本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，涉及檢測(cè)胰腺導(dǎo)管腺癌免疫組化標(biāo)記蛋白組合的抗體組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

胰腺癌是全世界最常見(jiàn)最嚴(yán)重的惡性腫瘤，被稱(chēng)為“癌癥之王”，患者五年生存率不到1％，預(yù)后極差。胰腺血管、淋巴管豐富，腺泡無(wú)包膜，因此胰腺癌起病隱匿，發(fā)展快，極易發(fā)生轉(zhuǎn)移。同時(shí)由于其生長(zhǎng)無(wú)痛，并且現(xiàn)今沒(méi)有特異度高的腫瘤標(biāo)記物，影像學(xué)技術(shù)尚不能發(fā)現(xiàn)早期微小病灶，導(dǎo)致胰腺癌病人被確診時(shí)通常已處于疾病晚期。胰腺癌發(fā)病部位中70％位于胰頭、胰頸和鉤突。腫瘤通常容易侵犯到周?chē)Y(jié)構(gòu)，特別是周?chē)难芎蜕窠?jīng)，常累及門(mén)靜脈、脾靜脈和腸系膜上靜脈，甚至腸系膜上動(dòng)脈也有侵犯。只有20％的腫瘤局限于胰腺內(nèi)，40％侵犯到周?chē)M織，另40％已經(jīng)有內(nèi)臟器官轉(zhuǎn)移，特別是肝臟。盡管近年來(lái)胰腺癌的切除率有提高，但是術(shù)后的生存率卻沒(méi)有明顯改善。淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移和腫瘤是否根除是預(yù)后的決定因素。

腫瘤標(biāo)記物是腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞由于癌基因、抑癌基因或其它腫瘤相關(guān)基因及其編碼產(chǎn)物異常表達(dá)所產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)。正常組織或良性病變時(shí)有一定程度表達(dá)但產(chǎn)量甚微，而腫瘤發(fā)生時(shí)則大幅上調(diào)。利用患者組織、體液或排泄物中存在腫瘤標(biāo)記物的特點(diǎn)，臨床實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用多種方法技術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)、分析和評(píng)估，便于腫瘤早期發(fā)現(xiàn)、診治及隨訪。臨床病理科常用的胰腺癌免疫組化標(biāo)記物有CEA、CA19-9、p53、Ki-67和CK等。

癌胚抗原(CEA)是屬于免疫球蛋白家族3的高分子量糖蛋白類(lèi)，屬于癌胚胎性抗原，只在胚胎期產(chǎn)生，其主要來(lái)源于胎兒的胃、腸道和血液。出生后，癌胚抗原的產(chǎn)生被抑制，在正常成人的腸道、胰腺和肝組織中也有少量存在。因此，在正常成人的血液中癌胚抗原很難被測(cè)出。此抗原表達(dá)于多種器官，包括胃、大腸、肺和胰腺。當(dāng)這些器官發(fā)生炎性變或者壞死時(shí)，釋放多量CEA使血中該物質(zhì)水平超過(guò)參考值的上限。

CA19-9是在胃腸道癌中被發(fā)現(xiàn)的一種比CEA診斷胰腺癌更為特異的腫瘤標(biāo)記物，并得到廣泛使用。其用于診斷胰腺癌的敏感性和特異性分別達(dá)到80％和86％。由于非癌疾病情況也可致CA19-9水平升高而呈現(xiàn)假陽(yáng)性，因此應(yīng)將其和其他腫瘤標(biāo)記物聯(lián)合使用。

腫瘤抑制基因p53在人類(lèi)癌中是最常見(jiàn)的突變基因，胰腺腫瘤細(xì)胞有50％～70％的突變率。p53基因的缺失或突變失活，在胰腺癌發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用，但出現(xiàn)時(shí)間較晚。

細(xì)胞角蛋白(CK)是上皮細(xì)胞骨架的組成成分，也是上皮來(lái)源癌細(xì)胞中間絲的組成成分。它是上皮組織特有的成分而在其他組織細(xì)胞(如內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、纖維細(xì)胞等)中不存在。胰腺導(dǎo)管腺癌屬于上皮來(lái)源的惡性腫瘤，因此，通過(guò)對(duì)胰腺疾病的患者進(jìn)行CK檢測(cè)來(lái)鑒別病灶中是否存在癌細(xì)胞。

正常的細(xì)胞需要有有絲分裂信號(hào)才能從靜止期進(jìn)展到增殖期。癌細(xì)胞往往缺少獨(dú)立的外部生長(zhǎng)刺激信號(hào)，卻能發(fā)出自發(fā)性生長(zhǎng)信號(hào)。Ki-67即是這樣一種與自發(fā)性生長(zhǎng)信號(hào)相關(guān)的胞核抗原，其存在于增殖細(xì)胞細(xì)胞周期中所有活躍期(G₁、s、G₂和M)，而不存在于靜止期(G₀)。Ki-67指數(shù)可作為胰腺癌生存率的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。

雖然上述標(biāo)記物已廣泛應(yīng)用于胰腺疾病病理常規(guī)檢測(cè)，但到目前為止，尚缺少針對(duì)胰腺導(dǎo)管腺癌的特異性病理診斷標(biāo)記物，與胰腺癌中其他類(lèi)別的鑒別診斷主要依靠技術(shù)員經(jīng)驗(yàn)。并且，對(duì)患者預(yù)后的判斷主要以組織周?chē)馨徒Y(jié)中是否出現(xiàn)異型細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)，尚未有關(guān)于病灶早期微轉(zhuǎn)移的靈敏標(biāo)記物的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)上述不足，提供胰腺導(dǎo)管腺癌免疫組化檢測(cè)組合物。

本發(fā)明的另一目的是提供所述組合物的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種胰腺導(dǎo)管腺癌免疫組化標(biāo)記蛋白組合，由TIMP1和CD82組成。

所述的TIMP1為基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子。所述的CD82又名KAI1，是tetraspanin家族成員之一。

檢測(cè)所述的蛋白組合的抗體組合物，由TIMP1的單克隆抗體和CD82的單克隆抗體組成。

本發(fā)明所述的TIMP1的單克隆抗體和CD82的單克隆抗體即可以按照現(xiàn)有技術(shù)自行制備，也可以購(gòu)買(mǎi)商業(yè)化的單克隆抗體成品。

所述的TIMP1的單克隆抗體優(yōu)選美國(guó)Abcam公司生產(chǎn)的貨號(hào)為ab109125的TIMP1兔單克隆抗體。

所述的CD82的單克隆抗體優(yōu)選美國(guó)Santa Cruz公司生產(chǎn)的貨號(hào)為sc-17752的CD82鼠單克隆抗體組成。

本發(fā)明所述的抗體組合物在制備胰腺導(dǎo)管腺癌臨床診斷和/或預(yù)后監(jiān)測(cè)試劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的抗體組合物優(yōu)選在制備胰腺導(dǎo)管腺癌臨床診斷和/或預(yù)后監(jiān)測(cè)的免疫組化試劑中的應(yīng)用。

利用本發(fā)明抗體組合物進(jìn)行胰腺組織免疫組化并進(jìn)行半定量評(píng)分。免疫組化半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞陽(yáng)性率(0-5分)×染色強(qiáng)度(0-5分)＝最終評(píng)分。CD82評(píng)分為0且TIMP1評(píng)分大于10時(shí)，可排除胰腺導(dǎo)管腺癌；CD82呈細(xì)胞漿染色，評(píng)分大于0，且TIMP1評(píng)分小于10時(shí)，判定為胰腺導(dǎo)管腺癌；CD82呈細(xì)胞膜染色，評(píng)分大于0，且TIMP1評(píng)分大于10時(shí)，判定為胰腺導(dǎo)管腺癌伴轉(zhuǎn)移。

一種胰腺導(dǎo)管腺癌免疫組化檢測(cè)試劑盒，包含本發(fā)明所述的抗體組合物。

有益效果：

(1)本發(fā)明將TIMP1/CD82組合作為新型的胰腺導(dǎo)管腺癌標(biāo)記物，可廣泛用于胰腺導(dǎo)管腺癌的疾病鑒別診斷和預(yù)后判定，填補(bǔ)這兩方面免疫組化檢測(cè)上的空白。使用該組合檢測(cè)出的胰腺導(dǎo)管腺癌陽(yáng)性結(jié)果與病理常規(guī)結(jié)果符合率達(dá)到96.9％。該組合檢測(cè)結(jié)果可直接指示病灶微轉(zhuǎn)移狀態(tài)，與病理常規(guī)結(jié)果符合率達(dá)到100％。

(2)TIMP1/CD82組合檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)在于其檢測(cè)兩個(gè)疾病相關(guān)標(biāo)記物，能夠簡(jiǎn)化目前臨床病理平行檢測(cè)三個(gè)以上標(biāo)記物的操作流程，降低由個(gè)體因素差異導(dǎo)致的多個(gè)標(biāo)記物結(jié)果的判讀難度，克服傳統(tǒng)檢測(cè)的低時(shí)效性和低特異性。此法可以用于胰腺導(dǎo)管腺癌的臨床診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)，從而達(dá)到個(gè)體化抗腫瘤治療目的。

附圖說(shuō)明

圖1熒光抗體標(biāo)記TIMP1和CD82在胰腺導(dǎo)管腺癌PANC-1細(xì)胞系中共定位。

圖2熒光抗體標(biāo)記TIMP1和CD82在胰腺良性病變患者和導(dǎo)管腺癌患者組織石蠟切片中共定位。

圖3 4例非胰腺導(dǎo)管腺癌、14例胰腺導(dǎo)管腺癌未轉(zhuǎn)移和14例胰腺導(dǎo)管腺癌已轉(zhuǎn)移患者組織石蠟切片中TIMP1和CD82免疫組化評(píng)分。

由圖可見(jiàn)，CD82在胰腺導(dǎo)管腺癌中表達(dá)大幅增加。當(dāng)胰腺導(dǎo)管腺癌伴轉(zhuǎn)移，CD82表達(dá)水平不變，TIMP1表達(dá)水平持續(xù)上調(diào)。

圖4非胰腺導(dǎo)管腺癌、胰腺導(dǎo)管腺癌未轉(zhuǎn)移、胰腺導(dǎo)管腺癌已轉(zhuǎn)移和結(jié)直腸癌患者組織石蠟切片免疫組化TIMP1和CD82的亞細(xì)胞定位。

由圖可見(jiàn)，胰腺導(dǎo)管腺癌患者CD82分布于癌細(xì)胞漿，伴轉(zhuǎn)移患者CD82僅分布于癌細(xì)胞膜。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

細(xì)胞培養(yǎng)及免疫熒光染色：PANC-1細(xì)胞株(購(gòu)自美國(guó)ATCC公司)生長(zhǎng)于含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基(購(gòu)自GIBCO)中。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于6孔板，孔板中預(yù)先鋪好滅菌蓋玻片，2×10⁵/孔。待細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁后，甲醇/丙酮以1:1比例配置固定液，進(jìn)行細(xì)胞固定。PBS洗2-3遍，使用含5％羊血清的PBS中室溫封閉1小時(shí)。一抗4℃孵育過(guò)夜。PBS洗3次，每次5分鐘。熒光標(biāo)記羊抗鼠或羊抗兔二抗室溫孵育2小時(shí)。PBS洗3次，每次5分鐘。加入抗熒光淬滅試劑，激光共聚焦顯微鏡觀察、記錄；結(jié)果見(jiàn)圖1。

石蠟切片標(biāo)本：來(lái)自2014年12月在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院的胰腺良性疾病、胰腺導(dǎo)管腺癌患者各2例，均經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)。

石蠟切片免疫熒光染色：選取4μm石蠟包埋胰腺組織切片，60℃孵育1小時(shí)。二甲苯中浸泡30分鐘脫蠟，并依次浸泡濃度梯度乙醇溶液。在檸檬酸鹽緩沖液中(pH 6.0)修復(fù)抗原，使用含5％羊血清的PBS中室溫封閉1小時(shí)。一抗4℃孵育過(guò)夜。PBS洗3次，每次5分鐘。熒光標(biāo)記羊抗鼠或羊抗兔二抗室溫孵育2小時(shí)。PBS洗3次，每次5分鐘。加入抗熒光淬滅試劑，激光共聚焦顯微鏡觀察、記錄；結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1和圖2提示TIMP1和CD82在胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞表面共定位。相較于胰腺良性病變，TIMP1和CD82在胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞表面共定位明顯增加。

實(shí)施例2

石蠟切片標(biāo)本：來(lái)自2014年1月至2015年1月期間在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院的胰腺疾病患者32例，所有患者均經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)。中位年齡65歲，其中男性患者18例，女性患者14例，臨床資料詳見(jiàn)表1，其中，28例胰腺導(dǎo)管腺癌，1例粘液囊性腫瘤，1例神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，1例漿液性囊腺瘤，1例粘液腺癌。28例胰腺導(dǎo)管腺癌患者中，14例未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，14例已有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

表1 32例確診胰腺疾病患者基本信息。

石蠟切片免疫組化：選取4μm石蠟包埋胰腺組織切片選取4μm石蠟包埋胰腺組織切片，60℃孵育1小時(shí)。二甲苯中浸泡30分鐘脫蠟，并依次浸泡濃度梯度乙醇溶液。使用甲醇配制的3％過(guò)氧化氫溶液室溫封閉10分鐘。PBS洗3次，每次5分鐘。含5％羊血清的PBS中室溫封閉2小時(shí)。一抗4℃孵育過(guò)夜。PBS洗3次，每次5分鐘。HRP標(biāo)記羊抗鼠或羊抗兔二抗室溫孵育30分鐘。PBS洗3次，每次5分鐘。使用DAB顯色后，立刻放入裝有PBS的臥式染缸內(nèi)沖洗，終止顯色。依次浸泡濃度梯度乙醇溶液，并在二甲苯中浸泡10分鐘，滴加中性樹(shù)膠封片，普通光學(xué)顯微鏡觀察、記錄；結(jié)果見(jiàn)圖3和4。

圖3提示只有胰腺導(dǎo)管腺癌中CD82表達(dá)大幅增加。當(dāng)胰腺導(dǎo)管腺癌伴轉(zhuǎn)移，CD82表達(dá)水平不變，TIMP1表達(dá)水平持續(xù)上調(diào)。圖4提示胰腺導(dǎo)管腺癌伴轉(zhuǎn)移時(shí)，CD82僅分布于癌細(xì)胞膜。

實(shí)施例3

石蠟切片標(biāo)本：來(lái)自2014年1月至2015年1月期間在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院的胰腺疾病患者10例，所有患者均經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)。中位年齡52歲，其中男性患者5例，女性患者5例。其中，5例胰腺導(dǎo)管腺癌，2例實(shí)性-假乳頭狀腫瘤，1例慢性胰腺炎，1例胰腺漿液性囊腺瘤，1例神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。10例均未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

石蠟切片免疫組化：選取4μm石蠟包埋胰腺組織切片選取4μm石蠟包埋胰腺組織切片，60℃孵育1小時(shí)。二甲苯中浸泡30分鐘脫蠟，并依次浸泡濃度梯度乙醇溶液。使用甲醇配制的3％過(guò)氧化氫溶液室溫封閉10分鐘。PBS洗3次，每次5分鐘。含5％羊血清的PBS中室溫封閉2小時(shí)。一抗4℃孵育過(guò)夜。PBS洗3次，每次5分鐘。HRP標(biāo)記羊抗鼠或羊抗兔二抗室溫孵育30分鐘。PBS洗3次，每次5分鐘。使用DAB顯色后，立刻放入裝有PBS的臥式染缸內(nèi)沖洗，終止顯色。依次浸泡濃度梯度乙醇溶液，并在二甲苯中浸泡10分鐘，滴加中性樹(shù)膠封片，普通光學(xué)顯微鏡觀察、記錄。免疫組化半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞陽(yáng)性率(0-5分)×染色強(qiáng)度(0-5分)＝最終評(píng)分。

表2提示同一類(lèi)型胰腺疾病患者中臨床病理常用免疫組化標(biāo)記物評(píng)價(jià)不一。而CD82評(píng)分可排除胰腺導(dǎo)管腺癌，TIMP1評(píng)分在胰腺導(dǎo)管腺癌中較低。

表2 10例確診胰腺疾病患者免疫組化評(píng)價(jià)