、硅藻土(例如，硅藻土公司制、商品名：硅藻土(注冊(cè)商標(biāo))等)等，但不特別限定。這些活化劑可單獨(dú)使用，也可將2種以上混合使用。鞣花酸化合物是指含鞣花酸、鞣花酸的鹽及鞣花酸的金屬絡(luò)合物的概念。

磷脂促進(jìn)血液的凝固反應(yīng)。磷脂是分子結(jié)構(gòu)中有磷酸酯部位的脂質(zhì)。磷脂可為天然來源磷脂，也可為合成磷脂。作為天然來源磷脂，例如，可舉出兔、牛、豬、雞、人等的動(dòng)物、大豆等的植物來源的磷脂等，但不特別限定。作為動(dòng)物來源的磷脂，例如，可舉出兔腦、牛腦、卵黃、人胎盤等來源的磷脂等，但不特別限定。作為磷脂，具體而言，例如，可舉出磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸等的甘油磷脂等，但不特別限定。在這些磷脂之中，為了血液的凝固反應(yīng)有效率地進(jìn)行，優(yōu)選為磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿及磷脂酰絲氨酸。這些磷脂可單獨(dú)使用，也可將2種以上混合使用。作為磷脂所具有的脂肪酸側(cè)鏈，例如，可舉出棕櫚酰基、油?；⒂仓；龋惶貏e限定。這些脂肪酸側(cè)鏈可在不妨礙血液的凝固反應(yīng)的范圍適宜選擇。

鎳離子形成化合物是在血液待測(cè)樣品中形成鎳離子的化合物即可。鎳離子形成化合物優(yōu)選為形成2價(jià)陽(yáng)離子的化合物。作為鎳離子形成化合物，例如，可舉出醋酸鎳、磷化鎳、硫化鎳、氯化鎳、硫酸鎳等，但不特別限定。這些鎳離子形成化合物之中，優(yōu)選為醋酸鎳。這些鎳離子形成化合物可單獨(dú)使用，也可將2種以上混合使用。

鈣鹽是在測(cè)定樣品中形成鈣離子的鹽即可。作為鈣鹽，可舉出氯化鈣、硫酸鈣、亞硝酸鈣、碳酸鈣、乳酸鈣、酒石酸鈣等，但不特別限定。這些鈣鹽可單獨(dú)使用，也可將2種以上混合使用。

在工序(A)中，將血液待測(cè)樣品、活化劑、磷脂和鎳離子形成化合物混合而得到樣品。在工序(A)之前，也可將血液待測(cè)樣品加溫到對(duì)于進(jìn)行凝固反應(yīng)適宜的溫度。血液待測(cè)樣品的加溫溫度通常，優(yōu)選為30～45℃、更優(yōu)選為36～38℃。

在工序(A)中，將血液待測(cè)樣品、活化劑、磷脂和鎳離子形成化合物的混合的順序不特別限定。工序(A)，例如，分為以下的實(shí)施方式。

(實(shí)施方式1)將血液待測(cè)樣品、活化劑和磷脂混合后，添加鎳離子形成化合物的工序

(實(shí)施方式2)將血液待測(cè)樣品和鎳離子形成化合物混合后，添加活化劑及磷脂的工序

(實(shí)施方式3)向血液待測(cè)樣品同時(shí)添加活化劑、磷脂和鎳離子形成化合物的工序

在實(shí)施方式1中，工序(A)，例如，含以下的工序(A1-1)及(A1-2)。

(A1-1)將血液待測(cè)樣品、活化劑和磷脂混合的工序、及

(A1-2)將工序(A1-1)中得到的混合物和鎳離子形成化合物混合的工序。

以下，舉實(shí)施方式1為例進(jìn)行說明，但本實(shí)施方式涉及的測(cè)定方法不特別限定。在工序(A1-1)中，將血液待測(cè)樣品、活化劑和磷脂混合而得到混合物。血液待測(cè)樣品、活化劑和磷脂的混合的順序不特別限定。也可將活化劑及磷脂同時(shí)與血液待測(cè)樣品混合。另外，也可將活化劑及磷脂在不同的時(shí)機(jī)與血液待測(cè)樣品混合。此時(shí)，可在向血液待測(cè)樣品的活化劑的添加后添加磷脂，也可在向血液待測(cè)樣品的磷脂的添加后添加活化劑。

在工序(A1-1)中，與血液待測(cè)樣品混合的活化劑的量是測(cè)定樣品中的活化劑的濃度成為指定濃度的量即可。測(cè)定樣品中的活化劑的濃度可根據(jù)活化劑的種類適宜設(shè)定。當(dāng)活化劑是鞣花酸化合物時(shí)，測(cè)定樣品中的活化劑的濃度通常優(yōu)選為3.5～150μM、更優(yōu)選是10～50μM。活化劑是氧化硅時(shí)，測(cè)定樣品中的活化劑的濃度通常優(yōu)選為0.04～0.4mg/mL、更優(yōu)選是0.07～0.2mg/mL。

在工序(A1-1)中，與血液待測(cè)樣品混合的磷脂的量是測(cè)定樣品中的磷脂的濃度成為指定濃度的量即可。測(cè)定樣品中的磷脂的濃度可根據(jù)磷脂的種類適宜設(shè)定。磷脂是磷脂酰乙醇胺時(shí)，測(cè)定樣品中的磷脂的濃度通常優(yōu)選為1～150μg/mL、更優(yōu)選是5～50μg/mL。磷脂是磷脂酰膽堿時(shí)，測(cè)定樣品中的磷脂的濃度通常優(yōu)選為1～100μg/mL、更優(yōu)選是5～80μg/mL。磷脂是磷脂酰絲氨酸時(shí)，測(cè)定樣品中的磷脂的濃度通常優(yōu)選為0.1～50μg/mL、更優(yōu)選是1～10μg/mL。磷脂是2種以上的磷脂的混合物時(shí)，測(cè)定樣品中的各磷脂的濃度的合計(jì)通常優(yōu)選為5～400μg/mL、更優(yōu)選是20～100μg/mL。

血液待測(cè)樣品和活化劑及/或磷脂的混合時(shí)的加溫溫度是對(duì)于進(jìn)行血液的凝固反應(yīng)適宜的溫度即可。加溫溫度通常優(yōu)選為30～45℃、更優(yōu)選為于36～38℃。另外，加溫時(shí)間通常優(yōu)選為10～150秒鐘、更優(yōu)選是30～90秒鐘。

在工序(A1-2)中，將工序(A1-1)中得到的混合物和鎳離子形成化合物混合而得到樣品。

在工序(A1-2)中，與工序(A1-1)中得到的混合物混合的鎳離子形成化合物的量是測(cè)定樣品中的鎳離子形成化合物的終濃度成為指定濃度的量即可。測(cè)定樣品中的鎳離子形成化合物的終濃度優(yōu)選為0.1μM以上、更優(yōu)選是0.1mM以上，優(yōu)選不足10mM、更優(yōu)選是5mM以下。

工序(A1-1)中得到的混合物和鎳離子形成化合物的混合時(shí)的加溫溫度是對(duì)于進(jìn)行血液的凝固反應(yīng)適宜的溫度即可。溫度通常優(yōu)選為30～45℃、更優(yōu)選為36～38℃。另外，加溫時(shí)間通常優(yōu)選為30～420秒鐘、更優(yōu)選是100～350秒鐘。

從有效抑制凝固時(shí)間的測(cè)定時(shí)凝固時(shí)間變得過長(zhǎng)的觀點(diǎn)來看，最好是在工序(A1-1)中的血液待測(cè)樣品、活化劑和磷脂的混合結(jié)束時(shí)起150秒鐘以內(nèi)、優(yōu)選為60秒鐘以內(nèi)，在工序(A1-2)中將工序(A1-1)中得到的混合物和鎳離子形成化合物混合。

在工序(B)中，將工序(A)中得到的樣品和鈣鹽混合而調(diào)制測(cè)定樣品，測(cè)定測(cè)定樣品的凝固時(shí)間。

與樣品混合的鈣鹽的量是測(cè)定樣品中的鈣鹽的濃度成為指定濃度的量即可。測(cè)定樣品中的鈣鹽的濃度優(yōu)選為2～20mM、更優(yōu)選是4～10mM。

在工序(B)中，在向樣品添加鈣鹽之前，也可將樣品加溫到對(duì)于進(jìn)行凝固反應(yīng)適宜的溫度。樣品的加溫溫度，從凝固反應(yīng)的反應(yīng)性的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選為30℃以上、更優(yōu)選是36℃以上，從蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性觀點(diǎn)來看，優(yōu)選為45℃以下，更優(yōu)選是38℃以下。此時(shí)，加溫時(shí)間，從凝固反應(yīng)的反應(yīng)性的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選為1分鐘以上、更優(yōu)選是2分鐘以上，從蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性觀點(diǎn)來看，優(yōu)選為6分鐘以下，更優(yōu)選是5分鐘以下。

測(cè)定樣品的凝固時(shí)間可基于凝固信息研究。作為凝固信息，例如，可舉出向測(cè)定樣品照射光時(shí)的透射光或散射光的變化、測(cè)定樣品的粘度的變化等，但不特別限定。此時(shí)，測(cè)定樣品的凝固時(shí)間可通過向測(cè)定樣品照射光，由監(jiān)測(cè)透過測(cè)定樣品的透射光或來自測(cè)定樣品散射光的變化、監(jiān)測(cè)測(cè)定樣品的粘度的變化等研究。其中，在本說明書中，“凝固時(shí)間”是指活化部分促凝血酶原激酶時(shí)間。凝固時(shí)間是向樣品的鈣鹽的添加開始時(shí)起至血漿凝固的時(shí)間。

血漿的凝固，例如，可以來自照射光的測(cè)定樣品光的變化消失，測(cè)定樣品的粘度的變化消失等作為指標(biāo)進(jìn)行判斷。

【2.凝固時(shí)間的測(cè)定裝置】

[測(cè)定裝置的整體構(gòu)成]

基于附圖說明在前述的測(cè)定方法中使用的凝固時(shí)間的測(cè)定裝置(以下，也簡(jiǎn)稱為“測(cè)定裝置”)的一例。如圖1所示，測(cè)定裝置10含測(cè)定單元20和處理裝置30。測(cè)定單元20和處理裝置30能通信地連接。

[測(cè)定單元的構(gòu)成]

如圖1所示，測(cè)定單元20含樣品調(diào)制部100、檢測(cè)部200、試劑收容部300、收容血液待測(cè)樣品的待測(cè)樣品收容部400和控制部500。

樣品調(diào)制部100從試劑收容部300取得試劑的同時(shí)，從待測(cè)樣品收容部400取得血液待測(cè)樣品。另外，樣品調(diào)制部100通過將取得的試劑和血液待測(cè)樣品以指定的處理順序混合調(diào)制測(cè)定樣品。樣品調(diào)制部100含待測(cè)樣品搬送部111、第1試劑搬送部112、第2試劑搬送部113、第3試劑搬送部114、第4試劑搬送部115和比色杯搬送部131。待測(cè)樣品搬送部111有第1噴嘴101。待測(cè)樣品搬送部111取得待測(cè)樣品收容部400內(nèi)收容的血液待測(cè)樣品。另外，待測(cè)樣品搬送部111將取得的血液待測(cè)樣品吐出到比色杯90內(nèi)。第1試劑搬送部112有第2噴嘴102。第1試劑搬送部112由第2噴嘴102，取得試劑收容部300的第1容器301內(nèi)收容的試劑。另外，第1試劑搬送部112將取得的試劑吐出到比色杯90內(nèi)。第2試劑搬送部113有第3噴嘴103。第2試劑搬送部113由第3噴嘴103，取得試劑收容部300的第2容器302內(nèi)收容的試劑。另外，第2試劑搬送部113將取得的試劑吐出到比色杯90內(nèi)。第3試劑搬送部114由第4噴嘴104，取得試劑收容部300的第3容器303內(nèi)收容的試劑。另外，第3試劑搬送部114將取得的試劑吐出到比色杯90內(nèi)。第4試劑搬送部115由第5噴嘴105，取得試劑收容部300的第4容器304內(nèi)收容的試劑。另外，第4試劑搬送部115將取得的試劑吐出到比色杯90內(nèi)。比色杯搬送部131將收容調(diào)制的測(cè)定樣品的比色杯90搬送到檢測(cè)部200。

檢測(cè)部200含光照射部201、光接收部202和第2比色杯裝載部203。光照射部201有對(duì)測(cè)定樣品的照射光的光源。照射光的波長(zhǎng)是對(duì)于監(jiān)測(cè)伴隨血液的凝固反應(yīng)的進(jìn)行的變化適宜的波長(zhǎng)即可。光接收部202接收來自測(cè)定樣品的光。另外，來自測(cè)定樣品光可為透射光，也可為散射光。光接收部202將對(duì)應(yīng)于接收的光的量的電信號(hào)輸出到處理裝置的算出部31。第2比色杯裝載部203設(shè)在光照射部201和光接收部202之間。在第2比色杯裝載部203裝載有從樣品調(diào)制部100搬送的比色杯90。

試劑收容部300收容凝固時(shí)間的測(cè)定中使用的試劑。在本實(shí)施方式中，試劑收容部300含收容活化劑的第1容器301、收容磷脂的第2容器302、收容鎳離子形成化合物的第3容器303及收容鈣鹽的第4容器304。在第1～第4容器各自設(shè)有用于識(shí)別各容器內(nèi)收容的試劑的種類的識(shí)別子。作為識(shí)別子，例如，可舉出條碼等，但不特別限定。再者，在本實(shí)施方式中，第1容器301和第2容器302作為不同的容器試劑設(shè)在收容部300。但是，由于活化劑和磷脂可同時(shí)與血液待測(cè)樣品混合，因此也可代替第1容器及第2容器而在同一容器中收容活化劑及磷脂。此時(shí)，第1試劑搬送部112和第2試劑搬送部113是共同的搬送部。

待測(cè)樣品收容部400收容血液待測(cè)樣品。在本實(shí)施方式中，待測(cè)樣品收容部400具備多個(gè)待測(cè)樣品容器401。另外，待測(cè)樣品收容部400將收容期望的血液待測(cè)樣品的待測(cè)樣品容器401搬送到指定的待測(cè)樣品抽引位置。在多個(gè)待測(cè)樣品容器401中各自設(shè)有用于識(shí)別各容器內(nèi)收容的血液待測(cè)樣品的種類的識(shí)別子。作為識(shí)別子，例如，可舉出條碼等，但不特別限定。

控制部500含CPU(中央處理器)501和存儲(chǔ)部502?？刂撇?00由計(jì)算機(jī)構(gòu)成。CPU501實(shí)行存儲(chǔ)部502中存儲(chǔ)的計(jì)算機(jī)程序。由此，CPU501進(jìn)行樣品調(diào)制部100中的樣品調(diào)制的處理以及檢測(cè)部200中的關(guān)于測(cè)定樣品的光學(xué)信息的取得的處理。作為計(jì)算機(jī)程序，例如，可舉出用于測(cè)定樣品的調(diào)制的計(jì)算機(jī)程序、用于取得關(guān)于測(cè)定樣品的光學(xué)信息的計(jì)算機(jī)程序等，但不特別限定。另外，存儲(chǔ)部502還存儲(chǔ)用于識(shí)別試劑收容部300內(nèi)收容的試劑的試劑識(shí)別信息、關(guān)于調(diào)制測(cè)定樣品時(shí)的處理順序的樣品調(diào)制信息、及用于識(shí)別待測(cè)樣品收容部400內(nèi)收容的血液待測(cè)樣品的待測(cè)樣品識(shí)別信息。作為樣品識(shí)別信息，例如，可舉出試劑的種類和收容容器的位置和識(shí)別子關(guān)聯(lián)的信息等，但不特別限定。另外，作為待測(cè)樣品識(shí)別信息，例如，可舉出血液待測(cè)樣品的種類和收容容器的位置和識(shí)別子的關(guān)聯(lián)的信息等，但不特別限定。CPU501使用存儲(chǔ)部502中存儲(chǔ)的試劑識(shí)別信息及樣品調(diào)制信息，實(shí)行測(cè)定樣品的調(diào)制用的計(jì)算機(jī)程序。由此，CPU501使測(cè)定單元20的樣品調(diào)制部10進(jìn)行測(cè)定樣品的調(diào)制。

[處理裝置的構(gòu)成]

處理裝置30，如圖1所示，含算出部31、顯示部32和輸入部33。在本實(shí)施方式中，處理裝置30由計(jì)算機(jī)系統(tǒng)構(gòu)成。算出部31含CPU601和存儲(chǔ)部602。CPU601實(shí)行存儲(chǔ)部602中存儲(chǔ)的計(jì)算機(jī)程序。由此，CPU601進(jìn)行凝固時(shí)間的算出的處理。作為顯示部32，例如，可舉出顯示屏等，但不特別限定。顯示部32，例如，顯示算出的凝固時(shí)間的信息等。作為輸入部33，例如，可舉出鍵盤、鼠標(biāo)等，但不特別限定。

存儲(chǔ)部602安裝有用于使CPU601實(shí)行的操作系統(tǒng)、應(yīng)用程序等的計(jì)算機(jī)程序及在計(jì)算機(jī)程序的實(shí)行中使用的數(shù)據(jù)。作為應(yīng)用程序，例如，可舉出用于凝固時(shí)間的測(cè)定的計(jì)算機(jī)程序等，但不特別限定。CPU601實(shí)行存儲(chǔ)部602中存儲(chǔ)的凝固時(shí)間的測(cè)定用的計(jì)算機(jī)程序。由此，CPU601使測(cè)定裝置10進(jìn)行凝固時(shí)間的測(cè)定。

[測(cè)定裝置的變形例]

待測(cè)樣品搬送部111、第1試劑搬送部112、第2試劑搬送部113、第3試劑搬送部114及第4試劑搬送部115也可為用于使待測(cè)樣品或試劑流動(dòng)的流路。作為流路，可舉出管等，但不特別限定。

另外，凝固時(shí)間也可基于隨血液的凝固的粘度的增加及其他的凝固信息測(cè)定。在基于隨血液的凝固的粘度的增加測(cè)定凝固時(shí)間時(shí)，檢測(cè)部200具備高頻率發(fā)送線圈、高頻率接收線圈、高頻率發(fā)送線圈和高頻率接收線圈之間的裝載收容鋼球的比色杯的比色杯裝載部、及在比色杯裝載部的兩端設(shè)的電磁鐵。比色杯內(nèi)的鋼球由電磁鐵發(fā)生的磁力左右簡(jiǎn)諧振動(dòng)。此簡(jiǎn)諧振動(dòng)隨著粘度增加而減少。如果測(cè)定樣品的凝固開始，則測(cè)定樣品的粘度增加，從而鋼球的振幅減小。從而，檢測(cè)部200通過高頻率接收線圈接收高頻率發(fā)送線圈發(fā)送的高頻率，檢測(cè)振幅的變化。另外，處理裝置30的算出部31基于檢測(cè)的振幅的變化，算出凝固時(shí)間。

[凝固時(shí)間的測(cè)定裝置的處理順序]

接下來，基于圖2，說明由測(cè)定裝置10的凝固時(shí)間的測(cè)定的處理順序的概要。在以下的處理順序中，測(cè)定單元20的控制部500使用從存儲(chǔ)部502取得的試劑識(shí)別信息及樣品調(diào)制信息，實(shí)行存儲(chǔ)部502中存儲(chǔ)的測(cè)定樣品的調(diào)制用的計(jì)算機(jī)程序。另外，控制部500實(shí)行存儲(chǔ)部502中存儲(chǔ)的關(guān)于測(cè)定樣品的光學(xué)信息的取得用的計(jì)算機(jī)程序。處理裝置30的算出部31使用取得的光學(xué)信息，實(shí)行存儲(chǔ)部602中存儲(chǔ)的凝固時(shí)間的測(cè)定用的計(jì)算機(jī)程序。

首先，在步驟S1中，測(cè)定單元20的控制部500使樣品調(diào)制部100實(shí)行樣品的調(diào)制。步驟S1的樣品的調(diào)制根據(jù)后述的圖3及圖4所示的處理順序?qū)嵭小?/p>

其后，在步驟S2中，控制部500使樣品調(diào)制部100實(shí)行向樣品的鈣鹽的添加。另外，在步驟S3中，控制部500使檢測(cè)部200實(shí)行關(guān)于測(cè)定樣品的光學(xué)信息的取得。步驟S2的向樣品的鈣鹽的添加和步驟S3的光學(xué)信息的取得根據(jù)圖5所示的處理順序?qū)嵭小?/p>

其后，在步驟S4中，處理裝置30的算出部31通過實(shí)行凝固時(shí)間的算出用的計(jì)算機(jī)程序，算出凝固時(shí)間。

[樣品的調(diào)制的處理順序]

接下來，基于圖3及圖4，說明由測(cè)定裝置10的樣品的調(diào)制的處理順序的概要。

首先，在步驟S101中，控制部500使樣品調(diào)制部100實(shí)行向圖1中的樣品調(diào)制位置62的比色杯90的配置。具體而言，控制部500在樣品調(diào)制部100中將比色杯90裝載至位于圖1中的第1比色杯裝載部61。由此進(jìn)行向樣品調(diào)制位置62的比色杯90的配置。

接下來，在步驟S102中，控制部500使待測(cè)樣品收容部400實(shí)行向圖1中的待測(cè)樣品抽引位置81的待測(cè)樣品容器401的搬送。此時(shí)，控制部500基于存儲(chǔ)部502中存儲(chǔ)的待測(cè)樣品識(shí)別信息，使待測(cè)樣品收容部400選擇收容期望的血液待測(cè)樣品的待測(cè)樣品容器401。進(jìn)而，控制部在待測(cè)樣品收容部400，將選擇的待測(cè)樣品容器401搬送至位于待測(cè)樣品抽引位置81。

接下來，在步驟S103中，控制部500使樣品調(diào)制部100實(shí)行向待測(cè)樣品抽引位置81的第1噴嘴101的移動(dòng)。其后，在步驟S104中，控制部500使樣品調(diào)制部100實(shí)行自待測(cè)樣品容器401抽引血液待測(cè)樣品。具體而言，控制部500使樣品調(diào)制部100經(jīng)第1噴嘴101抽引待測(cè)樣品容器401中收容的血液待測(cè)樣品。

接下來，在步驟S105中，控制部500使樣品調(diào)制部100實(shí)行向樣品調(diào)制位置62的第1噴嘴101的移動(dòng)。其后，在步驟S106中，控制部500使樣品調(diào)制部100實(shí)行向比色杯90的血液待測(cè)樣品的吐出。具體而言，控制部500使樣品調(diào)制部100將用第1噴嘴101抽引的血液待測(cè)樣品吐出到比色杯90。

接下來，在步驟S107中，控制部500使樣品調(diào)制部100實(shí)行向活化劑抽引位置71的第2噴嘴102的移動(dòng)。其后，在步驟S108中，控制部500使樣品調(diào)制部100實(shí)行自第1容器301抽引活化劑。具體而言，控制部500使樣品調(diào)制部100經(jīng)第2噴嘴102抽引第1容器301中收容的活化劑。

接下來，在步驟S109中，控制部500使樣品調(diào)制部100實(shí)行向樣品調(diào)制位置62的第2噴嘴102的移動(dòng)。其后，在步驟S110中，控制部500使樣品調(diào)制部100實(shí)行向比色杯90的活化劑的吐出。具體而言，控制部500使樣品調(diào)制部100將用第2噴嘴102抽引的活化劑吐出到比色杯90。

接下來，在圖4的步驟S111～步驟S114的各步驟中，控制部500使樣品調(diào)制部100實(shí)行向磷脂抽引位置72的第3噴嘴103的移動(dòng)、自第2容器302抽引磷脂、向樣品調(diào)制位置62的第3噴嘴103的移動(dòng)及向比色杯90的磷脂的吐出。步驟S111～步驟S114的各步驟除由第3噴嘴103進(jìn)行磷脂的抽引及吐出的一系列的處理之外，與圖3的步驟S107～步驟S110的各步驟相同。

接下來，在步驟S115至步驟S118的各步驟中，控制部500使樣品調(diào)制部100實(shí)行向鎳離子形成化合物抽引位置73的第4噴嘴104的移動(dòng)、自第3容器303抽引鎳離子形成化合物、向樣品調(diào)制位置62的第4噴嘴104的移動(dòng)及向比色杯90的鎳離子形成化合物的吐出。步驟S115至步驟S118的各步驟除由第4噴嘴104進(jìn)行鎳離子形成化合物的抽引及吐出的一系列的動(dòng)作之外，與圖3的步驟S107至步驟S110相同。由此，得到樣品。

再者，在本實(shí)施方式中，以活化劑的添加及磷脂的添加的順序進(jìn)行向血液待測(cè)樣品的活化劑及磷脂的添加。但是，活化劑及磷脂的添加也可同時(shí)進(jìn)行。

[向樣品的鈣鹽的添加及光學(xué)信息的取得的處理順序]

接下來，基于圖5，說明由測(cè)定裝置10的向樣品的鈣鹽的添加及光學(xué)信息的取得的處理順序的概要。

在圖5的步驟S201～步驟S204的各步驟中，控制部500使樣品調(diào)制部100實(shí)行向鈣鹽抽引位置74的第5噴嘴105的移動(dòng)、自第2容器302抽引鈣鹽、向樣品調(diào)制位置62的第5噴嘴105的移動(dòng)及向比色杯90的鈣鹽的吐出。由此，得到測(cè)定樣品。步驟S201～步驟S204的各步驟除由第5噴嘴105進(jìn)行鈣鹽的抽引及吐出的一系列的處理之外，與圖3的步驟S107～步驟S110的各步驟相同。

與步驟S204同時(shí)，在步驟S301中，控制部500使樣品調(diào)制部100經(jīng)比色杯搬送部131將比色杯90搬送到檢測(cè)部200的第2比色杯裝載部203。另外，在步驟S301中，控制部500使檢測(cè)部200實(shí)行向測(cè)定樣品的光照射。具體而言，控制部500使檢測(cè)部200的光照射部201對(duì)于第2比色杯裝載部203中裝載的比色杯90照射光。由此，向比色杯90內(nèi)的測(cè)定樣品照射光。

接下來，在步驟302中，控制部500使檢測(cè)部200實(shí)行來自測(cè)定樣品的光的測(cè)定。具體而言，控制部500使檢測(cè)部200的光接收部202將對(duì)應(yīng)于接收的透射光的量的電信號(hào)輸出到處理裝置的算出部31。

其后，處理進(jìn)行至圖2的步驟S4中的凝固時(shí)間的算出。

[處理順序的變形例]

步驟S107～步驟S110的一系列的步驟和步驟S111～步驟S114的一系列的步驟可并行進(jìn)行。另外，步驟S115～步驟S118的一系列的步驟也可先于步驟S107～步驟S110的一系列的步驟及步驟S111～步驟S114的一系列的步驟這兩者進(jìn)行。

另外，在基于隨血液的凝固的粘度的增加測(cè)定凝固時(shí)間時(shí)，作為檢測(cè)部200，可使用具備高頻率發(fā)送線圈、高頻率接收線圈、裝載收容鋼球的比色杯的比色杯裝載部和電磁鐵的檢測(cè)部。其中，控制部500通過由高頻率接收線圈接收檢測(cè)部200的高頻率發(fā)送線圈發(fā)送的高頻率檢測(cè)振幅的變化。接下來，控制部500使檢測(cè)部200將關(guān)于振幅的變化的信息輸出到處理裝置30。其后，處理裝置30的算出部31使用關(guān)于取得的振幅的變化的信息，通過實(shí)行存儲(chǔ)部602中存儲(chǔ)的凝固時(shí)間的測(cè)定用的計(jì)算機(jī)程序，算出凝固時(shí)間。

【3.凝固時(shí)間測(cè)定用試劑】

本實(shí)施方式涉及的凝固時(shí)間測(cè)定用試劑是含有鎳離子形成化合物的用于在前述的凝固時(shí)間的測(cè)定方法中使用的凝固時(shí)間測(cè)定用試劑。鎳離子形成化合物與前述的測(cè)定方法中的鎳離子形成化合物相同。

本實(shí)施方式涉及的凝固時(shí)間測(cè)定用試劑可為基本上由鎳離子形成化合物組成的試劑，也可為除鎳離子形成化合物外還含有適宜的溶劑、助劑等的試劑。再者，本實(shí)施方式涉及的凝固時(shí)間測(cè)定用試劑基本上不含有磷脂和活化劑。

凝固時(shí)間測(cè)定用試劑可以固體的狀態(tài)提供。此時(shí)，作為凝固時(shí)間測(cè)定用試劑的劑型，例如，可舉出粒劑、粉劑等，但不特別限定。

凝固時(shí)間測(cè)定用試劑可為使鎳離子形成化合物溶解于適宜的溶劑的狀態(tài)。此時(shí)，作為溶劑，例如，可舉出脫鹽純化水、生理鹽水等，但不特別限定。

在凝固時(shí)間測(cè)定用試劑是使鎳離子形成化合物溶解于適宜的溶劑的狀態(tài)的試劑時(shí)，凝固時(shí)間測(cè)定用試劑中的鎳離子形成化合物的含量?jī)?yōu)選為1μM以上、更優(yōu)選是0.1mM以上，優(yōu)選為50mM以下，更優(yōu)選是10mM以下。

在凝固時(shí)間測(cè)定用試劑還含有助劑時(shí)，作為助劑，例如，可舉出鎳離子形成化合物的穩(wěn)定化劑、保存劑等，但不特別限定。

【4.試劑盒】

本實(shí)施方式涉及的試劑盒是含第1試劑容器中收容的含活化劑和磷脂的第1試劑、第2試劑容器中收容的含鎳離子形成化合物的第2試劑及第3試劑容器中收容的含鈣鹽的第3試劑的試劑盒。作為本實(shí)施方式涉及的試劑盒的一例，可舉出圖6所示的試劑盒800等，但不特別限定。圖6所示的試劑盒800含第1試劑容器801、第2試劑容器802和第3試劑容器803。第1試劑容器801收容含活化劑和磷脂的第1試劑。第2試劑容器802收容含鎳離子形成化合物的第2試劑。第3試劑容器803收容含鈣鹽的第3試劑。試劑盒還可含附帶文書。附帶文書也可含使用本實(shí)施方式涉及的試劑盒進(jìn)行上述的凝固時(shí)間的測(cè)定方法的操作順序等的記載。

第1試劑中的活化劑的濃度是可將測(cè)定樣品中的濃度調(diào)整到上述的測(cè)定方法中的濃度的范圍的范圍即可?；罨瘎┦趋坊ㄋ峄衔飼r(shí)，第1試劑中的活化劑的濃度通常優(yōu)選為10～400μM、更優(yōu)選是50～150μM。活化劑是氧化硅時(shí)，第1試劑中的活化劑的濃度通常優(yōu)選為0.1～1mg/mL、更優(yōu)選是0.2～0.6mg/mL。

第1試劑中的磷脂的濃度是可將測(cè)定樣品中的濃度調(diào)整到上述的測(cè)定方法中的濃度的范圍的范圍即可。第1試劑中的磷脂的濃度通常優(yōu)選為30～400μg/mL、更優(yōu)選是10～100μg/mL。磷脂是磷脂酰乙醇胺時(shí)，第1試劑中的磷脂的濃度通常優(yōu)選為10～100μg/mL、更優(yōu)選是20～50μg/mL。磷脂是磷脂酰膽堿時(shí)，測(cè)定樣品中的磷脂的濃度通常優(yōu)選為10～300μg/mL、更優(yōu)選是10～100μg/mL。磷脂是磷脂酰絲氨酸時(shí)，測(cè)定樣品中的磷脂的濃度通常優(yōu)選為1～75μg/mL、更優(yōu)選是2～15μg/mL。

第2試劑可為固體狀態(tài)的鎳離子形成化合物，也可為使鎳離子形成化合物溶解于適宜的溶劑的狀態(tài)。溶劑與上述的凝固時(shí)間測(cè)定用試劑中的溶劑相同。

在第2試劑是使鎳離子形成化合物溶解于適宜的溶劑的狀態(tài)的試劑時(shí)，第2試劑中的鎳離子形成化合物的濃度是可將測(cè)定樣品中的濃度調(diào)整到上述的測(cè)定方法中的濃度的范圍的范圍即可。此時(shí)，第2試劑中的鎳離子形成化合物的濃度優(yōu)選為1μM以上、更優(yōu)選是0.1mM以上，優(yōu)選為50mM以下，更優(yōu)選是10mM以下。

第3試劑中的鈣鹽的濃度是可將測(cè)定樣品中的濃度調(diào)整到上述的測(cè)定方法中的濃度的范圍的范圍即可。第3試劑中的鈣鹽的濃度優(yōu)選為2.5～40mM、更優(yōu)選是10～30mM。

在本實(shí)施方式涉及的試劑盒中，第2試劑基本上不含有磷脂和活化劑。另外，在本實(shí)施方式涉及的試劑盒中，第1試劑基本上不含有鎳離子形成化合物。

在試劑盒中使用的活化劑、磷脂、鎳離子形成化合物及鈣鹽與在前述的測(cè)定方法中使用的相同。另外，在各試劑容器中，也可適宜地收容有適宜的溶劑、助劑等。溶劑及助劑與凝固時(shí)間測(cè)定用試劑中使用的溶劑及試劑相同。再者，在本實(shí)施方式涉及的試劑盒中，活化劑及磷脂也可在不同的容器中收容。

【實(shí)施例】

在下文中，凝固時(shí)間的測(cè)定由全自動(dòng)凝固時(shí)間測(cè)定裝置〔Sysmex(株)制、商品名：CS-2000i〕進(jìn)行。

【實(shí)施例1】

在本實(shí)施例中，作為血液待測(cè)樣品，使用正常血漿或被檢血漿。作為正常血漿，使用表1所示的正常血漿。另外，作為被檢血漿，使用表1所示的肝素添加血漿。

【表1】

將血液待測(cè)樣品50μL于37℃加熱60秒鐘。向加熱后的血液待測(cè)樣品添加APTT試劑〔Roche·Diagnostics公司制、商品名：PTT-LA(注冊(cè)商標(biāo))〕50μL，混合。將得到的混合物于37℃加熱20秒鐘。向加熱后的混合物添加2.5mM氯化醋酸鎳水溶液20μL，混合。將得到的混合物于37℃加熱170秒鐘。向加熱后的混合物添加作為凝固反應(yīng)促進(jìn)劑的25mM氯化鈣水溶液的同時(shí)測(cè)定凝固時(shí)間。由實(shí)施例1的測(cè)定方法測(cè)得的凝固時(shí)間示于圖7。

【比較例1】

在本比較例中，作為血液待測(cè)樣品，使用與實(shí)施例1同樣的血液待測(cè)樣品。將血液待測(cè)樣品50μL于37℃加熱60秒鐘。向加熱后的血液待測(cè)樣品添加APTT試劑〔Roche·Diagnostics公司制、商品名：PTT-LA(注冊(cè)商標(biāo))〕50μL，混合。將得到的混合物于37℃加熱170秒鐘。向加熱后的混合物添加25mM氯化鈣水溶液的同時(shí)測(cè)定凝固時(shí)間。由比較例1的測(cè)定方法測(cè)得的凝固時(shí)間示于圖7。

【結(jié)果】

從圖7所示的結(jié)果得知，由實(shí)施例1的測(cè)定方法測(cè)得的凝固時(shí)間比由比較例1的測(cè)定方法測(cè)得的凝固時(shí)間長(zhǎng)。從而得知，由實(shí)施例1的測(cè)定方法，即使是在使用含有肝素的待測(cè)樣品血漿時(shí)，也能與比較例1的測(cè)定方法比更高靈敏度測(cè)定凝固時(shí)間。

【實(shí)施例2及比較例2～5】

作為血液待測(cè)樣品，除使用表1所示的正常血漿、表1所示的被檢血漿之中的HE2、HE4、HE6、HE8及HE10之外，進(jìn)行與實(shí)施例1同樣的操作，測(cè)定凝固時(shí)間(實(shí)施例2)。使用由實(shí)施例2的測(cè)定方法得到的凝固時(shí)間，根據(jù)式(I)求出APTT比：

[APTT比]＝[被檢血漿的凝固時(shí)間/正常血漿的凝固時(shí)間] (I)

除了代替使用2.5mM醋酸鎳水溶液而使用2.5mM氯化鈣水溶液(比較例2)、2.5mM氯化鎂水溶液(比較例3)、2.5mM硫酸銅水溶液(比較例4)及2.5mM氯化鋅水溶液(比較例5)以及作為血液待測(cè)樣品，使用表1所示的正常血漿、表1所示的被檢血漿之中的HE2、HE4、HE6、HE8及HE10之外，進(jìn)行與實(shí)施例1同樣的操作，測(cè)定凝固時(shí)間。再者，氯化鈣、氯化鎂、硫酸銅及氯化鋅是形成2價(jià)鎳離子以外的2價(jià)離子(2價(jià)陽(yáng)離子)的化合物。

使用由比較例1～5各自的測(cè)定方法得到的凝固時(shí)間，根據(jù)式(I)，求出APTT比。研究肝素濃度和APTT比的關(guān)系的結(jié)果示于圖8。圖中，白色圓點(diǎn)表示由實(shí)施例2的測(cè)定方法(有鎳離子形成化合物)得到的APTT比、黑色四角形表示由比較例1的測(cè)定方法(無形成2價(jià)陽(yáng)離子的化合物)得到的APTT比、白色三角形表示由比較例2的測(cè)定方法(有形成鈣離子的化合物)得到的APTT比、黑色三角形表示由比較例3的測(cè)定方法(有形成鎂離子的化合物)得到的APTT比、白色四角形表示由比較例4的測(cè)定方法(有形成銅離子的化合物)得到的APTT比、黑色圓點(diǎn)表示由比較例5的測(cè)定方法(有形成鋅離子的化合物)得到的APTT比。

從圖8所示的結(jié)果得知，由實(shí)施例2的測(cè)定方法得到的APTT比比由比較例1～5的測(cè)定方法得到的APTT比大。從而得知，如實(shí)施例2一樣，通過使用鎳離子形成化合物，與使用其他形成二價(jià)離子的化合物時(shí)(比較例2～5)或以往的方法(比較例1)比，對(duì)含有肝素的待測(cè)樣品的靈敏度升高。另一方面得知，如比較例2～5的測(cè)定方法一樣，使用其他形成二價(jià)離子的化合物時(shí)，APTT比是與由比較例1的測(cè)定方法得到的APTT比同程度以下。

從這些結(jié)果得知，在使用APTT試劑的凝固時(shí)間的測(cè)定中，在添加凝固反應(yīng)促進(jìn)劑前，通過將在2價(jià)陽(yáng)離子之中也形成鎳離子的化合物添加到血液待測(cè)樣品，能高靈敏度測(cè)定凝固時(shí)間。