本發(fā)明涉及一種用于檢測鼻咽癌的試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
：鼻咽癌(NPC)是我國南方常見的惡性腫瘤，廣東為高發(fā)區(qū)。鼻咽癌是指鼻咽粘膜上皮發(fā)生的癌腫，大多為低分化鱗癌,其惡性度高，發(fā)病部位隱蔽，特別是在咽隱窩和鼻咽頂部者，早期癥狀不明顯，因而難以早期發(fā)現(xiàn)，誤診誤治率較高，可達(dá)12.2％,因而在確診的鼻咽癌中，其5年生存率長期徘徊在50％～60％左右。對鼻咽癌進(jìn)行早期診斷以便早期治療，提高患者的生存率一直是NPC臨床研究的重要課題之一。目前對鼻咽癌早期的檢測方法有多種，包括有：EB病毒血清學(xué)標(biāo)記物如病毒殼抗原一免疫球蛋白A(EBVCA21gA)、EB病毒潛伏膜蛋白、EB病毒早期復(fù)合抗原(EBV2-EA)IgG的抗體檢測，鼻咽癌相關(guān)腫瘤標(biāo)記物如白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、細(xì)胞間黏附分子、CYFRA2121以及端粒酶等的檢測。雖然這些指標(biāo)的單獨或聯(lián)合應(yīng)用為鼻咽癌的診斷提供了有用的信息，然而它們均缺乏足夠的靈敏度與特異性。NASG蛋白是一種分泌性蛋白(基因序列登錄號：AF439448.1)，在正常人及鼻咽部慢性炎癥患者的鼻咽組織中表達(dá)豐富，而在鼻咽癌患者的鼻咽組織中表達(dá)顯著下調(diào)。因而如何通過檢測NASG蛋白的含量以及如何無創(chuàng)傷地獲取NASG蛋白則是建立早期、無創(chuàng)傷檢測鼻咽癌的有效方法。核酸適體(Aptamer,又稱適配體,適配子)是能高親和性、高特異性的結(jié)合某種生物革El標(biāo)的單鏈寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸適體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systemat1cEvolut1onofL1gandsbyExponent1alenr1chment,SELEX)從人工合成的DNA/RNA文庫中篩選得到的能夠高度特異性結(jié)合靶標(biāo)分子的單鏈DNA/RNA。已報道核酸適體的靶標(biāo)包括金屬離子、有機小分子、多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞甚至組織等。核酸適體的分子識別功能與抗體類似，具有與抗體分子相當(dāng)甚至更強的靶標(biāo)識別能力，但與抗體相比具有很多優(yōu)良的特性，如分子量小，能批量生產(chǎn)，不易失活，無免疫原性、容易合成與標(biāo)記、快速的穿透組織、良好的代謝動力學(xué)、不同批次之間產(chǎn)品不會存在差異和具有很好化學(xué)穩(wěn)定性，在生物檢測、疾病診斷治療等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種特異結(jié)合NASG的核酸適體及其試劑盒。本發(fā)明提供的核酸適體，是序列表的序列1-15任一項所示的單鏈DNA。所述核酸適體與NASG蛋白具有較好的親和能力。還可將所述核酸適體進(jìn)行修飾或改造，得到所述核酸適體的衍生物。所述核酸適體的衍生物可為如下任意一種：a)將所述核酸適體刪除部分或增加部分互補的核苷酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；b)將所述核酸適體進(jìn)行核苷酸取代或部分修飾，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；c)將所述核酸適體的骨架改造為硫代磷酸酯骨架，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；d)將核酸適體改造為肽核酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；e)將所述核酸適體連接上熒光、放射性和治療性物質(zhì)后，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物。所述核酸適體可用于制備檢測NASG的試劑盒。利用本發(fā)明的核酸適體，可以捕獲中鼻咽組織中的中的NASG，從而用于相關(guān)鼻咽癌篩查。利用本發(fā)明的核酸適體，具有高靈敏、成本低、易制備、易保存的優(yōu)點。本發(fā)明具有很高的應(yīng)用價值。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例1NASG蛋白的獲得將AF439448.1所示的NASG基因通過本領(lǐng)域常規(guī)的真核表達(dá)方式進(jìn)行表達(dá)，獲得了相應(yīng)的目的多肽蛋白。實施例2核酸適體的篩選和制備設(shè)計兩端包含大約20個核苷酸、中間包括40個核苷酸的隨機核酸文庫如下：5‘-TAGCATGCAATGCCAGTATAG(N40)AACGTGCATGAACTATGAGT-3’；N40代表40個隨機核苷酸。將單鏈DNA文庫擴增為雙鏈DNA,產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化；以回收的雙鏈DNA為模板，體外轉(zhuǎn)錄出單鏈RNA隨機文庫，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)PAGE純化。75μgRNA文庫經(jīng)硝酸纖維素膜反篩去除與膜結(jié)合的RNA分子，然后與2ugNASG蛋白，37℃孵育30min，反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜；然后將濾膜剪碎，置于洗脫緩沖液(6mol/L尿素，0.55mol/L醋酸銨，l.5mmol/LEDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，離心，取上清，無水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以RNA為模板RT-PCR擴增雙鏈DNA，體外轉(zhuǎn)錄出RNA文庫用于下一輪篩選；每輪篩選過程中RT-PCR得到雙鏈DNA文庫，以該雙鏈DNA為模板體外轉(zhuǎn)錄出RNA適配子庫，篩選共進(jìn)行10輪。得到了15個適配子，其序列分別為SEQIDNO:1-15所示。具體序列如下所示：NASG-1：TAGCATGCAATGCCAGTATAGAATATTCAAGATTTCTATAACACATTCAGATTCCAACATTAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQIDNO:1)NASG-2：TAGCATGCAATGCCAGTATAGATCGCAACTCCATCACGCATCCCTACTCTTATAGATCACCAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQIDNO:2)NASG-3：TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCTCGAACGCACATTACATACATCTTAGTAATTATCTTTAAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQIDNO:3)NASG-4：TAGCATGCAATGCCAGTATAGTTTCTTTCACATATTCGCAATACAACAAACCTCTGCCACAAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQIDNO:4)NASG-5：TAGCATGCAATGCCAGTATAGCATTATATTCTTATCCACGCCTCTATCTACACTCAAAGAAAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQIDNO:5)NASG-6：TAGCATGCAATGCCAGTATAGAATCCTTACGCTCGCTCATTAATCACCACCTATAAATTCCAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQIDNO:6)NASG-7：TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCAAACAACTCAAGATAATCACTATTACAGAACAACAACTAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQIDNO:7)NASG-8：TAGCATGCAATGCCAGTATAGATATAGATCATACAAATATATTATTCCGCCTACAATTCCAAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQIDNO:8)NASG-9：TAGCATGCAATGCCAGTATAGTATCTTAATCAACGCATTACAAGACCTATAATTAACATACAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQIDNO:9)NASG-10：TAGCATGCAATGCCAGTATAGTTACTCATCGCCTCTCCACCTACCGCCTATACTCTACTACAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQIDNO:10)NASG-11：TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCAATTTTCACTATTAACACCAATAATTAAGATAACGAACAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQIDNO:11)NASG-12：TAGCATGCAATGCCAGTATAGAGACTCTATACATATATTCACTCTCCTTAATCAACAATTCAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQIDNO:12)NASG-13：TAGCATGCAATGCCAGTATAGTATCTATAGACACTCTCAATTCCAGAATTAACCTCGCCTCAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQIDNO:13)NASG-14：TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCACTTAATAATATTTCTCTTACGCTAATATATCCAACCCAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQIDNO:14)NASG-15：TAGCATGCAATGCCAGTATAGCTATATACACTATCACATTCCAGAATTAACCTCACCTCACAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQIDNO:15)實施例3蛋白結(jié)合適配子的性能測定將適配子分別取2.0μg，用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)37℃消化lh，純化回收去磷酸化的RNA；通過T4多核苷酸激酶標(biāo)記[γ-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。10nmol放射性標(biāo)記的適配子分別與不同濃度(1-200nM)的NASG37℃孵育30min，各組反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計數(shù)儀測定濾膜上殘留的放射量，同一樣品平行做兩次測定。計算各個適配子與leptin的解離常數(shù)。結(jié)果如下：名稱解離常數(shù)Kd(單位nM)NASG-113.5NASG-213.9NASG-313.8NASG-413.0NASG-513.5NASG-614.1NASG-713.8NASG-813.7NASG-913.7NASG-1014.0NASG-1113.9NASG-1213.8NASG-1313.4NASG-1413.5NASG-1513.5PBS空白對照無結(jié)合能力實施例4所述適配子特異性分析以及穩(wěn)定性分析分別采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，霍亂弧菌VgrG3C蛋白，大腸桿菌外膜蛋白A，COCH蛋白，NASG蛋白，與15條適配子進(jìn)行特異性檢測，經(jīng)過結(jié)合試驗發(fā)現(xiàn)，這些適配子都不與這些蛋白相結(jié)合，而只與NASG蛋白結(jié)合保持較高的特異性。將所述的適配子，取0.2ug，分別置于常溫的血清、水溶液中，放置三周。通過RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)三周的放置其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，沒有被降解。實施例5所述適配子疾病的診斷取10個患者和2個正常人的鼻咽分泌物。生理鹽水沖洗鼻腔，用細(xì)棉簽在鼻視鏡下插到鼻咽部，放置5-8分鐘，取出棉簽，將棉球放入底部空心，外套有離心收集管的小離心管中，在4攝氏度下7500g離心獲取分泌物，使用生理鹽水稀釋，獲得目標(biāo)樣本。將15個適配子分別與10個患者以及2個正常人的分泌物混合30min，通過生物素分離，定量分析其中的NASG蛋白的含量，通過分析發(fā)現(xiàn)，10個鼻咽癌患者中NASG蛋白的含量顯著增加3倍以上。以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表〈110〉張玲〈120〉一種用于檢測鼻咽癌的試劑盒及其檢測方法〈160〉15〈210〉1〈211〉81〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉NASG-1TAGCATGCAATGCCAGTATAGAATATTCAAGATTTCTATAACACATTCAGATTCCAACATTAACGTGCATGAACTATGAGT〈210〉2〈211〉81〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉NASG-2TAGCATGCAATGCCAGTATAGATCGCAACTCCATCACGCATCCCTACTCTTATAGATCACCAACGTGCATGAACTATGAGT〈210〉3〈211〉81〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉NASG-3TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCTCGAACGCACATTACATACATCTTAGTAATTATCTTTAAACGTGCATGAACTATGAGT〈210〉4〈211〉81〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉NASG-4TAGCATGCAATGCCAGTATAGTTTCTTTCACATATTCGCAATACAACAAACCTCTGCCACAAACGTGCATGAACTATGAGT〈210〉5〈211〉81〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉NASG-5TAGCATGCAATGCCAGTATAGCATTATATTCTTATCCACGCCTCTATCTACACTCAAAGAAAACGTGCATGAACTATGAGT〈210〉6〈211〉81〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉NASG-6TAGCATGCAATGCCAGTATAGAATCCTTACGCTCGCTCATTAATCACCACCTATAAATTCCAACGTGCATGAACTATGAGT〈210〉7〈211〉81〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉NASG-7TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCAAACAACTCAAGATAATCACTATTACAGAACAACAACTAACGTGCATGAACTATGAGT〈210〉8〈211〉81〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉NASG-8TAGCATGCAATGCCAGTATAGATATAGATCATACAAATATATTATTCCGCCTACAATTCCAAACGTGCATGAACTATGAGT〈210〉9〈211〉81〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉NASG-9TAGCATGCAATGCCAGTATAGTATCTTAATCAACGCATTACAAGACCTATAATTAACATACAACGTGCATGAACTATGAGT〈210〉10〈211〉81〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉NASG-10TAGCATGCAATGCCAGTATAGTTACTCATCGCCTCTCCACCTACCGCCTATACTCTACTACAACGTGCATGAACTATGAGT〈210〉11〈211〉81〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉NASG-11TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCAATTTTCACTATTAACACCAATAATTAAGATAACGAACAACGTGCATGAACTATGAGT〈210〉12〈211〉81〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉NASG-12TAGCATGCAATGCCAGTATAGAGACTCTATACATATATTCACTCTCCTTAATCAACAATTCAACGTGCATGAACTATGAGT〈210〉13〈211〉81〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉NASG-13TAGCATGCAATGCCAGTATAGTATCTATAGACACTCTCAATTCCAGAATTAACCTCGCCTCAACGTGCATGAACTATGAGT〈210〉14〈211〉81〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉NASG-14TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCACTTAATAATATTTCTCTTACGCTAATATATCCAACCCAACGTGCATGAACTATGAGT〈210〉15〈211〉81〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉NASG-15TAGCATGCAATGCCAGTATAGCTATATACACTATCACATTCCAGAATTAACCTCACCTCACAACGTGCATGAACTATGAGT當(dāng)前第1頁1 2 3