本發(fā)明涉及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種采用免疫競(jìng)爭(zhēng)法、磁微粒化學(xué)發(fā)光法測(cè)定人體中甘膽酸(CG)含量的試劑盒。

背景技術(shù)：

甘膽酸(Cholyglycine,CG)，是由膽酸和甘氨酸結(jié)合而成的結(jié)合型膽酸，是膽汁酸的主要成分之一。膽固醇在肝細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過(guò)極其復(fù)雜的酶促反應(yīng)，轉(zhuǎn)變成初級(jí)膽汁酸，包含膽酸(CA)和鵝去氧膽酸(CDCA)。當(dāng)肝細(xì)胞受損傷，肝有疾病時(shí)，就引起甘膽酸代謝和循環(huán)紊亂，血清中的肝膽酸量就增加，且較ALT、AST、總膽紅素(TBIL)、堿性磷酸酶(ALP)、谷酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)及血清白蛋白(ALB)等常規(guī)肝功能指標(biāo)更為敏感。各種肝臟疾病如：肝癌、肝硬化、急性肝炎、慢性肝炎等患者的甘膽酸水平均顯著升高，因此甘膽酸可作為診斷這些疾病的良好指標(biāo)。同時(shí)甘膽酸的檢測(cè)對(duì)孕婦妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(ICP)的診斷具有重要的臨床意義。

目前已知的甘膽酸測(cè)定方法有放射免疫法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、膠乳增強(qiáng)比濁法等。放射免疫法步驟繁瑣，試劑價(jià)格昂貴，需使用配套的儀器且存在放射性污染。酶聯(lián)免疫吸附法存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜、重復(fù)性差、不適于急診和臨床病人及時(shí)診斷的需要。膠乳增強(qiáng)免疫比濁法操作簡(jiǎn)單、快速，但是靈敏度低、低值重復(fù)性差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種檢測(cè)血清中甘膽酸含量的試劑盒，

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

本發(fā)明的試劑盒包括抗試劑A、抗試劑B、磁微粒試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、發(fā)光底物液和濃縮洗液；

其中，所述抗試劑A是堿性磷酸酶標(biāo)記的甘膽酸衍生物，含BSA的抗試劑A緩沖液；所述堿性磷酸酶標(biāo)記的甘膽酸衍生物是通過(guò)偶聯(lián)劑將甘膽酸衍生物和堿性磷酸酶偶聯(lián)后獲得，濃度為0.8ug/mL；所述抗試劑A緩沖液為10～100mM的Tris-HCl溶液，pH值為7-8，含有濃度為2-6wt％的PEG-6000、0.7-0.9wt％的氯化鈉、0.05-0.1wt％的疊氮鈉、0.3wt％的PC-300、0.1-1wt％牛血清白蛋白以及20mM EDTA；

所述抗試劑B是FITC標(biāo)記的甘膽酸抗體，含BSA的抗試劑B緩沖液；所述FITC標(biāo)記的甘膽酸抗體是通過(guò)偶聯(lián)劑將甘膽酸抗體和FITC偶聯(lián)后獲得；所述抗試劑A緩沖液為10～100mM的Tris-HCl溶液，pH值為7-8，0.12wt％的ANS、2-6wt％的PEG-6000、0.7-0.9wt％的氯化鈉、0.05-0.1wt％的疊氮鈉、0.3wt％的PC-300、0.1-1wt％牛血清白蛋白以及20mM EDTA；

所述磁微粒試劑是包被有FITC抗體的羧基磁微?；鞈乙海?/p>

所述校準(zhǔn)品和質(zhì)控品由人源性甘膽酸和緩沖液組成，緩沖液為濃度50-200mM的Tris-HCl溶液，含有濃度為0.1～1wt％的牛血清白蛋白、0.05～0.5wt％的PC-300、5～50mM的乙二胺四乙酸二鈉；

所述發(fā)光底物液是含有AMPPD的Tris-HCl溶液，所述Tris-HCl溶液的pH值為8.0～10.0，含有濃度20V％的AMPPD、16wt％的NaCl、0.4wt％的KCl和2.42wt％的Tris；

進(jìn)一步的，所述偶聯(lián)劑選自碳化二亞胺、戊二醛、二異氰酸化合物或二鹵化二硝基苯中的一種或多種。

進(jìn)一步的，所述FITC抗體選自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛轉(zhuǎn)鐵蛋白和血藍(lán)蛋白中的一種或多種。

進(jìn)一步的，所述羧基磁微粒為核殼結(jié)構(gòu)，直徑范圍為100～4500nm，濃度為1～5mg/mL；所述羧基磁微粒的表面帶有由羧基、氨基、羥基、酰肼基或氯甲基的一種或多種修飾的化學(xué)基團(tuán)；所述FITC抗體通過(guò)羧基磁微粒攜帶的基團(tuán)鍵合在羧基磁微粒表面。

進(jìn)一步的，所述濃縮洗滌液是含有吐溫20的Tris-HCl溶液，pH值為7.4，含有濃度16wt％的NaCl、0.4wt％的KCl、2.42wt％的Tris，使用時(shí)用雙蒸水15倍稀釋。

本發(fā)明的試劑盒的制備方法，包括如下步驟：

一、磁微粒試劑的制備：

1)、將羧基磁微粒用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)在pH4.5～pH5.5下進(jìn)行活化，然后在磁場(chǎng)上靜置使羧基磁微粒與液體分開，棄去上清；

2)用pH7.6的0.01M的PBS緩沖液洗去多余化活化劑，然后加入適量的FITC抗體，使FITC抗體的濃度為0.5ul/mg，在pH7.4～pH7.8下震蕩反應(yīng)；

3)反應(yīng)結(jié)束后在磁場(chǎng)上靜置使羧基磁微粒與液體分開，棄去上清，用含有1wt％牛血清白蛋白的0.01M的PBS緩沖液進(jìn)行封閉；

4)封閉結(jié)束后，加入封閉液以保存磁微粒試劑，使包被有FITC抗體的羧基磁微粒的最終濃度為2mg/mL；該磁微?；鞈乙褐糜?-8℃保存，以備使用；

二、抗試劑A的制備

甘膽酸衍生物的制備

使用SMCC活化劑將甘膽酸進(jìn)行活化，生成馬來(lái)酰亞胺-甘膽酸衍生物；馬來(lái)酰亞胺-甘膽酸衍生物含有可以與-SH基團(tuán)反應(yīng)的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)，加入含有-SH的堿性磷酸酶，將CG衍生物與堿性磷酸酶連接在一起；

抗試劑A緩沖液的制備

將9gNaCl、0.5g疊氮鈉、3gPC-300、10g牛血清白蛋白和5.84g EDTA溶于900mL雙蒸水中，用HCl調(diào)整PH7.0-8.0，用雙蒸水定容至1000mL；

三、抗試劑B的制備

將1.2gANS、9gNaCl、0.5g疊氮鈉、3gPC-300、10g牛血清白蛋白和5.84gEDTA溶于900mL雙蒸水中，用HCl調(diào)整pH7.0～8.0，用雙蒸水定容至1000mL，獲得含BSA的緩沖液；

在BSA緩沖液中，25℃條件下，F(xiàn)ITC與甘膽酸抗體產(chǎn)生偶聯(lián)反應(yīng)，經(jīng)過(guò)蛋白純化儀純化，收集包被有FITC的甘膽酸抗體，經(jīng)過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)包被有FITC的甘膽酸抗體的濃度，調(diào)整至工作濃度為1.4ug/mL；

四、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品的制備

用含有終濃度0.1-1wt％的牛血清白蛋白、0.05-0.5wt％的PC-300、5-50mM的乙二胺四乙酸二鈉的BSA緩沖液將人源性甘膽酸純品配制成濃度為0ug/mL、 1ug/mL、2.5ug/mL、10ug/mL、20ug/mL、40ug/mL的一系列校準(zhǔn)品；

用含有終濃度0.1-1wt％的牛血清白蛋白、0.05-0.5wt％的PC-300、5-50mM的乙二胺四乙酸二鈉的BSA緩沖液將人源性甘膽酸純品配制成濃度為2.5ug/mL、20ug/mL的質(zhì)控品；

五、發(fā)光底物液的制備

將200mL AMPPD、160gNaCl、4gKCl、24.2g三羥甲基氨基甲烷溶于900mL雙蒸水中，用HCl調(diào)整PH8.0～10.0，用雙蒸水定容至1000mL；

六、濃縮洗滌液的制備

將160NaCl、4gKCl、24.2g三羥甲基氨基甲烷、1mL吐溫20溶于900mL雙蒸水中，用HCl調(diào)整至PH7.4，用雙蒸水定容至1000mL，使用時(shí)用雙蒸水15倍稀釋。

本發(fā)明的技術(shù)原理如下：

異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的甘膽酸抗體與堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的甘膽酸配對(duì)抗體和樣本、校準(zhǔn)品或質(zhì)控品中的甘膽酸結(jié)合形成“三明治”復(fù)合物。隨后加入連有抗FITC抗體的磁微粒，通過(guò)抗FITC抗體與FITC的特異性結(jié)合使抗原抗體免疫復(fù)合物結(jié)合在磁微粒上。在外加磁場(chǎng)的作用下，將免疫反應(yīng)形成的復(fù)合物與未結(jié)合的其他物質(zhì)分離，清洗復(fù)合物后，加入酶促化學(xué)發(fā)光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)激發(fā)態(tài)中間體回到基態(tài)時(shí)發(fā)出光子，形成發(fā)光反應(yīng)，即可使用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度。在檢測(cè)范圍內(nèi)，發(fā)光強(qiáng)度與樣本中的甘膽酸的含量成正比，使用改良的四參數(shù)Logistic方程擬合可計(jì)算出樣本中甘膽酸濃度。

本發(fā)明的主要?jiǎng)?chuàng)新之處在于：

1、該試劑盒將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與免疫磁微粒相結(jié)合，提供了一種接近均相的反應(yīng)體系，并且采用了一步法反應(yīng)模式，使得檢測(cè)性能大大提高(靈敏度、精密性、檢測(cè)范圍等)，反應(yīng)時(shí)間大大縮短(從開始加樣到檢測(cè)結(jié)果，時(shí)間少于35min,明顯快于同類試劑盒)；

2、發(fā)明了一種新的FITC抗體與磁微粒偶聯(lián)方法，該方法偶聯(lián)效率高，結(jié)合牢固，且工藝穩(wěn)定，在提高產(chǎn)品性能的同時(shí)，大大降低了產(chǎn)品成本。

3、試劑盒中抗試劑A、抗試劑B、磁微粒試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、發(fā)光底物 液和濃縮洗液均是該反應(yīng)體系下的最優(yōu)配方，給該試劑盒的使用效期及檢測(cè)性能提供了有力保障。

附圖說(shuō)明

附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1是本發(fā)明試劑盒與市售試劑盒A臨床測(cè)定結(jié)果的對(duì)照?qǐng)D。

具體實(shí)施方式

以下對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例

1、樣本采集

采用正確醫(yī)用技術(shù)收集血清(嚴(yán)重溶血或脂血的樣本不能用于測(cè)定)，收集后的樣本在室溫放置不可超過(guò)8小時(shí)；如果不在8小時(shí)內(nèi)檢測(cè)需將樣本放置于2-8℃的冰箱中；若需72小時(shí)以上保存或運(yùn)輸，則應(yīng)凍存于-20℃以下，避免反復(fù)凍融。使用前回復(fù)到室溫，輕輕搖動(dòng)混勻。

2、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

①取一瓶濃縮洗液用蒸餾水進(jìn)行15倍稀釋；

②將恒溫箱或水浴鍋溫度調(diào)至37℃，待溫度穩(wěn)定后使用；

③將磁微?；鞈乙撼浞只靹蛑翢o(wú)肉眼可見沉淀。

3實(shí)驗(yàn)方法

①取出一定量的反應(yīng)容器(平底試管)，編號(hào)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求分別加入60ul校準(zhǔn)品/質(zhì)控品/臨床樣本；

②每孔分別加入抗試劑A60ul、抗試劑B 60ul；

②將反應(yīng)容器內(nèi)溶液混合均勻，37℃溫育15分鐘；

③每孔分別加入搖勻的磁微粒試劑30ul；

⑤將反應(yīng)容器內(nèi)溶液混合均勻，37℃溫育5分鐘；

⑥取出反應(yīng)容器，使用磁分離及洗滌設(shè)備，將反應(yīng)容器中磁微粒用洗液洗滌3 次；

⑦洗滌完成后倒去洗液，每孔加發(fā)光底物液200ul，震蕩；

⑧化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀器檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度；

⑨采用四參數(shù)擬合方式，以校準(zhǔn)品濃度值為X軸，以校準(zhǔn)品發(fā)光強(qiáng)度值為Y軸，建立定標(biāo)曲線。根據(jù)待測(cè)樣本的發(fā)光強(qiáng)度值回算相應(yīng)的濃度值。

將本發(fā)明試劑盒按照方法學(xué)鑒定，可達(dá)到如下指標(biāo)：

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性：R＞0.9900最低檢測(cè)限：≤0.07ug/mL。

表1為臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果，可知本發(fā)明試劑盒的最低檢測(cè)限為≤0.07ug/mL，由表2臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的正確度可知本發(fā)明試劑盒的添加回收率為，85％-115％，由表3可知，本發(fā)明試劑盒的變異系數(shù)CV≤8％，由表4可知，本發(fā)明試劑盒的變異系數(shù)≤15％，由表5可知，，本發(fā)明試劑盒的線性稀釋：R大于0.9900。

表1：臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果

表2：臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的正確度

表3重復(fù)性質(zhì)控品測(cè)定值

表4本發(fā)明試劑盒的批間差

表5本發(fā)明試劑盒的線性稀釋率

將120份血清樣本測(cè)值與市售甘膽酸檢測(cè)試劑盒A對(duì)比，比較本發(fā)明試劑盒與市售甘膽酸試劑盒檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性。，結(jié)果見表6，附圖1中顯示本發(fā)明的試劑盒與市售甘膽酸檢測(cè)試劑盒A對(duì)照的線性方程為y＝0.991x+0.061，R＝0.998

表6本發(fā)明的試劑盒與市售甘膽酸檢測(cè)試劑盒A對(duì)照

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。