本發(fā)明涉及一種煙草、煙草制品及煙氣中揮發(fā)性N-亞硝胺的測(cè)定方法，屬于煙草化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

N-亞硝胺是一類在結(jié)構(gòu)上含有-N-NO的多種化合物的總稱，根據(jù)物理性質(zhì)的差異可將其分為揮發(fā)性N-亞硝胺和非揮發(fā)性N-亞硝胺。其中，揮發(fā)性N-亞硝胺是一類受到廣泛關(guān)注的致癌物質(zhì)，不僅是霍夫曼清單和美國食品藥品監(jiān)督管理局“煙草制品及煙氣中有害及潛在有害物質(zhì)名單”中的重要物質(zhì)，也是國際癌癥研究機(jī)構(gòu)“無煙氣煙草制品中28種有害物質(zhì)”名單中的重要成分。因此，準(zhǔn)確分析煙草制品成分及釋放物中的揮發(fā)性N-亞硝胺含量，對(duì)評(píng)價(jià)煙草、煙草制品以及保障煙草制品消費(fèi)安全具有重要意義。

最早建立的煙葉及煙氣中揮發(fā)性N-亞硝胺的檢測(cè)方法為：樣品經(jīng)水提取后用二氯甲烷萃取，有機(jī)相過氧化鋁固相萃取柱凈化，凈化液濃縮后再經(jīng)氣相色譜-熱能分析聯(lián)用儀分離檢測(cè)。后來建立的煙草基質(zhì)中揮發(fā)性N-亞硝胺的測(cè)定方法均是在該方法的基礎(chǔ)上改良而來。但是上述方法均要進(jìn)行液液萃取、固相萃取凈化、凈化液濃縮等操作，樣品前處理步驟繁瑣，不利于大量樣品的快速分析。此外，熱能分析儀雖是分析揮發(fā)性N-亞硝胺的專屬型檢測(cè)器，但其仍存在前處理時(shí)間長、效率低等問題。

氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜以其強(qiáng)大的色譜分離能力、良好的選擇性和靈敏度，在復(fù)雜樣品痕量物質(zhì)的分析中展現(xiàn)出強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)，在食品、化妝品中揮發(fā)性N-亞硝胺的分析中取得了廣泛的應(yīng)用。公布號(hào)CN105353068A的發(fā)明專利公開了一種煙草及無煙氣煙草制品中揮發(fā)性N-亞硝胺的GC-MS/MS分析測(cè)定方法，包括：準(zhǔn)確稱取磨成粉末的煙葉樣品或無煙氣煙草制品樣品，加入堿性二氯甲烷和內(nèi)標(biāo)溶液，振蕩后加入無水硫酸鎂，振蕩，再加入N-丙基乙二胺和石墨碳，振蕩后離心，取上清液氮吹濃縮，最后用GC-MS/MS測(cè)定濃縮液中揮發(fā)性N-亞硝胺(包括NDMA、NPYR、NPIP、NMEA、NDEA、NMBA、NDPA、NMOR和NDBA)的含量。該方法將基質(zhì)分散固相萃取引入煙草及無煙氣煙草制品揮發(fā)性N-亞硝胺的前處理操作中，能實(shí)現(xiàn)對(duì)基質(zhì)的凈化，檢測(cè)靈敏度高、重現(xiàn)性好。但是該方法僅用于煙草及無煙氣煙草制品中揮發(fā)性N-亞硝胺的測(cè)定，并不涉及煙草制品釋放物中揮發(fā)性N-亞硝胺成分的測(cè)定，并且前處理操作中除水和凈化分兩步完成，不利于簡(jiǎn)化操作，而檢測(cè)靈敏度也有待提高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種煙草、煙草制品及煙氣中揮發(fā)性N-亞硝胺的測(cè)定方法。

為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

煙草、煙草制品及煙氣中揮發(fā)性N-亞硝胺的測(cè)定方法，包括樣品的前處理步驟，具體為：在樣品提取液中加入石墨化炭黑、N-丙基乙二胺鍵合硅膠、無水硫酸鎂和氯化鈉吸附劑，凈化后離心、過濾，即得待測(cè)溶液。

對(duì)于煙草及煙草制品，樣品提取液的制備步驟為：在浸有樣品的堿液中加入二氯甲烷，提取后分離出有機(jī)相，過濾，即得。所述堿液可采用氫氧化鈉水溶液，濃度為0.1～5mol/L，用量為1mL/g樣品。二氯甲烷的用量為8～12mL/g樣品。提取可采用超聲提取的方式，超聲功率280～700W，頻率20～40kHz，時(shí)間不少于10min，優(yōu)選為20min。分離可采用靜置、離心的方式，離心轉(zhuǎn)速5000～10000rpm，時(shí)間不少于3min，優(yōu)選為5min。過濾需采用有機(jī)相濾膜，如0.22μm或0.45μm的尼龍膜。

對(duì)于煙草制品釋放物(即煙氣)，樣品提取液的制備步驟為：將捕集有煙氣粒相物的濾片與二氯甲烷混合，提取后過濾，即得。所述二氯甲烷的用量為：捕集有5支卷煙主流煙氣總粒相物的濾片對(duì)應(yīng)加入不少于10mL的二氯甲烷，優(yōu)選為15mL。提取可采用超聲提取的方式，超聲功率280～700W，頻率20～40kHz，時(shí)間不少于10min，優(yōu)選為20min。過濾需采用有機(jī)相濾膜，如0.22μm或0.45μm的尼龍膜。

所述吸附劑中石墨化炭黑(GCB)、N-丙基乙二胺鍵合硅膠(PSA)、無水硫酸鎂(MgSO₄)、氯化鈉(NaCl)的質(zhì)量比為3:2.5:14:5。每1mL樣品提取液對(duì)應(yīng)加入5～200mg吸附劑，優(yōu)選加入120～130mg吸附劑。

所述凈化可采用漩渦振蕩的方式，如在轉(zhuǎn)速500～2500rpm下振蕩不少于1min，優(yōu)選為10min。

煙草、煙草制品及煙氣中揮發(fā)性N-亞硝胺的測(cè)定方法，還包括揮發(fā)性N-亞硝胺的測(cè)定步驟，具體為：取待測(cè)溶液進(jìn)行氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)溶液中揮發(fā)性N-亞硝胺的含量，經(jīng)計(jì)算得到樣品中揮發(fā)性N-亞硝胺的含量。

所述揮發(fā)性N-亞硝胺包括NDMA、NDPA、NPYR、NMOR和NPIP。對(duì)應(yīng)的，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析的條件為：色譜柱：DB-35ms，30m×0.25mm×0.25μm，色譜柱升溫程序：初始溫度60℃，先以4℃/min的速率升溫至120℃，再以40℃/min的速率升溫至280℃，保持10min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；載氣：高純氦氣，流速：1.0mL/min；進(jìn)樣口溫度：280℃；接口溫度：280℃，離子源溫度：200℃；質(zhì)譜電離源：EI源；電離電壓：70eV；溶劑延遲時(shí)間：3min；碰撞氣：氬氣；監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。

所述多反應(yīng)監(jiān)測(cè)中NDMA、NDPA、NPYR、NMOR、NPIP的定量離子對(duì)依次為74.0>44.1、130.0>113.2、100.0>55.1、116.0>86.1和114.0>84.2，相應(yīng)的碰撞電壓依次為7.0、4.0、7.0、4.0和7.0eV；NDMA、NDPA、NPYR、NMOR、NPIP的定性離子對(duì)依次為74.0>42.1、130.0>43.1、100.0>43.1、116.0>56.1和114.0>42.1，相應(yīng)的碰撞電壓依次為16.0、16.0、10.0、16.0和16.0eV。

所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備步驟為：以揮發(fā)性N-亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品為溶質(zhì)，二氯甲烷為溶劑，配制系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析后，以峰面積對(duì)應(yīng)物質(zhì)濃度作回歸分析，即得各目標(biāo)分析物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明中樣品前處理操作簡(jiǎn)單、快捷，雜質(zhì)及干擾物的去除效率高，處理時(shí)間短。吸附劑石墨化炭黑、N-丙基乙二胺鍵合硅膠、無水硫酸鎂和氯化鈉對(duì)樣品提取液具有良好的除水和凈化效果，能有效去除雜質(zhì)及干擾物，提高測(cè)定方法的準(zhǔn)確度和精密度，同時(shí)將除水、凈化兩步操作合二為一，簡(jiǎn)化了前處理過程。

本發(fā)明采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定性、定量分析煙草、煙草制品及煙氣中揮發(fā)性N-亞硝胺，檢測(cè)靈敏度高，準(zhǔn)確性和重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)單且快速高效。通過優(yōu)化質(zhì)譜分析中多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)(包括定性、定量離子對(duì)和碰撞能量等)，檢測(cè)的靈敏度提高，并且該方法的相對(duì)回收率介于82.4％～112.4％之間，日內(nèi)及日間精密度分別小于9.1％和8.2％。

附圖說明

圖1為NDMA的多反應(yīng)參數(shù)優(yōu)化結(jié)果圖；

圖2為NDPA的多反應(yīng)參數(shù)優(yōu)化結(jié)果圖；

圖3為NPYR的多反應(yīng)參數(shù)優(yōu)化結(jié)果圖；

圖4為NMOR的多反應(yīng)參數(shù)優(yōu)化結(jié)果圖

圖5為NPIP的多反應(yīng)參數(shù)優(yōu)化結(jié)果圖；

圖6為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液4的色譜圖；

圖7為中濃度加標(biāo)樣品的典型色譜圖；

圖8為不同質(zhì)量吸附劑凈化后待測(cè)溶液的紫外-可見吸收光譜圖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例僅對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。

實(shí)施例1

無煙氣煙草制品中揮發(fā)性N-亞硝胺的測(cè)定方法，包括以下步驟：

1)樣品的前處理

樣品提取液的制備：稱取1.0g口含型(無煙氣)煙草制品(精確至0.1mg)，置入15mL具塞離心管中，準(zhǔn)確加入1.0mL濃度1.0mol/L的氫氧化鈉溶液，充分浸潤后加入10mL二氯甲烷，置于超聲波發(fā)生器(購自昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ-700DB)上超聲提取20min，超聲功率700W，頻率40kHz，靜置5min后，置于離心機(jī)上離心5min，離心轉(zhuǎn)速10000rpm，取下層清液(即有機(jī)相)過0.22μm尼龍膜，即得樣品提取液。

樣品提取液的除水和凈化：取1mL濾液移至含有15mg GCB、12.5mg PSA、70mg MgSO₄和25mg NaCl的15mL具塞離心管中(GCB、PSA均購自維泰克科技(武漢)有限公司)，置于振蕩器上振蕩10min，轉(zhuǎn)速1000rpm，再置于離心機(jī)上離心5min，離心轉(zhuǎn)速10000rpm，取上清液過0.22μm尼龍膜，濾液即為待測(cè)溶液。

2)揮發(fā)性N-亞硝胺的測(cè)定

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：以五種揮發(fā)性N-亞硝胺(NDMA、NDPA、NPYR、NMOR和NPIP)為溶質(zhì)，二氯甲烷為溶劑，配制系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，具體見下表1。

表1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度表

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，分析條件為：(島津三重四級(jí)桿型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，型號(hào)：GCMS-TQ8030)，色譜柱：DB-35ms，30m×0.25mm×0.25μm，色譜柱升溫程序：初始溫度60℃，先以4℃/min的速率升溫至120℃，再以40℃/min的速率升溫至280℃，保持10min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；載氣：高純氦氣，流速：1.0mL/min；進(jìn)樣口溫度：280℃；接口溫度：280℃，離子源溫度：200℃；質(zhì)譜電離源：EI源；電離電壓：70eV；溶劑延遲時(shí)間：3min；碰撞氣：氬氣；監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，參數(shù)見下表2，優(yōu)化結(jié)果圖見圖1～5(圖1中74.0>44.1的最大響應(yīng)值為1313，74.0>42.1的最大響應(yīng)值為664；圖2中130.0>113.2的最大響應(yīng)值為994，130.0>43.1的最大響應(yīng)值為793；圖3中100.0>55.1的最大響應(yīng)值為738，100.0>43.1的最大響應(yīng)值為720；圖4中116.0>86.1的最大響應(yīng)值為1941，116.0>56.1的最大響應(yīng)值為1607；圖5中114.0>84.2的最大響應(yīng)值為712，114.0>84.2的最大響應(yīng)值為581)；程序運(yùn)行結(jié)束，以峰面積對(duì)應(yīng)物質(zhì)濃度作回歸分析，即得各目標(biāo)分析物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，參數(shù)見下表3，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液4的色譜圖見圖6。

表2多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式的參數(shù)設(shè)計(jì)

表3各目標(biāo)分析物對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量限和檢測(cè)限

注：檢測(cè)限和定量限分別是信噪比(S/N)3和10時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度。

樣品中揮發(fā)性N-亞硝胺的測(cè)定：取上述待測(cè)溶液進(jìn)行氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，分析條件同上，將測(cè)得的各物質(zhì)峰面積代入下式1中，經(jīng)計(jì)算得到樣品中目標(biāo)分析物的含量，其中NPIP的含量為40.2ng/g，其他物質(zhì)均未檢出。

式1：

式中，m為樣品中目標(biāo)分析物的含量，ng/g或ng/支；x為目標(biāo)分析物的峰面積；a為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，b為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；V為樣品提取液的體積，mL；n為樣品質(zhì)量或煙支數(shù)，g或支。

實(shí)施例2

卷煙主流煙氣中揮發(fā)性N-亞硝胺的測(cè)定方法，包括以下步驟：

1)樣品的前處理

樣品提取液的制備：按照GB/T 19609-2004、ISO 4387:2000的規(guī)定，用直線型吸煙機(jī)抽吸5支，將捕集有主流煙氣總粒相物的濾片置于容器中，加入15mL二氯甲烷，置于超聲波發(fā)生器(同實(shí)施例1)上超聲提取20min，超聲功率700W，頻率40kHz，提取液過0.22μm尼龍膜，即得樣品提取液。

樣品提取液的除水和凈化：取1mL濾液移至含有15mg GCB、12.5mg PSA、70mg MgSO₄和25mg NaCl的15mL具塞離心管中，置于振蕩器上振蕩10min，轉(zhuǎn)速1000rpm，再置于離心機(jī)上離心5min，離心轉(zhuǎn)速10000rpm，取上清液過0.22μm尼龍膜，濾液即為待測(cè)溶液。

2)揮發(fā)性N-亞硝胺的測(cè)定

樣品中揮發(fā)性N-亞硝胺的測(cè)定：取上述待測(cè)溶液進(jìn)行氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，分析條件同實(shí)施例1，將測(cè)得的各物質(zhì)峰面積代入式1中，經(jīng)計(jì)算得到樣品中目標(biāo)分析物的含量，其中NDMA的含量為35.4ng/支，NPYR的含量為69.0ng/支，其他物質(zhì)未檢出。

在本發(fā)明其他的實(shí)施例中，超聲提取、漩渦振蕩的條件均可適當(dāng)調(diào)整。

試驗(yàn)例

1)精密度及加標(biāo)回收測(cè)試

為考察上述測(cè)定方法的重現(xiàn)性，在實(shí)施例1的待測(cè)樣品中加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成低、中、高三種濃度的樣品(低、中、高濃度對(duì)應(yīng)的值分別為各目標(biāo)分析物線性范圍最低值的2、10和40倍)，中濃度樣品的典型色譜圖見圖7。從圖7可以看出，在優(yōu)化的分析條件下，目標(biāo)分析物與干擾物分離良好，干擾物不影響目標(biāo)分析物的定量。

以一天內(nèi)配制的5個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算不同濃度下的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；以連續(xù)4天配制的樣品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算不同濃度下的日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；將分析所得的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算得到待測(cè)溶液中目標(biāo)分析物的含量，并與實(shí)際添加量相比得到相對(duì)回收率，結(jié)果見下表4。從表4可以看出，目標(biāo)分析物在不同濃度下的日內(nèi)及日間精密度分別小于9.1％和8.2％，說明該方法具有較好的重現(xiàn)性。同時(shí)，不同濃度下目標(biāo)分析物的相對(duì)回收率介于82.4％～112.4％之間，說明該方法的準(zhǔn)確性好，可以滿足日常分析要求。

表4精密度及加標(biāo)回收測(cè)試結(jié)果

2)吸附劑用量的優(yōu)化

將不同質(zhì)量的吸附劑加入樣品提取液中，凈化后溶液的紫外-可見吸收光譜圖見圖8。從圖8可以看出，吸附劑對(duì)樣品提取液具有較好的除水和凈化效果，且隨著吸附劑用量的增加，凈化效果逐步升高。綜合考慮凈化效果和吸附劑用量，吸附劑的優(yōu)選用量為120～130mg/mL提取液。